Ultraschall Basierend Beurteilung der koronaren Herzfluss und koronare Flussreserve Mit der Drucküberlastung Modell an der Maus

1Cardiac Muscle Research Laboratory, Cardiovascular Division, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Division of Cardiovascular Medicine, Chi-Mei Medical Center, Tainan
* These authors contributed equally
Published 4/13/2015
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Medicine

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Chang, W. T., Fisch, S., Chen, M., Qiu, Y., Cheng, S., Liao, R. Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice. J. Vis. Exp. (98), e52598, doi:10.3791/52598 (2015).

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Abstract

Introduction

Clinical Aortenstenose (AS) ist gut bekannt, eine fortschreitende Zunahme der linksventrikulären (LV) Nachlast fördern. Um sich für diese chronisch steigenden hämodynamische Belastung zu kompensieren, erfolgt LV Hypertrophie (LVH) als adaptive Reaktion 1,2. Die Entwicklung der LVH ist oft mit Anomalien in koronaren Mikrozirkulation verbunden. Es wird vermutet, dass die mikrovaskuläre Dysfunktion trägt zu chronischer Ischämie in Patienten 5. Neben Koronarfluss 3,4, koronare Flussreserve (CFR) stellt Funktionsänderung der Koronararterien 1,3 und wird als das Verhältnis der maximalen Strömungsgeschwindigkeit in Hyperämie in den Ausgangsströmungsgeschwindigkeit oder ruhenden Strömungsgeschwindigkeit 4,6,7 definiert. CFR während LV Remodeling 1-3,5-9 verringert, und wird als Index für das Ausmaß der funktionalen Schwere koronare Dysfunktion 1,10,17 verwendet. Es ist bekannt, in vielen Formen der dilatierten Kardiomyopathie 10 sowie koronarer s beeinträchtigttenosis 6. CFR ist auch ein prognostischer Marker für schlechte klinische Ergebnisse 12.

LV Remodeling in der Einstellung der Herzdysfunktion, wie Ischämie oder LVH wird auch durch umfangreiche Fibrose, Veränderungen bei der koronaren Mikrozirkulation und Verdickung der Koronararterien 1,2 begleitet. Als Ergebnis dieser Veränderungen in koronaren Physiologie, dürfte Umbau der Koronararterien. Dies trägt zur Milderung von niedrigen Sauerstoffdiffusion und LV diastolische Dysfunktion, die in der Anfälligkeit für myokardiale Ischämie 1,2,13 führen kann.

Genetisch veränderte Mäuse, sind jetzt eine weit verbreitete Untersuchungstool für die Nachahmung menschlicher Erkrankungen Erkrankungen wie koronare Atherosklerose 5,7,10,12,17. Vor allem die Drucküberlastung Modell bei Mäusen wurde weitgehend untersucht 14,17. Das trans Aortakonstriktion Modell (TAC) wurde gezeigt, dass mit umfangreichen Fibrose und coronar zugeordnet werdeny Stenose resultierende, teilweise aus den medialen Verdickung der Koronararterien und mit begleitenden Änderungen im Koronarfluss Muster 1,11,17,19 ähnlich dem, was bei der Einstellung der LVH beim Menschen erwartet. Obwohl bekannt ist, dass eine längere Drucküberlastung führt zu dekompensierter Herzinsuffizienz in etwa 4-8 Wochen, die Auswirkungen auf die koronare Flussdynamik und Flussreserve in diesen Modellen, frühzeitig in den Prozess der Krankheitsprogression und in verschiedenen Stadien nach Streifenbildung, noch bisher klar.

Zahlreiche Stämme von Mäusen sind derzeit für Forschungszwecke, auch gut charakterisierte LDLR verfügbar - / - oder ApoE - / - Mäusen 10-12, und diese haben die Entwicklung von empfindlichen Techniken zur Beurteilung der Herz-Kreislauf-Funktion und Morphologie in lebenden Mäusen 11-15 aufgefordert werden. Solche Techniken umfassen MRI, PET, Kontrast CT, hochfrequenten Ultraschall, und Elektronenstrahltomographie 2,9,17,19, die alle für versprechende Alternativen zu invasivenMethoden wie die Herzkatheter und Koronarangiographie 12. In Mäusen, die mit sehr kleinen Größe der Herzkranzgefäße und hoher Herzfrequenz (HR), Bildgebung von Herzkreislauf noch eine technische Herausforderung für viele derzeit verfügbaren Techniken 4,12. Interessanterweise gab es einen exponentiellen Anstieg in dem technischen Fortschritt auf dem Gebiet der transthorakalen Dopplerechokardiographie (TTDE), einschließlich der Entwicklung von Hochfrequenz-Array Scanköpfe mit Mittenfrequenzen von 15 bis 50 MHz eine axiale Auflösung von etwa 30 bis 100 & mgr; m in einer Tiefe von 8 bis 40 mm, und Bildraten von mehr als 400 Bildern eingefangen / sec. Im Gegenzug haben TTDE-basierte Techniken als potenziell leistungsfähiges Werkzeug zur Abbildung größer 2 oder sogar kleinere Schiffe entstanden, wie Koronararterien 5,12.

Ein weiterer wichtiger Fortschritt, der es ermöglicht hat Ermittler zu diagnostischen bildgebenden Untersuchungen des Gefäßsystems in kleinen a führennimals der sorgfältig kontrollierten Einsatz von Anästhetika, die das Herz und die Atmungsrate der Tiere während der Bild 11 aufrechtzuerhalten. Kontrollierter Anästhesie Wartung ist besonders wichtig für Studien zur Gefäßerweiterung bei Mäusen verwandt, und die Wirkung der Narkose muss auch in diesem Zusammenhang 10,11 weiter untersucht werden. Bei Menschen, andererseits TTDE abgeleiteten CFR Messungen zu einem häufig verwendeten Werkzeug zur Auswertung der stenosierten und nichtblockierten epikardialen Koronararterien, überwiegend in der linken vorderen absteigenden (LAD) Koronararterie 5,16. Allerdings ist die prognostische Bedeutung der CFR und koronare Flussänderungen bei asymptomatischen Patienten oder Mäuse mit gut erhaltener systolischer Funktion in Ruhe viel weniger erforscht 16 gewesen. Daher das Ziel der Studie war es, zunächst eine klare Schritt-für-Schritt-Protokoll, auf Veränderungen in Koronarfluss mit TTDE in einer Drucküberlastung Mausmodell zu bewerten; zweitens, diese Studie untersuchte die prognostisches Zeichenificance der CFR und Koronarfluss sich infolge einer Überlast Stress in diesen Mäusen unter Druck. Wir vermuten, dass TTDE fundierte Beurteilung der CFR und Koronarfluss kann bei der Früherkennung der koronaren Dysfunktion LV Dysfunktion vorausgehen kann.

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Protocol

Hinweis: Alle Verfahren wurden bei Mäusen nach American Veterinary Medical Association (AVMA) Richtlinien durchgeführt und genehmigt Institutional Animal Care und Verwenden Komitees (IACUC) Protokolle.

1. Studiendesign

  1. Verwenden Sie 8-10 Wochen alten männlichen C57BL / 6 Mäuse (BW ~ 25 g) in der Studie.
  2. Zufälliger Mäuse (n = 11) in zwei Gruppen, die Studiengruppe für Aortenbandierung ausgewählte (n = 8) und der Kontrollgruppe (n = 3), um Scheinoperation via Thorakotomie unterzogen werden.
  3. Bereiten Sie das Tier für die Bildgebung durch Entfernen von Haaren aus der Brust mit Enthaarungscreme, die für medizinische Zwecke ist.
  4. Führen Sie eine erste Ultraschall (Abschnitt 2) 24 Stunden vor Aortenbandierung zum Ausgangsparameter am Tag -1 zu bestimmen, zwischen einem Bereich von 1% und 2,5% Isofluran (mit 100% O 2 über nosecone gemischt) induzierte Anästhesie.
  5. Wählen Sie einen medizinisch zugelassenen Anästhetikum (dh Isofluran) und Überwachung der Grad der Anästhesie (2-3% auf Indu-ce und 1,0% zu halten).
    HINWEIS: Das richtige Anästhesie ist entscheidend bei der Aufrechterhaltung der Herzschlag bei normaler physiologischer Frequenzen (etwa 500 Schläge / min).
  6. Bestätigen die Tiefe der Anästhesie durch Verlust der Bewegung von dem Tier als Antwort auf ein Pedal-Rückziehreflex. Verwenden paralube Tierarzt Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
  7. Führen Chirurgie am Tag 0 20,21.
  8. Für Aortenbandierung, Ligation der Aorta mit einer 7-0 Seidenfaden um einen konischen 26 G-Nadel auf dem Bogen platziert.
    HINWEIS: Details zur Versuchsprotokoll, einschließlich der chirurgischen Aortenbandierung Verfahren sind bisher 20,21 beschrieben.
  9. Führen Sie nach der Operation der Ultraschallbildgebung (Abschnitt 2) am Tag (e) 2, 6 und 13.
  10. Euthanize die Mäuse am Tag 14 und Ernte der Herzen für die histologische Bewertung. Euthanize die Tiere mit einer Überdosis Pentobarbital, gefolgt von Entfernung ein lebenswichtiges Organ wie das Herz. Verhaften Sie die Herzen in diastole und fixieren mit Formalin. Verwenden Sie das Verfahren des Herzens der Ernte, die zuvor 22 beschrieben wurde.
  11. Fix alle Herzgewebe mit gepufferte 10% Formalinlösung. Für Trichromfärbungen einbetten Gewebe in Paraffin vor dem Schneiden. Verwenden Sie die Details Trichromfärbungen, die gut vorher 14,23 veranschaulicht wurden.
  12. Analysieren Sie die Daten mit Offline-Software (Abschnitt 3).

2. Imaging Protocol

  1. Lange und kurze Achse Bilder septal Koronararterie (SCA) (B-Mode)
    1. Mit MS550D Sonde mit Mittenfrequenz von 40 auf die aktive-Port angeschlossen MHz, stellen Sie die Anwendung voreingestellt auf "Herzbildgebung".
    2. Mit dem Tier in Rückenlage auf dem beheizten Plattform und unter Narkose über Bugnase gesteuert, positionieren Sie die Sonde mit dem Schienensystem, um die parasternalen langen Achse (PSLAX) (1A) zu erhalten. Achten Sie immer darauf, dass das Tier warm vorgewärmten platfor gehaltenm und die Körpertemperatur wird bei physiologischen Werten gehalten.
    3. Drehen Sie die Sonde (mit Kerbe nach kaudal) im Uhrzeigersinn, so dass die Sonde Winkel 15 ° nach links Parasternallinie (Langachsenansicht) (Abbildung 1B).
    4. Stellen Sie die Sonde Winkel durch Kippen leicht entlang der y-Achse der Sonde, um ein Volllängenlängsansicht der SCA in der Mitte des Bildschirms (1B) zu erhalten.
    5. Wenn Sie die korrekten Sehenswürdigkeiten (Aortenklappe und Lungenarterie) betrachtet werden, cine Speicher das Bild mit der höchsten Bildrate möglich.
    6. Bei Nutzung der "xy" Achsen Mikromanipulatoren (1D), passen Sie die Sondenposition, um das klarste Bild des SCA erhalten.
    7. Drehen der Sonde 90 ° (mit Kerbe nach kaudal) im Uhrzeigersinn, so daß gekerbten Ende der Sonde ist an der linken Seite der Mittellinie (kurze Achse) (Abbildung 1C).
  2. Lange und kurze Achse Bildern von SCA (Farbdoppler Mode)
    1. Sobald ein B-Modus Bild aufgenommen oder Kino gespeichert, klicken Sie auf den Farb-Doppler-Taste auf der Tastatur, um Farb-Doppler-Schallfenster (Abbildung 2) zu drehen.
      ANMERKUNG: Dies hilft Koronararterie isolieren (weißer Pfeil gibt SCA) entweder in der Länge (Figur 2A) bzw. in der kurzen Achse (2C). Rote Farbe wird als in Echtzeit zu sehen und zeigt die Strömungsrichtung (weg von der Aortenklappe).
    2. Stellen Sie sicher, dass die Tiefenschärfe (mit einem gelben Pfeilspitze auf der rechten Seite des Bildschirms angezeigt wird), liegt im Zentrum der Koronararterie.
    3. Stellen Sie sicher, dass die Daten aufgezeichnet werden, mit dem Cine-Speichertaste, mit der höchstmöglichen Bildfrequenz (> 100 Bilder / s).
  3. PW-Doppler-Imaging von SCA (Pulsed-Wave oder PW-Modus)
    1. Während in der Farbe-Doppler-Modus, klicken Sie auf den PW-Taste auf der Herzkranzgefäße (Abbildung 2, in rot dargestellt) zu bringen, ein gelb-Anzeigelinie.
    2. Setzen Sie den gelbenPW Linie in der Mitte der Koronararterie in Ansicht, in einem Winkel, der die Richtwirkung der Strömung parallel. Beachten Sie, dass Geschwindigkeitsmessungen sind stark abhängig von dem Winkel der Bildaufnahme.
    3. Stellen Sie den Winkel des Flusses (PW Winkel-Taste) und Probenvolumen (SV-Taste), so dass der PW Winkelschlüssel ist 60 ° oder weniger und Probenvolumen erfasst fließen direkt im Zentrum des SCA vor.
    4. Verwenden cine Speicher, um die Wellenformen, die die Geschwindigkeit des koronaren Flusses an Spitzensystole (S) und Diastole (D) (3A und 3B) zeigen, zu erfassen, unter Verwendung von 1% und 2,5% Isofluran.

3. Daten Berechnung und Analyse

  1. Wählen Sie die Geschwindigkeit zeitliche Integral (VTI) Werkzeug, um den Höhepunkt des systolischen und diastolischen Geschwindigkeiten von den in den 3A und 3B gezeigten Bilder zu erhalten.
  2. Berechnen Sie die koronare Flussreserve Index (CFR) als das Verhältnis der hyperämisch (2,5% Isofluran) Spitzen diastolischen fniedriger Geschwindigkeit zum Ausgangswert (1% Isofluran) Spitzen diastolischen Strömungsgeschwindigkeit.
  3. Berechnen Sie die S / D-Verhältnis als die maximale systolische Herzkranzströmungsgeschwindigkeit / Peak diastolischen Herzkranzströmungsgeschwindigkeit. Bestimmen Sie das Verhältnis zu Beginn der Studie (1% Isofluran) und Hyperämie (2,5% Isofluran).
  4. Für Standard-Herzfunktionsparameter wie FS, FAC, LVM finden Sie in den Handbüchern des Herstellers, um die Datenanalyse durchführen proprietäre Software oder beziehen sich auf Chengs JoVE Papier 2.

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Representative Results

Von den 11 Mäusen, die von einem einzigen Beobachter zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht wurden (gebändert, n = 8 und Schein, n = 3), angemessene und reproduzierbare Bilder wurden: an der Grundlinie (D-1), D2, D6 und D13 . Außerdem wurde die Strömungsgeschwindigkeit an der Verengungsstelle als 2225 ± 110,9 mm / s gemessen wird, verglichen mit 277,5 ± 10,51 mm / s in den schein-Mäusen am Tag nach der Operation (p <0,05). Die Erhöhung der Geschwindigkeit war die Überprüfung der erfolgreichen Etablierung des Drucküberlast-Modell. Das SCA Strömungsgeschwindigkeit, die auch hier als CF Geschwindigkeit des CFR und den S / D-Verhältnisse bezeichnet wurden erfolgreich an der Basislinie und unter Hyperämie in allen Mäusen bewertet. In Abbildung 3 sind CF Veränderungen sham-Mäusen unter 1% und 2,5% Isofluran. Die Schein-Gruppe zeigte die Grundlinie diastolischen CF Geschwindigkeit von ~ 200 mm / s und Hyperämie induziert CF Geschwindigkeit von> 600 mm / s. Der Anstieg des diastolischen CF Geschwindigkeit und bei 13 Tagen in allen Mäusen aufrechterhalten (n = 3, p> 0,05). Gezeigtin den 3E und 3F sind die CF Veränderungen der gebändert Mäusen festgestellt, bei 1% und 2,5% Isofluran auf. Diese Mäuse zeigen ein ähnliches Muster der Induktion der hyperämisch (2,5%) gegenüber dem Ausgangs (1%) CFvelocity. Doch in dieser Gruppe zeigte die diastolische CF Geschwindigkeit einen dramatischen und eine systematische Reduzierung über die 14-tägige Testphase. Speziell wurde der diastolische CF Geschwindigkeit in dieser Gruppe von 600 mm / s (Ausgangswert) auf <200 mm / sec (Tag 13, Post banding) gedämpft. 4B faßt die hyperemisierend Reaktion dem CF Geschwindigkeitsänderungen gesehen, in den beiden Gruppen von Mäusen über 14 Tage untersucht.

CFR wird als das Verhältnis der Peak diastolischen Fließgeschwindigkeit in der SCA während maximaler Vasodilatation 2,5% Isofluran zu Ruheströmungsgeschwindigkeit unter minimal 1% Isofluran induzierter berechnet. 4C fasst die Veränderungen CFR gesehen, wie in der Sham und gebänderten Mäusen ausgewertet. Anders als bei der Sham-Gruppe zeigten die Mäuse ein gebändertmarkiert und kontinuierlicher Rückgang der CFR, ab 3. Tag nach der Operation und anhaltenden Durch Tag 13. Diese stetige Senkung CFR war suggestive der fortschreitenden Herzkranz Dysregulation was eine Verringerung der myokardialen Perfusion, vermutlich durch die Erhöhung der Nachlast induziert durch aortic banding ( n = 4; p <0,05). Vor Streifenbildung wurde durchschnittlich CFR für die Mäuse als 2,53 ± 0,47 berechnet, sondern von 13 Tage nach Banding, das CFR in der gleichen Mäusen verringerte sich auf 0,59 ± 0,27.

Der systolische diastolischen koronaren Geschwindigkeitsverhältnis (S / D-Verhältnis) ist ein weiterer Indikator für die koronare Dysfunktion. CF wesentlichen tritt während der Diastole, verglichen mit der Systole. Als solcher spielt CF in der Diastole eine herausragende Rolle bei der Aufrechterhaltung der myokardialen Perfusion 9,15. Es wurde berichtet, dass die distal zur Stelle der koronaren Stenose, gibt es einen Trend in Richtung auf eine Entzerrung des systolischen und diastolischen Beitrag zur Gesamt CF 17. Zusätzlich kann ein signifikanter Unterschiedzwischen S / D-Verhältnis zwischen normalen und erkrankten Arterien 18 beobachtet. Ein Cut-Off-Wert von S / D-Verhältnis von 0,58 wurde vorgeschlagen, zwischen signifikanten und nicht signifikanten Läsionen zu unterscheiden.

Wie in 5 gezeigt, dieses S / D-Wert stieg in der Gruppe nur gebändert, sowohl an der Grundlinie und in der hyperämisch Zustand. Es gab eine signifikante Senkung des diastolischen Koronarfluss Geschwindigkeit nach Aortenbandierung. Diese teil trug zur Erhöhung der S / D-Verhältnis (D0 bis D13, 0,45 ± 0,05 bis 0,83 ± 0,02 in der Grundlinie und 0,27 ± 0,02 bis 0,27 ± 0,01 in hyperemisierend Zustand). Als Ausgleichsmechanismus in Reaktion auf verminderte Sauerstoffversorgung und verringert Myokardperfusion, LV Kontraktilität erhöht, was zu einer gleichzeitigen Erhöhung der koronaren systolischen Strömungsgeschwindigkeit (D0 bis D13, 89,2 ± 3,2 bis 202,5 ​​± 0,85 mm / sec).

Die Echodaten wurden mit histopathologischen Daten zu erhalten Benchmarkaus dem Herzen, die an Tag 14 geerntet wurden, von allen Tieren ed. Die letztere Technik ist der derzeitige Goldstandard für die koronare Funktion Beurteilung 11. Die hämodynamischen Parameter in der Studie bewertet korreliert gut mit histopathologischen Veränderungen in der Maus SCA. Wie in 6 gezeigt, Massons Trichrom Färbung auf das Herz Abschnitte ergab eine erhöhte myokardiale und peri-Koronararterien Fibrose im gebändert-Gruppe (n = 4) im Vergleich zu der Sham-Gruppe (n = 2).

Wie in 7 gezeigt, wurde Intra- und Inter-observer Variabilität bewertet. Für intra-observer Variabilität wurden 20 Zufallswellenformen und Bilder für jede Maus für wiederholte Messungen, die Abstand von einer Woche durchgeführt wurden ausgewählt. Es gab keine signifikanten Unterschiede in den Spitzengeschwindigkeiten gemessen. Für Interobserver-Variabilität, evaluiert zwei erfahrene Beobachter die Wellenaufnahmen verblindet. Es gab keinen signifikanten differences in den Werten erhalten.

Darüber hinaus wurden keine signifikanten Änderungen in den zur LV-Funktion oder Herzphysiologie innerhalb von 14 Tagen zu bewerten (8 und 9) traditionelle echokardiographischen Parameter zu sehen.

Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse der Studie zeigten signifikante Veränderungen bei der koronaren Durchblutung in der SCA in allen Mäusen. Bemerkenswert ist auch, dass die Ultraschall-basierte Veränderungen CF voran Veränderungen konventionell bewertet LV-Funktion und spiegelt deshalb die Empfindlichkeit der Methode. Obwohl die Studie wurde auf eine sehr kleine Anzahl von Mäusen durchgeführt, noch zeigte Ergebnisse eine hohe Signifikanz zwischen den beiden Gruppen im Hinblick auf alle relevanten Parameter.

Abbildung 1
Abb. 1: Ultraschall-basierte Beurteilung der koronaren Flusses Die rote Linie zeigt the Position der Sonde zum Erhalten (A) Parasternal Längsachse (PSLAX) des Herzens, und (B) Geändert parasternal kurzen Achse (mod-PSALX). Die gepunktete wie Shows, dass durch Drehen der Sonde 15 ° im Uhrzeigersinn von Position (A), können CF in der SCA, in der Nähe Aortensinus und RVOT erkannt werden; (C) Kurzachsenansicht (SAX) erleichtert die Bildgebung von CF mit dem Quer Aorten-Level-Ansicht (D) der XY-Richtung der Sonde angezeigt.

Abbildung 2
Abbildung 2. Der Koronarfluß (CF) Detektion unter Verwendung der mod-PSLAX und SAX Ansichten. (A) Die Mod-PSLAX Ansicht zeigt CF in das Lumen des SCA parallel zur langen Achse des Herzens und um 10 Uhr Position entlang der IVS, in der Nähe von AV (B) Die Abbildung von mod-PSLAX die loca zeigention von SCA und umgebenden Strukturen (C) Die kurzen Achse zeigt die CF Herkunft aus Aortenklappe gegen 1 Uhr-Position. (D) Die Darstellung der kurzen Achse, um die Identifizierung von SCA zu erleichtern. Bedeutende Sehenswürdigkeiten sind in der Tabelle der Abkürzungen.

Figur 3
Abbildung 3: Gedämpfte Änderung des koronaren Flusses (CF) Geschwindigkeit in gebändert Mäusen unter Hyperämie im Vergleich zu Sham (A) Die gelbe Linie unterstreicht die CF-Peak in der Systole (S) und der Diastole (D). (B) Die Abbildung zeigt den Spitzen systolischen und diastolischen Strömungsgeschwindigkeit. Es sind auch Veränderungen der diastolischen CF in den Schein-Mäusen, unter (C) 1% und (D) 2,5% Isofluran was auf eine hyperämisch Induktion von CF in der Herzkranzgefäße in der Sham-Gruppe. Die Baseline-diastolischen CF erkannt wird ca. 200 mm / s und steigt auf> 600 mm / s unter Hyperämie Änderungen diastolischen CF in gebänderten Mäuse unter (E) 1% und (F) 2,5% Isofluran. Wie in dieser Gruppe dargestellt, werden die Veränderungen in (E) vor und nach Hyperämie, waren ähnlich wie die Scheingruppe. Nach Kanten, jedoch (F) war deutlich (von 600 m / s bis <200 m / s), insbesondere unter Hyperämie gedämpft.

4
Abbildung 4: Vergleich der CF Geschwindigkeit und CFR Veränderungen in Schein und gebändert Mäusen. (A) CF Geschwindigkeitsänderung in beiden Gruppen unter 1% Isofluran. Die CF wurde als ~ 200 mm / s in beiden Schein und gebändert Mäuse vor hyperämisch Induktion gemessen. (B) CF Geschwindigkeitsänderung bei Mäusen, unter 2,5% Isofluran. Die CF-Geschwindigkeit kontinuierlich über Tage nach aortic banding reduziert. Am D13, thE CF Schein und gebändert Mäuse zeigten signifikanten Unterschied (*: p <0,05). (C) Zusammenfassung der Änderung der CFR in Schein und gebändert Mäusen. Im Vergleich zu den schein-Mäuse, die CFR von gebändert Mäuse kontinuierlich verringert, korreliert mit dem Rückgang der CF-Geschwindigkeit. Dieses Phänomen zeigt Aortenbandierung induzierte Zunahme der Nachlast und dies trug zur koronaren Dysfunktion. (N = 8, *: p <0,05). CFR = CF 2,5% / 1,5% CF)

Abbildung 5
Abbildung 5: Die Änderung des S / D-Verhältnis unter 1% und 2,5% Isofluran in Schein und gebändert Mäusen (A) Die Änderung des S / D-Verhältnis in beiden Gruppen bei nicht-Hyperämie (1% isoflorane).. Die S / D-Verhältnis erhöht sowie nach der Operation war signifikant auf D9 und D13, auch im Ruhezustand (n = 11, *: p <0,05). (B) Die Änderung des S / D-Verhältnis in beiden Gruppen unter Hyperämie (2,5% Isofluran). Die S / D-Verhältnis signifikant nach der Operation in der hyperämischen Zustand erhöht (n = 11, *: p <0,05). S / D = koronare Flussgeschwindigkeit in der Systole / koronare Flussgeschwindigkeit in der Diastole.

Figur 6
Abb. 6: Myorcardial und pericoronary Arterie Fibrose von Masson Trichromfärbung Färbung nachgewiesen wurde Schein und gebändert Mäusen zwei Wochen nach aortic banding durchgeführt. (A) Nur begrenzte Fibrose wurde Mitte Hohlraum der LV in der Sham-Mäuse (20-fach) beobachtet. (B) Die Bilder bei starker Vergrößerung (400X) zeigte auch wenig Fibrose um peri-koronaren Herzbereich (weißer Pfeil angezeigt Fibrose). (C) in der Maus Herz folgenden Aortenbandierung, signifikant erhöht (20X) die blaue fibrotische Bereich. (D) Peri-koronaren Herzfibrose war auch signifkant in dieser Gruppe (Pfeilspitze) (X400) ergänzt. Die histologischen Daten zusammen korrelieren mit unserem Echo-basierten Beobachtung der Herzkranz Dysfunktion.

7
Abb. 7: Intra- und Inter-Beobachter Zuverlässigkeit der CF-Messung (A) Der intra-observer Zuverlässigkeit angegeben Hoch eine signifikante Korrelation (R 2 = 0,92). (B) Die Interobserver Zuverlässigkeit zeigten auch hohe Korrelation zwischen verschiedenen Beobachtern (R 2 = 0,88).

8
Abbildung 8:. Das Herzstück, das Körpergewicht (HW / SW) Verhältnis und nass zu trocken (B / T) Lungengewichtsverhältnis im Schein und gebändert Mäusen (A) HW / SW-Verhältnis war nicht signifikant verschieden zwischen Schein und gebändert Mäusen an Tag 15 (n= 11, p> 0,05). (B) Das W / D-Verhältnis der Lunge war in beiden Gruppen.

9
Abbildung 9: Die Herzfrequenz (HF) und konventionelle echokardiographische Parameter (A) Der HR wurde nicht wesentlich verändert.. Wie in (B) gezeigt, linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) war nicht signifikant reduziert. (C) Fraktionierte Verkürzung (FS) war in den beiden Gruppen. (D) linksventrikuläre Masse (LVM) zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen zu zeigen, auf 13 Tage nach der Streifenbildung.

Voller Name Abkürzung
Aortenstenose AS
Aortenklappe AV
Koronare Flussreserve CFR
Herzinsuffizienz CHF
Verkürzungsfraktion FS
Herzfrequenzen HR
Herz, das Körpergewicht-Verhältnis HW / SW
Inter-Ventrikelseptum IVS
Linken Vorhof LA
Linken vorderen absteigenden LAD
Linke Koronararterie LCA
Linksventrikulären Auswurffraktion LVEF
Linken Ventrikels LV
Linksventrikuläre Hypertrophie LVH
Die linksventrikuläre Masse LVM
Parasternal langen Achse PSLAX
Lungenarterie PA
Rechten Vorhof RA
Rechte Herzkammer RV
Kurzachsenansicht SAX
Septal Koronararterie SCA
Systolischen diastolischen Strömungsverhältnisse S / D
Transthorakale Doppler Echokardiographische TTDE
Geschwindigkeits-Zeit-Integral VTI
Wet Lungengewicht trocken B / T

Tabelle 1: Abkürzungen.

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Discussion

In diesem Ultraschall basierte Studie wurde nicht invasive Beurteilung der koronaren Flusses reproduzierbar in Echtzeit durchgeführt, über Tage, in Live-Versuchsmäusen; Darüber hinaus zeigte das Protokoll die Möglichkeit, koronare Herzfunktionsstörungen, die zu einem frühen Zeitpunkt anwesend war und mit Mangel an myokardialen Perfusion assoziiert zu erkennen. Diese Methode könnte letztlich als klinischer Parameter bei kardiovaskulären Risikostratifizierung und / oder Beurteilung Reaktion auf therapeutische Intervention genutzt werden.

Zuerst wird ein ausführliches Protokoll zur Visualisierung der anatomischen und funktionellen Veränderungen der Herzkranzarterie des kleinen Mäuseherz mit sequentiellen Bildgebung über die Zeit mit hoher Frequenz Farbdopplerechokardiographie beschrieben. Durch die sorgfältige Voraus Auswahl einer Reihe ergänzender akustische Fenster mit hoher axialer Auflösung, fest eingestellt Probenvolumen und korrekte Betäubung Kontrolle, jedem Betreiber (mit etwas Training auf dem Ultraschallgerät) kann perform alle vorgeschlagenen Schritte des Bildgebungsprotokoll als auch das Post-hoc offline-Analysen der erfassten Daten. Das Verfahren erlaubt reproduzierbare Visualisierung des linken Hauptkoronararterie und ermöglicht eine Modulation des visualisierten koronaren Funktion. Dieses Protokoll kann bei Kleintieren wie Mäusen oder Ratten durchgeführt werden, mit hoher Herz und Atemfrequenz. Es ist möglich, die Zuverlässigkeit der Daten aus sequentiellen Bildgebung über Tage oder Wochen, die Ermittler Funktion nichtinvasiv und in Längsrichtung in einem bestimmten experimentellen Modell folgendermaßen erhalten werden können.

Zweitens ist die Studie versucht, kleine Schiffe, die entscheidend für die richtige Herzfunktion sind zu bewerten, durch Auswertung der kleinen und frühe Veränderungen im inner koronare Physiologie (innerhalb von Minuten auftreten) im Rahmen der Gesamtzustand der Herzphysiologie (zB LV-Funktion). Die Schritte des Protokolls kann in einer nicht-invasiven, genau und reproduzierbar erfolgen. Die in Echtzeit zu erhalten Messungenkann von jedem Bediener mit etwas Training auf Maschinenbedienung und grundlegende Anatomie bezogen werden. Darüber hinaus sind die spezifischen Gefäß Indizes hierin gemessen, wie CFR und S / D, kann mit jedem Offline-Messsoftware erhalten werden kann und nicht nur die proprietäre Software durch den Maschinenhersteller zur Verfügung gestellt. Diese Indizes können zusätzlich zu einem Tier-Modell von Interesse, wie die ApoE angewendet werden - / - oder LDR R - / - Modelle, die verwendet werden können, um Atherosklerose zu studieren. Daher stellt das Verfahren ein hochübersetzenden Werkzeug für die Verwendung in Studien von einer Vielzahl von Herz-Kreislauf-Phänotypen.

Die Neuheit der Methode liegt in ihrer Flexibilität. Es ist auch durch kleinere Anpassungen wie das Ändern Sonde Platzierung, die Wahl der Sondenfrequenz (höchsten Mittenfrequenz sollte für niedrige Strömungsgeschwindigkeit Beurteilung wie Ischämie Studien aufgenommen werden), Probenvolumen (kleiner Probenvolumenausbeute genauere leicht modifizierbar Spitzenbewertung) und Winkelkorrektur (0 ° bis 60 °PW Winkel näher bei 0 ° ist genauer), so dass jeder Bediener kann trainiert werden, genaue absoluten Geschwindigkeiten der Koronararterie, Septum oder links-Haupt, indem Sie die anatomischen Sehenswürdigkeiten wie PA oder Aortenwurzel zu erhalten.

Kleine und zeitlichen Veränderungen können in der Regel schwer zu messen und kann eine hohe Fehlerrate, um physiologische Veränderungen in der Atmung oder Herzrate in Beziehung beinhalten. Fehlerbehebung beinhaltet gewöhnlich Identifizierung von geeigneten Sehenswürdigkeiten proximal des Ursprungs der Koronararterie und Aufrechterhaltung der normalen physiologischen Herzfrequenz. Durch die Überwachung der Tierphysiologie mit einem EKG-Signal-Monitoring-Tool ist, dass mit der Bilderzeugungsvorrichtung verbunden ist, erlaubt das Protokoll jeder Bediener, die Auswirkungen von potenziellen Vasomodulator (Vasokonstriktor oder Dilatator) zu überwachen, während der Bildgebung.

Die richtige Wahl, Weg und die Dosis der Betäubung Ebenen kann als kritische Determinanten richtige Abschätzung der Strömungsdynamik angesehen werden. Eine limitatiauf der Untersuchung könnte die Verwendung von Isofluran ist. Es ist bekannt, Herz Depressionen verursachen und ändern Lumendurchmesser in einigen Studien in einer dosisabhängigen Weise 7,10. Allerdings werden die Bilder in dieser Studie innerhalb von Minuten erhalten wird, und durch die Verwendung eines streng kontrollierten Anästhesiesystem, kann man genau zu schätzen, CF, CFR und S / D in jedem Zustand der Maus Physiologie einschließlich Hypoxie, Normoxie Vasodilatation oder Vasokonstriktion, mit minimale Auswirkungen der Herzfrequenz. Eine weitere Einschränkung ist das Fehlen von Goldstandard Korrelation zwischen CFR und Koronararterie Lumendurchmesser in vivo bei Mäusen durch sehr kleinen Probenvolumen, die aus Mäusen erhalten werden können. Jedoch, wie bei Menschen gezeigt dieser Nachteil potentiell durch histologische Beurteilung der Koronarmorphologie quantitative Echokardiographie überwunden werden, um Koronararterien Durchmesser 4,24 beschaffen.

Durch die Verwendung von alle notwendigen Schritte in der Bildgebungsprotokoll beschrieben (Schritt 2.1.1-2.3.4), CFR und S/ D-Verhältnis-Werte bei Mäusen sind erhältlich innerhalb weniger Minuten. Qualitativ hochwertige Bilder machen die Daten robust und mit geringer intra- und inter Beobachter Variabilität.

Zusammenfassend ist die Bildgebungsprotokoll, hierin beschriebenen, eine genaue Diagnose-Tool, die eine Alternative zu bestehenden invasive Optionen wie koronare Katheterisierung, Doppler-Leiter oder postmortalen histopathologischen Studien.

Zusammengenommen werden die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass eine nicht-invasive Methode der koronaren funktionelle Beurteilung als machbar und rentabel klinischen Diagnose-Tool, in der Kleintierforschung eingesetzt werden können. Eine solche nicht-invasive Verfahren kann dazu beitragen, das Erfordernis der Verwendung von Tieren, Euthanasie oder Autopsie in experimentellen Modellen wesentlich zu minimieren.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Depilatory cream Miltex, Inc. Surgi-Prep Apply 24 hours prior to imaging
Isoflurane Baxter International Inc. NDC 10019-773-40 2-3% for induction, and 1-1.5 % for maintenance; heart beats will be maintained at above 500 beats per minute
High Frequency Ultrasound FUJIFILM VisualSonics, Inc. Vevo 2100
High-frequency Mechanical Transducer FUJIFILM VisualSonics, Inc. MS250, MS550D, MS400

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References

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