루게릭 병에 TDP-43 변종 형태론 특정 시약의 분리에 대한 소설 원자 힘 현미경 기반 Biopanning

1School for Engineering of Matter, Transport and Energy, Arizona State University, 2Department of Neurology, Georgetown University Medical Center, 3Department of Pathology, Georgetown University Medical Center
Bioengineering

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Williams, S. M., Venkataraman, L., Tian, H., Khan, G., Harris, B. T., Sierks, M. R. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (96), e52584, doi:10.3791/52584 (2015).

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Abstract

단백질 변형은 TDP-43 루게릭 병에 (ALS)에서, 알파 - 시누 클레인 등 많은 질환에 중요한 역할을하기 때문에 파킨슨 병 및 알츠하이머 병에서 베타 - 아밀로이드와 타우, 그것은 형태 특정 시약을 선택적으로 타겟팅 할 수 있습니다 개발하는 것이 매우 중요하다 이러한 질병 특정한 단백질은 질병 병리학에 잠재적 인 진단 및 치료 응용 프로그램에 대한 이러한 변형의 역할을 연구하는 변종. 우리는 선택적 질병 특정한 단백질 변이체를 인식 시약의 분리를 가능하게 신규 원자력 현미경 (AFM) 계 biopanning 기술을 개발했다. 프로세스, 음성 및 양성 패닝 단계에 관여하는 두 가지 주요 단계가 있습니다. 네거티브 패닝 단계 동안 오프 - 타겟 항원에 대한 반응성이 파지 엄선 오프 표적 항원을 이용한 서브 트랙 티브 시리즈 패닝 여러 발사를 통해 제거된다. 음의 핵심 기능패닝 단계는 프로세스를 모니터링하고 모든 바람직하지 않은 파지 입자를 제거하는 것을 확인하기 위해 AFM을 이용하여 촬상된다. 포지티브 패닝 위상 관심 표적 항원은 운모 표면에 고정되고 결합 된 파지를 용출 선택적 표적 항원에 결합 된 파지를 식별하기 위해 스크리닝한다. 목적 단백질 변이체는 적절한 네거티브 패닝 제어가 사용되어왔다 제공 정제 할 필요가 없다. 심지어 양의 패닝 단계에서 이용 될 수있는 복잡한 생체 물질은 매우 낮은 농도로 존재하는 유일한 단백질 변이체를 타겟팅. 이 기술의 응용 프로그램을 통해, 우리는 선택적으로 인간의 ALS의 뇌 조직에서 발견되는 TDP-43의 단백질 변형에 대한 항체를 인수했다. 우리는이 프로토콜은 선택적으로 다른 생물학적 과정 및 다양한 질병에 존재하는 단백질 변이체를 생성하는 바인딩 시약에 적용 할 것을 기대한다.

Introduction

단백질 변이체의 존재는 알쯔하이머, ​​파킨슨, ALS 및 전 측두엽 치매 (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 같은 신경 퇴행성 질환을 포함한 다양한 질환의 진행에 인자로서 연루되어왔다 , 10, 11. 단백질 베타 아밀로이드 및 알파 - 시누 클레인의 올리고머 형태의 알츠하이머와 파킨슨 각각 2,3,4,5에 대한 책임이있는 독성 종 것으로 생각된다. TAR DNA 결합 단백질 43 (TDP-43)의 집계는 ALS와 FTD 12,13,14에 연결되어있다. 따라서 선택적으로 다른 단백질 변종으로 진단 마커 및 잠재적 치료제를 제공 할 수있는 강력한 도구가 될 수 타겟팅 할 수있는 항체와 같은 시약. 이 연구에서 우리는 그러나이 문서에서 설명 된 기술은 제자의 넓은 범위에 대해 시약의 분리에 적용해야한다, 선택적으로 ALS에 연루 TDP-43 단백질의 변형을 결합 시약을 개발에 초점을 맞추고EIN은 변종.

TDP-43의 세포질 집계 ALS 15,16,17,18,19의 병리학 적 기능으로 확인되었습니다. 그것은 세포질과 핵 15,17 사이를 이동하는 경향이 있지만, 일반적으로 TDP-43은 정상인의 모든 세포의 핵에서 발견된다. TDP-43의 그러나 ALS 집계 양식은 질병의 진행 16, 20시 세포질에 핵에서 TDP-43의 움직임을 제안하는 핵에있는 낮은 농도로 선택 신경 세포의 세포질과 아교 세포에서 발견된다. TDP-43의 응집 ALS의 대부분의 경우에서 발견되는 반면, 돌연변이에 연결된 1 % 총 ALS 케이스 (또는 15 % 가족 ALS 사례의 20 %)의 -2 % 보낸 모든 경우를 고려하지 않는다 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 1 (SOD1) 유전자 15,17. 때문에 ALS의 대부분의 경우에 TDP-43의 중요한 역할로, 여기에 우리가 선택적입니다 TDP-43 변형에 결합 할 수 항체 기반의 시약을 개발에 초점우리의 새로운 AFM 기반 biopanning 기술을 이용하여 인간의 ALS의 뇌 조직에 존재.

