Roman Atomic Force Microscopy Based Biopanning voor isolatie van morfologie specifieke reagentia tegen TDP-43 Varianten in Amyotrofische Lateraal Sclerose

1School for Engineering of Matter, Transport and Energy, Arizona State University, 2Department of Neurology, Georgetown University Medical Center, 3Department of Pathology, Georgetown University Medical Center
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Williams, S. M., Venkataraman, L., Tian, H., Khan, G., Harris, B. T., Sierks, M. R. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (96), e52584, doi:10.3791/52584 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Omdat eiwitvarianten spelen cruciale rol bij vele ziekten waaronder TDP-43 in Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS), alfa-synucleine in Parkinson en beta-amyloïde en tau in de ziekte van Alzheimer, is het uiterst belangrijk om morfologie specifieke reagentia die selectief kunnen richten ontwikkelen Deze ziekte-specifiek eiwit varianten om de rol van deze varianten bestuderen pathologie en voor potentiële diagnostische en therapeutische toepassingen. We hebben nieuwe atomic force microscopie (AFM) gebaseerd biopanning technieken die isolatie van reagentia die ziektespecifieke eiwitvarianten selectief weer herkent ontwikkeld. Er zijn twee belangrijke fasen in het proces, de negatieve en positieve panning fasen. Tijdens de negatieve panning fase worden fagen die reactief naar off-target antigenen zijn geëlimineerd door middel van meerdere rondes van subtractieve panning gebruik te maken van een reeks van zorgvuldig geselecteerde off-target antigenen. Een belangrijk kenmerk in de negatievepanning fase wordt met behulp van AFM beeldvorming om het proces te bewaken en te bevestigen dat alle faagpartikels ongewenst worden verwijderd. Voor de positieve panning fase wordt het doelantigeen plaats gefixeerd op een mica oppervlak gebonden fagen geëlueerd en gescreend op fagen die selectief het doelantigeen binden identificeren. Het doeleiwit variant hoeft niet te worden gezuiverd om een ​​geschikte negatieve panning controles werden gebruikt. Zelfs doelwiteiwit varianten die alleen aanwezig in zeer lage concentraties in complexe biologische materiaal kan worden gebruikt in de positieve panning stap zijn. Door toepassing van deze technologie, verkregen we antilichamen tegen eiwit varianten van TDP-43 die selectief worden aangetroffen in menselijk ALS hersenweefsel. We verwachten dat dit protocol geldende zijn aan productie reagentia die selectief eiwitten varianten aanwezig in een groot aantal verschillende biologische processen en ziekten binden.

Introduction

De aanwezigheid van eiwit varianten is geïmpliceerd als een factor in de progressie van vele ziekten zoals neurodegeneratieve ziekten, zoals Alzheimer, Parkinson, ALS en frontotemporale dementie (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. Oligomere vormen van de eiwitten beta-amyloïde en alfa-synucleïne worden gedacht aan toxische stoffen verantwoordelijk voor Alzheimer en Parkinson respectievelijk 2,3,4,5 zijn. Aggregaten van het TAR DNA-bindend eiwit 43 (TDP-43) zijn gekoppeld aan ALS en FTD 12,13,14. Daarom reagentia zoals antilichamen die selectief kunnen richten op de verschillende eiwit varianten kan een krachtig instrument om als diagnostische markers en potentiële therapeutische dienen. In deze studie hebben we gericht op het ontwikkelen reagentia die selectief varianten van TDP-43 proteïne betrokken bij ALS binden, maar de techniek die in dit document dienen voor de isolatie van reagentia tegen een breed scala van protein varianten.

Cytoplasmatische aggregatie van TDP-43 is geïdentificeerd als een pathologische functie in ALS 15,16,17,18,19. Typisch TDP-43 wordt gevonden in de kern van cellen van een normaal individu, hoewel het de neiging om tussen de cytosol en de kern 15,17. In ALS geaggregeerde vormen van TDP-43 zijn gedetecteerd in het cytoplasma van geselecteerde neuronen en glia met lagere concentraties in de kern suggereert de beweging van TDP-43 van de kern naar het cytoplasma tijdens ziekteprogressie 16,20. Terwijl de aggregatie van TDP-43 wordt gevonden in de meeste ALS gevallen is het niet goed voor alle gevallen vanaf 1% -2% van de totale ALS gevallen (15% -20% van familiale ALS gevallen) zijn verbonden met mutaties in de superoxide dismutase 1 (SOD1) gen 15,17. Vanwege de belangrijke rol van TDP-43 in de meeste ALS gevallen hier richten we ons op het ontwikkelen antilichamen gebaseerde reagentia die selectief kan binden aan TDP-43 varianten dieaanwezig in menselijke ALS hersenweefsel gebruik te maken van onze nieuwe AFM gebaseerd biopanning technieken.

In eerste instantie hebben we een divers repertoire van antilichaam bindende domeinen. Wij gecombineerde drie faagdisplay enkele keten variabel domein antilichaamfragmenten (scFvs) bibliotheken (Tomlinson I en J en Sheets bibliotheken 21). De panning proces is verdeeld in negatieve en positieve panning fasen. Fagen van de bibliotheken worden eerst onderworpen aan de negatieve panning proces waarbij fagen reactief meerdere off-target antigenen uitgesloten. Na voltooiing van elke ronde van panning negatief tegen elkaar off-doelantigeen, wordt het proces gecontroleerd door AFM beeldvorming zodat alle faagbinding de off-target antigenen zijn verwijderd. Na te hebben door AFM beeldvorming dat alle reactieve fagen worden verwijderd moeten we overgaan naar het volgende doel. Om reagentia tegen TDP-43 varianten betrokken bij ALS isoleren we gebruik gemaakt van de volgende negatieve panning antigenen: 1) BSA faag die zwak of niet-specifiek binden aan proteïnen te verwijderen; 2) geaggregeerde alpha-synuclein om faag die zich binden aan generieke structurele elementen van geaggregeerde eiwitten te verwijderen; 3) menselijke hersenen weefselhomogenaten om faag die binden aan een eiwit of andere componenten aanwezig zijn in post-mortem monsters van gezonde menselijke hersenweefsel te verwijderen; 4) immunogeprecipiteerd TDP-43 van gezonde menselijke hersenen te faag die zich binden aan alle TDP-43 vormen in verband met gezonde menselijke hersenen te verwijderen; en 5) immunogeprecipiteerd TDP-43 geïsoleerd van FTD hersenhomogenaten om faag dat TDP-43 varianten geassocieerd met niet-ALS pathologie binden verwijderen. Na verwijdering van faag reactieve alle off-target antigenen, heeft vervolgens we de positieve panning fase waarin antilichaam fragmenten die het antigeen van belang bindt worden geïsoleerd, in casu TDP-43 immunologisch van menselijk ALS hersenweefsel. Deze geïsoleerde antilichamen kunnen reactief naar geaggregeerd of gemodificeerde vormen van TDP-43 zijn.

"> Conventionele faag biopanning richt zich vooral op de positieve panning fase 22,23. Meestal is het doel van belang is geïmmobiliseerd, de faag bibliotheek toegevoegd en gebonden fagen geëlueerd. De fagen worden dan versterkt en toegevoegd aan het doel weer. Deze versterking en broedproces gewoonlijk verscheidene malen herhaald om het percentage positieve bindende fagen verhogen. Hoewel variaties van dit proces zijn uitgebreid gebruikt antilichaamreagentia isoleren tegen een breed scala van doelwit antigenen, ze vereist in het algemeen grote hoeveelheden gezuiverd doelwitantigeen 24,25,26, 27, terwijl onze werkwijze vereist slechts sporen van het doelantigeen. De hier beschreven protocol kan worden gebruikt voor reagentia die selectief binden doel antigenen die bij zeer lage concentraties aanwezig zijn, zonder de noodzaak voor zuivering en de panning direct tegen kan worden uitgevoerd isoleren antigen aanwezig in complexe weefselmonsters. Het gebruik van uitputtend negatieve panning protocollen als geverifieerddoor AFM zorgt ervoor dat klonen geïsoleerd tegen de positieve antigen selectief het doel toen niet gezuiverd of verrijkt moeten binden zelfs.

Kasturirangan en collega's (2003) hebben een soortgelijke negatieve en positieve biopanning proces om antilichamen reactief naar oligomere beta-amyloïde behulp nanogram concentratie van het doelwit 5 isoleren uitgevoerd. Hier breiden wij deze werkwijze het genereren van reagentia die selectief binden ziektespecifieke eiwit varianten rechtstreeks uit menselijke weefselmonsters mogelijk. In toekomstige studies zijn we van plan om verder te onderzoeken, niet alleen de diagnostische waarde van de reagentia hier geïsoleerd, maar ook hun therapeutische relevantie voor de behandeling van ALS.

Kortom, zou onze nieuwe AFM gebaseerd biopanning technologie voor de isolatie van een ziekte-specifiek eiwit variant elk biologisch materiaal zonder eiwitzuivering of modificatie, zelfs wanneer het doelantigeen concentrations zijn extreem laag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. faagproductie

  1. Voer alle faag productie en biopanning processen in een bioveiligheid kast. Opbrengst fagen deeltjes uit de verschillende bibliotheken (Tomlinson I en J bibliotheken en Sheets bibliotheek 21) voor het biopanning werkwijze volgens de instructies van de fabrikant (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
    OPMERKING: We maken gebruik van meerdere bibliotheken in onze panning proces om de diversiteit van de beschikbare antilichamen te verhogen.
  2. Kort cultuur bacteriën voorraden van de drie bibliotheken in 200 ml 2xYT bevattende 1% glucose en 100 ug / ml ampicilline op een shaker bij 37 ° C totdat OD600 0,4.
  3. Voeg 8 x 10 11 van KM13 helperfaag 200 ml Tomlinson I en J bibliotheken en 8 x 10 11 van VCSM13 helperfaag 200 ml van de Sheets bibliotheek. Incubeer bibliotheek monsters met helper faag gedurende 30 minuten bij 37 ° C zonder schudden.
  4. Centrifuge dekweken bij 3000 xg gedurende 10 min en resuspendeer de celpellet in 200 ml 2xYT met 0,1% glucose, 100 ug / ml ampicilline en 50 ug / ml kanamycine.
  5. Incubeer de kweken O / N bij 30 ° C onder schudden en vervolgens draaien gedurende 30 minuten bij 3300 xg de volgende dag.
  6. Voeg 50 ml polyethyleenglycol (PEG) 8000 in 2,5 M NaCl aan de 200 ml supernatant uit elk van de bibliotheken en incubeer op ijs gedurende 1 uur. Na PEG precipitatie, draaien de oplossingen opnieuw gedurende 30 min bij 3300 x g.
  7. Voeg 1-2 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de celpellet (afhankelijk van de grootte van de korrels) en transfer naar microcentrifugebuizen.
  8. Incubeer faagdeeltjes op ijs gedurende 1 uur bij 37 ° C met af en toe mengen vóór centrifugeren gedurende 10 min bij 11.600 x g. Verzamel de supernatant en bewaar bij -80 ° C.
  9. In te vriezen transfer een klein volume van de faagdeeltjes van de drie bibliotheken om een ​​microcentrifugebuis en titreren elke bibliotheekindividueel gebruik TG1 cellen om concentratie te bepalen. Hieronder volgt een beschrijving van de titer levert voor een bibliotheek.
    1. Groei TG1 cellen OD600 van 0,4. Voeg 990 pl PBS 6 microcentrifugebuizen.
    2. De eerste buis wordt 10 ul van de faagdeeltjes. Na het mengen, verwijderen 10 ul van de buis een en toe te voegen aan de buis 2. Herhaal deze stap voor de resterende 4 buizen.
    3. Voeg 200 ul van TG1 cellen 6 buizen en voeg 10 ul van elk van de zes faag verdunningen aan deze buizen. Laat de faagdeeltjes te infecteren gedurende 30 minuten zonder schudden bij 37 ° C.
    4. Plaat 100 ul van de cellen tot Luria-Bertani agar platen met 100 ug / ml ampicilline (LBA). Incubeer O / N bij 37 ° C en bepalen vervolgens de pve / ml met behulp van het aantal zichtbare kolonies.

2. Negatieve Biopanning Proces

OPMERKING: Vermijd te veel vries dooi van de fagen in de hele biopanning proces. Ideally, is het het beste om uit te voeren zoals veel van de negatieve panning stappen mogelijk in een dag. Na de voltooiing van de rondes van negatieve of positieve panning tegen elkaar gericht is het belangrijk om een ​​aantal van de faag behalve in geval van verontreiniging naar elke stap.

  1. 12 Rondes van negatieve panning tegen runderserumalbumine (BSA)
    1. Voeg 4 ml van 1 mg / ml BSA oplossing in PBS bij 12 immuunbuizen en geïncubeerd O / N bij 4 ° C.
    2. Combineer 1 x 10 12 faagdeeltjes uit elk van de drie bibliotheken (vernietiging van een kleine hoeveelheid van dit faag mengsel toekomstige verificatie van de negatieve panning werkwijze).
    3. Gooi de BSA-oplossing uit de eerste buis en was het buisje 2-3 keer met PBS om ongebonden BSA verwijderen.
    4. Voeg de gecombineerde faagbibliotheken deze eerste buis, incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur aan de rotator en verzamel de ongebonden fagen.
    5. Herhaal stap 2.1.3 met de tweede immunobuis en voeg de verzamelde uit stap 2.1.4 faag om dit immunotube. Herhaal stap 2.1.4.
    6. Herhaal stappen 2.1.3-2.1.4 de resterende 10 pijpen van BSA-oplossing en de ongebonden faag na elke incubatie verzameld.
    7. Om te controleren of verwijdering van alle BSA faag bindmiddelen gebruiken AFM. Voeg 10 ul van de faag uit stap 2.1.2 en 10 pl van het resterende faag na stap 2.1.7 afzonderlijk tot 10 ug / ml BSA gebonden gesplitst mica. Een korte versie van de AFM proces wordt beschreven in paragraaf 8.
    8. Het is belangrijk om een ​​kleine hoeveelheid faag slaan na afloop van de vele ronden van negatieve panning tegen elkaar doel succes van de panning werkwijze controleren.
  2. 10 Rondes van Negative Panning tegen diverse vormen van Alpha-synuclein
    OPMERKING: In dit project willen we faag dat andere geaggregeerde vormen van eiwitten zoals alfa-synucleïne (monomeer, dimeer, trimeer, enz.) En dus zullen we een van deze fagen te elimineren (het doel is het wegnemen als zou kunnen binden verwijderen veel cross-reactieve fagen mogelijk). Laat gezuiverde alfa-synucleïne om te aggregeren gedurende ten minste 7 dagen zodat zowel monomere en oligomere vormen negatieve panning aanwezig zijn.
    1. Bereid 4 immuunbuizen met 500 ug / ml geaggregeerde alfa-synucleine in PBS en 4 immuunbuizen met 100 ug / ml geaggregeerde alfa-synucleine en incubeer O / N bij 4 ° C.
    2. Gooi de oplossing van één van de buizen met 500 ug / ml geaggregeerde alfa-synucleine, wassen met PBS en voeg de faag bibliotheek na 12 ronden van negatieve panning met BSA verzameld.
    3. Incubeer de buis gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur aan de rotator en verzamel de ongebonden fagen.
    4. Herhaal stap 2.2.3 en 2.2.4 voor de resterende buizen met 500 ug / ml geaggregeerde alfa-synucleine en daarna de buizen met 100 ug / ml geaggregeerde alfa-synucleïne met de ongebonden faag na stap 2.2.4 telkens verzameld.
    5. Herhaal stap 2.1.8 met de faag na de eerste negatieve panning tegen 500 ug / ml geaggregeerde alpha-synuclein en de faag na de achtste ronde van negatieve panning tegen 100 ug / ml alfa-synucleïne.
    6. Om alle negatieve bindmiddelen tegen elimineren alpha-synuclein bereiden twee extra immuunbuizen met 500 ug / ml van geaggregeerde alpha-synuclein en herhaal de stappen 2.2.2-2.2.4.
  3. 10 Rondes van Negative Panning tegen Gezonde Human Brain Tissue Homogenaat
    1. Naar 1x STEN buffer (50 mM Tris (pH 7,6), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,2% NP-40, 0,2% BSA, 20 mM PMSF en protease inhibitor cocktail) menselijk hersenweefsel 28. Homogeniseer bij 24.000 rpm gedurende 1 minuut, centrifuge monsters bij 3000 rpm en verzamelen supernatant.
    2. Bereid 2 immuunbuizen met 2 ml van 50 ug / ml humaan hersenweefsel in PBS en 8 immuunbuizen met 10 ug / ml humaan hersenweefsel en incubeer O / N bij 4 ° C.
    3. Herhaal stappen 2.2.3-2.2.5 eerst met de buizen die 50 ug / ml humaan hersenweefsel en daarna met die welke 10 ug / ml humane Bregen weefsel met behulp van de niet-gebonden faag na de negatieve panning tegen alfa-synuclein verzameld.
    4. Herhaal stap 2.1.8 met de faag na de eerste negatieve panning tegen 50 ug / ml humaan hersenweefsel en de faag na de tiende ronde van negatieve panning tegen humaan hersenweefsel.
  4. 8 Rondes van Negative Panning tegen Gezonde immunogeprecipiteerd TDP-43
    1. Immunoprecipiteren gezonde TDP-43 eiwit uit gezonde menselijke hersenweefsel met behulp van de in hoofdstuk 9. beschreven protocol Vanwege lagere hoeveelheid immunogeprecipiteerd eiwit, het uitvoeren van deze rondes van negatieve panning met behulp van mica.
    2. Aanhangen acht mica oppervlakken.
    3. De eerste mica toe ~ 100 ui 5 ug / ml van het eiwit immunologisch neergeslagen en incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Was de mica 5 keer met 0,1% PBS met Tween 20 (PBST).
    5. Voeg ~ 100 ul van de faag na de negatieve panning tegen gezond hersenweefsel en incubeer gedurende 5-10 min bijRT.
    6. Bij Midway incubatie van stap 2.4.5, uit te voeren stap 2.4.3 met behulp van de tweede mica.
    7. Verzamel de faag uit stap 2.4.5 en was de mica 5 keer met 0,1% PBST.
    8. Was mica uit stap 2.4.6 en voeg de faag uit 2.4.7.
    9. Herhaal de stappen 2.4.4 tot 2.4.9 totdat de faag negatief panning tegen alle acht mica met immunologisch eiwit. Herhaal stap 2.1.7 met de faag na de eerste acht ronde negatieve panning.
  5. 2 Rondes van Negatieve Panning tegen FTD immunogeprecipiteerd TDP-43
    1. Immunologisch TDP-43 eiwit van de hersenen van individuen met FTD.
    2. Aanhangen 2 mica oppervlakken.
    3. Voeg 50 ul van 10 ug / ml FTD TDP-43 een mica. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Was de mica 5 keer met 0,1% PBST.
    5. Voeg 50 ul van de na negatieve panning tegen gezonde TDP-43 verzameld faag. Incubeer gedurende 5 min.
    6. Het verzamelen van de niet-gebonden fagen.
    7. Repeats stappen 2.5.3 tot 2.5.6 met de tweede mica en de ongebonden faag in 2.5.6 verzameld.

3. Positieve Panning tegen immunogeprecipiteerd TDP-43 van Personen met ALS

  1. Immunologisch TDP-43 eiwit van de hersenen van individuen met ALS. Aanhangen 3 mica oppervlakken. Voeg 50 ul van 10 ug / ml ALS TDP-43 een mica. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was de mica 5 keer met 0,1% PBST.
  2. Voeg 50 ul van de na negatieve panning tegen gezonde TDP-43 aan de mica verzameld faag. Incubeer gedurende 5 min.
  3. Het verzamelen van de niet-gebonden fagen. Ook het verzamelen van de gebonden fagen met behulp van drie elutie methoden. Het is belangrijk om alle verzamelde fagen in deze panning stappen gescheiden te houden.
    1. Voeg eerst 50 ul trypsine (1 mg / ml in PBS) aan elk mica en incubeer gedurende maximaal 10 min. Verzamel de oplossing en op te slaan. Voeg vervolgens 50 ui 100 mM triéthylamine (TEA) om elke mica en incubeer gedurende maximaal 10 min. Collect de oplossing, voeg gelijk volume van 1 M Tris-HCl buffer pH 7,4 en opslaan.
    2. Ten derde, voeg 50 ul van TG1 bij OD 600 van 0,4 direct naar mica en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Voeg ook de vanuit het twee elutie methoden fagen 3.3.1 tot 100 ul TG1 bij OD600 van 0,4 en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  4. Herhaal de stappen 3.1 met een tweede mica.
  5. Neem de ongebonden faag in 3.3.2 verzameld. met behulp van de eerste mica met ALS TDP-43 en voeg deze toe aan de tweede mica met ALS TDP-43. Incubeer gedurende 5 min.
  6. Herhaal alle stappen in 3.3 voor deze tweede sets van mica.
  7. Combineer de TG1 cellen geïnfecteerd met de fagen geëlueerd met trypsine van de beide VV TDP-43 mica en plaat op LBA platen. Doe hetzelfde voor het TEA en TG1 geëlueerde fagen van de beide VV TDP-43 mica voor een totaal van drie platen.
    Opmerking: Door betrokkenheid TDP-43 in zowel ALS en FTD, sommige klonen afgezonderdtwee ronden van positieve panning tegen ALS TDP-43 kan specifiek voor dit doel zijn, maar kan ook FTD binden. Om beter te isoleren ALS specifieke klonen, neem de ongebonden faag na 2 ronden van negatieve panning tegen verzameld FTD TDP-43 (omdat deze twee rondes van negatieve panning enige doel dat is reactief naar FTD TDP-43 had moeten verwijderd) en het gebruik van deze fagen in een ronde positieve panning tegen ALS TDP-43 antigeen op mica (bereiden ALS TDP-43 mica zoals beschreven in 3.3 en 3.4).
  8. Herhaal alle stappen in 3.3 met deze derde ALS mica en plaat de geïnfecteerde TG1 cellen op drie LBA platen O / N bij 37 ° C. De volgende dag tel het aantal kolonies op de platen met 6 LBA potentiële ALS klonen. Er moeten minder kolonies op de drie LBA platen met potentiële ALS klonen na de derde ronde van panning positief tegenover de drie LBA platen na twee ronden van positieve panning.

4. Het kweken en Fagen Goederenion van mogelijke positieve klonen tegen ALS Specifieke TDP-43

  1. Grow elke kolonie van de 6 platen met 96 putjes die 100 ui 2xYT met 1% glucose en 100 ug / ml ampicilline op een shaker bij 37 ° CO / N.
  2. De volgende dag overdracht 10 ul van de putjes die het klonen van het 3'LBA platen na de derde ronde van positieve panning met ALS TDP-43 eiwit microcentrifuge buisjes die 1 ml 2xYT met 1% glucose en 100 ug / ml ampicilline .
  3. Glycerol In alle culturen in de 96-well platen tot een eindconcentratie van 15% en vries de platen bij -80 ° C. Laat het 1 ml kweken groeien 2-3 uur schudden bij 37 ° C.
  4. Voeg 10 9 van KM13 helperfaag en laat de helperfaag infecteren gedurende 1 uur bij 37 ° C onder schudden. Centrifugeer de cellen gedurende 10 min bij 3000 xg, gooi het supernatant en voeg 1 ml 2xYT met 0,1% glucose, 100 ug / ml ampicilline en 50 ug / ml KanAmycin.
  5. De cellen te kweken O / N bij 30 ° C onder schudden. Centrifugeer de buizen bij 3300 xg gedurende 30 min, breng de supernatant nieuwe microcentrifugebuisjes en voeg 250 ul PEG / NaCl aan elke buis.
  6. Incubeer de buizen op ijs gedurende 1 uur. Centrifugeer de buizen opnieuw bij 3300 xg gedurende 30 min, de bovenstaande vloeistof en voeg 100 ul van PBS aan elke buis.
  7. Incubeer de buizen op ijs gedurende 1 uur. Spin de buizen gedurende 10 min bij 11.600 xg en breng de supernatant nieuwe buizen. Bewaar de fagen bij -80 ° C.

5. Sequencing van Potentiële ALS Clones

  1. Herhaal stap 4.2 en laten culturen groeien O / N bij 37 ° C onder schudden. De volgende dag uitvoeren DNA plasmide preps van de klonen volgens de instructies van de fabrikant. Sequentie van de klonen met de juiste voorwaartse en achterwaartse primers.

6. Screening Potentiële positieve klonen tegen ALS Specifieke TDP-43 Gebruik Indirecte ELISA

  1. Voeg 100 ul van 2,5 ug / ml ALS, FTD en gezond menselijk hersenweefsel aan de putjes van een hoge bindende ELISA-plaat voor elke potentiële ALS kloon. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 1 uur onder langzaam schudden.
  2. Was de platen 3 maal met 0,1% PBST. Voeg 200 ul van 2% melkpoeder in PBS om de put en incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 1 uur onder langzaam schudden.
  3. Herhaal de wasstap en voeg 100 ul van elke faag verdunde tenminste 1/100 in PBS aan de putjes. Na de incubatie en wasstappen, voeg 100 ul van 1 / 1.000 anti-M13 HRP aan elk putje. Was de plaatjes en visualiseren met behulp van de ELISA Femto chemieluminescentie substraat kit.

7. scFv Productie en screening met indirecte ELISA

  1. Groeien HB 2151 cellen OD600 van 0,4. Voeg 5 ul van de verschillende fagen aan 20 gl van de HB 2151 cellen. Laat de fagen 30 minuten te infecteren bij 37 ° C zonder schudden. Verdeel LBA platen in rasters zodat ongeveer 20 klonen kunnen worden uitgeplaat op elk.
  2. Voeg 5-10 pi van elke faag geïnfecteerde bacteriën op de plaat en incubeer O / N bij 37 ° C. De volgende dag toe individuele kolonies aan 1 ml 2xYT met 0,1% glucose en 100 ug / ml ampicilline en schud bij 37 ° C gedurende 3-4 uur totdat OD600 0,6.
  3. Voeg 1 ul van 1 M isopropylthiogalactoside (IPTG) aan elke buis en incubeer O / N bij 30 ° C onder schudden. Spin de buizen bij 11.600 xg gedurende 10 min en de oogst van het bovenstaande voor ELISA testen.
  4. Voor de ELISA-tests volgen dezelfde procedures in hoofdstuk 6, behalve in plaats van faag in 6,5 voeg de scFv onverdund en voor 6,6 voeg 100 ul van 1 / 1.000 9E10 HRP.

8. AFM Process

  1. Voeg 10-20 ul van het doelantigeen tot gesplitst mica en incubeer gedurende 5-10 minuten. Was de mica 5 keer met water. Voeg 10-20 ul van de fagen aan de mica en incubeer gedurende 5-10 minuten.
  2. Was de mica 5 keer opnieuw with water en laat het mica aan de lucht drogen. Visualiseer faagbinding met AFM 1. Voeren de AFM imaging proces met behulp van AFM tapping mode met een NanoScope IIIa-controller in de lucht bij RT 29. De siliconen AFM probes hebben een resonantiefrequentie van 300 kHz en een veerconstante van 40 N / m. Gebruik een scansnelheid van 3,05 Hz en een scanresolutie van 512 monsters / lijn.
  3. Verwerk de beelden door basische afvlakking van de achtergrond om ervoor te zorgen dat alle deeltjesgrootte vergelijkbaar zijn in elk beeld. Faag breedte (niet duur) kan variëren van beeld tot beeld als gevolg van andere deeltjesgrootte en het scangebied, maar het zal nooit afbreuk doen aan de nauwkeurigheid van het al dan niet faag bindt aan het antigeen.
  4. Als tijdens de AFM verificatie voor elke set van negatieve panning fagen zijn zichtbaar op de mica, voeren naast rondes tot geen fagen worden gedetecteerd voordat u verder gaat naar de volgende reeks van negatieve panning.

9. Immuunprecipitatie van Target Antigen

  1. Om Isolate het doelantigeen (TDP-43), voeg 250 ug homo- hersenweefsel (van motorische cortex), 100 pl 1/100 verdunning van het anti-TDP 43 polyklonaal antilichaam en 1x STEN buffer 700 ul totaal volume een Eppendorf buis 28.
  2. Incubeer O / N bij 4 ° C op een rotator. Was A / G agarose kralen met 1x STEN buffer 2-3 keer en voeg 25 ml aan het weefsel mengsel. Incubeer bij 4 ° C gedurende 1,5 uur op een rotator en centrifugeer bij 2000-4000 rpm gedurende 1 min.
  3. Verwijder de supernatant en was de pellet één keer met 1x STEN buffer en 5 maal met PBS. Voeg 40-60 pl 1x STEN buffer om de pellet en koken gedurende 5 min. Nadat de monsters zijn koel, centrifuge en het verzamelen van de bovenstaande vloeistof. Met SDS-PAGE en Western blotting succes van het proces 30 immunoprecipitatie verifiëren.

10. Dot Blot Analyse

  1. Snijd nitrocellulosepapier in kleine rechthoeken voor elke kloon die zal worden getest. Punt 2 pl van ALS, FTD en gezond menselijk brein weefselmonsters den nitrocellulosepapier en laat het volledig drogen.
  2. Voeg 1-2 ml van 5% melkpoeder in PBS en laat het schudden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Voeg 1 ml 1/100 verdunning van elk faag en laat schudden O / N bij 4 ° C. Was het membraan 3 maal gedurende 10 min elk met 0,5% PBST.
  3. Voeg 1 ml van 1/1000 verdunning van anti-M13 HRP en laat schudden gedurende 1 uur bij KT. Herhaal wassen procedure en gevisualiseerd met behulp van Western chemieluminescentie oplossing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In figuur 1 het schema toont de negatieve panning proces waardoor we verwijderd faagbinding off-target antigenen uit onze bibliotheek met behulp immuunbuizen. We aanvankelijk begonnen met BSA omdat dit een gemeenschappelijk blokkerend middel en eventuele faag die niet-specifiek zou reageren met deze doelstelling problematisch toekomst immunoassays zijn. Vervolgens verwijderden we bindmiddelen geaggregeerde alfa-synucleïne faag die reactief met generieke structuren van geaggregeerde eiwitten (bijvoorbeeld, een antilichaam dat kruisreactief geaggregeerde alfa-synucleine zou, TDP-43, Abeta, etc.) elimineren. AFM resultaten toonden faagbinding na 1 ronde van negatieve panning tegen de geaggregeerde alpha-synucleïne (Figuur 2A) en geen bindend na 8 ronden (figuur 2B). We hebben toen een negatief gepand tegen gezond menselijk hersenweefsel om faag te verwijderen binden de vele antigenen aanwezig is in gezonde menselijke hersenhomogenaat. Figuur 2C (figuur 2D). Aangezien de hoeveelheid gezonde en FTD immunologisch TDP-43 proteïne vindt panning was laag, met mica plaats immuunbuizen gebruikt minder volume en daardoor verlaagd totaal eiwit verbruikt (figuur 3). Na 8 ronden van negatieve panning tegen gezonde immunogeprecipiteerd TDP-43, werd de faag verdeeld. De helft van de faag werd uitgegeven in twee rondes van negatieve panning tegen FTD TDP-43. Het doel was om elke FTD TDP-43 reactieve klonen elimineren (vanwege betrokkenheid TDP-43 in FTD), terwijl eventuele ALS TDP-43 specifieke klonen behouden.

Voor de positieve panning gedeelte (figuur 4), ook toegepast mica als substraat om materiaalgebruik te minimaliseren. We gebruikten de ongebonden faag na de FTD TDP-43 negatieve panning tegen ALS TDP-43 aan een te verwervenALS specifieke klonen. We hebben ook positief panning tegen ALS TDP-43 tweemaal indien we geen klonen hadden verkregen na gebruik van de gebonden faag van het negatieve panning tegen FTD TDP-43. Nadat het gehele panning proces, onze drie elutie methoden leverden 154 klonen uit de twee positieve panning tegen ALS TDP-43 en 45 potentiële ALS specifieke klonen (klonen die reactief naar ALS en FTD kan zijn) (met behulp van de niet-gebonden faag uit de FTD TDP 43 negatieve panning).

Ter verdere vermindering van de 45 potentiële ALS specifieke klonen, worden de klonen de sequentie bepaald en alleen klonen zonder stopcodons werden verder overwogen, behalve één kloon die tweemaal kwamen. Dit liet ons met 23 potentiële ALS specifieke klonen. Na het voorbereiden van zowel faag en oplosbare scFv met deze klonen, worden ze getest in de indirecte ELISA voor de specificiteit aan ALS weefsel. Bijna alle fagen toonde een voorkeur voor ALS weefsel dan gezond weefsel (Figuur 5). Vergelijkbare resultaten zijn OBTained bij het ​​vergelijken van faag binden aan ALS te FTD weefsel (Figuur 6). Voor toekomstige studies is het essentieel dat deze klonen tot expressie hoge opbrengsten aan functionele scFvs, dus geproduceerde kleine hoeveelheden van de verschillende scFvs en uitgevoerd soortgelijke indirecte ELISA. Vergelijking van scFv binding aan ALS weefsel zowel gezonde (figuur 7) en FTD weefsel (figuur 8) toonden nogmaals selectieve binding aan ALS weefsel in vrijwel alle klonen.

We gebruikten een immunoassay (dot blots) verdere verifiëren binding aan ALS weefsel en tevens te bepalen welke klonen reactief andere immunologische toepassingen. Kloon 2A binding aan ALS weefsel wordt getoond (Figuur 9). Al deze klonen toonde veelbelovende resultaten in een of beide van de faag en scFv ELISA. Deze resultaten bevestigen dat onze AFM gebaseerd biopanning taak is een zeer krachtige techniek die kan worden gebruikt voor reagentia die ziekte-specifiek eiwit vari selectief binden genererenmieren rechtstreeks uit complexe bronnen.

Figuur 1
Figuur 1. Negatieve Biopanning werkwijze waarbij immuunbuizen. Schematische aantonen van de negatieve biopanning proces. Fagen die reactief naar eiwitten zoals BSA, geaggregeerde alpha-synuclein en gezond hersenweefsel worden verwijderd met behulp van immunobuizen zijn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Bevestiging van negatieve Panning resultaten. AFM beeldvorming wordt gebruikt om de negatieve panning stappen tegen verschillende doelen te controleren om alle reactieve fagen worden verwijderd. Hier laten we een aantal van de AFM resultaten aantonen van deniveau van faagbinding vóór en na de negatieve panning. (A) Faag binding kan worden gedetecteerd geaggregeerde alfa-synucleine deeltjes na de eerste ronde van panning negatief, maar (B) geen fagen zichtbaar na 8 ronden van negatieve panning. (C ) Na de eerste ronde van panning tegen negatieve gezonde weefsel faagbinding is evident, maar (D) geen binding wordt waargenomen na 10 ronden van negatieve panning. Alle beelden zijn 5 micrometer. De grote witte structuren op de AFM beelden zijn meestal te wijten aan zouten aanwezig in de buffers of resterende PEG van de PEG precipitatiestap tijdens faag productie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Negatieve Biopanning werkwijze waarbij Mica. Schematische demonstreren additionele negatieve biopanning behulp van mica. Vanwege beperkte steekproef mica oppervlak wordt gebruikt om eerst bindmiddelen om gezond te elimineren en dan FTD immunogeprecipiteerd TDP-43. Alvorens over te gaan tot de twee rondes van negatieve panning tegen FTD TDP-43, wordt de faag in tweeën (in het geval van mislukte isolatie van ALS TDP-43 exclusieve fagen tijdens de positieve panning fase). Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.

Figuur 4
Figuur 4. ALS Positieve Biopanning Process. Schematische aantonen van de ALS-positieve biopanning proces. De ongebonden fagen na de negatieve panning tegen FTD TDP-43 worden gebruikt in een ronde van positieve panning tegen ALS TDP-43 elueerde more ALSTDP-43 specifieke klonen. Ook twee ronden van positieve panning tegen ALS TDP-43 wordt uitgevoerd met mica oppervlak en de gebonden fagen na negatief panning tegen gezonde immunologisch TDP-43 (de gebonden fagen geëlueerd omdat deze fagen niet gezond TDP-43 moet verbinden, maar sommige kan kruisreactief zijn met zowel ALS en FTD). Drie elutie methoden worden gebruikt (trypsine, TEA en TG1 cellen) om ervoor te zorgen alle gebonden fagen worden verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. faag-ELISA screenen van potentiële ALS Clones (ALS versus HT). Met behulp van gehomogeniseerd menselijke ALS, FTD en gezond hersenweefsel (HT) monsters voerden we indirecte ELISA met gebruikmaking van faag geproduceerd uit de verschillende klonen. Resultaten worden vertegenwoordigd de verhouding aan gezond weefsel monsters. De resultaten toonden aan dat sommige klonen onderscheid tussen TDP-43 gevonden bij ALS patiënten en die bij gezonde. De ALS, FTD en HT weefsels zijn een mix van de hersenen monsters (motorische cortex) van drie personen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6. Faag ELISA screenen van potentiële ALS Clones (ALS versus FTD). Hier laten we de faag ELISA resultaten van ALS versus FTD-patiënten. De meeste van de klonen hebben een voorkeur voor ALS dan FTD. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

_upload / 52.584 / 52584fig7highres.jpg "/>
Figuur 7. scFv ELISA screenen van potentiële ALS Clones (ALS versus HT). Met behulp van de uit elke kloon kunnen we klonen die een voorkeur voor de TDP-43 van ALS-patiënten ouder dan gezonde moeten observeren scFvs. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.

Figuur 8
Figuur 8. scFv ELISA screenen van potentiële ALS Clones (ALS versus FTD). Het succes van onze panning proces wordt verder aangetoond bij het ​​vergelijken van ALS te FTD voor de verschillende scFvs in de indirecte ELISA's. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken .

manieren "> Figuur 9
Figuur 9. Dot Blot analyse van de potentiële ALS Clones. Met behulp van dot blot plaats van ELISA is een andere techniek om de specificiteit van de klonen voor ALS dan FTD of HT tonen. Kloon 2A wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie ​​van NIH: R21AG042066. We willen graag Philip Schulz bedanken voor zijn bijdragen in het creëren van de screen capture video's.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tomlinson I and J Libraries MRC (Cambridge, England)
Sheets Library MRC (Cambridge, England)
2xYT BD Sciences 244020
Glucose Amresco 0188-2.5KG
Ampicillin Amresco 0339-25G Irritant
KM13 Helper Phage MRC (Cambridge, England)
Kanamycin OmniPur 5880 Irritant
Polyethylene Glycol 8000 OmniPur 6510 Irritant
Sodium Chloride Macron 7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic Amresco 0404-1KG Irritant
Potassium Chloride EMD PX1405-1 Irritant
Potassium Phosphate Monobasic Amresco 0781-500G Irritant
TG1 Cells MRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani Agar EMD 1.10283.0500
Bovine Serum Albumin Amresco 0332-100G
STEN buffer Crystalgen Inc. 33429775
Immunotubes Thermo Scientific 470319
Mica Spruce Pine Mica 24365
Tween 20 EMD
Trypsin Sigma T-0303 Irritant
Triethylamine Sigma T-0886 Flammable
Glycerol Amresco 0854-1L Irritant
DNA Plasmid Prep Kit qiagen 27106 Irritant
Non-Fat Milk Powder Carnation
96-Well High Binding ELISA Plate Costar 3590
Anti-M13 HRP GE Healthcare Life Sciences 27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit Thermo Scientific 37074
Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody ProteinTech 10782-2-AP
A/G Agarose Beads Santa Cruz Biotechnology sc-2003
HB 2151 Cells MRC (Cambridge, England)
Isopropylthiogalactoside Teknova 13325
9e10 HRP Santa Cruz Biotechnology sc-40
Nitrocellulose Membrane Biorad 162-0115 Flammable
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope Veeco
AFM Probes VistaProbes T300R-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies. Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).
  2. Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity. Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).
  3. Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein. Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).
  4. Kasturirangan, S., et al. Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form. Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).
  5. Kasturirangan, S., et al. Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples. Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).
  6. Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells. Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).
  7. Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer's Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP. Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).
  8. Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP. Journal of Alzheimer's Disease. 28, 961-969 (2012).
  9. Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein. Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).
  10. Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis. Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).
  11. Akamatsu, M., et al. A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation. Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).
  12. Keage, H. A., et al. TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age. Journal of Alzheimer's Disease. 42, 641-650 (2014).
  13. Honda, D., et al. The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons. FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).
  14. Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).
  15. Ling, S. -C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).
  16. Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).
  17. Robertson, J., et al. Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS. Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).
  18. Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS. Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).
  19. Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons. Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).
  20. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  21. Sheets, M. D., et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).
  22. Hairul Bahara, N. H., et al. Phage display antibodies for diagnostic applications. Biologicals. 41, 209-216 (2013).
  23. Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
  24. Zhang, X., et al. Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt). Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).
  25. Liu, H., et al. Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library. Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).
  26. Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display. Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).
  27. Adamson, C. S., et al. Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display. Virology. 358, 166-177 (2007).
  28. Hebron, M. L., et al. Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6). Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).
  29. Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM. Langmuir. 25, 912-918 (2008).
  30. Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus. Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).
  31. Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., Górski, A. The influence of external factors on bacteriophages—review. Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).
  32. Hammers, C. M., Stanley, J. R. Antibody Phage Display: Technique and Applications. J Invest Dermatol. 134, e17 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics