Tümör Patogenezinde Aday Kooperatif Genlerin Fonksiyonel Genomik Analizi Mozaik Zebra balığı Transgenesis

Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis. J. Vis. Exp. (97), e52567, doi:10.3791/52567 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Kanserler zamanla patolojik mutasyonlar, silmeler ve kromozom kazançları birikimi ile işaretlenmiş ilerici hastalıklardır. Bu genetik anormallikler, hipoksi gibi yanıtları stres hücre iskeletinin hücre döngüsü, hücre ölümü, enerji metabolizmasında ve montaj kadar çok sayıda hücresel süreçleri etkileyebilir. Bu nedenle, tümörigenezin biyolojik süreçlerin bir yelpazede çok sayıda genetik bozuklukların kolektif eylemleri yansıtır. Tüm genom dizileme, exome sıralanması, hedeflenen sıralama, derin sıralama ve genom dernek çalışmaları da dahil olmak üzere son bütünleştirici genomik araştırma çabaları, tümörlerin 1-4 esasen her türlü yeni genetik değişikliklerin giderek artan sayıda belirledik. Birçok durumda, genetik lezyonlar hastalığın patogenezinde işbirliğini düşündüren, bir rastgele olmayan bir şekilde 5-8 birlikte görülür. F Elde edilen anormal ifade edilen genlerin büyük bir dizi onkojenik rolleri KesmeBu genomik lezyonları rom, yeni tedavi stratejileri hazırlamak ve bu ajanların tümör hücrelerinin tepkilerini anlamak için gerekli, ancak bu yüksek verimli fonksiyonel genomik analiz yürütülmesinde çok sağlam hayvan modeli sistemleri gerektiren, zor bir görev olduğunu kanıtlamıştır vivo.

Memeliler, özellikle kemirgenler, kanser biyolojisinde tercih modeller olmasına rağmen, Zebra balığı büyük ilgi çekmek için başlamıştır. Teleost zebra balığı (Dario rerio) 1960 yılından bu yana gelişim incelemesi için bir model organizma olarak kullanılmaktadır ve birinci 1982 9-11 tümör patojenez çalışma uygulanmıştır. Bakım, küçük vücut büyüklüğü ve yüksek doğurganlık kolaylığı Zebra balığı anormal ve patolojik fenotipleri 10 görüşmek mutasyonları tespit etmek büyük ölçekli ileri genetik ekranlar için sağlam bir model olun. Zebra balığı embriyolarının optik şeffaflık gibi, bu kanser modelinin daha geniş kullanımını destekleyen bir başka önemli özelliğiBu, gerçek zamanlı 9, kemirgen 12 nispeten zor bir uygulama, tümör gelişmesini bulmak için yapılacak in vivo görüntüleme sağlar. Zebra balığı referans genom (Zv9) son karşılaştırmalı genomik analiz,% 71% 82 Man (OMIM) veritabanında 13 Online Mendel Kalıtım hastalıkla ilişkili genleri ile ilişkili olan insan ortologlara, sahip, 26.206 protein kodlama genleri ortaya 14. Sonuç olarak, Zebra balığı nöroblastom 8 dahil olmak üzere insan kanserlerinin farklı tipleri, modellemek için kullanılır olmuştur, T-hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) 15,16, melanom 17,18, Ewing sarkomu 19, rabdomiyosarkoma 20,21, pankreas karsinomu 22, hepatoselüler karsinom 23 ve miyeloid 24,25 malignitesinin ve Ksenonakilden bir kanser modeli 11,26 çalışmalar olarak seçilmiştir.

Stabil bir transgenikZebra balığı yaklaşım yaygın kazanç fonksiyon-normal gelişimi veya hastalık patogenezinde 27,28 genlerin etkisini incelemek için kullanılır. Bu tip bir model (Şekil 1A) geliştirmek için, bir tek hücreli vahşi tip embriyolara bir doku spesifik promotör tarafından sürülen ilgili geni içeren bir DNA yapısı enjekte eder. Enjekte embriyolar cinsel olgunluğa ulaştığında Üç dört ay enjeksiyondan sonra, onlar kurucu balık olarak lisansları onların germline içinde inşa DNA entegrasyonu gösteren olanlar için ekrana vahşi tip balık çaprazlanırlar. Bu tür kopya sayısına ve transgen entegrasyonu alanı olarak bir çok faktör, kararlı transgenik hatlarda transjenin ekspresyonunu etkilemektedir. Bu nedenle, transgenik bir tümör modeli geliştirmek için, tek bir onkojenini aşırı ifade çok kararlı transgenik çizgiler, ilk oluşturulan ve tümör indüksiyonu yol açacak bir seviyede transgen ifade hattı için taranması gerekecektir. Fakat, eğer bir aday o aşırı ekspresyonuncogene germ hücreleri için toksik olan, doğrudan transgen 29 aşırı eksprese eden stabil bir transgenik çizgiden üretmek zordur. Dolayısıyla, bu yaklaşım uygun bir kanser modeli oluşturmak için başarısızlık riski yüksek olan, zaman alıcı olabilir.

Burada, in vivo fonksiyonel genomik çalışma için geleneksel sabit transgenesis benzersiz avantajlar sağlamaktadır mozaik geçici transgenezi (Şekil 1B) dayalı bir alternatif strateji göstermektedir. Bu yaklaşımda, bir veya daha fazla transgen yapıları transgenik ya da vahşi türdeki embriyo tek hücreli aşamada enjekte edilir. transgenleri ihtiva eden enjekte DNA yapıları, tek tek balık 30, çok hücreli bir popülasyon içindeki karıştırılmış genotipler ile sonuçlanan, daha sonra mosaically rastgele primer enjekte balık entegredir. Ayrıca, birden fazla DNA ko-enjeksiyon tek hücreli embriyolar yapıları birlikte entegrasyon rasgele sitelerde aynı hücreye, Tra için izin açarTransjenlerin hücreleri ce ve mozaik hayvanlarda 31 hastalık patogenezi sırasında farklı genlerin etkileşimi keşfetmek. Prensip kanıtı olarak, geçici olarak doğal tipte balık ve MYCN ifade eden transjenik balık dopamin beta hidroksilaz (d βh) promoteri kontrolü altında, periferal simpatetik sinir sistemi (PSNS) 'de MCherry raportör geni ile mutationally aktive ALK (F1174L) aşın. bir reseptör tirosin kinazını kodlamaktadır ALK, yüksek riskli nöroblastom 5-7,32,33 de en sık mutasyona genidir. ALK en yaygın ve potansiyel somatik aktive mutasyonlar olarak (F1174L), temsil edilen aşırı bir MYCN- yüksek riskli hastalar nöroblastom büyütülmüş ve stabil bir transgenik fareler ve transjenik zebra balığı model 8,34,35 hem de nöroblastom tümörogenez hızlandırmak için MYCN aşırı ekspresyonu ile sinerjize etmektedir. Mozaik tarafındanMYCN transgenik balık mCherry ile ALK (F1174L) geçici olarak aşın, mozaik transgenezi stratejisi için hızlı ve etkili bir şekilde kullanılabileceğini düşündüren, ALK (F1174L) ve MYCN hem aşırı ifade eden stabil transgenik balık gözlemlenen tümör başlangıç ​​ivme değinmeyecek in vivo tümör başlatılması birden onkojenlerin göreceli katkıları değerlendirmek.

Protocol

Not: tüm zebra balığı çalışmalar ve hayvan bakımı Mayo Kliniği Enstitüsü, IACUC onaylı protokol # A41213 ile uygun olarak yapılmıştır.

Transgenesis 1. DNA konstruktları

  1. Bir DNA şablonu olarak (BACPAC kaynakları merkezine (BPRC) 'den) CH211-270H11 BAC klonu kullanılarak bir 5.2 kb dopamin beta hidroksilaz (d βh) promotör bölgesini 8 yükseltin. 2 dakika için 94 ° C, (94 ° C, 15 saniye, 50 ° C, 10 döngü 30 saniye 68 °: Uzun DNA şablonları ve uzun doğru PCR amplifikasyonu için bir PCR sistemi uygun ve PCR için aşağıdaki döngü programları kullanarak (94 ° C, 15 saniye, 53 ° C, 30 saniye, 68 ° C'de, 8 dakika), 68 ° C, 4 dakika (ileri doğru primer 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ', 30 devir ile takip olunan Cı, 8 dakika), ve ters primer 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
  2. D βh -pDONRP4-P1R giriş clo oluşturne 8 gibi çoklu ağ geçidi gibi ticari rekombinant klonlama sistemi kullanılarak. Saflaştırılmış dβh PCR ürünü (172 ng / ul), 1 ul (150 ng / ul) pDONRP4-P1R donör vektörü 1 ul karıştırın (diğer ağ geçidi vektörleri Dr. Chi-Bin Chien, Univ cömert hediyeler birlikte. Utah) TE tamponu (pH 8.0), BP Clonase enzim karışımı 2 ul 4 ul, 25 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir ve daha sonra bir sut TOP10 yeterli E. transform E. coli, üreticinin protokolüne göre yöntem.
  3. Oluştur d βh: EGFP-MYCN transgenik adım 1.2'de belirtilen 8 kullanarak rekombinant klonlama sistemi inşa. Her giriş klonunun 1 ul bir 5.2 kb dβh promoteri (dβh -pDONR P4-P1R yapısı), EGFP bir durdurma kodonu (pME-EGFP yapısı) eksik de dahil olmak üzere (150 ng / ml) ve insan MYCN cDNA karıştırın (cömert bir hediye Dr. Hogarty adlı Pennsylvania Çocuk Hastanesi'nde, MYCN-pDONRP2R-P3 yapı), 1 ul bir I-SceI tanıma sitesi (Dr. C. GRABHER, Karlsruhe Teknoloji Enstitüsü, Karlsruhe, Almanya) 'dan cömert bir hediye, TE tamponu 4 ul ihtiva eden tadil edilmiş hedef vektörünün (150 ng / | il), ( LR Clonase enzim karışımı 2 ul pH 8.0) içinde, 25 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir ve daha sonra transforme kimyasal olarak yetkili E. E. coli gibi bir atış ilk 10 ve üreticinin protokolünü takip ediniz.
  4. MITF edin: MITF transgenik PNP-MITF vektör sindirilmesi ile 8 inşa Notl ve SalI kısıtlama enzimleri ile 2 saat boyunca oda sıcaklığında ve serbest 2.65-kb alt-klonlanmasıyla (Dr. D. Raible, Univ cömert bir hediye Washington). MITF promotörünü ve çevreleyici bir I-SceI tanıma sitesi ihtiva eden bir tadil edilmiş pBluescript vektörü Notl ve Mlul mevkilerine zebra balığı MITF genin kodlama dizisini ihtiva eden bir DNA fragmanı (Dr. Hui Fe cömert bir hediyeng, Boston Üniversitesi) üreticinin protokolüne göre T4 DNA ligaz kullanılmıştır.
    NOT: stabil MYCN -expressing hatları üreten verimliliğini artırmak için d βh: EGFP-MYCN ve MITF:. MITF DNA yapıları tek hücreli aşamada sedef embriyolara birlikte enjekte edilir Sedef nöral eksik mutant balık türü belirler tepe-türetilmiş gelişim sırasında 36 melanofor. Böylece, enjekte edilen embriyolar pigment hücrelerinin görünümü MITF entegrasyonu önerir: MITF DNA genomuna oluşturur. Bu iki ya da üç birlikte enjekte DNA yapıları, balık genomuna 31 içine ko-entegre edilebilir gösterilmiştir. EGFP-MYCN transgen ve MYCN stabil bir transgenik çizgiden daha kolay tanımlama için: Bu nedenle, MITF sentezlenmesinin neden pigmentasyon dβh entegrasyonu için markör olarak görev yapabilir.
  5. EGFP-MYCN ve MITF: d βh Mix MITF DNAI-SceI enzim 1 ul tampon maddesi ve 0.75 ul bir 15 ul reaksiyon toplam hacim içinde: 1 oranında 3 de yapıları. Reaksiyonda DNA toplam tutarı 750 ng geçmemesi emin olun.
  6. 4 saat veya O / N için oda sıcaklığında I-SceI sindirimi yürütmek. İkinci günde,-SceI- DNA'lar mikroenjeksiyon için hazır olan veya ileride enjeksiyon için -20 ° C 'de muhafaza edilebilir dijeste edilmiştir. Bunu, enzim etkinliğini korumak için küçük kısımlar halinde, -80 ° C'de bir I-SceI enzim saklayın.
  7. Dr. C. GRABHER (a cömert bir hediye bir pENTRY1A vektörünün EcoRI ve Notl mevkilerine pcDNA3 vektörü insan ALKF1174L ve vahşi tip ALK gen (Dana Farber Kanser Enstitüsü'nde Dr. George cömert bir hediye) 7-klonlanmıştır, Karlsruhe Teknoloji Enstitüsü, Karlsruhe, Almanya) üreticinin protokolüne göre T4 DNA ligaz kullanılmıştır.
  8. D βh oluşturun: ALKF1174L </ Em> veya dβh: Protokolü 1.2 belirtildiği gibi rekombinant sistemini kullanarak ALKWT transgenik yapıları. Kısaca, üç giriş klonlar birleştirmek dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (veya ALKWT -pENTRY1A) ve P3E- poliA, I-SceI tanıma sitesi (Dr. C. GRABHER, Karlsruhe cömert bir hediye içeren değiştirilmiş hedef vektörüne Teknoloji Enstitüsü, Karlsruhe, Almanya) üreticinin protokolüne göre, LR Clonase enzim karışımı kullanılmıştır.
  9. Karıştırın d βh: ALKF1174L (veya dβh: ALKWT) ve dβh: MCherry DNA 3'te oluşturur: 1 oranında PROTOKOL 1,5-1,6 tarif edildiği gibi I-SceI enzim ile linearize.