처음에 우리는 항체 결합 도메인의 다양한 레퍼토리를해야합니다. 우리는 세 가지 다른 파지 디스플레이 단일 쇄 가변 도메인 항체 단편 (scFvs) 라이브러리 (톰린슨 I 및 J 및 시트 라이브러리 21)를 결합했다. 패닝 과정은 음성 및 양성 패닝 단계로 구분된다. 파아지 라이브러리의 첫번째 다수 오프 표적 항원을 제외 반응성 파지되는 동안 음의 패닝 처리가 실시된다. 각 오프 - 타겟 항원에 대한 부정적인 패닝 각 라운드의 종료 후, 처리는 오프 - 타겟 항원 결합 파지 모두가 제거되었는지를 확인하기 위해 AFM 촬상에 의해 모니터링된다. 만 모든 반응 파지가 제거 AFM 이미징에 의해 확인 후 우리는 다음 목표로 진행 않습니다. ALS에 연루 TDP-43 변종 시약을 분리하기 위해 우리는 다음과 같은 부정적인 패닝 항원을 사용 : 1) BSA는 약하게 또는 비특이적 단백질에 결합하는 파지를 제거; 2) 집계 알파 - 시누 클레인 집계 단백질의 일반적인 구조 요소에 결합하는 파지를 제거; 3) 인간의 뇌 조직 균질은 단백질이나 건강한 사람의 뇌 조직의 사후 샘플에 존재하는 다른 구성 요소에 결합하는 파지를 제거; 4) 건강한 사람의 뇌와 관련된 모든 TDP-43 형태로 결합하는 파지를 제거하기 위해 건강한 사람의 뇌에서 TDP-43 면역; 5) TDP-43 비 ALS 병리와 관련된 TDP-43 변종을 결합하는 파지를 제거하기 위해 FTD 뇌 균질에서 격리 면역. 모든 오프 - 타겟 항원에 대한 반응성 모든 파지를 제거한 후에, 우리는 인간 ALS의 뇌 조직에서 면역 침전이 경우 TDP-43, 관심 항원 결합 항체 단편을 단리하는 동안, 포지티브 패닝 단계로 진행. 이러한 고립 된 항체는 TDP-43의 집계 또는 수정 된 형태로 반응 할 수있다.

"> 기존 파지 biopanning가 긍정적 인 패닝 단계 (22, 23)에 주로 초점을 맞추고있다. 일반적으로 관심의 대상이 고정화되어, 파지 라이브러리를 추가하고 바운드 파지.이 증폭 배양 과정을 파지 한 후 증폭된다. 용출 다시 대상에 추가 이 프로세스의 변화가 타겟 항원의 넓은 범위에 대해 항체 시약을 분리하기 위해 광범위하게 사용되었지만, 일반적으로 양성 파지 결합의 비율을 증가시키기 위해 여러 번 반복된다. 그들은 일반적으로 정제 된 표적 항원 24,25,26 다량 필요 우리의 프로세스는 표적 항원 미량 필요 반면. 27 여기에서 설명한 프로토콜은 정제 및 패닝 필요없이 매우 낮은 농도로 존재 선택적 바인딩 대상 항원,에 대해 직접 수행 될 수 시약을 분리하는데 사용될 수있다 복잡한 조직 샘플에 존재하는 항원. 철저한 네거티브 패닝 프로토콜의 사용을 통해 입증AFM에 의해 정제 또는 농축하지 않을 경우 양의 항원에 대해 격리 클론 선택적으로도 대상을 결합하는 것을 보장한다.

Kasturirangan 및 동료 (2003)는 타겟 (5)의 나노 그램의 농도를 이용하여 베타 - 아밀로이드 올리고머와 반응하는 항체를 분리하는 유사한 음성 및 양성 biopanning 처리를 실시했다. 여기에서 우리는 선택적으로 질병 특정한 단백질이 인간의 조직 샘플에서 직접 변종 결합 시약의 생성을 사용하려면이 프로세스를 확장합니다. 향후 연구에서 우리는 또한 여기뿐 절연 진단 시약의 값을 조사 할뿐만 아니라, ALS를 치료하기위한 그들의 치료 학적 관련성을 평가하고자.

전반적으로, 우리의 신규 biopanning AFM 기반 기술은, 단백질 정제 또는 변경의 필요성없이 생체 물질에 특이 질병 변이체 단백질의 분리에 적용되어야하는 경우에도 표적 항원 concentratioNS은 매우 낮다.

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Protocol

1. 파지 생산

  1. 바이오 안전성 캐비닛에 모든 파지 생산 및 biopanning 프로세스를 수행합니다. 제조업체의 지침을 사용하여 biopanning 프로세스 (21 라이브러리 톰린슨 I 및 J 라이브러리 및 시트) 다른 라이브러리에서 파지 입자를 생산 (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
    참고 : 우리는 사용 가능한 항체의 다양성을 높이기 위해 우리의 패닝 프로세스에서 여러 라이브러리를 사용합니다.
  2. 간단히, OD 600까지 37 ° C에서 진탕을 함유하는 2 × YT 포함 1 % 당 200 ml의 암피실린의 100 ㎍ / ㎖의 3 대 도서관의 문화 박테리아 주식은 0.4입니다.
  3. 톰린슨 I와 J 라이브러리 200 ㎖ 및 시트 라이브러리의 VCSM13 도우미 파지의 8 × 10 11 200 ml의 KM13 도우미 파지의 8 × 10 (11)를 추가합니다. 흔들림없이 37 ° C에서 30 분 동안 헬퍼 파지와 라이브러리 샘플을 품어.
  4. 원심 분리기10 분 동안 3,000 XG에 배양하고, 0.1 % 포도당을 함유하는 2 × YT 200 ㎖ 앰피 실린 100 ㎍ / ㎖의 카나마이신 및 50 ㎍ / ㎖ 중의 세포 펠렛을 재현 탁.
  5. 진탕 30 ° C에서 문화 O / N을 품어 후 다음 날 XG 3300에서 30 분 동안 회전.
  6. 각 라이브러리에서 상층 액의 200 ml의 2.5 M의 NaCl에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 8000 50 ㎖를 추가하고 1 시간 동안 얼음에 품어. PEG 침전 후, 3300 x g에서 30 분 동안 다시 용액을 스핀.
  7. 마이크로 원심 분리 튜브에 세포 펠렛 (펠렛의 크기에 따라) 및 전송에 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 1-2 ml를 추가.
  8. 11,600 x g에서 10 분 동안 원심 분리하기 전에 종종 혼합하면서 37 ℃에서 1 시간 동안 얼음 상 파지 입자를 부화. -80 ° C에서 뜨는 및 저장소를 수집합니다.
  9. 동결 전에, 또 다른 마이크로 원심 분리 튜브에 세 라이브러리로부터 파지 입자의 작은 부피를 전송하고 각 라이브러리 역가개별적으로 농도를 결정 TG1 세포를 사용. 다음은 하나의 라이브러리에 대한 역가 프로세스에 대하여 설명한다.
    1. 0.4 (600) 중독에 TG1 세포를 성장. 6 마이크로 원심 튜브에 PBS의 990 μl를 추가합니다.
    2. 첫 번째 튜브에 파지 입자의 10 μl를 추가합니다. 혼합 한 후, 튜브 하나에서 10 μl를 제거하고 나머지 4 튜브 2. 반복을 튜브에이 단계를 추가합니다.
    3. 6 튜브에 TG1 세포의 200 μl를 추가하고 이러한 튜브까지 6 파지 각각의 희석액의 10 μl를 추가합니다. 파지 입자가없는 37 ℃에서 진탕 30 분 동안 감염을 허용합니다.
    4. 플레이트의 앰피 실린 100 μg의 / ㎖ (LBA)와 함께 접시 한천 루리아 - 베르 타니에게 세포를 100 ㎕. 37 ° C에서 O / N을 품어 후 눈에 보이는 식민지의 번호를 사용하여 PFU / ml로 결정합니다.

2. 부정적인 Biopanning 프로세스

주 : biopanning 과정 전반에 걸쳐 파지의 너무 많은 동결 해동을 피하십시오. 신분증eally, 그것은 하루에 가능한 한 부정적인 패닝 많은 단계로 수행하는 것이 가장 좋습니다. 각각에 대하여 음 또는 양의 패닝의 발사 종료 후는 어느 단계에서 오염의 경우에 파지의 일부를 저장하는 중요한 대상.

  1. 소 혈청 알부민에 대한 부정적인 패닝의 12 라운드 (BSA)
    1. 12 immunotubes에 PBS에 1 ㎎ / ㎖ BSA 용액 4 ML을 추가하고 4 ℃에서 O / N을 품어.
    2. (옆으로 네거티브 패닝 프로세스의 향후 검증이 파지 액의 소량 세트) 세 라이브러리로부터 각각 1 × 1012 파지 입자를 결합.
    3. 제 1 튜브에서 BSA 솔루션을 취소하고 모든 언 바운드 BSA를 제거하는 PBS로 튜브를 2 ~ 3 회 씻어.
    4. 이 최초의 튜브에 결합 된 파지 라이브러리를 추가 회에 30 분 동안 실온에서 배양과 결합하지 않은 파지를 수집합니다.
    5. 두 번째 immunotube와 단계 2.1.3를 반복하고이 전 단계 2.1.4에서 수집 된 파지를 추가mmunotube. 단계를 반복 2.1.4.
    6. BSA 용액을 각각 배양 한 후 수집 된 언 바운드 파지의 나머지 10 튜브 단계를 반복 2.1.3-2.1.4.
    7. 모든 BSA 파지 바인더의 제거가 AFM을 사용하여 확인합니다. 단계 이후에 절단 운모에 바인딩 BSA의 2.1.7 별도로 10 μg의 / ㎖를 단계 2.1.2에서 파지의 10 μL하고 나머지 파지의 10 μl를 추가합니다. AFM 프로세스의 간단한 버전은 제 8 항에 개략되어있다.
    8. 이는 패닝 프로세스의 성공 여부를 확인하기 위해 각각의 타겟에 대해 부정적인 패닝 수많은 발사 끝나면 파지 소량을 절약하는 것이 중요하다.
  2. 알파 - 시누 클레인의 다양한 형태에 대한 부정적인 패닝의 10 라운드
    참고 :이 프로젝트에서 우리는 (등 단량체, 이량 체, 삼량) 알파 - 시누 클레인 같은 단백질 그래서 우리는 이러한 파지 중 하나를 제거 할 다른 응집 형태를 (목표로 제거하는 것입니다 결합 할 수 파지를 제거하려면 가능한 한 많은 교차 반응 파지). 두 단량체 및 올리고머 형태의 부정적인 패닝 존재 있도록 정제 된 알파 - 시누 클레인은 최소 7 일 동안 집계 할 수 있습니다.
    1. PBS에서 집계 된 알파 - 시누 클레인의 500 μg의 / ㎖ 4 immunotubes 집계 알파 - 시누 클레인의 100 ㎍ / ㎖의 4 immunotubes를 준비하고 4 ℃에서 O / N을 품어.
    2. 집계 된 알파 - 시누 클레인의 500 μg의 / ㎖와 튜브의 하나의 솔루션을 버리고 PBS로 세척하고 BSA 패닝 음의 12 라운드 이후에 수집 된 파지 라이브러리를 추가합니다.
    3. 로테이터에 RT에서 30 분 동안 튜브를 부화 언 바운드 파지를 수집한다.
    4. 반복 500 μg의의 /의 집계 알파 - 시누 클레인 ㎖의 단계 2.2.4 이후에 매번 수집 언 바운드 파지를 사용하여 집계 알파 - 시누 클레인의 100 ㎍ / ㎖의와 튜브 나머지 튜브 2.2.3와 2.2.4 단계를 반복합니다.
    5. 집계 된 알파 500 ㎍ / ㎖의에 대한 부정적인 패닝의 첫 번째 후 파지를 사용하여 단계를 반복 2.1.8-synuclein 및 알파 - 시누 클레인의 100 μg의 / ㎖에 대한 부정적인 패닝의 8 라운드 후 파지.
    6. 에 대한 모든 부정적인 바인더 제거하기 위해 알파 - 시누 클레인 집계 알파 - 시누 클레인의 500 μg의 / ㎖와 두 개의 여분의 immunotubes을 준비하고 반복 2.2.2-2.2.4 단계를 반복합니다.
  3. 건강한 인간의 뇌 조직 균질 현탁액에 대한 부정적인 패닝의 10 라운드
    1. 1X STEN 버퍼 (50 mM 트리스 (PH 7.6), 150 mM의 NaCl을, 2 mM의 EDTA, 0.2 % NP-40, 0.2 % BSA, 20 mM의 PMSF 및 단백질 분해 효소 칵테일 억제제) 인간의 뇌 조직 28를 추가합니다. 3,000 rpm에서 1 분간 24,000 rpm으로 원심 분리기 샘플을 균질화하고 상층 액을 수집합니다.
    2. PBS에서 인간의 뇌 조직의 50 ㎍ / ml의 2 ml의 인간 뇌 조직의 10 ㎍ / ml의 8 immunotubes와 2 immunotubes를 준비하고 4 ℃에서 O / N을 품어.
    3. 인간의 (B)의 10 ㎍ / ml를 함유하여 그 후 인간 뇌 조직의 50 ㎍ / ml를 함유 튜브 제 2.2.3-2.2.5 단계를 반복하고알파 - 시누 클레인에 대한 부정적인 패닝 후 수집 된 언 바운드 파지를 사용하여 비 조직.
    4. 50 μg의의 / 인간 뇌 조직 ㎖의 인간의 뇌 조직에 대한 부정적인 패닝의 열 번째 라운드 후 파지에 대한 부정적인 패닝의 첫 번째 후 파지를 사용하여 단계를 반복 2.1.8.
  4. 건강한 면역 TDP-43에 대한 부정적인 패닝의 8 라운드
    1. , 인해 면역 단백질의 낮은 수량에 9 장에 기술 된 프로토콜을 사용하여 건강한 인간의 뇌 조직에서 건강한 TDP-43 단백질을 면역 침전 운모를 사용하여 음의 패닝의 이러한 순찰을 실시하고 있습니다.
    2. 여덟 운모 표면을 베기.
    3. 첫 번째 운모 ~ 면역 단백질의 5 ㎍ / ㎖의 100 μl를 추가하고 실온에서 5 ~ 10 분 동안 품어.
    4. 트윈 20 0.1 % PBS (PBST)와 운모 5 회 반복한다.
    5. 건강한 뇌 조직에 대한 부정적인 패닝 후 파지 ~ 100 μl를 추가하고 5 ~ 10 분에서 부화RT.
    6. 단계 2.4.5의 중간 배양, 제 2 운모를 사용하여 단계 2.4.3을 실시하고 있습니다.
    7. 단계 2.4.5에서 파지를 수집하고 0.1 % PBST로 운모 5 회 반복한다.
    8. 단계 2.4.6에서 운모를 씻고 2.4.7에서 파지를 추가합니다.
    9. 파지가 부정적인 면역 단백질과 여덟 운모에 대해 패닝 될 때까지 반복 2.4.9에 2.4.4 단계를 반복합니다. 제 부정적인 패닝의 여덟 라운드 후 파지를 사용하여 단계를 반복 2.1.7.
  5. FTD 면역 TDP-43에 대해 부정적인 패닝의 발사 속도
    1. FTD 개인의 뇌에서 면역 침전 TDP-43 단백질.
    2. 2 운모 표면을 베기.
    3. FTD의 10 μg의 / ㎖ TDP-43 운모 하나의 50 μl를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 품어.
    4. 운모에게 0.1 % PBST 5 회 반복한다.
    5. 건강한 TDP-43에 대한 부정적인 패닝 후 수집 된 파지의 50 μl를 추가합니다. 5 분 동안 품어.
    6. 언 바운드 파지를 수집합니다.
    7. REPEATS는 두 번째 운모 및 2.5.6에서 수집 한 언 바운드 파지와 2.5.6에 2.5.3 단계를 반복합니다.

면역 TDP-43 ALS 가진 개인에서 상대로 3. 긍정적 인 패닝

  1. ALS와 개인의 뇌에서 면역 침전 TDP-43 단백질. 3 운모 표면을 베기. ALS의 10 μg의 / ㎖ TDP-43 운모 하나의 50 μl를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 품어. 운모에게 0.1 % PBST 5 회 반복한다.
  2. 건강한 TDP-43 운모에 대해 부정적인 패닝 후 수집 된 파지의 50 μl를 추가합니다. 5 분 동안 품어.
  3. 언 바운드 파지를 수집합니다. 또한 세 용출 방법을 사용하여 결합 된 파지를 수집합니다. 그것은 별도의 이러한 패닝 단계에서 수집 된 모든 파지를 유지하는 것이 중요합니다.
    1. 우선, 각 마이카 트립신 50 μL (PBS에 1 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 10 분보다 더 동안 배양. 솔루션을 수집하고 저장합니다. 다음으로, 각 운모 100 MM의 트리 에틸 아민 (TEA)의 50 μl를 추가하고 10 분 이상 더 이상 부화. 공동솔루션 llect, 1 M 트리스 - 염산 완충액 pH 7.4 및 저장의 동일한 볼륨을 추가합니다.
    2. 셋째, 직접 운모 0.4 OD 600 TG1의 50 μL를 추가하고, 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다. 또한 0.4의 OD 600에서 TG1 3.3.1 100 μL의 두 용출 방법에서 수집 된 파지를 추가하고, 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다.
  4. 반복 두 번째 운모 3.1 단계를 반복합니다.
  5. 3.3.2에서 수집 한 언 바운드 파지를 가져 가라. ALS TDP-43 첫 번째 운모를 사용하여 ALS의 TDP-43와 두 번째 운모에 추가합니다. 5 분 동안 품어.
  6. 운모의 이러한 두 번째 세트 3.3의 모든 단계를 반복합니다.
  7. LBA 판에있는 두 개의 ALS TDP-43 운모 판에서 트립신 용출 파지에 감염 TG1 세포를 결합합니다. TEA에 대해 동일한 과정을 반복하고 TG1은 3 개의 판의 총 두 ALS TDP-43 운모에서 파지를 용출.
    참고 : 때문에 ALS와 FTD 모두 TDP-43의 관여, 클론의 일부에 고립ALS TDP-43에 대한 긍정적 인 패닝 두 차례이 대상에 해당 될 수 있지만 일부는 FTD을 결합 할 수 있습니다. 더 나은 ALS에게 특정 클론을 분리하기 위해, FTD TDP-43 (음 팬이 두 라운드 FTD TDP-43에 반응성이 모든 대상을 제거해야하기 때문에)에 대한 부정적인 패닝의 2 라운드 후 수집 된 언 바운드 파지을 가지고 이러한 파지를 사용 운모에 ALS TDP-43 항원에 대한 긍정적 인 패닝 (3.3 및 3.4에서 상술 한 바와 같이 ALS TDP-43을 제조 운모)의 하나 이상의 라운드.
  8. 세 번째 ALS 운모와 3.3의 모든 단계를 반복하여 37 ° C에서 세 LBA 판 O / N에 감염된 TG1 세포를 접시. 다음 날 가능성 ALS 클론와 6 LBA 판에 식민지의 수를 계산합니다. 긍정적 인 패닝의 두 라운드 후 세 LBA 판에 비해 긍정적 인 패닝의 세 번째 라운드 후 잠재적 인 ALS 클론와 세 LBA 판에 적은 수의 식민지가 있어야합니다.

4. 배양 및 파지 제품루게릭 병에 대한 잠재적 인 긍정적 클론의 이온 특정 TDP-43

  1. 37 ° CO / N에서 통에 1 % 포도당을 함유하는 2 × YT 100 ㎕ 암피실린 100 ㎍ / ㎖의를 포함하는 96 웰 플레이트에 6 판에서 각 식민지를 성장.
  2. 다음날 전송 1 % 포도당을 함유하는 2 × YT 1 ml의 암피실린의 100 ㎍ / ㎖의를 포함하는 마이크로 원심 튜브에 ALS TDP-43 단백질과 긍정적 인 패닝의 세 번째 라운드 후 3 LBA 판에서 클론을 포함하는 우물에서 10 μL .
  3. 15 %의 최종 농도로 96 웰 플레이트의 모든 문화에 글리세롤을 첨가하고, -80 ℃에서 동결 판. 1 ml의 문화가 37 ° C에서 흔들어 2-3 시간 동안 성장하는 것을 허용합니다.
  4. KM13 도우미 파지의 10 구를 추가하고 헬퍼 파지 진탕 37 ° C에서 1 시간 동안 감염 할 수 있습니다. 원심 분리기 10 분 동안 세포 3,000 XG에, 100 ㎍ / ㎖의 암피실린 kanam 50 ㎍ / ml의 상층 액을 제거하고 0.1 %의 포도당으로 함유하는 2 × YT 1 ㎖​​를 추가ycin.
  5. 문화 흔들어 30 ° C에서 세포 O / N. 원심 분리기 튜브는 30 분 동안 3,300 XG에서, 새로운 마이크로 원심 튜브에 뜨는을 전송하고 각 튜브에 PEG / NaCl을 μL (250)를 추가합니다.
  6. 1 시간 동안 얼음에 튜브를 품어. 30 분 동안 3,300 XG에서 다시 튜브를 원심 분리기 뜨는을 버리고 각각의 튜브에 PBS 100 ㎕를 추가합니다.
  7. 1 시간 동안 얼음에 튜브를 품어. 11,600 XG에서 10 분 동안 튜브를 스핀과 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. -80 ° C에서 파​​지를 저장합니다.

잠재적 인 ALS 클론의 5 연속

  1. 단계를 반복 4.2은 진탕 37 ° C에서 O / N 성장을 문화로 할 수 있습니다. 다음 날은 제조업체의 지침에 따라 클론의 DNA 플라스미드 최상의 상태로 준비를 실시하고 있습니다. 순방향 적절한 사용 클론을 시퀀싱 및 역방향 프라이머.

ALS 특정 TDP-43 사용하여 간접 ELISA에 대해 잠재적 인 긍정적 클론 상영 (6)

  1. 각각의 잠재적 ALS 클론에 대한 높은 결합 ELISA 플레이트의 웰에 ALS, FTD와 건강한 사람의 뇌 조직의 2.5 ㎍ / ㎖의 100 μl를 추가합니다. 천천히 진탕하면서 1 시간 동안 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션.
  2. 플레이트를 0.1 % PBST로 3 회 세척 할 것. 웰을 PBS로 2 % 분유 200 μl를 첨가하고, 진탕하면서 천천히 1 시간 동안 37 ° C에서 배양 한 플레이트.
  3. 세척 단계를 반복 한 다음 우물에 PBS에서 최소 1/100 희석 각 파지의 100 μl를 추가합니다. 그리고 배양 후 것은 단계를 씻어 각 웰에 1 / 1,000 방지 M13 HRP 100 ㎕를 추가합니다. 접시를 세척하고 ELISA 펨토 화학 발광 기판 키트를 사용하여 시각화.

(7)의 scFv 생산 및 간접 ELISA를 사용하여 검사

  1. 0.4 (600) 중독에 HB에게 2151 세포를 성장. HB 2151 세포의 20 μL에 다른 파지의 5 μl를 추가합니다. 30 분 파지 흔들림없이 37 ° C에서 감염을 허용합니다. 그리드에 LBA 판을 나누기 때문에즉 약 20 개의 클론 각각에 도금 될 수있다.
  2. 판에 각 파지 감염 박테리아의 5 ~ 10 μl를 추가하고 37 ° C에서 O / N을 품어. 다음날 1 0.1 % 글루코스와 함께 함유하는 2 × YT 100 ㎖의 암피실린에 ㎍ / ml의 개별 콜로니를 추가하고 OD 600 = 0.6이 될 때까지 3-4 시간 동안 37 ° C에서 진탕.
  3. 각각의 튜브에 1 M isopropylthiogalactoside (IPTG)의 1 μl를 추가하고 진탕 30 ° C에서 O / N을 품어. 10 분 동안 11,600 XG에서 튜브를 스핀과 ELISA 테스트를위한 뜨는을 수확.
  4. ELISA 시험은 원액의 scFv를 추가 제외하고 대신 파지의 6.5, 6 절에서 동일한 절차에 따라 6.6 1 / 1,000 9e10 HRP의 100 μl를 추가합니다.

8. AFM 프로세스

  1. 절단 운모로 표적 항원의 10 ~ 20 μl를 추가하고 5 ~ 10 분 동안 품어. 물 운모 5 회 반복한다. 운모로 파지의 10 ~ 20 μl를 추가하고 5 ~ 10 분 동안 품어.
  2. 5 회 다시 WI 운모를 씻으일 물과 공기 건조에 운모를 할 수 있습니다. AFM (1)을 사용하여 파지 결합을 시각화. RT 공기 중에서 29 나노 스코프 Ⅲa의 컨트롤러 탭핑 모드 AFM을 이용 AFM 촬상 처리를 실행한다. 실리콘 AFM 프로브는 300 kHz의 공진 주파수에서 40 N / m의 스프링 상수를 갖는다. 3.05 Hz의 스캔 속도와 512 샘플 / 라인의 스캔 해상도를 사용합니다.
  3. 모든 입자 크기는 이미지 내 각 비교되도록 배경 염기성 의해 평탄화 된 영상을 가공. 파지 폭 (안 길이) 이미지별로 인해 다른 입자 크기 및 주사 영역에 따라 달라질 수 있지만 여부 파지의 정밀도가 항원에 결합 손상되지 않을 것이다.
  4. 부정적인 패닝 파지의 각 세트에 대한 AFM 확인 중 운모에 볼 수있는 경우에는 파지 부정적인 패닝의 다음 세트로 진행하기 전에 검출되지 않을 때까지, 또한 라운드를 수행합니다.

대상 항원 9. 면역 침전

  1. ISOLAT하려면E 표적 항원 (TDP는-43), (운동 피질)에서 균질화 뇌 조직, 항 TDP 43 폴리 클로 날 항체 및 1X STEN 1/100 희석액 100 ㎕를 에펜 도르프에 700 ㎕의 총 부피로 버퍼 250 μg의 추가 튜브 (28).
  2. 회 전자에 4 ° C에서 O / N을 품어. 1 배 STEN 씻을 A / G 아가로 오스 비즈 2 ~ 3 번 버퍼 및 조직 혼합물에 25ml를 추가합니다. 회 전자에 1.5 시간 동안 4 ° C에서 부화 후 1 분 동안 2,000-4,000 rpm에서 원심 분리기.
  3. 상층 액을 제거하고 1X STEN 버퍼와 PBS로 5 회 한 번 펠렛을 씻는다. 펠렛에 1X STEN 버퍼의 40 ~ 60 μl를 추가하고 5 분 동안 끓인다. 샘플 후 멋진, 원심 분리하고 상층 액을 수집합니다. 면역 과정 (30)의 성공 여부를 확인하기 위해 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로 팅을 사용합니다.

10 점의 얼룩 분석

  1. 테스트 할 각 복제에 대한 작은 사각형으로 니트로 셀룰로오스 종이를 잘라. ALS, F의 도트 2 μLTD과 니트로 셀룰로오스 종이에게 건강한 인간의 뇌 조직 샘플 및 완전히 건조시킵니다.
  2. PBS에 5 %의 분유 1-2 ML을 추가하고 실온에서 1 시간 동안 흔들어 보자. 각 파지의 1/100 희석의 1 ML을 추가하고 4 ℃에서 O / N를 흔들 수 있습니다. 0.5 % PBST 10 분마다 막 3 회 반복한다.
  3. 안티 M13 HRP의 1 / 1,000 희석 한 ML을 추가하고 실온에서 1 시간 동안 흔들어 보자. 반복 세척 절차 및 서부 발광 솔루션을 사용하여 시각.

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Representative Results

그림 1에서 회로도는 우리가 immunotubes를 사용하여 우리의 라이브러리에서 오프 대상 항원을 결합 파지를 제거하는 부정적인 패닝 과정을 보여줍니다. 이 공통 차단 에이전트와 미래의 면역에 문제가 될 것이 목표 비특이적 반응만한 파지이기 때문에 우리는 처음 BSA 시작했다. 다음으로, 우리는 집계 단백질 (즉, 집계 알파 - 시누 클레인에 교차 반응 것 항체, TDP-43, 아 베타 등)의 일반적인 구조와 반응성이 파지를 제거하기 위해 집계 된 알파 - 시누 클레인에 바인더를 제거했습니다. AFM 결과 파지 집계 된 알파 - 시누 클레인에 대한 부정적인 패닝의 1 라운드 (그림 2A) 구속력이되고 더 8 라운드 (그림 2B) 구속력을 보였다. 우리는 다음 음으로 건강한 사람의 뇌 균질에 존재하는 많은 항원을 결합 파지를 제거하기 위해 건강한 사람의 뇌 조직에 대해 됐어요. 그림 2C (그림 2D)의 10 라운드 구속력이 남아 있지. 패닝 가능한 건강한 면역 FTD TDP-43 단백질의 양 때문에 immunotubes 적은 부피를 이용하기 때문에 소비되는 총 단백질 (도 3) 하강보다는 운모를 사용 낮았다. 건강한 면역 TDP-43에 대한 부정적인 패닝의 8 라운드 후, 파지 분할되었다. 반 파지 FTD TDP-43에 대한 부정적인 패닝 두 차례에 소비했다. 목적은 잠재적 인 ALS TDP-43 특정 클론을 유지하면서, (인해 FTD에 TDP-43의 개입에) 어떤 FTD TDP-43 반응 클론을 제거하는 것이었다.

포지티브 패닝 부 (도 4)를 위해, 우리는 또한 재료의 사용을 최소화 운모 기판 등을 채용. 우리는 TDP-43은 어떤을 취득하는 ALS에 대한 FTD TDP-43 부정적인 패닝 후 언 바운드 파지를 사용ALS 특정 클론. 우리는 또한 적극적으로 우리가 FTD TDP-43에 대한 부정적인 패닝에서 언 바운드 파지를 사용 후 클론을 취득하지 않은 경우에 TDP-43 번 ALS에 대해 됐어요. 전체 패닝 과정 후, 우리의 세 용출 방법 (FTD TDP-에서 언 바운드 파지를 사용하여 45 잠재적 인 ALS 특정 클론 (ALS와 FTD에 반응 할 수있다 클론) ALS TDP-43에 대한 두 가지 긍정적 인 패닝 (panning)에서 154 클론을 얻었다 43 부정적인 패닝).

또한 45 잠재적 인 ALS 특정 클론을 줄이기 위해, 클론 서열 것으로, 어떤 정지 코돈없이 만 클론 두 번 나타났다 한 클론을 제외하고, 추가로 고려되었다. 이 23 잠재적 인 ALS 특정 클론으로 우리를 떠났다. 이러한 클론와 모두 파지 및 가용성의 scFv를 준비한 후, 그들은 ALS의 조직 특이성에 대한 간접 ELISA를 테스트하고 있습니다. 거의 파지 모든 건강한 조직 (그림 5)을 통해 ALS 조직에 대한 선호를 보였다. 비슷한 결과는 OBT 있습니다ained FTD 조직에 ALS에 결합하는 파지 (그림 6)를 비교할 때. 미래 연구는 이러한 클론 기능 scFvs의 높은 수율을 표현하는 것이 중요하다, 그래서 우리는 다른 scFvs의 작은 일괄 생산 및 이와 유사한 간접 ELISA를을 실시했다. scFv를 건강 (그림 7)과 FTD 조직 (그림 8) 모두에 ALS 조직에 결합의 비교는 다시 거의 모든 클론 ALS 조직 결합을 선택했다.

우리는 더 ALS 조직에 결합 확인하고 다른 면역 학적 응용 프로그램에 반응성이있는 클론을 확인하기 위해 다른 면역 (도트 말)을 사용했다. ALS 조직에 결합 복제 2A (그림 9) 표시됩니다. 이들 클론 모두는 파지 및 scFv를 한 ELISA의 어느 하나 또는 둘 다에 유망한 결과를 나타내었다. 이러한 결과가 우리의 AFM 기반 biopanning 프로세스 선택적 질병 특정한 단백질 VAR​​I 결합 시약을 생성하는데 사용될 수있는 매우 강력한 기술이다 ​​확인직접 복잡한 소스에서 개미.

그림 1
Immunotubes을 활용 그림 1. 부정적인 Biopanning 프로세스. 회로도 부정적인 biopanning 과정을 보여주는. 이러한 BSA, 집계 알파 - 시누 클레인과 immunotubes를 사용하여 제거 건강한 뇌 조직 등 단백질에 반응하는 파지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도 2 네거티브 패닝 결과 확인. AFM 영상은 모든 반응성 파지가 제거되도록하여 다양한 대상에 대해 네거티브 패닝 단계를 모니터링하는 데 사용된다. 여기에서 우리는 시연 AFM 결과의 일부를 보여이전과 부정적인 패닝 후 파지 결합의 수준입니다. (A) 파지는 부정적인 패닝의 첫 번째 라운드 후 집계 된 알파 - 시누 클레인 입자를 검출 할 수있다 결합하지만, (B)없이 파지는 부정적인 패닝의 8 라운드 후 볼 수 있습니다. (C를 ) 바인딩 건강한 조직 파지에 대한 부정적인 패닝의 첫 번째 라운드가 분명하지만, (D) 구속력이 부정적인 패닝의 10 라운드 감지되지 후. 모든 이미지는 5 μm의입니다. AFM 이미지에 큰 흰색 구조는 일반적으로 파지 생산 중 PEG 침전 단계에서 버퍼 또는 잔류 PEG에 존재하는 염에 기인한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 부정적인 Biopann프로세스 운모를 활용을 보내고. 운모를 사용하여 회로도 시연 추가 부정적인 biopanning는. 한계 때문에 샘플 운모 표면에 바인더 건강 제를 제거하기 위해 채용 된 후는 FTD TDP-43 면역 침전. FTD TDP-43에 대한 부정적인 패닝의 두 라운드로 진행하기 전에, 파지 (긍정적 인 패닝 단계에서 ALS의 TDP-43 전용 파지의 실패 분리의 경우에) 반으로 분할됩니다. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.

그림 4
그림 4. ALS 긍정적 Biopanning 프로세스. 회로도 ALS 긍정적 인 biopanning 과정을 보여주는. FTD TDP-43에 대한 부정적인 패닝 후 언 바운드 파지는 TDP-43가 용출 ALS에 대한 긍정적 인 패닝의 라운드에 사용되는 더 ALSTDP-43 특정 클론. 또한, ALS TDP-43에 대한 긍정적 인 패닝 두 차례 운모 표면과 건강이 파지 건강 TDP-43에 결합하지해야하기 때문에 TDP-43 (바운드 파지가 용출 면역 그러나 일부에 대한 부정적인 패닝 후 언 바운드 파지를 사용하여 수행됩니다 ALS와 FTD) 모두 교차 반응 할 수있다. 세 용출 방법이 모두 결합 된 파지를 제거하기 위해 (트립신, 차 TG1 세포)를 사용한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
균질화 된 인간의 ALS, FTD 우리가 다른 클론에서 생산 파지를 사용하여 간접 ELISA를 수행 건강한 뇌 조직 (HT) 샘플을 사용하여 잠재적 인 ALS 클론 (HT 대 ALS). 그림 5. 파지 ELISA 상영. 결과는 표시됩니다 건강한 조직 샘플에 대한 비율로서. 결과는 일부 클론 ALS 환자와 건강에 그에서 발견 TDP-43 구분 것으로 나타났다. ALS, FTD와 HT 조직이 세 개인의 뇌 샘플 (운동 피질)의 혼합이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6. 잠재적 인 ALS 클론의 파지 ELISA 상영 (FTD 대 루게릭 병). 여기에서 우리는 FTD 환자 대 ALS의 파지 ELISA 결과를 보여줍니다. 클론의 대부분은 FTD을 통해 ALS에 대한 선호를 가지고있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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잠재적 인 ALS 클론 (HT 대 ALS)의 그림 7의 scFv ELISA 심사는. 우리는 TDP-43 건강 이상 ALS 환자의 선호가 클론을 관찰 할 수있는 각각의 클론에서 생산 scFvs 사용. 여기를 클릭하십시오 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 이 그림의.

그림 8
잠재적 인 ALS 클론의 그림 8. scFv를 ELISA 심사 (FTD 대 ALS) 간접 ELISA를에서 다른 scFvs에 대한 FTD에 ALS를 비교할 때. 우리의 팬 프로세스의 성공을 추가로 설명된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

방법 "> 그림 9
그림 잠재적 인 ALS 클론의 9 점의 얼룩 분석. 대신 ELISA의 점 오점 사용은 FTD 또는 HT를 통해 ALS에 대한 클론의 특이성을 보여주는 또 다른 기술이다. 복제 2A가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Acknowledgments

이 연구는 NIH의 연구비 지원 : R21AG042066. 우리는 화면 캡처 비디오를 만드는 그의 공헌 필립 슐츠에게 감사의 말씀을 전합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tomlinson I and J Libraries MRC (Cambridge, England)
Sheets Library MRC (Cambridge, England)
2xYT BD Sciences 244020
Glucose Amresco 0188-2.5KG
Ampicillin Amresco 0339-25G Irritant
KM13 Helper Phage MRC (Cambridge, England)
Kanamycin OmniPur 5880 Irritant
Polyethylene Glycol 8000 OmniPur 6510 Irritant
Sodium Chloride Macron 7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic Amresco 0404-1KG Irritant
Potassium Chloride EMD PX1405-1 Irritant
Potassium Phosphate Monobasic Amresco 0781-500G Irritant
TG1 Cells MRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani Agar EMD 1.10283.0500
Bovine Serum Albumin Amresco 0332-100G
STEN buffer Crystalgen Inc. 33429775
Immunotubes Thermo Scientific 470319
Mica Spruce Pine Mica 24365
Tween 20 EMD
Trypsin Sigma T-0303 Irritant
Triethylamine Sigma T-0886 Flammable
Glycerol Amresco 0854-1L Irritant
DNA Plasmid Prep Kit qiagen 27106 Irritant
Non-Fat Milk Powder Carnation
96-Well High Binding ELISA Plate Costar 3590
Anti-M13 HRP GE Healthcare Life Sciences 27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit Thermo Scientific 37074
Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody ProteinTech 10782-2-AP
A/G Agarose Beads Santa Cruz Biotechnology sc-2003
HB 2151 Cells MRC (Cambridge, England)
Isopropylthiogalactoside Teknova 13325
9e10 HRP Santa Cruz Biotechnology sc-40
Nitrocellulose Membrane Biorad 162-0115 Flammable
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope Veeco
AFM Probes VistaProbes T300R-10

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References

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