Novel microscopia a forza atomica Based biopanning per isolamento di Morfologia reagenti specifici contro TDP-43 varianti di Sclerosi Laterale Amiotrofica

1School for Engineering of Matter, Transport and Energy, Arizona State University, 2Department of Neurology, Georgetown University Medical Center, 3Department of Pathology, Georgetown University Medical Center
Bioengineering

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Williams, S. M., Venkataraman, L., Tian, H., Khan, G., Harris, B. T., Sierks, M. R. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (96), e52584, doi:10.3791/52584 (2015).

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Abstract

Perché varianti proteiche svolgono un ruolo critico in molte malattie, tra cui TDP-43 in Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA), l'alfa-sinucleina in di malattia e beta-amiloide e tau nella malattia di Alzheimer, è di fondamentale importanza per lo sviluppo morfologia reagenti specifici che possono selettivamente indirizzare Parkinson questi proteina specifica malattia varianti per studiare il ruolo di queste varianti in patologia della malattia e per le potenziali applicazioni diagnostiche e terapeutiche. Abbiamo sviluppato la microscopia a forza atomica (AFM) tecniche biopanning basate nuove che permettono l'isolamento di reagenti che riconoscono selettivamente varianti proteiche malattie specifiche. Ci sono due fasi chiave coinvolti nel processo, le fasi panning negativi e positivi. Durante la fase di panning negativo, fagi che sono reattivi agli antigeni fuori bersaglio vengono eliminate attraverso vari cicli di panning sottrattiva utilizzando una serie di accuratamente selezionati antigeni fuori bersaglio. Una caratteristica fondamentale in senso negativofase panning sta utilizzando l'imaging AFM per monitorare il processo e verificare che tutte le particelle dei fagi indesiderate vengono rimossi. Per la fase di panning positiva, l'antigene bersaglio di interesse è fissato su una superficie di mica e fagi legati sono eluiti e proiettati per identificare fagi che si legano selettivamente l'antigene bersaglio. La variante proteina bersaglio non deve essere purificato fornire sono stati utilizzati gli appropriati controlli negativi panning. Anche bersaglio varianti proteiche che sono presenti solo a concentrazioni molto basse di materiale biologico complesso possono essere utilizzati nella fase di panning positivo. Attraverso l'applicazione di questa tecnologia, abbiamo acquisito anticorpi varianti proteiche di TDP-43 che si trovano selettivamente nel tessuto cerebrale ALS umano. Ci aspettiamo che questo protocollo dovrebbe essere applicabile ai reagenti generazione che si legano selettivamente varianti proteiche presenti in una vasta gamma di diversi processi biologici e malattie.

Introduction

La presenza di varianti proteiche è stato implicato come fattore nella progressione di molte malattie, tra cui le malattie neurodegenerative come l'Alzheimer, il Parkinson, SLA e demenza frontotemporale (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. Forme oligomerici di proteine ​​beta-amiloide e alfa-sinucleina si pensa siano le specie tossiche responsabili della malattia di Alzheimer e di Parkinson, rispettivamente, 2,3,4,5. Aggregati del TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) sono stati legati alla SLA e FTD 12,13,14. Reagenti Quindi come gli anticorpi che possono selettivamente colpiscono le diverse varianti proteiche possono essere potenti strumenti per servire come marcatori diagnostici e potenziali terapie. In questo studio, ci siamo concentrati sullo sviluppo di reagenti che si legano selettivamente varianti del TDP-43 proteina implicata nella SLA, tuttavia la tecnica descritta in questo documento dovrebbe essere applicabile all'isolamento di reagenti contro una vasta gamma di protVarianti ein.

Aggregazione citoplasmatica di TDP-43 è stato identificato come una caratteristica patologica nella SLA 15,16,17,18,19. Tipicamente TDP-43 si trova nel nucleo di tutte le cellule di un individuo normale, anche se tende a spostarsi tra citosol e nel nucleo 15,17. Forme Tuttavia, in ALS aggregati di TDP-43 vengono rilevati nel citoplasma di selezionare neuroni e glia con basse concentrazioni riscontrate nel nucleo suggerire il movimento di TDP-43 dal nucleo al citoplasma durante la progressione della malattia 16,20. Mentre aggregazione di TDP-43 si trova nella maggior parte dei casi di SLA, che non tiene conto di tutti i casi dal 1% -2% del totale casi di SLA (o 15% -20% dei casi di SLA familiare) sono collegate a mutazioni nel superossido dismutasi 1 (SOD1) gene 15,17. A causa del ruolo importante di TDP-43 nella maggior parte dei casi di SLA, qui ci concentriamo sullo sviluppo di anticorpi reattivi based che può selettivamente legarsi al TDP di 43 varianti che sonopresente in tessuto cerebrale SLA umano utilizzando le nostre tecniche biopanning basato romanzo AFM.

Inizialmente abbiamo bisogno di un vasto repertorio di domini di legame anticorpo. Abbiamo unito tre singola catena di frammenti di anticorpi dominio variabile phage display diverso librerie (scFvs), (Tomlinson I e J e biblioteche Sheets 21). Il processo di panning è diviso in fasi panning negativi e positivi. Fagi dalle librerie vengono prima sottoposti al processo di panning negativo durante il quale fagi reattivo sono esclusi antigeni multipli fuori bersaglio. Dopo il completamento di ogni turno di panning negativo contro l'antigene di fuori bersaglio, il processo è monitorato da immagini AFM per assicurare che tutte vincolanti gli antigeni fuori bersaglio fago sono stati rimossi. Solo dopo aver verificato da AFM immagini che tutti i fagi reattivi vengono rimossi dobbiamo procedere al prossimo obiettivo. Per isolare i reagenti contro TDP-43 varianti implicati nella SLA abbiamo utilizzato i seguenti antigeni panning negativi: 1) BSA per rimuovere fago che legano debolmente o non specificamente alle proteine; 2) aggregati di alfa-sinucleina per rimuovere fago che si legano a elementi strutturali generici di proteine ​​aggregate; 3) omogenati di tessuto cerebrale umano per rimuovere fago che legarsi agli proteine ​​o altri componenti presenti nei campioni post-mortem del tessuto cerebrale umano sano; 4) immunoprecipitato TDP-43 dal cervello umano sano di rimuovere fago che si legano a tutti TDP-43 forme associate con il cervello umano sano; e 5) immunoprecipitata TDP-43 isolato da FTD omogenati di cervello per rimuovere fago che legano TDP 43-varianti associate con i non-ALS patologia. Dopo la rimozione di tutto fago reattiva a tutti gli antigeni bersaglio off, si è quindi proceduto alla fase panning positiva durante la quale i frammenti di anticorpi che legano l'antigene di interesse sono isolati, in questo caso TDP-43 immunoprecipitato da tessuto cerebrale umano ALS. Questi anticorpi isolati possono essere reattivi a forme aggregate o modificate di TDP-43.

"> Convenzionale fago biopanning concentra principalmente sulla fase panning positiva 22,23. Solitamente il bersaglio di interesse è immobilizzato, la libreria fagica aggiunto e fagi legati eluito. I fagi sono poi amplificati e aggiunto al bersaglio di nuovo. Questo processo di amplificazione e l'incubazione di solito è ripetuta più volte per aumentare la percentuale di fago legame positivo. Mentre variazioni di questo processo sono stati ampiamente utilizzati per isolare anticorpi reattivi contro un'ampia gamma di antigeni bersaglio, generalmente richiede grandi quantità di antigene purificato bersaglio 24,25,26, 27, mentre il nostro processo richiede in tracce l'antigene bersaglio. Il protocollo qui descritto può essere usato per isolare reagenti antigeni bersaglio selettivamente bind che sono presenti a concentrazioni molto basse, senza la necessità di purificazione e il panning possono essere eseguite direttamente contro antigene presente in campioni di tessuto complesse. L'uso di protocolli di panning negativi esaustivi, verificatada AFM assicura che i cloni isolati contro l'antigene positivo dovrebbe legare selettivamente l'obiettivo anche quando non purificato o arricchito.

Kasturirangan e colleghi (2003) hanno effettuato un simile processo biopanning negativo e positivo di isolare anticorpi reattivi di oligomeri di beta-amiloide con concentrazione nanogrammo dell'obiettivo 5. Qui abbiamo espandere su questo processo per consentire la generazione di reagenti che legano selettivamente proteina specifica malattia varianti direttamente da campioni di tessuto umano. In studi futuri intendiamo approfondire non solo il valore diagnostico dei reagenti isolato qui, ma anche valutare la loro rilevanza terapeutica per il trattamento della SLA.

Nel complesso, la nostra nuova tecnologia AFM biopanning base dovrebbe essere applicabile all'isolamento di qualsiasi malattia-specifica variante di proteine ​​in qualsiasi materiale biologico senza la necessità di purificazione delle proteine ​​o modifica, anche quando il bersaglio antigene concentrations sono estremamente basse.

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Protocol

1. Phage Produzione

  1. Eseguire tutti i processi produttivi fago e biopanning in un armadio biosicurezza. Produrre fagi particelle delle diverse librerie (librerie Tomlinson I e J e fogli di biblioteca 21) per il processo biopanning utilizzando le istruzioni del produttore (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
    NOTA BENE: Usiamo più librerie nel nostro processo di panning per aumentare la diversità degli anticorpi disponibili.
  2. Brevemente, batteri cultura scorte dei tre librerie in 200 ml di 2xYT contenente 1% di glucosio e 100 ug / ml di ampicillina su agitatore a 37 ° C fino OD 600 è 0,4.
  3. Aggiungere 8 x 10 11 di KM13 helper phage a 200 ml di librerie Tomlinson I e J e 8 x 10 11 di VCSM13 helper phage a 200 ml della biblioteca fogli. Incubare i campioni biblioteca con fago helper per 30 minuti a 37 ° C senza agitazione.
  4. Centrifuga laculture a 3.000 xg per 10 min e risospendere il pellet cellulare in 200 ml di 2xYT con 0,1% di glucosio, 100 ug / ml di ampicillina e 50 ug / ml di kanamicina.
  5. Incubare le culture O / N a 30 ° C con agitazione e poi girare per 30 minuti a 3.300 xg il giorno seguente.
  6. Aggiungere 50 ml di polietilene glicole (PEG) 8000 in 2,5 M NaCl ai 200 ml di surnatante da ciascuna delle librerie e incubare in ghiaccio per 1 ora. Dopo precipitazione PEG, girare le soluzioni ancora per 30 min a 3300 x g.
  7. Aggiungere 1-2 ml di tampone fosfato salino (PBS) al pellet (a seconda delle dimensioni del pellet) e trasferimento in provette da microcentrifuga.
  8. Incubare particelle fagiche in ghiaccio per 1 ora a 37 ° C con miscelazione occasionali prima centrifugazione per 10 min a 11.600 x g. Raccogliere il surnatante e conservare a -80 ° C.
  9. Prima di congelamento, il trasferimento di un piccolo volume di particelle fagiche dalle tre librerie a un'altra provetta e titolare ciascun bibliotecautilizzando singolarmente cellule TG1 per determinare la concentrazione. Segue una descrizione del processo titolo per una libreria.
    1. Crescere cellule TG1 a OD 600 di 0,4. Aggiungere 990 ml di PBS a 6 tubi microcentrifuga.
    2. Per il primo tubo di aggiungere 10 ml di particelle fagiche. Dopo la miscelazione, togliere 10 ml di tubo uno e aggiungere al tubo 2. Ripetere questa operazione per i restanti 4 tubi.
    3. Aggiungere 200 microlitri di cellule TG1 a 6 provette e aggiungere 10 ml di ciascuna delle sei diluizioni fagiche a questi tubi. Lasciare le particelle dei fagi di infettare per 30 minuti senza agitazione a 37 ° C.
    4. Piatto 100 ml di cellule unto Luria-Bertani agar piastre con 100 mg / ml di ampicillina (LBA). Incubare O / N a 37 ° C e quindi determinare la pfu / ml utilizzando il numero di colonie visibili.

2. Negativo Process biopanning

NOTA: Evitare troppi disgelo congelamento dei fagi durante tutto il processo biopanning. Ideally, è meglio effettuare il maggior numero di passaggi panning negativi come possibile in un giorno. Dopo il completamento dei cicli di panning negativa o positiva contro l'obiettivo è importante per risparmiare del fago in caso di contaminazione in ogni fase.

  1. 12 Rounds di Panning negativo contro albumina sierica bovina (BSA)
    1. Aggiungere 4 ml di 1 mg / ml soluzione BSA in PBS a 12 immunotubes e incubare O / N a 4 ° C.
    2. Combinare 1 x 10 12 particelle fagiche da ciascuno dei tre librerie (annullare una piccola quantità di questa miscela fago per futura verifica del processo di panning negativo).
    3. Eliminare la soluzione BSA dal primo tubo e lavare il tubo 2-3 volte con PBS per rimuovere non legato BSA.
    4. Aggiungere le librerie fagiche combinate a questo primo tubo, incubare per 30 minuti a RT sul rotatore e raccogliere i fagi legati.
    5. Ripetere passo 2.1.3 con il secondo immunotube e aggiungere il fago raccolti dal punto 2.1.4 a questo immunotube. Ripetere il punto 2.1.4.
    6. Ripetere 2.1.3-2.1.4 con i restanti 10 tubi di soluzione BSA e il fago non legato raccolto dopo ogni incubazione.
    7. Per verificare la rimozione di tutti i leganti BSA fagi usare AFM. Aggiungere 10 ml di fago dal punto 2.1.2 e 10 ml di fago rimanente dopo passo 2.1.7 separatamente a 10 mg / ml di BSA legati a mica spaccati. Una breve versione del processo AFM è delineato nel paragrafo 8.
    8. È importante salvare una piccola quantità di fago dopo aver terminato i numerosi cicli di panning negativa contro ogni bersaglio per verificare il successo del processo di panning.
  2. 10 Viaggi di Panning Negative contro varie forme di alfa-sinucleina
    NOTA: In questo progetto, vogliamo rimuovere fago che potrebbero legare altre forme aggregate di proteine ​​come alfa-sinucleina (monomero, dimero, trimero, ecc) e quindi dovremo eliminare qualsiasi di questi fagi (l'obiettivo è quello di eliminare il molti fagi cross-reattivi possibile). Lasciare purificato alfa-sinucleina per aggregare per almeno 7 giorni in modo che entrambe le forme monomeriche e oligomeriche sono presenti per panning negativo.
    1. Preparare 4 immunotubes con 500 mg / ml di aggregati di alfa-sinucleina in PBS e 4 immunotubes con 100 ug / ml di aggregati alfa-sinucleina e incubare O / N a 4 ° C.
    2. Eliminare la soluzione di uno dei tubi con 500 mg / ml di aggregati alfa-sinucleina, lavare con PBS e aggiungere la libreria fagica raccolti dopo i 12 giri di negativo panning con BSA.
    3. Incubare la provetta per 30 minuti a RT sul rotatore e raccogliere i fagi legati.
    4. Ripetere i punti 2.2.3 e 2.2.4 per i restanti tubi con 500 mg / ml di aggregati alfa-sinucleina e poi i tubi con 100 ug / ml di aggregati alfa-sinucleina utilizzando il fago non legato raccolto dopo ogni passo 2.2.4.
    5. Ripetere il passaggio 2.1.8 utilizzando il fago dopo la prima di panning negativa contro 500 mg / ml di alfa aggregato-synuclein e il fago dopo l'ottava prova del panning negativa contro 100 mg / ml di alfa-sinucleina.
    6. Per eliminare tutti i leganti negative contro l'alfa-sinucleina preparare due immunotubes extra con 500 mg / ml di aggregati alfa-sinucleina e ripetere i passaggi 2.2.2-2.2.4.
  3. 10 Viaggi di Panning Negative contro Healthy Human Brain Tissue Omogenato
    1. Aggiungere 1x tampone STEN (Tris 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 0,2% NP-40, 0,2% BSA, 20 mM PMSF e proteasi cocktail inibitore) di tessuto cerebrale umano 28. Omogeneizzare a 24.000 rpm per 1 min, centrifugare i campioni a 3.000 giri e raccogliere il surnatante.
    2. Preparare 2 immunotubes con 2 ml di 50 mg / ml di tessuto cerebrale umano in PBS e 8 immunotubes con 10 ug / ml di tessuto cerebrale umano e incubare O / N a 4 ° C.
    3. Ripetere i passaggi 2.2.3-2.2.5 prima con le provette contenenti 50 mg / ml di tessuto cerebrale umano e poi con quelli contenenti 10 mg / ml di b umanatessuti di pioggia con il fago non legato raccolti dopo il panning negativa contro l'alfa-sinucleina.
    4. Ripetere il passaggio 2.1.8 utilizzando il fago dopo la prima di panning negativa contro 50 mg / ml di tessuto cerebrale umano e il fago dopo il decimo turno di panning negativa contro tessuto cerebrale umano.
  4. 8 Viaggi di Panning Negative contro Healthy immunoprecipitati TDP-43
    1. Immunoprecipitare sano TDP-43 proteine ​​dal tessuto cerebrale umano sano utilizzando il protocollo descritto nella sezione 9. A causa della minore quantità di proteine ​​immunoprecipitate, effettuare questi giri di panning negativo utilizzando mica.
    2. Cleave otto superfici di mica.
    3. Per il primo mica aggiungere ~ 100 microlitri di 5 ug / ml di proteine ​​immunoprecipitate e incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
    4. Lavare la mica 5 volte con il 0,1% di PBS con Tween 20 (PBST).
    5. Aggiungi ~ 100 ml di fago dopo il pan negativo contro il tessuto cerebrale sano e incubare per 5-10 minuti aRT.
    6. A metà di incubazione passo 2.4.5, eseguire il punto 2.4.3 utilizzando il secondo mica.
    7. Raccogliere il fago dal punto 2.4.5 e lavare la mica 5 volte con 0,1% PBST.
    8. Lavare mica dal punto 2.4.6 e aggiungere il fago da 2.4.7.
    9. Ripetere i punti 2.4.4 a 2.4.9 fino a quando il fago viene stroncato negativamente contro ogni otto mica con la proteina immunoprecipitato. Ripetere il passaggio 2.1.7 utilizzando il fago dopo la prima e otto round di panning negativo.
  5. 2 Colpi di Panning negativa contro FTD immunoprecipitati TDP-43
    1. Immunoprecipitare TDP-43 proteina dal cervello di individui con FTD.
    2. Cleave 2 superfici di mica.
    3. Aggiungere 50 ml di 10 mg / ml di FTD TDP-43 ad uno mica. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
    4. Lavare la mica 5 volte con 0,1% PBST.
    5. Aggiungere 50 ml del fago raccolti dopo panning negativo contro sana TDP-43. Incubare per 5 min.
    6. Raccogliere i fagi non associate.
    7. Repeats passaggi 2.5.3 a 2.5.6 con la seconda mica e il fago non legato raccolti in 2.5.6.

3. Positive Panoramica contro immunoprecipitati TDP-43 da individui con SLA

  1. Immunoprecipitare TDP-43 proteina dal cervello di individui con SLA. Cleave 3 superfici di mica. Aggiungere 50 ml di 10 mg / ml di SLA TDP-43 ad uno mica. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare la mica 5 volte con 0,1% PBST.
  2. Aggiungere 50 ml del fago raccolti dopo panning negativo contro sana TDP-43 alla mica. Incubare per 5 min.
  3. Raccogliere i fagi non associate. Raccogliere anche i fagi legati con tre metodi di eluizione. E 'importante mantenere tutti i fagi raccolti in questi passaggi panning separati.
    1. Innanzitutto, aggiungere 50 ml di tripsina (1 mg / ml in PBS) per ciascun mica e incubare per non più di 10 min. Raccogliere la soluzione e salvare. Successivamente, aggiungere 50 ml di trietilammina mM 100 (TEA) a ciascun mica e incubare per non più di 10 min. Collect la soluzione, aggiungere uguale volume di 1 M Tris-HCl a pH 7.4 e risparmiare.
    2. Terzo, aggiungere 50 ml di TG1 a OD 600 di 0,4 direttamente alla mica e incubare per 30 min a 37 ° C. Aggiungere anche i fagi raccolti dai due metodi di eluizione in 3.3.1 a 100 ml di TG1 a OD 600 di 0,4 e incubare per 30 min a 37 ° C.
  4. Ripetere i passaggi 3.1 con un secondo mica.
  5. Prendete il fago non legato raccolti in 3.3.2. utilizzando il primo mica con ALS TDP-43 e aggiungerlo al secondo mica con ALS TDP-43. Incubare per 5 min.
  6. Ripetere tutti i passi in 3.3 per questi seconda serie di mica.
  7. Unire le cellule TG1 infettate con i fagi eluiti con tripsina dai due ALS TDP-43 mica e piastra su piastre LBA. Ripetere la stessa procedura per il TEA e TG1 eluito fagi da due ALS TDP-43 mica per un totale di tre piastre.
    NOTA: A causa del coinvolgimento di TDP-43 sia in SLA e FTD, alcuni dei cloni isolati indue turni di panning positivo contro la SLA TDP-43 possono essere specifiche per questo obiettivo, ma alcuni possono anche legarsi FTD. Per isolare meglio ALS cloni specifici, prendere il fago non legato raccolte dopo 2 giri di panning negativo contro FTD TDP-43 (poiché questi due cicli di panning negativo avrebbero dovuto essere rimosso in qualsiasi destinazione che è reattivo a FTD TDP-43) e utilizzare queste fagi in un ulteriore ciclo di panning positiva contro la ALS TDP-43 antigene mica (preparare l'ALS TDP-43 mica come descritto sopra in 3.3 e 3.4).
  8. Ripetere tutti i passi in 3.3 con questo terzo mica ALS e piastra le cellule infette TG1 su tre piatti LBA O / N a 37 ° C. Il giorno successivo contare il numero di colonie sui 6 piatti LBA con i potenziali cloni SLA. Ci dovrebbe essere un minor numero di colonie sulle tre piastre LBA con i potenziali cloni ALS dopo il terzo turno di panning positivo rispetto ai tre piastre LBA dopo i due turni di panning positivo.

4. coltura e Phage prodottoion di potenziali cloni positivi contro la SLA specifica TDP-43

  1. Grow ogni colonia dalle 6 piastre in piastre da 96 pozzetti contenenti 100 ml di 2xYT con 1% di glucosio e 100 ug / ml di ampicillina su agitatore a 37 ° CO / N.
  2. Il trasferimento successivo giorno 10 ml dai pozzetti contenenti i cloni delle 3 piastre LBA dopo il terzo turno di panning positivo con l'ALS TDP-43 proteine ​​per microprovette contenenti 1 ml di 2xYT con 1% di glucosio e 100 ug / ml di ampicillina .
  3. Aggiungere glicerolo a tutte le colture nelle piastre a 96 pozzetti ad una concentrazione finale del 15% e congelare le piastre a -80 ° C. Lasciare le 1 ml culture a crescere per 2-3 ore agitazione a 37 ° C.
  4. Aggiungere 10 9 di KM13 helper fago e consentire il fago helper di infettare per 1 ora a 37 ° C con agitazione. Centrifugare le cellule per 10 min a 3000 xg, scartare il surnatante e aggiungere 1 ml di 2xYT con 0,1% di glucosio, 100 ug / ml di ampicillina e 50 ug / ml di Kanamycin.
  5. Coltivare le cellule O / N a 30 ° C con agitazione. Centrifugare le provette a 3.300 xg per 30 minuti, trasferire il surnatante in nuovi tubi microcentrifuga e aggiungere 250 microlitri PEG / NaCl ad ogni provetta.
  6. Incubare le provette in ghiaccio per 1 ora. Centrifugare le provette di nuovo a 3.300 xg per 30 minuti, scartare il surnatante e aggiungere 100 ml di soluzione salina in ogni provetta.
  7. Incubare le provette in ghiaccio per 1 ora. Gira le provette per 10 minuti a 11.600 xg e trasferire il surnatante in nuovi tubi. Conservare i fagi a -80 ° C.

5. Sequenziamento dei potenziali ALS Clones

  1. Ripetere il passaggio 4.2 e permette di culture a crescere O / N a 37 ° C con agitazione. Il giorno successivo effettuare preparazioni plasmide DNA dei cloni secondo le istruzioni del produttore. Sequenza dei cloni utilizzando l'apposito avanti e indietro primer.

6. Screening potenziali cloni positivi contro la SLA specifica TDP-43 Uso indiretto ELISA

  1. Aggiungere 100 ml di 2,5 mg / ml di SLA, FTD e tessuto sano del cervello umano per i pozzetti di una piastra ELISA alto vincolante per ciascun potenziale clone SLA. Incubare le piastre a 37 ° C per 1 ora con lenta agitazione.
  2. Lavare le piastre 3 volte con 0,1% PBST. Aggiungere 200 ml di 2% latte in polvere in PBS per pozzetto ed incubare le piastre a 37 ° C per 1 ora con lenta agitazione.
  3. Ripetere la fase di lavaggio e poi aggiungere 100 ml di ogni fago diluito almeno 1/100 in PBS ai pozzetti. Dopo l'incubazione e lavare passi, aggiungere 100 ml di 1 / 1.000 anti-M13 HRP in ogni pozzetto. Lavare le piastre e visualizzare utilizzando il kit di supporto chemiluminescenza femto ELISA.

7. scFv Produzione e screening utilizzando indiretta ELISA

  1. Crescere HB 2151 cellule per OD 600 di 0,4. Aggiungere 5 ml di diverse fagi a 20 ml di cellule HB 2151. Lasciare i fagi 30 min a infettare a 37 ° C senza agitazione. Dividere piastre LBA nelle reti in modoche circa 20 cloni possono essere placcati su ciascuno.
  2. Aggiungere 5-10 ml di ogni fago infetta i batteri alla piastra e incubare O / N a 37 ° C. Il giorno successivo aggiungi singole colonie a 1 ml di 2xYT con 0,1% di glucosio e 100 ug / ml di ampicillina e agitare a 37 ° C per 3-4 h fino OD 600 è 0,6.
  3. Aggiungere 1 ml di 1 M isopropylthiogalactoside (IPTG) a ciascuna provetta e incubare O / N a 30 ° C con agitazione. Spin le provette a 11.600 xg per 10 min e il supernatante raccolto per il test ELISA.
  4. Per il test ELISA seguire le stesse procedure di cui al punto 6, tranne che invece di fago in 6.5 aggiungere il scFv diluito e per 6,6 aggiungere 100 ml di 1 / 1.000 9E10 HRP.

8. AFM Process

  1. Aggiungere 10-20 ml di antigene bersaglio di mica spaccati e incubare per 5-10 min. Lavare la mica 5 volte con acqua. Aggiungere 10-20 ml di fagi al mica e incubare per 5-10 min.
  2. Lavare la mica 5 volte wi nuovoth acqua e lasciare la mica asciugare all'aria. Visualizza fago legame con AFM 1. Eseguire il processo di imaging AFM con AFM modalità toccando con un controller Nanoscope IIIa in aria a RT 29. Le sonde AFM silicio hanno una frequenza di risonanza di 300 kHz e una costante elastica di 40 N / m. Utilizzare una velocità di scansione di 3,05 Hz e una risoluzione di scansione di 512 campioni / linea.
  3. Elaborare le immagini di appiattimento base dello sfondo per garantire che tutte le dimensioni delle particelle sono comparabili all'interno di ogni immagine. Larghezza Phage (non lunghezza) può variare in base all'immagine dovuto altre dimensioni delle particelle e l'area di scansione, ma non potrà mai compromettere la precisione o meno fago lega all'antigene.
  4. Se durante la verifica AFM per ogni set di fagi panning negativi sono visibili sulla mica, effettuare giri aggiunta fino a quando non fagi vengono rilevati prima di procedere alla prossima serie di panning negativo.

9. Immunoprecipitazione di Target Antigen

  1. Per isolate l'antigene bersaglio (TDP-43), aggiungere 250 mg di tessuto cerebrale omogeneizzare (dalla corteccia motoria), 100 ml di 1/100 diluizione della anti-TDP 43 policlonale anticorpi e 1x STEN buffer per 700 microlitri volume totale di un Eppendorf tubo 28.
  2. Incubare O / N a 4 ° C su un rotatore. Wash A / G agarosio con 1x STEN buffer di 2-3 volte e aggiungere 25 ml di miscela di tessuto. Incubare a 4 ° C per 1,5 h su un rotatore e centrifugare a 2.000-4.000 rpm per 1 min.
  3. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet una volta con 1x tampone STEN e 5 volte con PBS. Aggiungere 40-60 ml di tampone 1x STEN al pellet e far bollire per 5 min. Dopo i campioni sono fresche, centrifugare e raccogliere il surnatante. Utilizzare SDS-PAGE e Western blotting per verificare il successo del processo di immunoprecipitazione 30.

10. Dot Blot Analysis

  1. Tagliare la carta di nitrocellulosa in piccoli rettangoli per ogni clone che saranno testati. Dot 2 ml di SLA, FTD e campioni di tessuto cerebrale umano sano unto la carta di nitrocellulosa e lasciare asciugare completamente.
  2. Aggiungere 1-2 ml di 5% di latte in polvere in PBS e lasciate agitare per 1 ora a temperatura ambiente. Aggiungere 1 ml di 1/100 di diluizione di ogni fago e lasciate scuotere O / N a 4 ° C. Lavare la membrana 3 volte per 10 minuti ciascuno con 0,5% PBST.
  3. Aggiungere 1 ml di 1 / 1.000 diluizione anti-M13 HRP e lasciarlo agitare per 1 ora a temperatura ambiente. Ripetere la procedura di lavaggio e visualizzata usando la soluzione chemiluminescenza occidentale.

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Representative Results

Nella figura 1, lo schema illustrato il processo di panning negativo con cui abbiamo rimosso fago vincolante antigeni fuori bersaglio della nostra biblioteca con immunotubes. Inizialmente abbiamo iniziato con BSA in quanto si tratta di un agente bloccante comune e qualsiasi fago che reagiscono in maniera non specifica con questo obiettivo sarebbe problematico in saggi immunologici futuri. Quindi, abbiamo rimosso leganti a aggregata alfasinucleina per eliminare fago che sono reattivi con strutture generiche di proteine ​​aggregate (cioè, un anticorpo che sarebbe cross-reattivo a aggregata alfasinucleina, TDP-43, Abeta, etc.). Risultati AFM hanno mostrato vincolante dopo 1 round di panning negativa contro aggregato alfa-sinucleina (Figura 2A) e non vincolante dopo 8 turni (Figura 2b) fago. Abbiamo poi stroncato negativamente contro il tessuto cerebrale umano sano per rimuovere vincolante molti antigeni presenti nel sano omogenato cervello umano fago. Figura 2C (Figura 2D). Poiché la quantità di sano e FTD immunoprecipitato TDP-43 proteina disponibile per panning era basso, utilizzando mica piuttosto che immunotubes utilizzati volume inferiore e quindi abbassati proteine ​​consumate totale (Figura 3). Dopo 8 turni di panning negativo contro sana TDP-43 immunoprecipitate, il fago è stato diviso. Metà del fago è stato speso in due turni di panning negativo contro FTD TDP-43. L'obiettivo era quello di eliminare eventuali FTD TDP-43 cloni reattivi (a causa del coinvolgimento di TDP-43 in FTD), mantenendo i potenziali ALS TDP-43 cloni specifici.

Per la porzione panning positivo (Figura 4), ​​abbiamo anche impiegato mica come substrato per minimizzare l'uso di materiale. Abbiamo usato il fago non legato dopo il panning negativo FTD TDP-43 contro la SLA TDP-43 per acquisire qualsiasiALS cloni specifici. Abbiamo anche positivamente stroncato contro la SLA TDP-43 per due volte nel caso in cui non abbiamo fatto ottenere cloni dopo aver usato il fago non legato dal panning negativa contro FTD TDP-43. Dopo tutto il processo di panning, i nostri tre metodi di eluizione produssero 154 cloni dai due panning positivo contro SLA TDP-43 (cloni che possono essere reattivi per SLA e FTD) e 45 potenziali cloni specifici SLA (con il fago non legato dal FTD TDP- 43 panning negativo).

Per ridurre ulteriormente i 45 potenziali cloni specifici SLA, i cloni sono in sequenza e solo i cloni senza alcun codoni di stop sono stati considerati più, ad eccezione di un clone che ha mostrato due volte. Questo ci ha lasciato con 23 potenziali cloni specifici SLA. Dopo la preparazione sia del fago e scFv solubili con questi cloni, sono testati in ELISA indiretti per la specificità al tessuto SLA. Quasi tutti i fagi mostrato una preferenza per il tessuto ALS, nel tessuto sano (Figura 5). Risultati simili sono OBTained quando si confrontano legame ALS al tessuto FTD fago (Figura 6). Per gli studi futuri è essenziale che questi cloni esprimono alti rendimenti di scFv funzionali, quindi abbiamo prodotto piccoli lotti di diversi scFv ed eseguita ELISA indiretto simili. Confronto di scFv legame al tessuto ALS sia sano (Figura 7) e FTD tissutale (Figura 8) ha mostrato ancora selettiva legame al tessuto ALS in quasi tutti i cloni.

Abbiamo usato un test immunologico (macchie dot) per verificare ulteriormente legame al tessuto SLA e anche per accertare che i cloni sono reattivi in ​​altre applicazioni immunologiche. Clone legame al tessuto ALS 2A è mostrato (Figura 9). Tutti questi cloni ha mostrato risultati promettenti in uno o entrambi del fago scFv ed ELISA. Questi risultati confermano che il nostro processo biopanning basato AFM è una tecnica molto potente che può essere utilizzato per generare i reagenti che legano selettivamente proteina specifica malattia variformiche direttamente da fonti complessi.

Figura 1
Figura 1. Negativo Process biopanning Utilizzando Immunotubes. Schema dimostrando il processo biopanning negativo. Fagi che sono reattivi alle proteine ​​quali BSA, aggregati di alfa-sinucleina e tessuto cerebrale sano vengono rimossi con immunotubes. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. La conferma dei risultati negativi Panning. Immagini AFM viene utilizzato per monitorare le fasi negative panning contro i vari obiettivi per garantire che tutti fagi reattivi vengono rimossi. Qui vi mostriamo alcuni dei risultati che dimostrano la AFMlivello di legame, prima e dopo il panning negativo fago. (A) dei fagi obbligatorio può essere rilevato da aggregati di particelle alfa-sinucleina, dopo il primo turno di panning negativo, ma (B) senza fago sono visibili dopo 8 turni di panning negativo. (C ) Dopo il primo giro di panning negativa contro sano fago tessuto di legame è evidente, ma (D) non vincolante viene rilevato dopo 10 turni di panning negativo. Tutte le immagini sono 5 micron. Le grandi strutture bianche sulle immagini AFM sono di solito a causa di sali presenti nei buffer o residuo PEG dalla precipitazione passo PEG durante la produzione dei fagi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Negativo Biopanning Process Utilizzando Mica. dimostrando schematica aggiuntiva biopanning negativo utilizzando mica. A causa di campione limitato superficie mica è impiegato per eliminare prima leganti per salutare e poi FTD immunoprecipitata TDP-43. Prima di procedere a due cicli di panning negativo contro FTD TDP-43, il fago è diviso a metà (in caso di isolamento non riuscita di SLA TDP-43 fagi esclusivi durante la fase di panning positivo). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. ALS positivo biopanning Process. Schema dimostrando il processo biopanning positivo SLA. I fagi non legato dopo il panning negativa contro FTD TDP-43 sono utilizzati in un giro di panning positivo contro la SLA TDP-43 per eluire più SLATDP-43 cloni specifici. Inoltre, due turni di panning positivo contro la SLA TDP-43 sono effettuate utilizzando la superficie mica e fagi non legato dopo panning negativo contro sana immunoprecipitata TDP-43 (i fagi legati vengono eluiti in quanto questi fagi non dovrebbero legare sano TDP-43, ma alcuni può essere cross-reattivi sia con SLA e FTD). Tre metodi di eluizione si usano (tripsina, TEA e le cellule TG1) per garantire che tutti fagi legati vengono eliminati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. fagi ELISA Proiezione di potenziali SLA Clones (ALS contro HT). Utilizzando omogeneizzato umana ALS, FTD e tessuto cerebrale sano (HT) campioni abbiamo effettuato ELISA indiretto con fagi prodotte dai diversi cloni. I risultati sono rappresentati come rapporto di campioni di tessuto sano. I risultati hanno mostrato che alcuni cloni distinguono tra TDP-43 si trovano in pazienti con SLA e quelli in buona salute. I tessuti ALS, FTD e HT sono un mix di campioni di cervello (corteccia motoria) da tre individui. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. fagi ELISA Proiezione di potenziali SLA Clones (ALS contro FTD). Qui si mostrano i fagi risultati ELISA di SLA rispetto pazienti FTD. La maggior parte dei cloni hanno una preferenza per la SLA oltre FTD. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 7. scFv ELISA Proiezione di potenziali SLA cloni (ALS contro HT). Utilizzando i scFv prodotti da ogni clone possiamo osservare cloni che hanno una preferenza per la TDP-43 da pazienti affetti da SLA più sano. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8
Figura 8. scFv ELISA di screening di potenziali SLA Clones (ALS contro FTD). Il successo del nostro processo di panning è ulteriormente dimostrato quando si confrontano ALS per FTD per i diversi scFv nei test ELISA indiretto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .

modi "> Figura 9
Figura 9. Dot Blot analisi dei potenziali ALS cloni. Utilizzando macchia puntino invece di ELISA è un'altra tecnica per dimostrare la specificità dei cloni per la SLA oltre FTD o HT. Clone 2A viene visualizzato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione NIH: R21AG042066. Vorremmo ringraziare Philip Schulz per il suo contributo nella creazione di video cattura dello schermo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tomlinson I and J Libraries MRC (Cambridge, England)
Sheets Library MRC (Cambridge, England)
2xYT BD Sciences 244020
Glucose Amresco 0188-2.5KG
Ampicillin Amresco 0339-25G Irritant
KM13 Helper Phage MRC (Cambridge, England)
Kanamycin OmniPur 5880 Irritant
Polyethylene Glycol 8000 OmniPur 6510 Irritant
Sodium Chloride Macron 7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic Amresco 0404-1KG Irritant
Potassium Chloride EMD PX1405-1 Irritant
Potassium Phosphate Monobasic Amresco 0781-500G Irritant
TG1 Cells MRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani Agar EMD 1.10283.0500
Bovine Serum Albumin Amresco 0332-100G
STEN buffer Crystalgen Inc. 33429775
Immunotubes Thermo Scientific 470319
Mica Spruce Pine Mica 24365
Tween 20 EMD
Trypsin Sigma T-0303 Irritant
Triethylamine Sigma T-0886 Flammable
Glycerol Amresco 0854-1L Irritant
DNA Plasmid Prep Kit qiagen 27106 Irritant
Non-Fat Milk Powder Carnation
96-Well High Binding ELISA Plate Costar 3590
Anti-M13 HRP GE Healthcare Life Sciences 27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit Thermo Scientific 37074
Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody ProteinTech 10782-2-AP
A/G Agarose Beads Santa Cruz Biotechnology sc-2003
HB 2151 Cells MRC (Cambridge, England)
Isopropylthiogalactoside Teknova 13325
9e10 HRP Santa Cruz Biotechnology sc-40
Nitrocellulose Membrane Biorad 162-0115 Flammable
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope Veeco
AFM Probes VistaProbes T300R-10

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References

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