2. Mikroenjeksiyon

  1. Tüm enjeksiyonlar 37 için, 1.0 mm çaplı cam mikropipetler kullanın. Enjeksiyondan önce bir jilet ile cam mikropipetlerin ucunu kırın. Inject enjeksiyon hacmi kalibremineral yağı, bir damla halinde H2O ing. Elde edilen damlacıkların çapı ölçülür ve enjeksiyon hacmi bir hücre aşamasında embriyoların toplam hücre hacminin% 10'undan daha az olmasını sağlamak için mikroenjektör (basınç ya da basınç palsının süresini) ayarlayın.
  2. DNA ihtiva eden enjeksiyon çözeltisi, 5 ul taze bir I-SceI enzim (5 ünite / ul) ilave 0.5 ul ekle enjeksiyon transgenesis 38 etkinliğini arttırmak için hemen önce oluşturur. Tek hücre aşamasında embriyoların sitoplazmasına Doğrusal hale getirilen DNA yapıları 50-80 pg enjekte edilir. Enjeksiyon başarısını sağlamak için, görselleştirme için% 0.25 fenol kırmızısı ile örnek karıştırın. Hücreler enjeksiyondan sonra kırmızı açarsanız, bu mikroenjeksiyon başarılı olduğunu gösterir. Transgenik balık üretmek için yüksek bir başarı oranı sağlamak için, biz genellikle 500 kadar embriyolar enjekte.
  3. EGFP-MYC: stabil MYCN sentezleyen transgenik balık oluşturmak için, çizgiselleştirilmiş d βh birlikte enjekteK ve MITF: MITF DNA yapıları, (3: 1 oranında), bir hücre aşamasında pigmentasyon mutan sedef zebrabalıkları embriyolara. MITF ifadesi balık genomunda transgenik yapıların entegrasyonu için bir muhabir olarak hizmet vermektedir.
  4. Dβh ile; ALK F1174L (ALKWT veya dβh:): yabani tipte veya MYCN transgenik embriyolar ALK mozaik aşırı ekspresyonu için, doğrusallaştırılmış d βh birlikte enjekte bir hücreye: MCherry DNA (1 oranında 3 de) oluşturur vahşi tip AB balık ile transgenik balık: F1 heterozigot Tg (EGFP-MYCN dβh) olarak ıslah kaynaklanan embriyolar. Bu nedenle, yavru yarısı MCYN için transgenik olan ve yarı vahşi tip bulunmaktadır.

Kararlı ya da Mozaik Transgenik balık için 3. Ekran

  1. Tricaine (% 0,02) bir öncelikli olarak enjekte sedef embriyolar anestezi stabil MYCN -expressing hatlarının tespiti verimini arttırmakT gün pigmentasyon postfertilization ve ekranın 3-5. Germ hücreleri EGFP-MYCN transgenini: d βh taşıyan kurucu balık için daha fazla tarama için cinsel olgunluk onları taze yumurta su ile yeni bir petri pigmentasyon ile embriyolar transfer ve yükseltmek.
  2. EGFP-MYCN, daha genotiplemede için 1-2 gün sonrası döllenme de EGFP-pozitif embriyolar için yabani tip AB balık ve ekran outcross pigmentli F0 yetişkin balık germ iletimi ile kurucusu tanımlamak için. PCR tüp içine tek bir EGFP-pozitif F1 embriyo yerleştirin ve tüm sıvı çıkarın. 4x liziz tamponu 12.5 ul, 35 ul H2O ve 2.5 | il proteinaz K tek embriyo (10 mg / ml) içeren gDNA ekstraksiyon tamponu 50 ul ekle. 4x liziz tamponu içinde 50 ml yapmak için K proteinaz inaktif için 98ºC inkübasyondan 10 dakika, ardından 55 ° C'de 2-3 saat boyunca reaksiyonu, inkübe 1 M Tris, 500 ul (pH 8.4), 2.5 mL 1 M KCI tH 2 O o 47 ml NOT: F0 MYCN istikrarlı transgenik balık vahşi tip AB balık ile yetiştirilen sonra, yavruların hepsi pigmentli bulunmaktadır. Böylece, pigmentasyon MYCN- olumlu balık belirlenmesi için işaretleyici olarak hizmet edemez. MYCN transgenik balık iken, EGFP-MYCN füzyon proteini gibi ve soğanilikteki gibi üstün servikal ganglionlar ve sempatik zincirin sıralı segmental ganglion ve non-PSNS dopaminerjik nöronların sempatik nöronlar da dahil olmak üzere, PSNS ifade edilir kranial ganglion 8. Bu nedenle, EGFP ekspresyonu MYCN kararlı transgenik embriyo tanımlanması için bir markör olarak görev yapabilir.
  3. Şablon olarak pigmentli F1 embriyo ekstre gDNA 2 ul kullanarak MYCN primerleri -test F1: 5'-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 '; MYCN -R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 've aşağıdaki program zekâh GC açısından zengin bir PCR Sistemi: 3 dakika için 95 ° C'lik 1 döngü, 30 saniye için 95 ° C 25 döngü, 30 saniye için 58 ° C ve 3 dakika için 72 ° C. Genellikle, pigmentli embriyolar entegre MYCN transgenin varlığı MITF ve MYCN aşırı ifade fazla 6 kurucu balık bu yöntem ile belirlenmiştir emin olmak için tek eşleşme gelen 14-16 pigmentli embriyolar genotiplemesi.
  4. EGFP-pozitif F1 embriyoların kalanını kadar kaldırın. Fin klip ayrıca balık içine MYCN transgen entegrasyonu onaylamak için yukarıdaki protokolü kullanılarak yaş 2-3 ay onları Genotip ve. F1 MYCN vahşi tip AB balık ile stabil transgenik balık Breed. ALK F1174L (veya dβh: ALKWT) dβh ile: doğrusallaştırılmış d βh Co-enjekte PROTOKOL 2.4 açıklandığı gibi MCherry DNA tek hücreli embriyolara oluşturur.
  5. Sıralama deneyde embriyolar -expressing MYCN üç boyutlu bir flor kullanarak protokol 2.4 de tarifEscence mikroskop ve gün PSNS EGFP-MYCN ifadesi için postfertilization 1-3 öncelikle enjekte embriyolar ekran. Daha sonra, gün postfertilization 2-5 sırasında tricaine (% 0.02) ile embriyolar anestezi ve üç boyutlu bir floresan mikroskobu kullanılarak PSNS içinde mCherry sentezlenmesi göre yine bu MYCN- pozitif ya da negatif embriyolar sıralamak. mCherry sentezlenmesi mozaik birinci enjekte edilmiş hayvanların dokularında ALK birlikte ekspresyonuna için bir markör olarak görev yapar.
    Not: ALK F1174L ve dβh: mCherry, dβh: ALKWT ve dβh: mCherry veya dβh vahşi tip balık MYCN kararlı transgenik balık üretimi kaynaklanan ~ 600 yavru d βh de dahil olmak üzere, doğrusallaştırılmış DNA yapısı ile, grup başına enjekte edilmiştir : MCherry tek başına, sırasıyla. MCherry mozaik ifadesi öncelikle enjekte balık 70-90% olarak görülebilir. Bir buçuk, bir-Enjekte balık üçüncü tümör izlemek için larva aşamasında kurtuldu.
  6. MCherry + MYCN + ve mCherry + MYCN tüm toplamak - zebra balığı kitap 39, standart protokollere göre, embriyo ve 5 hafta postfertilization başlayarak tümör başlangıç ​​izler.

Mozaik Transgenik balık 4. Tümör İzle

  1. Tümör başlangıcı kanıtı için 5 hafta postfertilization başlayan her 2 hafta mCherry- pozitif öncelikle enjekte balık izleyin.
  2. MCherry varlığı için tricaine (% 0.02) ve ekranın balık anestezisi - ve EGFP dijital görme DS-U1 kamera ile donatılmış Nikon SMZ-1500 stereoskopik flöresanlı mikroskop altında PSNS tümörlerin -expressing.
  3. Tümörler ALK transgen ifade olup olmadığını doğrulamak için, mCherry- ve ALK genotiplemesi PCR için EGFP-pozitif kitleleri izole.
  4. PCR kullanarak, genomik DNA'yı büyütmemiştirALK P7: 5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 've ALK P18: 5'-TGT CAG CTT GCT GAT GTT GC-3' ve aşağıdaki PCR reaksiyonu: 1 döngü, aşağıdaki primerler ile geliştirilen tümörleri ekstre 5 dakika boyunca 94 ° C, 30 döngü (30 saniye için 30 saniye için 94 ° C, 55 ° C ve 60 sn için 72 ° C). Daha sonra, sıra ALK P7 primeri ile PCR ürünü, bundan başka MCherry pozitif tümörlerde mutant veya yabani-tür ALK varlığını teyit etmek için.

Representative Results

Mutationally aktif ALK F1174L veya vahşi tip ALK aşın nöroblastom indüklenmesinde MYCN ile işbirliği olup olmadığının araştırılması için, MYCN ifade eden transjenik balık PSNS d βh promoterinin kontrolü altında aktive edilmiş insan ALK ya da vahşi-tipli insan ALK ya aşın. ALKF1174L veya dβh - - aşağıdaki yapıları, dβh herhangi biri ALKWT, dβh ile birlikte enjekte edildi - mCherry tek hücreli, vahşi tip veya MYCN transgenik embriyo (Şekil 2A) 8 içine. mCherry sentezlenmesi mozaik birinci enjekte edilmiş hayvanların dokularında ALK birlikte ekspresyonuna için bir markör olarak görev yaptı. Beklenen genotip tüm enjekte balık temsil edilmiştir: Aktif ALKF1174L ve mCherry mozaik ekspresyonuna (1) MYCN -expressing balık ALK ve mCherry mozaik birlikte ekspresyonuna belirlenen MYCN (2) MYCN -expressing balık; (3) mCherry mozaik ifadesi ile balık -expressing MYCN, MYCN belirlenen, mozaik MCherry; Mozaik ALKmut aktive ALKF1174L ve mCherry belirlenen WT mozaik ekspresyonuna (4) vahşi-tür balık; ve WT belirlenen vahşi tip ALK ve mCherry, mozaik ekspresyonuna (5) vahşi-tür balık; mozaik ALKWT. Bir tümör saat sonra 492 enjekte edilmiş olan hayvanların toplam 5 hafta postfertilization (wpf) için her 2 haftada bir gerçekleştirilmiştir.

Sekiz GFP + / MCherry + tümörler MYCN -expressing balık 9 wpf göre, interrenal bezi insan böbreküstü bezi eşdeğer çıkan birlikte enjekte d βh - ALKF1174 L dβh - MCherry (Şekil 2B ve 3). Bu tümörler histolo edildigically, insan nöroblastom için immünhistokimyasal ve ultrastrüktürel karşılaştırılabilir (veri referans 8 bulunabilir). Dβh ile (= Şekiller 2C ve 3, s 0,002) mCherry ya da enjekte - - ALKWT ve dβh - Buna karşılık, herhangi bir tümör MYCN -expressing dβh ile birlikte enjekte balık 9 haftalık ile gözlendi MCherry tek başına (Şekil 2B ve 3, p = 0.007). Tümörler, her iki MYCN ortaya çıkan, mozaik ALKWT ve MYCN, 12 hafta sonra indüksiyon aynı oranda mozaik MCherry balık. Buna ek olarak, nöroblastomlar izleme 15 hafta boyunca doğal tipte ALK ve MCherry veya ALKF1174L ve MCherry transgenlerin ya ile birlikte enjekte herhangi bir vahşi tip balık tespit edilmemiştir. Birlikte ele alındığında, bu bulgular mutationally aktive ALK mozaik ekspresyonu MYCN indüklenen tümör o hızlandırır olduğunu gösteriyornset ne olursa olsun, tek tek mozaik hayvanlarda entegrasyon sahasında ve dβh promoteri tarafından tahrik edilen seviyelerde doğal tipte ALK bu aşırı ifadesinin, bu model sistemde nöroblastom uyarılması için MYCN aşırı ekspresyonu ile işbirliği yapmak için görünmez.

Şekil 1,
Şekil 1: Geleneksel istikrarlı ve tümörigeneze Aday onkojenlerin Kooperatif Katılımlar çalışmada mozaik geçici Zebra balığı transgenik stratejiler şematik anahat (A) Durağan transgenik strateji.. Doğrusallaştırılmış transgenik DNA yapısı ihtiva eden aday onkogen transgen rasgele genomik lokusları balık genomuna entegre edilebilir tek hücreli aşamada yabani tip ya da mutant sedef zebra balığı embriyoların içine enjekte edilir. Germ hücre içine transgen entegrasyonu Generatio için gerekli olanstabil bir transgenik çizgiden n. Öncelikle enjekte embriyolar transgen tohum çizgisi iletimi ile kurucusu balık ekrana yabani tip veya sedef mutant balık ile çaprazlanırlar olacak cinsel olgunluğa (balık F0 nesil), ulaşmak için 3 ila 4 ay sürer. Kurucu balık bileşke yavrular, F1 nesil olarak adlandırılan kendi genomunda transgen heterozigot allel taşır. Tümörijenezde gibi geni iki aday onkogenler, "a" ve gen "b", işbirlikçi etkilerini değerlendirmek için, biz bileşik transgenleri taşıyan yavruların sadece dörtte, bu transgenleri aşın ifade iki kararlı transgenik hatları F1 döl yetiştirilen. Çünkü kararlı transgenik çizgiler üretilmesi nispeten düşük verimlilik, bu yaklaşım, yüksek verimli fonksiyonel genomik analizler için uygun değildir. (B) Mozaik geçici transgenik stratejisi. Istikrarlı transgenesis benzer, Lineerleştirilmiş transgenik DNA ko aday genleri ihtiva eden nstructs tek hücreli aşamada vahşi tip embriyoların içine enjekte edilebilir. Transgen germ hücrelerinin genomuna entegre olmak zorunda olmadığından, çok zaman ve çaba kurucusu balık belirleme sürecinde kaydedilebilir. Aday onkojenler birini fazla sentezleyen transgenik balık hattı (bizim durumumuzda, MYCN transgenik balık geliştirilmiştir) varsa Alternatif, diğer aday genleri içeren Lineerleştirilmiş transgenik DNA yapıları işbirliğini incelemek için tek hücreli aşamada transgenik embriyolar enjekte edilebilir tümörigenezin. Birlikte enjekte ve öncelikle enjekte balık 31 birlikte tanımlanması üç transgen yapıları kadar; Böylece, tümörijenezde aday onkojenlerin etkileşimi öncelikle enjekte balık değerlendirilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

"Src =" / files / ftp_upload / 52.567 / 52567fig2.jpg "/>
Şekil 2:. Aktif ALK Mozaik İfade MYCN başlangıcı Elsevier (referans 3466510609819) izni ile Nöroblastom 8 Modifiye rakam -kaynaklı hızlandırır. Mozaik transgenesis oluşturmak için (A) Bir Yaklaşım. (BF) öncelikle enjekte edilen embriyoların 2 gün eski larvaları. Birleştirilmiş floresan-aydınlık görüntüler (üst panel) kranial ganglionlar (CG, ok uçları dahil) dopaminerjik nöronların istikrarlı EGFP ifade Yanal manzarası. Kranial ganglionlar (CG, ok uçları), soğanilikteki (MO, oklar) mozaik MCherry ifade (alt paneller) Yanal manzarası. Bazı ektopik MCherry sentezleme olmayan PSNS olmayan dopaminerjik nöronlarda görülmektedir. (G - K) 7 haftalık öncelikle enjekte balık.(B, G) MYCN -expressing balık birlikte enjekte d βh - ALKF1174L ve dβh - mCherry inşa (MYCN; mozaik ALKmut). EGFP - ve MCherry pozitif tümörler 7 hafta (G beyaz boş oklar) ortaya çıkmıştır. (Cı, lH) dβh ile birlikte enjekte balık -expressing MYCN - ALKWT ve dβh - MCherry (MYCN; mozaik ALKWT) oluşturur. (D, I) dβh enjekte balık -expressing MYCN - mCherry tek başına (MYCN; mozaik mCherry) inşa. (E, J), vahşi tip (WT) dβh ile birlikte enjekte balık - ALKF1174L ve dβh - MCherry (WT; mozaik ALKmut) oluşturur. ALKWT ve dβh - - dβh ile birlikte enjekte (K, K), vahşi tip (WT), balık mCherRy yapılar (WT; mozaik ALKWT). MCherry veya dβh - - nöroblastoma dβh-ALKWT ve dβh ile birlikte enjekte balık -expressing MYCN gözlenmemiştir tek başına 7 wpf de mCherry veya MYCN transgen miras yoktu ve her iki ALKWT geni ya da enjekte edilmiş kardeş herhangi ALKF1174L geni. Ölçek çubukları 100 B um - F ve G 1 mm - K. Dijital görüş DS-U1 kamera ve Leica DFC 345FX dijital kamera ile donatılmış bir Leica MZ10F stereoskopik floresan mikroskop ile donatılmış bir Nikon SMZ-1500 stereoskopik floresan mikroskop görüntüleri işlenmiş ve Adobe Photoshop ile derlendi kazanılmış floresan görüntülerde yakalamak için kullanıldı ve Illustrator CS3 (Adobe) yazılımı. tıklayınız daha büyük bir versiyonunu görmek içinBu rakamın.

Şekil 3,
Şekil 3: DNA Yapılar ile Mozaikler birlikte enjekte olarak MYCN Transgenik Balık Nöroblastom başlangıcı ya da Yabani tip (WT) Balık. . Elsevier (referans 3466510609819) izni ile yayımlanmaktadır d βh - ALKF1174 L ve dβh - mCherry (mozaik ALKmut); dβh - ALKWT ve dβh - mCherry (mozaik ALKWT); veya dβh - MCherry (mozaik MCherry) tek başına 8. dβh ile birlikte enjekte MYCN doğrultusunda ve bu - ALKWT (mozaik ALKmut MYCN) mCherr y - ALKF1174 L ve dβh - dβh ile birlikte enjekte MYCN -expressing balık 9 wpf tümör başlangıcı arasındaki fark dβh - mCherry (MYCN; mozaik ALKWT) veya dβh - mCherry tek başına (MYCN; mozaik mCherry) iki-kuyruklu Fisher testi ile, sırasıyla p = 0.002 ve p = 0.007, istatistiksel olarak anlamlıdır.

Discussion

Bu temsili çalışmada, bu genler, belirgin bir şekilde bileşik kararlı transgenik balık coexpressing bizim önceki bulgusuyla tutarlıdır nöroblastom başlamasını hızlandırmak için işbirliği göstermek için transgenik balık -expressing MYCN içinde MCherry raportör geni ile geçici birlikte enjeksiyonu ve aktif ALK yakımının birlikte kullanılır Her iki ALK ve MYCN 8 aktif. Bu yöntem ile mozaik transgenik bir yaklaşım geleneksel bir yöntemle kıyasla birkaç ayrı avantaj sahiptir. En önemlisi, bu tip tipik olarak ALK kararlı -expressing ıslahı ve tanımlanmasında ilgili çok fazla zaman ve emek ortadan kaldırılması, kararlı transgenik hayvanlar için gerek kalmadan esas olarak enjekte edilen hayvanlarda aday onkojenlerinin (F0 nesil) coexpressing etkileri hızlı bir şekilde incelenmesini sağlar transgenik balık. Ayrıca ya da fazla MYCN olmadan vahşi tip ALK aşırı ifadesinin etkisini inceledikTümör başlaması üzerine ifadesi. sonuçlar, balık modelinde yabani tip ALK geçici olarak aşın bağımsız MYCN onkogen durumu, nöroblastom tümörogenez başlatmak için yeterli olmadığını göstermektedir. Bu yabani tip balık hem aktif ALK ve MYCN geçici koekspresyonu öncelikle enjekte balık tümörogenez önceki başlamasına neden olabilir mi gelecekte test etmek ilginç olacaktır. Bu çalışma daha sadık hem de genlerin somatik değişiklikler, yüksek riskli nöroblastom hastaların 5 bir alt co-meydana geldiği gerçek hastalık bağlamı, taklit ediyorum.

Mozaik geçici transgenik stratejisinin önemli bir tasarım öğesi öncelikle enjekte Zebra balığı embriyolarının arasında ve pozitif balık izlemek için transgenlerin başarılı entegrasyonu ile hayvanlar için taramasında yardımcı ilgi herhangi bir aday onkogenlerle eş-enjeksiyona için bir raportör gen dahil olduğunu tumor başlangıcı ve ilerlemesi. Transgenesis verimliliğini artırmak için, önemli ölçüde meganuclease 38 enjekte edilmiş embriyoların% 76 meganuclease olmadan esas olarak enjekte edilen embriyoların% 26 den transgenlerin düzgün hızlandırıcı bağlı ekspresyonunu arttırır I-SceI meganuclease aracılı transgenik bir yaklaşım, uyguladık . I-SceI meganuclease-aracılı transgenik yaklaşım kullanılması oldukça transgenesis verimliliğini artırmasına rağmen, olumlu transgenleri için enjekte edilen embriyoların yüzdesi hala iyi% 100 altında kalır. Bu durumda, bir birlikte enjekte raportör genin ekspresyonu ayrıca tümör başlaması için balık izlenmesi ve aday transgenlerin başarılı bir şekilde entegre enjekte embriyolar belirlemek için bir markör olarak görev yapabilir. Bunun aksine, Tol2 transpozon aracılı transgenik bir yaklaşım modeli omurgalılarda popüler genetik bir araç haline gelmiştir ve başarılı bir genetik dönüştürme, girmeyle mutagenez, gen tuzak kullanılmaktadırping ve güçlendirici 40,41 yakalama. Döllenmiş embriyolar haline transposaz mRNA ile Tol2 transposon birlikte enjeksiyonu, kromozomal entegrasyona etkinliğini artırır ve transgenin 42 başarılı tohum çizgisi iletimini kuvvetlendiren erken entegrasyon aktiviteleri kolaylaştırabilir. Ancak DNA transpozisyonu "cut-ve-yapıştır" mekanizması nedeniyle, transgen tek bir kopyası ekleme lokus 42 başına kromozom içine entegre edilmiştir. Bu nedenle, birlikte enjekte aday genler muhtemelen farklı hücrelerde aday genleri ile esas olarak enjekte edilen balık birlikte enjekte genlerin daha karmaşık bir geçici ve mozaik ifade modeline neden olabilir farklı bölgelerde balık genom içine tek tek entegre edilmiştir.

Genel olarak, bu çalışma ortak çalışılabilen, belki sinerjik, yüksek th birden onkogenler arasındaki ilişkileri değerlendirmek için hızlı bir araç olarak mozaik transgenesis gelecekteki kullanımını desteklerroughput şekilde, kemirgenler dahil olmak üzere diğer hayvan modelleri ile karşılamak zor bir meydan okuma. Bugüne kadar bu strateji de başarıyla rabdomyosarkomu 31 aktif RAS indüklenen başlatılmasını bastırmak ve MYC-uyarılan T-hücreli akut lenfoblastik lösemi 31 radyasyon duyarlılığını değiştirmek genleri tanımlamak için transgenik zebrafish uygulanmıştır. Ayrıca, Langenau'daki ve arkadaşları, 15, ısı-şoku-uyarımlı transgenik bir yaklaşım ile birlikte enjeksiyonu yaklaşımı birleştirerek, esas olarak enjekte edilen balık ısı şoku ile transgen ifadesini endükleyebilen tümör onkogenlerin ortak rol keşfetmek çok faydalı olduğu olduğunu göstermiştir gen ifadesini izin gibi, primer tümör kurulduktan sonra ilerleme açık olması. Çok yakın, Langenau ve arkadaşları mühendislik çinko-parmak ile rag2 genini hedef ilk bağışıklığı baskılanmış Zebra balığı modeli 43 nükleazlara geliştirdi. Kayıprag2 fonksiyonunun, terapötik aday transgenlerin aşırı ifade eden ve kendi kendini yenileme kapasitesine mozaik transgen ifadesinin etkisini değerlendirmek heterojen kanser hücrelerinin nakli faydalı olabilir bir avantaj birçok dokuda ve kanser hücrelerinin 43 sağlam ve uzun vadeli bütünleşmesini izin yanıtları ve bu kanser hücrelerinin büyüme oranı.

Son olarak, mozaik transgenesis istikrarlı transgenesis üzerinde benzersiz bir avantaj sunuyor. Kararlı transgenik hayvanlarda, transgenler vücuttaki her hücrenin genomu içine entegre edilmiş ve kuşaktan kuşağa 27 kalıtsaldır edilir. Ancak, birçok kanser germ hücreleri 44 somatik hücrelerin yerine kalıtsal mutasyonlar genetik değişiklikler ortaya çıkar. Böylece, birincil transgen entegrasyon mozaik desen balık ve daha iyi th özetlemek istiyorum bireysel mozaik transgenik balık hücre popülasyonlarının içinde karışık genotipleri enjekteE somatik bozukluklar hastalarda bulundu ve istikrarlı bir transgenik doğrultusunda tek bir ekleme sitesi neden yapay pozisyonel etkiyi önlemek olacaktır. Öte yandan, esas olarak enjekte edilen balık transgenleri aşırı eksprese eden hücrelere ve mozaik ve küçük bir nüfus mekanik çalışma daha zor hale getirir.

Özetle, mozaik transgenik strateji tümör başlaması ve yayılması için onkojenlerin ortak katkısıyla hızlı ve etkili değerlendirilmesi için sağlam bir araç sağlar. Bu ilerleme acilen onkojenik mekanizmalar ve yollar daha verimli soruşturma ve etkili hedefe yönelik tedavi geliştirmek için gerekli olan aday onkogenleri arasında etkileşimi üzerinde seminal bilgi üretmek bekleniyor. Üçten fazla birlikte enjekte DNA yapılarının koentegrasyonun etkinliğinin artırılması kutu çeşitli eşzamanlı ifade multigen kombinasyonları arasındaki karmaşık ilişkilerin incelenmesi için fırsat açacakcers. Gelecek için Zorluklar kazandı, aşın sadece protein kodlama değiştirmek mutasyonlar veya genlere kullanımını neoplastik süreçte bir rol oynar, yerine sınırlamak herhangi bir genomik veya epigenetik değişiklik karşılamak için mozaik transgenik strateji değiştirmek olacak ya amplifiye edilmiştir. Son zamanlarda, bu tür transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlardır (TALENS) 45 ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa yineleyen tekrarlar (CRISPR) / CRISPR ilişkili (Cas) sistemleri 46 olarak geliştirilmiş genom düzenleme teknikleri, daha hızlı ve verimli bir şekilde kullanılır endojen değiştirmek yaygın hale gelmiştir hücreler ve organizmalar 46 çeşitli genler. Bu tür teknikler bize Zebra balığı model sisteminde, genom dizisi ve gen ifadesinin yüksek verimli değişiklikler hedeflenen gerçekleştirmek ve daha iyi tümör patogenezinde genomik veya epigenetik değişikliklerin rolü altında yatan mekanizma (lar) anlamak için izin verecek. Bu da, inci teşvik muhtemeldirkanserlerin bir dizi yeni moleküler terapötik e gelişimi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expand Long Template PCR System  Roche Applied Science, IN 11681834001
pCR-TOPO vector  Invitrogen, CA 451641
T4 DNA ligase New England Biolabs, MA M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme
Mix
Invitrogen, CA 11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
GC-RICH PCR System  Roche Applied Science, IN 12 140 306 001
Meganuclease I-SceI  New England Biolabs, MA R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope  Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera Nikon, NY

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10, (6), 353-358 (2009).
  2. Maher, B. Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling. Nature. 459, (7244), 146-147 (2009).
  3. Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat Rev Genet. 11, (10), 685-696 (2010).
  4. Chung, C. C., Chanock, S. J. Current status of genome-wide association studies in cancer. Hum Genet. 130, (1), 59-78 (2011).
  5. Mosse, Y. P., et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 455, (7215), 930-935 (2008).
  6. Janoueix-Lerosey, I., et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature. 455, (7215), 967-970 (2008).
  7. George, R. E., et al. Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 455, (7215), 975-978 (2008).
  8. Zhu, S., et al. Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis. Cancer Cell. 21, (3), 362-373 (2012).
  9. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13, (9), 624-636 (2013).
  10. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  11. Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
  12. Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14, (6), 406-418 (2014).
  13. Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496, (7446), 494-497 (2013).
  14. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, (7446), 498-503 (2013).
  15. Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, (5608), 887-890 (2003).
  16. Feng, H., et al. T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation. Cancer Cell. 18, (4), 353-366 (2010).
  17. Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current biology : CB. 15, (3), 249-254 (2005).
  18. Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling. Pigment Cell Melanoma Res. 25, (2), 287-289 (2012).
  19. Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Dis Model Mech. 5, (1), 95-106 (2012).
  20. Le, X., et al. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (22), 9410-9415 (2007).
  21. Langenau, D. M., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Genes & development. 21, (11), 1382-1395 (2007).
  22. Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134, (7), 2080-2090 (2008).
  23. Zheng, W., et al. Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma. PLoS One. 9, (3), e91179 (2014).
  24. Forrester, A. M., et al. NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis. British journal of haematology. 155, (2), 167-181 (2011).
  25. Alghisi, E., et al. Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway. Leukemia. 27, (11), 2229-2241 (2013).
  26. Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Dis Model Mech. 7, (7), 745-754 (2014).
  27. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nat Rev Genet. 2, (12), 956-966 (2001).
  28. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, (5), 353-367 (2007).
  29. Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification. Gene Ther. 13, (3), 266-275 (2006).
  30. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233, (2), 329-346 (2001).
  31. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27, (30), 4242-4248 (2008).
  32. Chen, Y., et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature. 455, (7215), 971-974 (2008).
  33. Pugh, T. J., et al. The genetic landscape of high-risk neuroblastoma. Nature genetics. (2013).
  34. Berry, T., et al. The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma. Cancer Cell. 22, (1), 117-130 (2012).
  35. Heukamp, L. C., et al. Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice. Sci Transl Med. 4, (141), 141ra191 (2012).
  36. Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, (17), 3757-3767 (1999).
  37. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  38. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118, (1-2), 91-98 (2002).
  39. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, (3), 253-310 (1995).
  40. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (50), 19827-19832 (2008).
  41. Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. Intercellular bridges in vertebrate gastrulation. PLoS One. 6, (5), e20230 (2011).
  42. Ivics, Z., Izsvak, Z. The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering. Mob DNA. 1, (1), 25 (2010).
  43. Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11, (8), 821-824 (2014).
  44. Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. Emerging patterns of somatic mutations in cancer. Nat Rev Genet. 14, (10), 703-718 (2013).
  45. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29, (8), 697-698 (2011).
  46. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, (4), 347-355 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics