면역이 저하 된 성인 Zebrafish의에 정상 및 악성 근육 세포 이식

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Immunology and Infection
 

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Tenente, I. M., Tang, Q., Moore, J. C., Langenau, D. M. Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (94), e52597, doi:10.3791/52597 (2014).

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Abstract

Zebrafish의 개발, 재생, 암을 평가하기위한 강력한 도구가되었다. 최근에는 동종 세포 이식 프로토콜 조사, 동계, 면역 타협 성인 지브라 피쉬으로 정상 및 종양 세포의 생착을 허가 개발되었다. 최적화 된 세포 이식 프로토콜과 함께 이들 모델은 줄기 세포 기능, 재생 부상 다음, 암의 신속한 평가를 허용한다. 여기서 우리는 면역 손상 성인 rag2 E450fs 동형 접합 돌연변이 제브라 피쉬에 제브라 피쉬 성인 골격근과 배아 횡문근 육종 (ERMS), 배아 근육과 기능을 공유하는 소아 육종의 세포 이식을위한 방법을 제시한다. 중요한 것은, 이러한 동물은 T 세포와 관련이없는 부족한 공여 동물 조직의 넓은 범위의 생착을 촉진, B 세포 기능을 감소시켰다. 우리 최적화 프로토콜은 형광 근육 세포를 위해 준비 표지 보여rag2 동형 접합 돌연변이 물고기의 등 근육에 이식 할 때 α 액틴 RFP 형질 전환 제브라 피쉬에서 관리 포인트 견고하게 접목. 우리는 또한 형광 분화 상태에 따라 세포에 국한되어 형광 형질 전환 ERMS의 생착을 보여줍니다. 특히, ERMS는 AB-변형 myf5-GFP에서 만든, mylpfa-mCherry 이중 형질 전환 동물 및 종양은 성인 면역 손상 물고기의 복막에 주입. 이러한 프로토콜의 유틸리티는 등쪽 근육 또는 성인 지브라 피쉬의 복막 내로 주입 될 수있는 정상 및 악성 도너 세포의 광범위한 생착으로 연장된다.

Introduction

그들은 절단 지느러미뿐만 아니라 손상된 뇌, 망막, 척수, 심장, 골격 근육과 다른 조직 하나를 다시 생성 할 수 있기 때문에 Zebrafish의 회생 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 세포 이식에 의한 다양한 조직에서 줄기 및 전구 세포의 식별이 최근 2를 탐험하고있는 동안 성인 zebrafish의 세포 및 재생 연구는 크게 부상에 대응 재생의 특성에 초점을 맞추고있다 줄기. (10) - 제브라 피쉬는 인간의 질병 3을 모방 유전자 변형 암 모델의 생성을 통해 암 연구를위한 사용이 증가되고있다.

암의 설정에서는 세포 이식 방법이 널리 채택되고 자기 갱신 11 이질 기능성 12,13, 14 신생 혈관 증식, 암과 같은 중요 프로세스의 동적 평가를 허용되었다,치료 반응을 15, 16, 17 및 내습. 그러나 접목 세포는 종종 공격 이식 (18)를 죽이는 면역 체계를 개최 할 예정받는 생선 거부됩니다. 몇 가지 방법이 접목 세포 거부 반응을 극복하기 위해 사용되어왔다. 예를 들어, 수신자 동물의 면역 시스템은 이식 전에 일시적으로 18,19 저용량 감마선 조사에 의해 절제된다. 그러나,받는 사람의 면역 체계 20 일까지 사후 조사를 복구하고 기증자 세포 (18)을 죽일 것이다. 대안 적으로, 치료는 덱사메타손 이상 면역 억제 조절을 제공하고, 30 일까지 14 인간 종양의 광범위한 생착을 촉진, T 및 B 세포 기능을 억제하기 위해 사용되어왔다. 이 실험은 일정한 약물 투여를 필요로 고형 종양의 연구 제한됩니다. 22, 기증자 및 recipi - 장기 생착 분석은 유 전적으로 동일 동계 라인 (20)을 사용했다엔트 세포는 일치 면역 있습니다. 그러나 이러한 모델은 관심의 유전자 변형 라인이 완전히 동계 라인을 생산하기 위해 개 이상의 세대를 위해 동계 배경으로 교차 할 필요합니다. 받는 사람 물고기 면역 거부의 문제를 미연에 방지하기 위해, 우리 그룹은 최근 면역 T 및 B 세포의 기능을 감소 및 조직 (23)의 넓은 범위의 생착을 허용하는 손상 rag2 E450fs 동형 접합 돌연변이 (ZFIN 대립 지정 rag2의 fb101) 라인을 개발했다. 유사 면역 감염된 마우스 모델은 마우스 및 사람 조직 (24)의 세포 이식을 위해 광범위하게 사용되어왔다.

여기서 우리는 골격근과 배아 횡문근 육종 (ERMS), 새로 설명 rag2 동형 접합 돌연변이 제브라 피쉬으로, 골격근과 기능을 공유하는 소아 육종의 이식 방법을 제시한다. 면역 손상 성인 제브라 피쉬의 가용성직접 시각화하고 정상 및 악성 조직 내 줄기 세포는자가 재생 (self-renewal)을 평가하기 위해 대규모 세포 이식 연구를 수행 할 수있는 능력을 확장한다. 이 방법, 형광 (25) 형질 전환 제브라 피쉬가 견고 rag2에 접목 α 액틴 RFP 성인에서 근육 세포의 준비를 표시 등쪽 근육에 주입 다음 동형 접합 돌연변이 제브라 피쉬. 또한, 우리는 생착 및 기본 myf5의 -GFP의 확장을 보여; rag2 E450fs 동형 접합 돌연변이 제브라 피쉬에 복강 내 주사 다음 mylpfa- mCherry 형질 전환 ERMS를. 이러한 프로토콜의 유틸리티는 표시된 예를 뛰어 넘어 쉽게 추가 제브라 피쉬의 재생 조직 및 암에 적용 할 수 있습니다.

Protocol

모든 동물의 절차는 프로토콜 # 2011N000127에서 연구 동물 관리에 매사추세츠 종합 병원 분과위원회에 의해 승인되었다.

성인 rag2 E450fs 동질 접합체 돌연변이 제브라 피쉬에 제 1 절 골격근 세포 이식

성인 Zebrafish의 기부자 골격근 세포의 1. 준비

  1. 형광 근육을 표시 한 형질 전환 성인 제브라 피쉬를 얻습니다. 이 실험에서, 30-α 액틴 RFP 공여체 물고기 25받는 어류 당 1 × 106 세포를 이식하기 위해 이용 하였다.
  2. 1.6 MG의 희생 기증자 제브라 피쉬는 / 10 분이나 더 아가미의 움직임이 분명하지 않을 때까지 메탄 (MS222)를 tricaine ㎖로.
  3. 흡수 종이 타월 및 소비세에 깨끗한 면도날을 사용하여 등쪽 근육을 공여 물고기를 놓습니다. 도 1a에서 언급 된 바와 같이 절단은 조직 수집을 (최대화하기 위해 45 ° 각도로 항문 부근 이루어져야
  4. 해부 조직에 500 μL 현탁 완충액 (프리 냉장 0.9 인산염 완충액 식염수, 5 % 우 태아 혈청 (FBS) 보충 된 (PBS))를 추가한다. 10 기증자 제브라 피쉬까지이 책에 함께 배치 할 수 있습니다.
  5. 세포가 균일 한 현탁액 때까지> 20 회 면도날로 조직을 말하다. 전체 지느러미 근육은 피부, 뼈와 지느러미를 포함하여 균질화. 서스펜션 버퍼 2 ML을 추가합니다. 5 ㎖ 피펫을 사용하여, 세포를 해리 세포 현탁액을 ≥20 회 연화.
  6. 얼음 상에 배치 된 50ml 원추형 튜브에 40 ㎛의 메쉬 스트레이너를 통해서 세포 현탁액을 필터.
  7. 나머지 조직을 수집하고 5 ㎖ (10 기증자 물고기가 분리 당 사용할 수있는)의 최종 볼륨, 같은 여과기 및 원뿔 튜브를 통해 필터링 서스펜션 버퍼의 추가 2.5 ml의 페트리 접시를 씻으십시오.
    참고 : 피부, 뼈와 지느러미를 여과 다음 제외됩니다. 해당되는 경우, 같은 원뿔 튜브에 유사한 현탁액을 결합한다.
  8. 트리 판 블루 및 혈구 염료를 사용하여 생존 세포의 총 수를 계산.
  9. (옵션, 2 단계)를 원하는 경우, 유동 세포 계측법 500 μl를 보유합니다.
  10. 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG, 원심 분리기 세포 현탁액.
  11. 3.33 × 10 5 세포 / μL에 뜨는에 resuspend 세포를 폐기 (0.9 PBS + 5 % FBS). 총 3 μL은 수신자 당 1 × 106 세포 (단계 3)의 총 수신자 어류 당 주입한다.
    참고 : 세포 현탁액 미만 3 μL받는 사람 물고기에 이식해야한다. 세포 수는 제한되어있는 경우,받는 사람에 따라 낮은 4 ~ 10 × 5와 같은 세포는 성공적으로 생착 (표 1)을 초래할 수 있습니다.

기증자 골격근 세포의 제조 2. 유동 세포 계측법 분석 (선택 사항)

  1. 난을 설명 된대로 야생형, 비 형질 전환 어류에서 근육을 분리N 단계 1.1. 이 샘플은 음성 대조군 역할 및 유동 세포 계측법 게이트를 설정하는 데 유용합니다.
  2. 적절한 생존 염료를 추가합니다. 예를 들어, 근육 준비의 500 μL에 스톡 DAPI 용액 (500 NG / μL)의 5 μl를 추가합니다. 분석에 약간 이전의 소용돌이. 5 × 10월 3일부터 1일까지 × 104 이벤트를 획득. 형질 전환 어류에서 분리 된 근육 세포의 분석에 의해 다음 게이트를 배치하는 최초의 야생 형 제어 샘플을 분석 할 수 있습니다.
    참고 : 유동 세포 계측법 분석은 일반적으로 해부 세포가 60 % 이상 생존 (그림 2)를 유지하는 동안 근육 조직 절제 후 1 시간 내에서 수행된다. 세포는 항상 얼음에 보관해야합니다. 총 세포 생존율은 트리 판 블루 색소 및 혈구를 사용 전에 재 이식에 평가 될 수있다.

성인 rag2 동질 접합체 돌연변이 제브라 피쉬에 골격근 세포의 3. 근육 이식

  1. 10 μ를 청소;에서 드로잉 및 70 % 에탄올 (5 배) 하였다 10 % 표백제 용액 (5 회), 추방하고 현탁 완충액 (0.9 PBS + 5 % FBS, 10 회) 하였다 의해 L 26S G 마이크로 주사기.
  2. 아가미의 움직임 느린에게까지 시스템 물에서 물고기를 포함하는 페트리 접시에 tricaine 메탄 (MS222, 4 ㎎ / ㎖ 원액)의 한 방울을 추가하여 2-4개월 된 동형 접합 rag2 돌연변이 물고기 또는 (컨트롤 등) 야생형받는 물고기를 마취 물고기는 여전히.
    참고 : tricaine 마취의 투여 량받는 사람 제브라 피쉬의 나이와 크기에 따라 달라집니다.
  3. 왼쪽면이 위를 향하도록하여, 젖은 종이 타월이나 스폰지에 마취받는 사람 제브라 피쉬를 놓습니다.
  4. latero - 등의 근육에 주사기 바늘을 삽입 (1A 그림 참조). 주사는 45 ° 각도로 수행되어 있는지 확인합니다. 수신자 당 1 × 106 세포의 총 어류 당 (1.12 단계에서 제조 된) 세포 현탁액 3 μl를 주입한다.
  5. 조심스럽게 복구 플라스틱 숟가락을 사용하여 깨끗한 탱크에 주입 제브라 피쉬를 전송합니다.
  6. 밝은 필드와 표면 형광 현미경 하에서 마취 물고기를 영상화하여 10, 20, 30 일 후 이식에서 생착 속도에 대한받는 사람 제브라 피쉬를 평가합니다.

성인 동형 rag2 돌연변이 제브라 피쉬에 제 2 절 배아 성 횡문근 육종 (ERMS) 이식

제브라 피쉬 배아 4. DNA 미세 주입

  1. 6 시간 또는 O / N 37 ° C에서 XhoI에와 DNA의 10 μg의를 소화하여 rag2-kRASG12D 플라스미드 7 선형화.
  2. 표준 페놀에 의한 DNA 정화 : 클로로포름 추출과 에탄올로 침전. 탈 이온수 20 μL에 재현 탁 (대안 적으로, 상업적 DNA 단편 정화 컬럼이 사용될 수있다).
  3. 1 % 아가 로즈 겔상에서 DNA 소화 및 소화를 실행하고 DNA (B)의 농도를 결정Y 분광계 읽기. 1, 1 : 1, 또는 실행에서 샘플을 5, 1 % 아가 로스 겔상에서 1시 10분 희석 및 DNA 래더와 비교 재배 적.
  4. 0.1 M의 KCl과 0.5 배 트리스 EDTA 15 NG 소화 rag2-kRASG12D DNA의 / μL의 최종 농도로 주입 믹스를 준비합니다. 주입 부피의 주입이 NL 최종 DNA 량은 30 PG 것이다.
    참고 : 세 가지 DNA 구조까지 효율적으로 공동 주입 배아 당 DNA의 60 페이지의 최대에있을 수 있습니다. 가이 유전자는 게놈에 통합 개발 종양 (26) 내에서 공동 발현.
  5. 관심 제브라 피쉬의 변형 (그림 1B)로 27 설명한 바와 같이 본질적으로 하나의 세포 단계의 배아로 선형화 rag2-kRASG12D을 주입한다. 주사는 높은 효율의 노른자에 셀이 아닌 수행해야합니다. 이 실험, 이중 형질 전환 AB-변형에서, myf5-GFP, mylpfa-mCherry 사용 하였다. 표준 양육 페이지를 사용하여 제브라 피쉬를 올립니다28 rotocols.
    참고 : 사출 생존 자주 사용하는 제브라 피쉬의 변형에 따라 달라집니다. 평균적으로, 주입 된 배아의 30 %는 ERMS를 개발합니다. 300-600 배아 그 GFP 양성 및 충분한 차 mCherry 양성 종양 이식 및 분석을 위해 생성되도록하기 위해 실험 당 주입한다.

Zebrafish의 유충에 차 ERMS 5. 심사

  1. 10 ~ 30 일이 외부에서 볼 수있는 기본 ERMS의 출현을 위해 주사를 게시로부터 분사 된 제브라 피쉬를 관찰합니다.
  2. 30 일 포스트 분사시 아가미 움직임 느리고 물고기가 아직까지 물고기 시스템 물을 함유하는 페트리 접시로 tricaine 메탄 (MS222 4 ㎎ / ㎖ 원액)의 단일 방울을 추가하여받는 지브라​​ 피쉬 마취.
    참고 : tricaine 마취의 투여 량받는 사람 제브라 피쉬의 나이와 크기에 따라 달라집니다. 차 종양 베어링 제브라 피쉬는 tricaine의 낮은 용량을 필요로한다.
  3. 차 ERMS 베어링을 선택표면 형광 현미경을 이용하여, myf5-GFP 양성 및 mylpfa-mCherry가 양성이다 물고기.

6. ERMS 종양 준비

  1. 10 분이나 더 아가미의 움직임이 분명하지 않을 때까지 1.6 ㎎ / ㎖ tricaine 메탄 (MS222)에서 선택한 기본 ERMS 베어링 제브라 피쉬를 희생.
  2. 개별적으로 각각의 종양 베어링 제브라 피쉬를 처리합니다. 깨끗한 페트리 접시에 생선을 놓고 면도날 및 미세 집게 (그림 1B에서와 같이)를 사용하여 종양 주위 해부. 깨끗한 페트리 접시에 해부 종양 조직을 전송합니다.
  3. 5 % 태아 소 혈청 (FBS)와 보충 미리 냉장 0.9 인산 버퍼 식염수 (PBS)의 100 μl를 추가합니다. 깨끗한 면도날 말하다 조직> 셀 때까지 20 시간은 균일 한 현탁액에 있습니다.
  4. 피펫 팁 필터링 1000 μl를 사용하여 세포를 해리 위아래로 여러 번 같은 버퍼 900 μL (0.9 PBS + 5 % FBS), 피펫을 추가합니다. 40을 통해 필터# 956; 해당하는 50 ML 원뿔 튜브에 m 메쉬 여과기입니다. 얼음에 보관하십시오.
  5. 버퍼의 추가 2-4 ml의 페트리 접시를 씻으, 같은 메쉬 스트레이너를 통해 해당 원뿔 튜브로 전달합니다.
  6. 4 ° C에서 10 분 동안 1,000 XG, 원심 분리기,.
  7. 버퍼 100 ㎕에 뜨는에 resuspend 폐기하십시오.
  8. 트리 판 블루 및 혈구 염료를 사용하여 생존 세포의 총 수를 계산.
  9. 동일한 완충액에 원하는 세포 농도로 희석 (0.9 PBS + 5 % FBS). 세포를받는 당 2.5 × 104 세포, 총 수신자 제브라 피쉬 당 5 μl를 이앙 / μL를 5 × 103 세포로 희석한다.
  10. 유동 세포 계측법 분석은 샘플 내에서 형광 세포의 상대적인 비율을 양자화하는 단계 6.5에서 현탁액의 소량을 행할 수있다.
    참고 : 옆 (단계 3.5 필터링 다음) 세포 현탁액 100 ㎕ 설정하고 400 μL로 희석유동 세포 계측법 분석을위한 0.9 PBS + 5 % FBS 서스펜션 버퍼의. 적절한 게이팅을 보장하기 위해, 성인 야생형, myf5-GFPmylpfa-mCherry 물고기에서 고립 된 단일 유전자 변형 종양 조직 또는 근육을 사용하여 추가 분석을 수행합니다. 제 1의 2 단계에 설명 된대로 본질적으로 유동 세포 계측법을 수행합니다.

성인 rag2 동질 접합체 돌연변이 제브라 피쉬에 ERMS 7. 이식

  1. (5 회)에서 드로잉 10 % 70 % 에탄올 이어 표백 용액 (5 회), 추방함으로써 10 μL 26S G 마이크로 주사기를 청소 한 후 현탁 완충액 (0.9 PBS + 5 % FBS, 10 배 이어 ).
  2. 아가미 움직임 느리다 물고기가 계속 될 때까지 시스템을 물에 물고기를 포함하는 페트리 접시로 tricaine 메탄 (MS222 4 ㎎ / ㎖ 원액)의 단일 방울을 추가하여 수신자 동형 접합성 rag2 돌연변이 물고기 마취.
  3. 젖은 종이 타월 또는 SPO에 마취받는 사람 제브라 피쉬를 배치NGE, 복부면이 위를 향.
  4. 복강 (받는 당 2.5 × 104 세포)에 세포 현탁액의 5 μL를 주입한다.
    주 : 단계 4.1에 기재된 바와 같이 주입 바늘이 다른 종양의 주사를 청소한다. 5 내지 10 μL 효율적받는 물고기 크기에 따라 복강 내 이식 할 수있다. 종양 생착을받는 어류 당 1 × 104 5 × 5 × 정렬되지 않은 세포 (표 1)을 주입함으로써 달성 될 수있다.
  5. 조심스럽게 플라스틱 스푼으로 깨끗한 탱크에받는 사람 제브라 피쉬를 배치합니다.
  6. 밝은 필드와 표면 형광 현미경 하에서 마취 물고기를 영상화하여 10, 20, 30 일 후 이식에서 생착 속도에 대한받는 사람 제브라 피쉬를 평가합니다.
  7. 분화 상태 (그림 3H), 표준 조직 학적 analy을 평가하기 위해 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 포함하여 다운 스트림 애플리케이션에 접목 물고기를 활용SIS (도 3f), 촬상 요법 응답 (15), 및 / 또는 직렬 이식 희석 분석 (11)을 포함하여 제한에 접근한다.

Representative Results

면역에 준비하고 α 액틴 RFP 형질 전환 기증자 골격 근육 세포를 이식하는 과정은 동형 접합 rag2 돌연변이 제브라 피쉬를 손상 (프로토콜 제 1 절, 그림 1A그림 2) 입증되었다. 골격 근육 조직은 α 액틴 RFP 형질 전환 공여자로부터 제조하고, 유동 세포 계측법 분석 (도 2b) 아래의 DAPI 배제하여 평가 결과로 단일 세포 현탁액을 84.3 % 생존 세포를 함유 하였다. RFP 양성 세포는이 단일 세포 현탁액 (도 2C)의 35.3 %를 차지. (물고기 당 주입 1 × 10 6 세포, 표 1, 그림 2D-I) 다핵 섬유로 단일 세포의 분화에 의해 평가로 rag2 동형 접합 돌연변이받는 물고기의 지느러미 골격 근육 세포의 이식은 일관되고 강력한 생착되었다. 와일드 유형받는 사람 물고기는 30 일 실험 (n은 = 13)을 통해 근육 섬유를 접목하는 데 실패했습니다. 10 일 후 이식으로 14 rag2 동형 접합 돌연변이 제브라 피쉬 중 9 주입 (64.3 %, 그림 2E, F)의 사이트 근처 RFP 양성 근육 섬유가 포함되어 있습니다. 중요한 것은, 접목 RFP 양성 근육 후 생착과 나타내는 강력하고 지속적인 근육 생착 (데이터 미기재) 1백15일 동안 추적되는 동물의 서브 세트로, 이식 후 삼십일 (도 2G-I)로 유지. 이러한 결과는 동일한 프로토콜 (표 1)를 이용하여 우리 그룹 (23)에 의해 이전에보고 된 것과 유사하다.

또한 rag2 동형 접합성 돌연변이받는 물고기 (프로토콜 부분이,도 1b 및도 3)의 복강 내로 ERMS 종양 세포의 발생, 제조 및 이식하는 방법을 제시 하였다. ERMS doubl에서 생성 된전자 형질 전환 myf5-GFP, mylpfa-mCherry 물고기 인트라 즉 종양 이종 이식 (11) 다음과 같은 종양 세포 개체군의 기능 분석의 시각화를 허용하는 것으로 나타났다. 이들이 10 내지 30 일의 생활 종양 세포의 수가 하류 애플리케이션에 한정되는 사이 ERMS를 개발할 때 물고기가 작기 때문에, 각각의 하위 집단의 상기 분자 특성화가 어렵다. 하나의 해결책은 성인받는 사람 제브라 피쉬에 ERMS를 engrafting에 의해 종양 세포 수를 확장하는 것입니다. 지금까지 유사한 실험 CG1 - 변형 동계 물고기를 사용하여 완료하고 myf5-GFP를위한 형질 전환했다 동계 라인을 개발하기 위해 교잡의 4 세대를 초과 필요한; mylpfa-mCherry. 이러한 문제를 회피하기 위해, 우리는 AB-변형 제브라 피쉬에서 차 ERMS를 접목하는 면역 손상 rag2 동형 접합 돌연변이받는 사람 제브라 피쉬의 유틸리티를 보여 주었다. 모든 차 ERMS는 접목G2 종양 (표 1)의 팽창을 용이 동형 접합성 돌연변이 동물. 0 ~ 7의 야생형 형제 질병 (23)을 접목하면서 유사한 결과가 최근에, 24 개의 27 rag2 동형 접합 돌연변이 제브라 피쉬의 접목 ERMS의보고되었다. 접목 ERMS의 대표적인 예는 그림 3E에 30 일 후 이식에 표시됩니다. 접목 ERMS는 일차 종양 (도 3b 및도 3F)에서 발견 된 것과 유사 배아 성 횡문근 육종, 조직 학적 특징을 공유한다. FACS 분석은 그 myf5-GFP 및 / 또는 mylpfa-mCherry을 발현하는 세포 및 분화 세포를 전파 기능적으로 뚜렷한 종양을 포함 ERMS 확인했다. 복강 내 주사 절차 후 생존율은 95 %를 초과했다. 받는 사람 제브라 피쉬는 일반적으로 30 일 이식 후 시점 후 종양 부담에서 굴복한다.


(A) 정상 및 (B) rag2 동형 접합성 돌연변이로 악성 골격근 세포 이식 그림 1. 프로토콜 개략적 제브라 피쉬. 선택 단계는 (*)로 표시됩니다.

그림 2
rag2 동형 접합 돌연변이 제브라 피쉬에 그림 2. 골격 근육 생착. (A) α 액틴 RFP 형질 전환 기증자 제브라 피쉬. 절연 근육 세포 현탁액 (B) 세포 생존율 DAPI 염색에 의해 평가 제외 유세포 분석기로. 야생형 대조군에 비해 (C) α 액틴 RFP 공여체 (레드)에서 근육 세포 현탁액 내에서 발견 RFP 양성 세포의 비율(회색). (DE)는 삼십일 이식 후에서 밝은 필드와 야생형 동물 (D) 또는 rag2 동형 접합 돌연변이 물고기 (E)의 형광 이미지를 병합. 시간이 지남에 따라 (F) 생착 속도. 회색이 아닌 접목 물고기를 표시하는 동안 빨간색 접목 동물의 수를 나타낸다. 각 시점에서 분석 된 동물의 수는 표시된다. 시간 (화살촉)를 통해 차별화 된 근육 섬유의 유지를 표시 (GI) 10 (G)에 표시 패널 E의 박스 영역의 높은 배율 이미지, 20 (H) 및 30 (I) 일 이식 후. 스케일 바는 2mm 같아. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
myf5-GFP의 그림 3. 이식, rag2 동형 접합 돌연변이에 mylpfa-mCherry ERMS . AB-변형 myf5-GFP에서 발생하는 제브라 피쉬 (AD) rag2-kRASG12D 유도 주 ERMS; 생명 30 일에 mylpfa-mCherry의 제브라 피쉬. (EH) rag2 동형 접합 돌연변이 제브라 피쉬 ERMS와 접목 및 이식 후 삼십일에서 분석 하였다. (A, E)는 밝은 필드와 기본 및 이식 ERMS의 형광 이미지를 병합. 종양 영역은 설명하고 화살촉은 E에서 주사 부위를 나타냅니다. (B, F) Hematoxylin- 암과 관련된 증가 세포 수의 영역을 표시 차 (B)의 에오신 염색 파라핀 섹션과 접목 ERMS (F). (C,DAPI 염색 배제에 의해 평가 및 유동 세포 계측법으로 G) 세포 생존 능력. (D, H) 형광 종양 세포의 서브 모집단 유세포로 평가. 스케일 바는 2mm (A, E) 50 μm의 (B, F)을 동일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1
ERMS 근육 세포 이식 생착 표 1. 결과. (*)는 이전에 동일한 기술을 사용하여 데이터 (23)를보고 나타낸다. 데이터가 자연 방법에서 허가 재판된다에게. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

성인 등의 골격근의 효율적이고 강력한 생착이 rag2 동형 접합 돌연변이 물고기의 등 근육에 세포를 주입 한 다음 아주 간단한 세포 제조 방법으로 달성했다. 몇몇 관련된 사망 즉시 10 %에서 35 %에 따라 실험에 이르기까지 주입 절차를 다음과 같이 일반적으로 근육 주사 절차가 매우 강력했다. 추가 최적화 가능성이 세포를 이식의 용이성을 용이하게 주입 및 현미경과 미세 조작기를 이용하여 고정 사출 장치의 개발을위한 작은 게이지 바늘의 사용에 중심됩니다. 우리의 접근은 또한 공여 동물에서 정렬되지 않은 근육 세포를 이용하고 약 30 %에만 근육 모세포를 함유 하였다. 가능성이받는 물고기로 증가 생착로 이어질 풍부한 세포 현탁액을 제공 할 것입니다 줄기 세포와 FACS 분리 라벨을 유전자 변형 기자 라인의 사용. 골격근 C이전 29 설명 된대로 ELL 학생은, 농축 및 이식 배양 이전 할 수있다. 놀랍게도, 우리의 결과는 또한 십일 근육 생착 및 재생을 평가하기위한 강력하고 빠른 실험 플랫폼으로이 모델을 수립, 이식을 게시하기 전에 틈새 설립 및 기증자의 근육 조직의 분화의 단계가 발생을 나타냅니다. 또한,이 실험은 굳어 cardiotoxin 또는 염화 바륨과 근육의 사전 부상 (30, 31)를 생착하기 전에 이일을 필요 마우스, 완료 것과 대조. 이는 이식 과정 중에 생성 바늘 부상받는 동물 32,33 내의 재생 환경의 생산을 자극하여 생착을 증강 가능성이있다. 또한 초기 골격근 발달에 영향을주는 유전 적 돌연변이의 평가를 허용하는, 우리의 방법은 쉽게 이하 지브라 피쉬에서 골격 근육 조직의 이식에 적응되도록 구상하지만 애벌레 단계에서 치사로 이어집니다.

우리는 또한 비 에어컨, rag2 동형 접합 돌연변이 물고기로 복강 내 주사하여 제브라 피쉬 ERMS의 생착에 대한 자세한 프로토콜을 제공하고 있습니다. 이 접근법은 동계 트랜스 제닉 라인 내의 종양을 생성하기위한 트랜스 제닉 없이도 이중 차 종양의 확장에 유용 하였다. 우리의 최근의 연구는 세포 이식 방식은 단일 종양 동물의 수천으로 확장과 성장, 자기 갱신 및 신생 혈관 (15)에 미치는 영향을 평가할 수있다 생체 내에서 ERMS 약물 민감도를 평가하기 위해 새로운 실험 모델을 제공하는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 우리는 성공적 T 세포 급성 림프 모구 백혈병, 흑색 종, 및 23를 포함 ERMS rag2 동형 접합성 돌연변이 물고기 종양 내로의 광범위한 접목했다. 미래를 향해 찾고, 우리는이 선이 암의 중요한 기능적 특성을 평가하기위한 도움이 될 것입니다 구상내 종양 대 이질성, 침공, 전이, 혈관 신생, 및 치료에 저항을 평가를 포함하는 생체 내. 또한, 광학적으로 투명한 캐스퍼 변형 제브라 피쉬 (34)에 rag2 동형 접합 돌연변이 물고기의 발생 가능성이 암의 이러한 특징의 많은 직접 영상을 촉진 할 것이다.

총에서, 우리는 성인 rag2 동형 접합 돌연변이 면역 손상 제브라 피쉬에 정상 표시 - 형광 및 악성 골격 근육의 성공적인 생착에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

Acknowledgments

이 작품은 재단 (DML), 미국 암 학회 (DML), MGH 하워드 굿맨 원정대 (DML), 건강의 미국 국립 연구소가 부여 스탠드 알렉스의 레모네이드에 의해 지원됩니다 R24OD016761 및 1R01CA154923 (DML). CNY 유동 세포 계측법 코어 및 흐름 이미지 분석, 공유 기기 허가 번호 1S10RR023440-01A1. IMT는 과학 기술의 포르투갈어 재단 (- FCT Fundação 파라 Ciência 전자 TECNOLOGIA)에서 친교에 의해 투자된다. QT는 중국 장학위원회가 자금을 지원한다. 우리는 그녀의 도움의 의견과 조언을 안젤라 Volorio 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris-EDTA buffer solution 1x Sigma-Aldrich 93283-100ML Microinjection. Injection mix.
Potassium Chloride Fisher Science Education S77375-1 Microinjection. Injection mix.
XhoI Restriction Enzyme New England Biolabs R0146S Microinjection. Plasmid linearization.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 (50) or 28106 (250) Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb.
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol Fisher Scientific BP1753I-100 Microinjection. For purification of linearized plasmid.
UltraPure Agarose, 500 g Invitrogen 16500-500 Microinjection. Linearized plasmid quantification.
Nanodrop 2000 Spectrophotometer Thermo Scientific http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx Microinjection. Linearized plasmid quantification.
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) Life Technologies D1306 flow cytometry/FACS
5 ml polystyrene round bottom tube BD Falcon 352058 flow cytometry collection tube
BD FACSAria II BD Biosciences Special Order Research Products (SORP) program FACS
5 ml polypropylene round bottom tube BD Falcon 352063 FACS collection tube
BD LSR II BD Biosciences Special Order Research Products (SORP) program flow cytometry
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) Life Technologies 10010-023 transplantation
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-01 transplantation
Tricaine methanesulphonate (MS-222) Western Chemical Inc. http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html Transplantation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin.
VWR Absorbent Bench Underpads VWR 56616-018 Transplantation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative.
Singe Edge Industrial Razor Blades VWR 55411-050 transplantation
Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile VWR 25384-302 transplantation
Cell Strainer, 40 µm Nylon Falcon-Corning Incorporated 352340 transplantation
50 ml Centrifuge Tube Corning Incorporated 430828 transplantation
Trypan Blue Stain (0.4%) Life Technologies 15250-061 transplantation
Hemacytometer Set  Hausser Scientific 1483 transplantation
Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 µl, needle size 26s ga (bevel tip) Hamilton 80366 transplantation
Austin's A-1 Bleach, Commercial James Austin Company Transplantation. Any commercial solution can be used.
Ethanol 190 Proof Decon Labs, Inc. DSP-MD.43 Microinjection (linearized plasmid purification) and transplantation. Any commercial  solution can be used.
High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge Denville Scientific Inc. C0265-24 transplantation
Sorvall Legend XFR Centrifuge Thermo Scientific 75004539  Transplantation. Catalog number for 120 V, 60 Hz (US).
5 ml serological pipets BD Falcon 357529 transplantation
Corning Stripettor Plus Pipetting Controller Corning Incorporated 4090 Transplantation. Any automatic pipetting controller can be used.
Powder free examination gloves All steps. Any commercial brand can be used.
Filter pipet tips and micropipettes All steps. Any commercial brand can be used.
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11205-20 transplantation
Fluorescent Stereomicroscope Olympus MVX10 Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used.
Olympus DP72 microscope digital camera Olympus DP72 Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used.

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References

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