CXCR6.Gfp रिपोर्टर चूहों का उपयोग स्वस्थ और रोगग्रस्त जिगर में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लॉन्ग टर्म intravital Multiphoton माइक्रोस्कोपी इमेजिंग

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., Ergen, C., Kohlhepp, M., Mossanen, J. C., Schneider, C., Vogt, M., Tolba, R. H., Trautwein, C., Martin, C., Tacke, F. Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice. J. Vis. Exp. (97), e52607, doi:10.3791/52607 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

चोट करने के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में जिगर में सूजन monocytes, न्यूट्रोफिल, टी सेल सबसेट, बी कोशिकाओं, प्राकृतिक हत्यारा (एन.के.) और NKT कोशिकाओं सहित leukocytes के विशिष्ट उपप्रकार की घुसपैठ से जुड़े एक बेहद गतिशील प्रक्रिया है। प्रतिरक्षा सेल प्रवास की निगरानी के लिए जिगर के intravital माइक्रोस्कोपी के कारण नमूना तैयार करने और निर्धारण, ऑप्टिकल संकल्प और लंबी अवधि के पशु अस्तित्व के बारे में उच्च आवश्यकताओं के लिए विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है। फिर भी, सूजन प्रक्रियाओं के साथ-साथ सेलुलर बातचीत के अध्ययन की गतिशीलता बेहतर भड़काऊ जिगर की बीमारी की दीक्षा, प्रगति और प्रतिगमन को समझने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सके। इसलिए, एक बेहद संवेदनशील और विश्वसनीय विधि गहन देखभाल के साथ संयोजन में प्रवास और intravital दो photon लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (TPLSM) से लंबी अवधि (लगभग 6 घंटा) पर माउस जिगर में अलग प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सेल सेल-बातचीत का अध्ययन करने के लिए स्थापित किया गया था निगरानी।

ईएनटी "> प्रदान की विधि एक सज्जन तैयारी और अंग की न्यूनतम गड़बड़ी के साथ जिगर के स्थिर निर्धारण भी शामिल है, लंबी अवधि के intravital इमेजिंग ट्रैकिंग की अनुमति देता है, अप करने के लिए 6 घंटा की एक समय अवधि में वास्तव में कोई photobleaching या phototoxic प्रभाव के साथ बहुरंगा multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग और माउस के महत्वपूर्ण मापदंडों और परिसंचरण, तापमान और गैस विनिमय के स्थिरीकरण की व्यापक निगरानी की वजह से स्थिर इमेजिंग की स्थिति, विशिष्ट ल्युकोसैट कैंपेन्स की।

CXCR6.gfp जिगर में सूजन पर लिम्फोसाइट प्रवास जांच करने के लिए दस्तक में चूहों आधारभूत शर्तों के तहत और कार्बन टेट्राक्लोराइड का intraperitoneal इंजेक्शन (एस) (सीसीएल 4) द्वारा प्रेरित तीव्र और जीर्ण जिगर की क्षति के बाद intravital जिगर इमेजिंग के अधीन थे।

प्राकृतिक हत्यारा (एन.के.) - - इसके अलावा और ऐसी सीडी 4 टी कोशिकाओं के रूप में टी lymphocytes के सबसेट लेकिन श्लैष्मिक एसोसिएशन CXCR6 मुख्य रूप से प्राकृतिक हत्यारा टी (NKT) पर लिम्फोसाइटों पर व्यक्त एक केमोकाइन रिसेप्टर है,पैदा अपरिवर्तनीय (MAIT) टी कोशिकाओं 1। एक जिगर चोट पर उनकी बदल व्यवहार में विस्तृत जानकारी और रोग प्रगति में इसलिए उनके संभावित भागीदारी की अनुमति दी CXCR6.gfp + प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवासी पैटर्न और स्थिति के बाद।

Introduction

कोशिकाओं और पूरे अंगों में सेलुलर कार्यों या यहां तक कि पूरे जीवों के दृश्य के शरीर दो के लगभग सभी भागों सहित 50 से अधिक वर्षों के लिए महान ब्याज की गई है। इसलिए, कुछ प्रारंभिक अध्ययन पहले से ही जिगर 3,4 के intravital इमेजिंग कार्यरत हैं। हालांकि, कई सीमाएं जिगर ऊतक के लंबे समय तक स्थिर उच्च संकल्प इमेजिंग के बारे में तारीख करने के लिए मौजूद हैं।

कारण डायाफ्राम और जठरांत्र संबंधी मार्ग 5 के साथ निकट संपर्क में जिगर की शारीरिक स्थिति के लिए, सूक्ष्म intravital इमेजिंग के लिए सबसे आम समस्या आंत्र पथ 6 की एक हद तक कम करने, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला, आंदोलन श्वसन की वजह से है और। अन्य ठोस अंगों की तुलना में, जिगर सर्जरी विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है। कारण घने माइक्रोवैस्कुलर संरचना करने के लिए, शल्य चिकित्सा में गड़बड़ी, भारी रक्तस्रावी घावों के निवासी का बिगड़ा microcirculation में सात और भी सक्रियण नेतृत्व कर सकते हैं मैंऐसे Kupffer कोशिकाओं के रूप में 8 mmune कोशिकाओं। इसलिए, ऊतक के यांत्रिक निर्धारण 6,9 intravital माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप करने की संभावना है कहीं और प्रकाशित के रूप में।

एक स्वस्थ जिगर में, कुल रक्त की मात्रा का 10-15% जिगर vasculature के भीतर रहता है, और अंग संचलन में परिवर्तन (जैसे, रक्तचाप में उतार-चढ़ाव के लिए अत्यधिक अतिसंवेदनशील अंग प्रतिपादन, समग्र कार्डियक आउटपुट 10 में से लगभग 25% प्राप्त करता है )। इसलिए, अत्यधिक होने के कारण ऊतक से निपटने या केंद्रीकृत परिसंचरण द्वारा जैसे, कतरनी तनाव, विस्थापन, चोट करने के लिए यकृत रक्त प्रवाह में बाधा के रूप में अच्छी तरह से जिगर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित करने, ल्युकोसैट प्रवासी व्यवहार में कृत्रिम परिवर्तन, बिगड़ा जिगर oxygenation और इसलिए आगे जिगर की क्षति के लिए नेतृत्व करेंगे अंग संरक्षण और जानवर के समग्र जीवन समय के रूप में।

प्रारंभिक सूक्ष्म पढ़ाई intravital epifluorescence मील पर आधारित थेcroscopy, लेकिन इस तरह के फोटो विरंजन और कम प्रवेश गहराई के रूप में कई तकनीकी बाधाओं दीर्घकालिक जिगर इमेजिंग 4,11,12 के लिए इस तकनीक के उपयोग की सीमा। इस नई विधि वास्तविक जीवन स्थितियों 13-15 के तहत लगभग सभी अंगों में इमेजिंग अध्ययन प्रदर्शन करने के लिए तकनीकी रूप से सक्षम था के रूप में 1990 के दशक में multiphoton माइक्रोस्कोपी के विकास के साथ, फोटो विरंजन या प्रवेश गहराई की सीमाओं को मुख्य रूप से हल कर रहे थे। हालांकि, जिगर इमेजिंग के संबंध में मुख्य शेष चुनौतियों थे: कई घंटा 16 वर्ष की लंबी अवधि के लिए यकृत sinusoids में अनछुए रक्त का प्रवाह है, और विशेष रूप से स्थिर इमेजिंग हासिल सांस आंदोलनों, जिगर ऊतक के autofluorescence,।

कई अध्ययनों से जिगर में 17, उदाहरण के लिए, NKT कोशिकाओं 18-20, टी कोशिकाओं 21,22, जिगर मैक्रोफेज 23,24 या न्यूट्रोफिल 25, दीर्घकालिक multiphoton एम समारोह और विभिन्न leukocytes के प्रवास को संबोधित यद्यपिicroscopy इमेजिंग अभी तक सफलतापूर्वक कारण आगे के नुकसान से 26 मौजूदा क्षति है और इसलिए उच्च संवेदनशीलता के लिए एक कार्य और भी चुनौतीपूर्ण तीव्र या जीर्ण जिगर की बीमारी के साथ जानवरों में, स्थापित नहीं किया गया था। हालांकि, वास्तविक समय में जिगर में leukocytes के प्रवासी व्यवहार और सेलुलर समारोह की निगरानी जिगर homeostasis और रोग 27 में उनकी विशेष भूमिका में उपन्यास अंतर्दृष्टि देता है।

केमोकाइन रिसेप्टर CXCR6 प्राकृतिक हत्यारा (एन.के.) कोशिकाओं, NKT कोशिकाओं और कुछ टी सेल आबादी 18,28 सहित कई लिम्फोसाइट कैंपेन्स, पर व्यक्त की है। चूहों में पूर्व के अध्ययन CXCR6 और उसके आत्मीय ligand के CXCL16 समस्थिति दौरान जिगर sinusoids पर NKT कोशिकाओं की गश्त नियंत्रित कर सकते हैं कि संकेत दिया है। नतीजतन, (CXCR6 लोकस में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन [GFP] की एक दस्तक में ले जाने) CXCR6.gfp चूहों का उपयोग इस तरह के मस्तिष्क के रूप में 29 विभिन्न अंगों में लिम्फोसाइटों के पलायन की जांच के लिए वर्णित किया गया हैऔर भी जिगर 18,20, सूजन पर CXCR6.gfp कोशिकाओं की घुसपैठ में वृद्धि हुई दिखा रहा है।

इस अध्ययन में प्रदान की विधि के साथ यह स्थिर शर्तों के तहत समय की एक लंबी अवधि में इन प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए संभव था। intravital multiphoton आधारित प्रक्रिया पशु और अंग की न्यूनतम गड़बड़ी के साथ अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य था कि इमेजिंग की अनुमति दी; श्वसन और रक्त परिसंचरण के करीब नियंत्रण द्वारा पीछा व्यापक निगरानी से लंबी अवधि के पशु अस्तित्व के लिए अनुकूलित; और अत्यधिक लचीला और आसान जैसे गुर्दे या तिल्ली के रूप में अन्य parenchymal अंगों को भी अपनाने के लिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: प्रयोगों (एनआईएच प्रकाशन, 8 वीं संस्करण, 2011) 'की देखभाल और उपयोग प्रयोगशाला पशु के लिए गाइड' निम्नलिखित जानवरों के अध्ययन गवर्निंग जर्मन कानून के अनुसार में प्रदर्शन किया गया और जानवरों के संरक्षण पर निर्देशक 2010/63 / यूरोपीय संघ वैज्ञानिक उद्देश्यों (यूरोपीय संघ की आधिकारिक जर्नल, 2010) के लिए प्रयोग किया जाता है। सरकारी अनुमति के सरकारी पशु की देखभाल और उपयोग कार्यालय (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, जर्मनी) से प्रदान की गई थी।

नोट: लघु अवधि के इमेजिंग के लिए छोड़ा जा सकता है कि कदम तैयारी के समय को कम करने और शल्य प्रोटोकॉल सरल करने के लिए तारक (*) से चिह्नित कर रहे हैं (उदाहरण के लिए भी शॉट्स, 3-डी के ढेर या छोटी अवधि के समय चूक माइक्रोस्कोपी तस्वीर)। आवश्यक है, तथापि, अस्तित्व समय स्पष्ट रूप से कम हो जाएगा अगर इमेजिंग भी व्यापक निगरानी और संचलन नियंत्रण के बिना किया जा सकता है।

1. माइक्रोस्कोप सेटअप और पूर्व सर्जरी तैयारी (5-10 मीलएन)

  1. (माइक्रोस्कोप, शक्ति लैब, लेजर, हीटिंग पैड, जलवायु चैम्बर, वेब कैमरा, सिरिंज पंप युक्ति, श्वासयंत्र) पर स्विच प्रणाली।
  2. 1.5 वॉल्यूम% करने के लिए ओ 2 Isoflurane भाप के लिए आपूर्ति और सेट Isoflurane स्तर कनेक्ट (वी / वी), एक छोटे जानवर श्वासयंत्र से कनेक्ट।
    1. लघु अवधि के इमेजिंग के लिए, केवल प्रारंभिक आईपी संज्ञाहरण प्रेरण के बाद isoflurane का उपयोग कर संज्ञाहरण बनाए रखने के (2.2 कदम देखें)। फिर स्थिर जिगर microcirculation में की गारंटी करने के खंड 2% (वी / वी) Isoflurane उपयोग करें, और 2 घंटा नीचे इमेजिंग समय रहते हैं।
  3. 150-200 μl की एक मात्रा के साथ 120-140 श्वसन चक्र / मिनट के लिए श्वसन सेट करें।
  4. माउस के agarose मंच की स्थापना की। 40 डिग्री के कोण में एक डिश (लगभग 10 सेमी x 15 सेमी आधार) में डालने का कार्य, 3% (डब्ल्यू / वी) agarose की 100 मिलीलीटर की तैयारी।
  5. आवश्यक इंस्ट्रूमेंटेशन का संग्रह शल्य चिकित्सा कार्य क्षेत्र निर्धारित करें। सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण को रोकने के लिए, Sekusept प्रधान गुण एस के 1% समाधान (का उपयोग उपकरणों 9.9% / वी डब्ल्यू कीटाणुरहित), Glutaral वी / डब्ल्यू 9.8%, प्रयोग (चित्रा 1 ए से पहले 5 मिनट के लिए Formaldehyde)।
  6. शेष घटकों प्राप्त करें: त्वचा निस्संक्रामक (जैसे, 10% povidone आयोडीन घोल), जिगर मंच (के ढेर और पुल), agarose समाधान (3% (डब्ल्यू / वी) पीबीएस में) 5% के साथ, सिरिंज पंप (डब्ल्यू / वी) ग्लूकोज समाधान संवेदनाहारी समाधान मैं (Ketamine 0.1 मिलीग्राम / एमएल, Xylazine 0.5 मिलीग्राम / एमएल, Fentanyl 5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल), कपास swabs, एन-ब्यूटाइल-2-Cyanoacrylat, और 1x पीबीएस के साथ (जी-5), सिरिंज पंप। Preheating के लिए ऊष्मायन के चेंबर में agarose चरण पकवान रखो।

2. ट्रेकिआटमी (10-15 मिनट)

  1. 25-28 ग्राम वजन घर प्रजनन में से C57BL / 6 चूहों का प्रयोग करें। हाउस एक 12 घंटा प्रकाश / 12 घंटा अंधेरे चक्र के साथ एक तापमान में FELASA दिशा निर्देशों के अनुसार, और आर्द्रता नियंत्रित वातावरण में विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत चूहों। जानवरों मानक चूहों आहार (सूंघ स्टैंडर्ड कृंतक डाइट) और पानी यथेच्छ के लिए स्वतंत्र पहुँच की अनुमति दें।
  2. Init द्वारा माउस anesthetizeial intraperitoneal संवेदनाहारी समाधान द्वितीय के 250 μl (Ketamine 0.1 मिलीग्राम / एमएल, Xylazine 1 मिलीग्राम / एमएल, buprenorphine 10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) के इंजेक्शन (आईपी)।
    1. * Intravital इमेजिंग के दौरान रखरखाव के लिए लगातार निरंतर आईपी इंजेक्शन द्वारा संवेदनाहारी समाधान मैं प्रशासन (Ketamine 0.1 मिलीग्राम / एमएल, Xylazine 0.5 मिलीग्राम / एमएल, Fentanyl 5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) 0.2 मिलीग्राम / घंटा के प्रवाह की दर के साथ एक सिरिंज पंप डिवाइस का उपयोग inhalative isoflurane 0.5 वॉल्यूम% के साथ संयोजन (वी / वी)।
    2. , ट्रेकिआटमी के लिए त्वचा कीटाणुरहित, 5 मिनट (संदंश के साथ जैसे चुटकी पैर पैड) के बाद सजगता की जाँच माउस शल्य सहिष्णु संज्ञाहरण अवस्था में है तैयारी शुरू करते हैं।
    3. (चित्रा 1 बी) बाहर सुखाने से कॉर्निया को रोकने के लिए आँख सुरक्षात्मक क्रीम (जैसे, Dexpanthenol 50 मिलीग्राम / छ) को लागू करें।
  3. हाथ-पाँव के लिए चिपकने वाला टेप का उपयोग उदर पक्ष को उजागर करने की तैयारी की मेज पर माउस fixate; धीरे इस स्थिति में fixate उदा।, गर्दन overstretch, एक रबर बैंड का उपयोग करके टी झुकाकृन्तक ओ।
    1. एक कपास झाड़ू के साथ कीटाणुनाशक लगाने से, povidone आयोडीन समाधान का उपयोग त्वचा और फर कीटाणुरहित।
  4. सीधे ठोड़ी के नीचे प्रारंभिक त्वचा में कटौती (0.5-1 सेमी लंबाई) प्रदर्शन (चित्रा 1C)
    1. ध्यान से लार ग्रंथियों (चित्रा -1) के बीच संयोजी ऊतक काटना।
    2. ध्यान से खुला पेशी ट्यूब आसपास के श्वासनली (चित्रा 1E, एफ) आंसू।
  5. बाद में वेंटिलेशन ट्यूब निर्धारण (चित्रा 1G) के लिए ट्रेकिआ नीचे शल्य धागा रखें।
    1. एक टी के आकार का चीरा प्रदर्शन कर उपास्थि के छल्ले के बीच सूक्ष्म कैंची के साथ ओपन श्वासनली (चित्रा 1H)
  6. चीरा (~ 0.5 सेमी) के माध्यम से श्वासनली में वेंटिलेशन ट्यूब रखें। आगे, ट्यूब धक्का छोटे संरचनात्मक संदंश के साथ दुम अंत हड़पने के लिए और धीरे श्वासनली में ट्यूब अग्रिम कर (चित्रा 1 मैं)
  7. शल्य धागे के साथ ट्यूब fixate (जैसे (चित्रा 1J, कश्मीर) से बचने के लिए त्वचा पर ट्यूब के दूसरे कपाल निर्धारण करते हैं।
  8. ऊतक गोंद (जैसे, एन-ब्यूटाइल-2-Cyanoacrylat) (चित्रा 1L) के साथ सील कटौती।
  9. चिपकने वाला टेप का उपयोग कर सिर पर ट्यूब fixate।

3. laparatomy (15-20 मिनट)

  1. हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए हीटिंग पैड पर माउस रखें। पेट दाढ़ी, ध्यान से त्वचा से बालों को हटा दें। Povidone आयोडीन समाधान का उपयोग करके मुंडा त्वचा और फर कीटाणुरहित।
  2. शल्य कैंची (2A चित्रा) का उपयोग उरोस्थि नीचे में कटौती एक छोटा सा त्वचा प्रदर्शन करते हैं। रक्तस्राव को रोकने के लिए सभी दृश्य रक्त वाहिकाओं cauterizing, पार्श्व दोनों पक्षों के लिए पसलियों के नीचे कटौती बढ़ाएँ।
  3. ध्यान से पेरिटोनियम (चित्रा 2B) खोलने, उरोस्थि नीचे linea अल्बा पर एक छोटे से कट प्रदर्शन करते हैं। Cauteriz का उपयोग करते हुए दोनों पक्षों के लिए कटौती का विस्तारसमझना (चित्रा -2, डी) खून बह रहा रोकने के लिए।
  4. Agarose चरण पकवान (चित्रा 2 ई) में माउस रखें। माउस (आमतौर पर 12-14 कवर फिसल जाता है) (चित्रा 2 एफ) के दोनों किनारों पर उचित ऊंचाई के ढेर रखें।
  5. श्वसन के साथ माइक्रोस्कोप सिंक्रनाइज़ करने के लिए पीठ के ऊपरी हिस्से के नीचे सांस ट्रिगर सेंसर रखें। ट्रिगर इकाई (चित्रा 2 जी) को सक्रिय करें।
  6. पसलियों (चित्रा 2I) वापस लेना उरोस्थि के माध्यम से शल्य धागा (5-0) रखें।
  7. ध्यान से घुमावदार शल्य कैंची का उपयोग जिगर और डायाफ्राम (दात्राकार बंधन) को जोड़ने के बंधन के रूप में अच्छी तरह से जिगर और जठरांत्र संबंधी मार्ग में कटौती। महाधमनी (चित्रा 2J) करने के लिए नीचे दात्राकार बंधन कट।

4. नमूना सेटअप (10-15 मिनट)

  1. बड़े जिगर पालि में आसानी से प्रवेश के लिए 45 डिग्री के कोण के साथ सही पक्ष पर माउस रखें।
  2. पेट को कवर, पसलियों के नीचे मचान पुल जोड़ेंगुहा। तेज किनारों (चित्रा 2K) को कवर करने के लिए चिपकने वाला टेप कोटिंग के साथ एक मानक कवर पर्ची का उपयोग करके एक पुल का निर्माण।
  3. मंच पर बड़े जिगर पालि रखें। ध्यान से डबल गेंद लेखनी जांच या जिगर के नीचे एक गद्देदार रंग पर्ची और एक गीला कपास झाड़ू या गीला ऊतक का उपयोग अंग के शीर्ष पकड़ो। स्लाइड पर पालि लिफ्ट और कोमल खींचें लागू होते हैं। पालि तुला या तह किया जा सकता है। जिगर (चित्रा 2L) के ही कोमल हेरफेर करने के लिए अतिरिक्त देखभाल प्रदान।
  4. उदाहरण के लिए, छोटे कवर फिसल जाता है (20 मिमी x 20 मिमी), यह करने के लिए अगले जिगर लोब के लगभग एक ही ऊंचाई के ढेर कवर पर्ची समर्थन करने के लिए पार्श्व समर्थन कर दांव, रखें।
  5. जिगर पालि पर बड़े कवर पर्ची (24 मिमी x 50 मिमी) रखें। कि कवर पर्ची सुनिश्चित करें संभव (चित्रा 2 एम) के रूप में क्षैतिज रूप में उन्मुख है।
    नोट: कवर पर्ची यह फैलाएंगे बिना ऊतक के साथ संपर्क में होना चाहिए। बिगड़ा रक्त प्रवाह (सफेद ऊतक) के स्पष्ट संकेत के लिए जाँच करें। Microcirc हैंआबादी बाधित है, आगे दांव का समर्थन जोड़ें।
  6. * दीर्घकालिक संज्ञाहरण और जी -5 आवेदन के लिए स्थान दो स्वतंत्र intraperitoneal कैथेटर (चित्रा 2N)। अगले हिंद अंग को पेट के निचले हिस्से में पार्श्व कैथेटर को स्थापित करें।
    नोट: intraperitoneal कैथेटर स्वयं बनाया लचीला सिलिकॉन टयूबिंग (चित्रा 3) के साथ 27 जी सुइयों को जोड़ने के द्वारा किया जा सकता है।
  7. * त्वचा को 5-0 शल्य धागे के एक पाश के साथ fixate सुई आकस्मिक विस्थापन से बचने के लिए।
  8. * मैं एक कैथेटर को संज्ञाहरण समाधान के साथ सिरिंज पंप संलग्न करें, 0.2 मिलीग्राम / घंटा सेट करने के लिए प्रवाह दर; 0.1 मिलीग्राम / घंटा के लिए कैथेटर से 2 जी-5 के साथ सिरिंज पंप, सेट प्रवाह की दर देते हैं।

5. माउस निगरानी

  1. * प्लेस ईसीजी सामने में इलेक्ट्रोड और हिंदुस्तान के छोरों (चित्रा -4 ए)।
  2. * 2 स्तर सेंसर सीओ समाप्ति ट्यूबिंग संलग्न।
  3. (चित्रा 4C गर्मी पैड से जुड़ा बाहरी तापमान संवेदक जोड़ें)।

6. एम्बेड और ऊतक निर्धारण (5-10 मिनट)

  1. 3% 1X पीबीएस में (डब्ल्यू / वी) agarose की 100 मिलीलीटर की तैयारी। तापमान 5 मिलीलीटर सिरिंज और एक 18 जी सुई (चित्रा 5A) का उपयोग कर 41 डिग्री सेल्सियस पर जब जिगर शामिल करें।
  2. Coverslip पर और माउस (चित्रा 5 ब, सी) के आसपास शेष agarose डालो। Agarose पूरी तरह gelatinized होने तक प्रतीक्षा करें।
  3. तैयार जिगर पालि (चित्रा 5D, ई) स्कैन करने के लिए पर्याप्त एक viewfield बड़ी तैयारी, हीडेमैन रंग का उपयोग अतिरिक्त agarose हटायें।

7. इमेजिंग

  1. माइक्रोस्कोप जलवायु चैम्बर में माउस स्थानांतरण।
  2. 1x पीबीएस के 50-100 मिलीलीटर जोड़ें (37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ देते हैं)।
  3. वाष्पीकरण (चित्रा 5F) को रोकने के लिए नमूना पकवान कवर।
  4. * 0.5 वॉल्यूम% करने के लिए inhalative isoflurane कमी (वी / वी)।
  5. *, सॉफ्टवेयर की निगरानी ईसीजी, हृदय गति और निःश्वास सीओ 2 रिकॉर्डिंग शुरू करो।
  6. इमेजिंग शुरू: ला खोलनेसेवा बंद,, ब्याज के मद्देनजर क्षेत्रों की पहचान जेड के ढेर के लिए ऊपरी और निचले सीमा को परिभाषित है, और समय चूक रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं। जेड बहाव सही करने के लिए यदि आवश्यक हो तो (जेड ढेर रद्दोबदल उदा। के कारण रक्तचाप या तापमान में उतार-चढ़ाव, चित्रा (5G) में बदलाव के लिए।
    नोट: जानवरों के संचलन या संज्ञाहरण इमेजिंग अवधि की या अगर पूरा होने अस्थिर हो जाता है के बाद, (संज्ञाहरण से जागृति के बिना) गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से चूहों बलिदान।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हमारे intravital TPLSM दृष्टिकोण को मान्य करने के लिए, हम intravital TPLSM इमेजिंग के लिए CXCR6 GFP / + चूहों अधीन है। चूहे या तो आधारभूत नियंत्रण के रूप में अनुपचारित छोड़ दिया है या तीव्र जिगर की क्षति 20 प्रेरित करने के लिए कार्बन टेट्राक्लोराइड का एक भी intraperitoneal इंजेक्शन (सीसीएल 4) के अधीन थे।

कारण उनके हरे प्रतिदीप्ति करने के लिए वीडियो दृश्यों 2-5 घंटा की एक समय अवधि में ले जाया गया, और कोशिकाओं समय अधिक का पता लगाया गया। सामान्य सेलुलर गतिशीलता दिखाने के लिए, प्रक्रिया के दौरान पाया गया कि सभी पटरियों एक आरोपित छवि (चित्रा 6A) के रूप में साजिश रची थे। आधारभूत शर्तों के तहत कोशिकाओं केंद्रीय नस की ओर जिगर sinusoids साथ लंबी दूरी प्रवास से पता चला है, जबकि 18 घंटा सीसीएल 4 उपचार के बाद CXCR6 / + GFP कोशिकाओं पहले से ही आंशिक रूप से बिगड़ा आंदोलन पैटर्न से पता चला है। कुछ तेजी से आगे बढ़ कोशिकाओं को अभी भी जिगर sinusoids में मौजूद थे, कई फोकल क्षेत्रों कोशिकाओं के साथ दिखाई दे रहे थे किचोट के क्षेत्र के लिए कोशिकाओं की भर्ती एक chemotactic प्रतिक्रिया दर्शाता है, स्थानीय स्कैनिंग करने के लिए यादृच्छिक प्रवास से बदल गया था। प्रभाव और भी अधिक वास्तव में कोई सक्रिय प्रवास के साथ CXCR6 + कोशिकाओं के एक लगभग पूरा गिरफ्तारी दिखा, 36 घंटा के बाद घोषित किया गया था। आधारभूत शर्तों के तहत सबसे अधिक पलायन कोशिकाओं यादृच्छिक दिशात्मक बदलाव के साथ चर प्रवास गति थी, सीसीएल 4 इलाज जानवरों के कुछ स्वतंत्र रूप से गतिशील कोशिकाओं 18 घंटा लेकिन नहीं करने के बाद 36 घंटे के बाद sinusoids गश्त के रूप में ही धीरे धीरे के रूप में अच्छी तरह रेंग रहे थे कि कोशिकाओं को दिखाया। रंग कोडित प्रवास पटरियों का उपयोग, सेल गति सीसीएल 4 उपचार के प्रभाव का आकलन करने के लिए सीधे कल्पना की जा सकती है। 36 घंटा के बाद कोई गतिशील कोशिकाओं किसी भी detectable थे जबकि बिगड़ा प्रवास, 18 घंटा सीसीएल 4 के बाद लंबी दूरी की राशि के रूप में अच्छी तरह से औसत ट्रैक की लंबाई स्पष्ट रूप से कम हो गया था के रूप में पटरियों दिखा रहा है कि, यह भी सामान्यीकृत ट्रैक आरेख (चित्रा 6B) में दिखाई दे रहा था अधिक। डब्ल्यू लाइन मेंइन निष्कर्षों के ith, आज़ादी वाहिका संरचना पर गश्त करने के लिए एक सेल की क्षमता का वर्णन है जो सेलुलर विस्थापन, 36 घंटा हेपैटोसेलुलर क्षति (चित्रा 6C) की साइट पर सीसीएल 4 उपचार के बाद कोशिकाओं के एक फँसाने का संकेत है, समय के साथ कम किया है।

और अधिक विस्तार में जिगर में CXCR6 / + GFP कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार का पालन करने के लिए, प्रतिनिधि व्यक्ति की कोशिकाओं के पलायन की गति समय के साथ गतिशीलता के अपने स्तर कल्पना करने के लिए साजिश रची गई थी। हम और दूसरों को पहले से CXCR6 / + GFP कोशिकाओं के कई अलग गति पैटर्न वर्णित: सक्रिय यादृच्छिक रेंगने एक चिपके सेलुलर गतिशीलता और लौकिक मौन राज्यों के चरणों दिखा, पैटर्न रोलिंग के साथ; सक्रिय रेंगने के लिए सक्षम अभी भी एक ब्याज के क्षेत्र लेकिन स्कैनिंग कोशिकाओं के साथ सेलुलर भर्ती निर्देशित; प्रतिरक्षा सेल सक्रियण 18,20 के साथ कुल सेलुलर गिरफ्तारी। इलाज के बिना चूहों मुख्य रूप से थे कि कोशिकाओं से पता चला है जबकि स्वतंत्र रूप से मोतीले के साथ गति 15 माइक्रोन / सेक करने के लिए, सीसीएल 4 के साथ इलाज चूहों में CXCR6 / + GFP कोशिकाओं स्पष्ट रूप से 36 घंटा (चित्रा 7A) के बाद सेल प्रवास गति और आंशिक गिरफ्तारी के पहले से ही के बाद 18 घंटा और पूर्ण प्रवासी गिरफ्तारी कम प्रदर्शन किया। एकल कोशिका विश्लेषण के साथ लाइन में, एक दृश्य के भीतर सभी कोशिकाओं के सांख्यिकीय डेटा अधिकतम प्रवास गति भी औसत ट्रैक गति (चित्रा 7C) द्वारा मची थी जो सीसीएल 4 उपचार (चित्रा 7B), के बाद कुल माइग्रेशन गति कम और ट्रैक से पता चला (चित्रा 7 दिन), दृष्टिकोण जिगर की बीमारी के विकास में सेल प्रवास और स्थिति में मतभेद का वर्णन करने के लिए उपयुक्त था कि दिखा।

चित्र 1
चित्रा 1:। तैयारी के लिए इस्तेमाल माउस का ट्रेकिआटमी (ए) सर्जिकल उपकरण। 1x मानक गपशपएन संदंश, 1x Semken संदंश, 1x ड्यूमॉन्ट .7 संदंश, Graefe संदंश (4 आयामी (कुंद)), डबल गेंद लेखनी जांच हीडेमैन (जैसे, मिश्रण चिकनाना करनेवाला 3PL), 2x ब्लेयर retractors (सीधे / 1x घुमावदार दाँतेदार 2x) रंग HD2, सुई धारक (मैथ्यु या Halsey), 1x छोटे शल्य कैंची (तीव्र / कुंद, 1xcurved, 1x सीधे), सूक्ष्म कैंची (जैसे, Vannas वसंत कैंची), 1x छोटे जानवर Cauter, कपास swabs, आंख सुरक्षात्मक साल्वे, शल्य चिकित्सा धागा, एन-ब्यूटाइल-2-Cyanoacrylatglue। (बी) आँखें एक आँख सुरक्षात्मक मरहम का उपयोग कर संरक्षित कर रहे हैं। (सी) ट्रेकिआ तैयारी के लिए प्रारंभिक त्वचा में कटौती। Submaxillary लार ग्रंथियों के बीच संयोजी ऊतक (डी) विच्छेदन। श्वासनली (ई) प्रदर्शनी। ट्रेकिआ आसपास के मांसपेशियों के ऊतकों के (एफ) विच्छेदन। ट्यूब के निर्धारण के लिए ट्रेकिआ नीचे शल्य धागा (G) प्लेसमेंट। (एच) Tracheऊपरी उपास्थि के छल्ले के बीच microscissors के उपयोग करते हुए अल चीरा। श्वासनली में वेंटिलेशन ट्यूब (i) निवेशन। कपाल शल्य धागे की (जे) प्लेसमेंट त्वचा के लिए ट्यूब ठीक करने के लिए। (कश्मीर) ट्यूब की डबल निर्धारण। (मैं) एन-ब्यूटाइल-2-Cyanoacrylat का उपयोग कर शल्य चीरा सील। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। Laparatomy और जिगर की तैयारी (ए) के प्रारंभिक त्वचा चीरा, रक्त वाहिकाओं अत्यधिक रक्तस्राव को रोकने के लिए cauterized थे। उरोस्थि के नीचे पेरिटोनियम (बी) खोलना। दाग़ना इकाई का उपयोग कर पेरिटोनियल कटौती (सी) एक्सटेंशन। अधिजठर वाहिकाओं (डी) सील। ( G> ई) पसलियों के नीचे पेरिटोनियल चीरा का आगे विस्तार। Agarose चरण डिश में पशु की (एफ) प्लेसमेंट। समर्थन के ढेर के (एफ) प्लेसमेंट। श्वसन ट्रिगर सेंसर (G) प्लेसमेंट। (एच) श्वसन सिंक्रनाइज़ इमेजिंग के लिए ट्रिगर सीमा से सेटअप। (मैं) उरोस्थि निर्धारण शल्य धागे का उपयोग पसलियों वापस लेना। दात्राकार बंधन के डायाफ्राम और विच्छेदन से पित्ताशय की (जे) वियोग। कवर पर्ची के मंचन की (कश्मीर) प्लेसमेंट। (एल) के मंच पर जिगर पालि की नियुक्ति। जिगर पालि पर coverslip के (एम) प्लेसमेंट। (एन) प्लेसमेंट दीर्घकालिक संज्ञाहरण के लिए आईपी कैथेटर की। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3 "src =" / फ़ाइलें / ftp_upload / 52,607 / 52607fig3.jpg "/>
चित्रा 3:। लचीला सिलिकॉन टयूबिंग के साथ जुड़ा हुआ intraperitoneal कैथेटर 27 जी सुइयों।

चित्रा 4
चित्रा 4: माउस की निगरानी। (ए) प्लेसमेंट ईसीजी इलेक्ट्रोड (हरे, लाल, नीले केबल) के। के रूप में दिखाया ईसीजी का पता लगाने के लिए सुई subcutaneously रखा जाता है। ईसीजी (लाल) (बी) निगरानी दीर्घकालिक प्रगति (बाएं) और वास्तविक माप (दाएं) दिखा, निःश्वास सीओ 2 (नीला) और दिल की दर (लाल)। (सी) तापमान गर्मी पैड पर नियंत्रण के लिए यूनिट बिजली नियंत्रित। तापमान 36 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हमेशा ">:" रख-together.within पृष्ठ = के लिए "ve_content चित्रा 5
चित्रा 5: लिवर embedding और इमेजिंग। जिगर पालि की (ए) एम्बेड। पीबीएस में 3% agarose के एक 18G सुई के साथ एक 2 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कवर पर्ची के तहत 41 डिग्री सेल्सियस पर इंजेक्ट किया जाता है। (बी) जिगर पालि पूरी तरह से आंदोलन कलाकृतियों को कम से कम करने के लिए agarose में एम्बेडेड है। निर्जलीकरण को रोकने के लिए agarose शेष के साथ पेरिटोनियम (सी) सील। पूर्ण gelatinization के बाद देखने के agarose कवर खुर्दबीन क्षेत्र (डी) निकालना। Viewfield (ई) तैयार करना। जेड-स्तर और प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग नमूना रक्त के प्रवाह के मूल्यांकन के एफ समायोजन। (डी) कवर पकवान अत्यधिक वाष्पीकरण को रोकने के लिए। कवर सेटअप को दिखाने के लिए चित्र में उठाया है। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के संस्करण।

चित्रा 6
चित्रा 6:। सीसीएल चार इंजेक्शन के बाद जीर्ण जिगर की क्षति में CXCR6 GFP / + कोशिकाओं की ट्रैकिंग चूहों के साथ आईपी इंजेक्शन थे 0.6 मिलीग्राम / किग्रा सूरजमुखी तेल 18 घंटा या इमेजिंग से पहले 36 घंटे में भंग सीसीएल 4। के रूप में वर्णित प्रयोग के दिन, चूहों intravital TPLSM के अधीन थे। (ए) अभी भी सेल ट्रैकिंग की छवियों। सभी समय बिंदुओं से पटरियों सेलुलर गतिशीलता और विस्थापन को दिखाने के लिए आरोपित किया गया था। छवियाँ एक भी किरण टाइटन Saphire लेजर 840 एनएम और एक TPLSM माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया था। क्षेत्रों स्कैन चक्र के अनुसार लगभग 30 सेकंड का एक नमूना दर के साथ 70μm की पैठ गहराई के साथ 3-5 जेड ढेर लेने के स्कैन किया गया। (:; बैंगनी धीमी गति से चलती है या बिना डंठल कोशिकाओं: गतिशील कोशिकाओं हल्के नीले रंग) पटरियों प्रवास गति को दिखाने के लिए कोडित रंग थे। स्केल सलाखों: 100 μ; मी। (बी) ट्रैक दिशात्मकता और ट्रैक की लंबाई (माइक्रोन) दिखा उनके मूल लिए सामान्यीकृत रास्तों के xy-चित्र। अपने मूल से कोशिकाओं (सी) कुल विस्थापन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7:। आधारभूत और सीसीएल 4 इलाज चूहों कोशिकाओं जिगर गश्त उनके प्रवास गति के लिए विश्लेषण किया गया में जिगर ऊतक में intravital TPLSM द्वारा पीछा CXCR6 GFP / + कोशिकाओं के प्रवासन के आंकड़े। एकल कक्षों की (ए) प्रतिनिधि गति समय के साथ पीछा किया। स्पीड हर समय बिंदु पर मापा जाता है और व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक फ्रेम के लिए साजिश रची गई थी। लाइन्स व्यक्ति की कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। वाई-कुल्हाड़ियों अधिकतम प्रवास गति के अनुसार पहुंचा रहे हैं। (बी) सेंटसभी कोशिकाओं से ए फ़्रेम विशिष्ट गति के atistical विश्लेषण वर्गीकृत किया है और आधारभूत में विश्लेषण और सीसीएल चार चूहों इलाज किया गया। (सी) औसत ट्रैक गति सभी पटरियों से ट्रैक और आंकड़ों के अनुसार गणना की गई विश्लेषण के लिए वर्गीकृत किया गया। प्रत्येक ट्रैक (डी) अधिकतम गति साजिश रची और विश्लेषण किया गया था। सभी प्रयोगों तीन जानवरों के समूह में प्रदर्शन किया गया और परिणाम दो स्वतंत्र प्रयोगों में पुष्टि की गई। *** पी <0.001 (अयुगल छात्र टी परीक्षण दो पूंछ)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हमारे अध्ययन का उद्देश्य जिगर की intravital TPLSM इमेजिंग के लिए एक अत्यधिक, मानकीकृत स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि विकसित करने के लिए किया गया था। सामान्य रूप में intravital इमेजिंग घर वापस आना और विकास, homeostasis और बीमारी में अलग ल्युकोसैट आबादी की बातचीत निम्नलिखित वास्तविक जीवन की स्थितियों के तहत सेलुलर व्यवहार में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि दे दी है। हालांकि, सीधे अन्य ठोस अंगों की तुलना में जिगर के साथ ही उनके उच्च कमजोरी को प्रेषित कर रहे हैं, जिसकी वजह से श्वसन और क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला आंत्र आंदोलन करने के लिए जिगर की कुछ हद तक चुनौतीपूर्ण शारीरिक स्थिति, स्थिर दीर्घकालिक intravital इमेजिंग के लिए कई चुनौतियों लगाया। हाल के वर्षों में, चूहों में कई प्रयोगात्मक अध्ययन निवासी या monocytes / मैक्रोफेज 30-32, न्यूट्रोफिल 33 या विभिन्न लिम्फोसाइट कैंपेन्स 34,35 घुसपैठ से प्रमुख योगदान के साथ, घायल जिगर 28 में प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ की अत्यधिक गतिशील प्रकृति से पता चला है। हालांकि, एमइन आंकड़ों के कमजोर पक्ष अंत बिंदु विश्लेषण (जैसे, बहुरंगा जानवरों त्याग के बाद प्रवाह cytometry) से प्राप्त किए गए। अब तक केवल कुछ अध्ययनों बहुरंगा intravital इमेजिंग का उपयोग कर जिगर में सूजन के दौरान सेलुलर यातायात की गतिशीलता का वर्णन मौजूद हैं। उल्टे सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग होने के कारण कांच 24 नीचे करने के लिए ऊतक की फर्म आसंजन निर्धारण और जिगर की मॉइस्चराइजिंग के लिए आवश्यकता circumvents। कई multiphoton सूक्ष्मदर्शी ईमानदार इमेजिंग सिस्टम के रूप में बनाया जाता है हालांकि, बाद से, और अधिक व्यापक तैयारी और निर्धारण के तरीकों इमेजिंग के समय के लिए ऊतक को स्थिर करने की जरूरत है। आमतौर पर, कस्टम बनाया मचान प्रणालियों ऊतक निर्धारण 6, 36,37 के लिए वर्णित किया गया है, लेकिन इन के साथ यह ऊतक पर भी कम से कम दबाव रोगग्रस्त जिगर 38 पर और भी अधिक गंभीर प्रभाव के साथ sinusoidal के रक्त के प्रवाह को प्रभावित करता है, के बाद से जिगर microcirculation में मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

इसलिए, निम्नलिखित बातों पर विज्ञापन थेइन विवो TPLSM इमेजिंग द्वारा प्राप्त परिणामों का अनुकूलन करने के लिए इस विधि का सेटअप में कपड़े पहने: microcirculation में से कम से कम नमूना गड़बड़ी और विघटन से तैयारी की गुणवत्ता बढ़ाने के कारण मुद्दों से निपटने के लिए और पशुओं के अस्तित्व में वृद्धि हुई; गहन देखभाल की निगरानी और जैसे संज्ञाहरण, श्वसन और रक्त परिसंचरण आगे बढ़ाया पशु अस्तित्व के स्थिरीकरण और कम से कम शारीरिक कलाकृतियों के बाद के अनुकूलन, रक्त पीएच में असंतुलन के कारण होता है। ट्रिगर इमेजिंग के साथ संयोजन में नियंत्रित श्वसन श्वसन चक्र के साथ खुर्दबीन के तुल्यकालन के कारण आंदोलन कलाकृतियों को खत्म करने के लिए आवश्यक था। शारीरिक नमक सांद्रता वाले agarose में अंग के embedding धीरे किसी भी आगे यांत्रिक हेरफेर के बिना तैयारी के बाद अंग fixate के लिए फायदेमंद था और यह भी नमूने के निर्जलीकरण रोका। जिगर माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल सबसे प्रोटोकॉल स्टेशन के लिए केवल अपर्याप्त तरीके प्रदान ble है, लंबी अवधि के संज्ञाहरण। हालांकि, जानवरों के अस्तित्व के लिए काफी निगरानी के साथ यहाँ और संयोजन में प्रदान की संज्ञाहरण प्रोटोकॉल के साथ 8 घण्टे तक जीवित रहने के ऊपर गारंटी करने के लिए पर्याप्त था बढ़ाया जा सकता है। वैकल्पिक तरीकों ऐसे न्युट्रोफिल आक्रमण के रूप में 39 आम तौर पर 3 घंटे का समय अवधि के भीतर प्रक्रियाओं कल्पना करने के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन लंबे समय तक छवि के लिए इस तरह के monocyte या लिम्फोसाइट आक्रमण 22 या यहां तक कि सेल प्रसार के रूप में 6 स्थायी प्रक्रियाओं संभावना की कमी है। तीव्र और जीर्ण जिगर में सूजन के दौरान भर्ती, घुसपैठ और सेलुलर बातचीत की गतिशीलता को समझना जिगर की बीमारी के विकास और प्रगति में अधिक विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकते हैं। इम्युनोपैथोलोजी के इस बढ़ाया समझ का उपयोग करके यह ब्याज का लक्ष्य कोशिकाओं को संबोधित करने के बजाय जैसे गैर चयनात्मक प्रतिरक्षादमनकारी दृष्टिकोण का उपयोग करने के मामले में और अधिक परिष्कृत उपचारों डिजाइन करने के लिए संभव हो जाएगा।

leukocytes की स्थिति, स्थानांतरगमन और बातचीत को संबोधित करने के लिए> "ove_content, उच्च गुणवत्ता के चित्र जिगर vasculature और जिगर ऊतक 18,20,40 के भीतर कोशिकाओं की सटीक 4D नज़र रखने के लिए आवश्यक हैं।

हम यहाँ उपलब्ध कराने के विधि यह दोनों के लिए आसान संभाल करने के लिए कर रही है और नमूना की न्यूनतम गड़बड़ी के साथ कुशल लागत, आम प्रयोगशाला अभिकर्मकों और उपकरणों का उपयोग कर लागू किया जा सकता है। यथासंभव लंबे समय के लिए माउस की शारीरिक स्थिति बनाए रखने के लिए, यह ऑक्सीजन और रक्त सीओ 2 के स्तर को नियंत्रित करने के लिए सांस की मात्रा और आवृत्ति फ़ाइन-समायोजित करने के लिए आवश्यक है। कारण पेरिटोनियम में तरल पदार्थ की निरंतर प्रेरणा को हालांकि कम से कम केवल संचलन के स्थिरीकरण के बारे में एक आंशिक नियंत्रण की अनुमति परिसंचरण, ईसीजी और दिल आवृत्ति माप स्थिर करने के लिए एक अस्थायी आपूर्ति है। प्रत्यक्ष रक्तचाप नियंत्रण और केंद्रीय शिरापरक तरल आवेदन को लागू करने से यह संभावना है कि महत्वपूर्ण parametनेताओं स्थिरता और जीवित रहने की भी बेहतर बनाने के लिए अग्रणी है, और भी अधिक स्थिर किया जा सकता है।

यहां तक कि अत्यधिक नियंत्रित परिस्थितियों में, आमतौर पर ऐसी एसिटामिनोफेन प्रेरित जिगर की क्षति के रूप में चूहों में इस्तेमाल जिगर की क्षति मॉडल के अधीन कर दिया गया है, जो जानवरों की इमेजिंग, सीसीएल 4 प्रेरित जिगर की क्षति या आहार प्रेरित फैटी लीवर रोग चुनौती बनी हुई है। कारण चयापचय राज्य के नियंत्रण में जिगर और रक्त परिसंचरण में अपनी केंद्रीय स्थिति के आवश्यक कार्य करने के लिए, जिगर की कार्यक्षमता या microcirculation में पशुओं के सीधे प्रभाव लंबे समय तक जीवित रहने, इसलिए संभावना को सीमित करने के लिए परिवर्तन भारी की लंबी TPLSM वीडियो दृश्यों प्राप्त करने के लिए गंभीर हेमोरेज या नष्ट कर दिया microvasculature के साथ जैसे क्षतिग्रस्त अंगों। इसके अलावा, व्यापक necroses के साथ मॉडल के रूप में गंभीर रूप से बदल जिगर microanatomy में, यह सेल सेल-मुलाकातों और भड़काऊ सेल समुच्चय के स्थानीय compartmentalization अध्ययन करने के लिए मुश्किल बना हुआ है कोई स्टेन क्योंकि(जैसे पारंपरिक माइक्रोस्कोपी या इम्यूनोफ्लोरेसेंस में DAPI धुंधला में hematoxylin-धुंधला) के रूप में शारीरिक संरचनाओं के लिए dardized "जवाबी धुंधला" आगे इमेजिंग प्रक्रिया से प्राप्त आंकड़ों के intravital TPLSM.The गुणवत्ता के लिए उपलब्ध है कोशिकाओं की लेबलिंग तीव्रता पर निर्भर करता है और सूक्ष्म सेटअप।

कई दृष्टिकोण जिगर में GFP + कोशिकाओं कल्पना करने के लिए मौजूद हैं। बहुत कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के साथ उच्चतम प्रतिदीप्ति 900 और 920 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के बीच प्राप्त की है। जिगर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का लगभग पूरा नुकसान ऐसे Dextran या Lectin के रूप में अतिरिक्त पोत ट्रैकर का उपयोग नहीं करते हैं, तो जिगर के भीतर कोशिकाओं की स्थिति की जांच की अनुमति नहीं है। इसलिए, हम GFP संकेत और भी उज्ज्वल विस्तृत नहीं बल्कि जिगर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के बीच सबसे अच्छा अनुपात दे रही है, 840 एनएम के तरंग दैर्ध्य में छवि की ओर पलायन ल्यूकोसाइट्स का फैसला किया।

साथ में ले ली, intrइस अध्ययन में पेश AVITAL TPLSM इमेजिंग प्रणाली जिगर विशिष्ट intravital माइक्रोस्कोपी सवालों की एक व्यापक विविधता के लिए लागू किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण के साथ, इस तरह के गुर्दे, जिगर, मूत्राशय, पेट या अग्न्याशय के रूप में अन्य ठोस अंगों में TPLSM इमेजिंग इसलिए में कोशिकाओं की लंबी अवधि प्रवासी प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक अत्यंत लचीला दृष्टिकोण प्रदान करने, सर्जिकल प्रक्रियाओं और ऊतक मचान का केवल मामूली संशोधनों के साथ संभव है विवो।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetics
Buprenorphine Essex Pharma 997.00.00 Analgeticum, 0.1 mg/kg
Fentanyl Rotex Medica charge: 30819
Fluovac anesthesia system Harvard Apparatus 34-1030
Glucose 5% Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser Eickemeyer 4802885
Isoflurane Forene Abbott B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution DeltaSelect GmbH PZN 00765145
Ketamin 10% ceva Charge: 36217/09
Xylazin 2% medistar Charge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20 ml Syringe BD Plastipak
250 ml Erlenmeyer flask Schott Duran 21 226 36
25 ml Beaker 2x Schott Duran 50-1150
2 ml syringe BD Plastipak
4-0 Vicryl suture Ethicon V7980
Agarose commercially available
Bepanthen Eye and Nose ointment Bayer Vital GmbH 6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit Fine Science Tools Inc. 18010-00
Cotton Gauze swabs Fuhrmann GmbH 32014
Cover Slip 24x50 mm ROTH 1871
Durapore silk tape 3M 1538-1
Feather disposable scalpel Feather 02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID Smiths medical 800/100/200
Histoacryl Braun 1050052 5x 0.5 ml
Leukoplast BSN Medical Inc.
Microscope Slides ROTH 1879
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum Antiseptica GmbH 72PAH200
Sterican needle 18 G x 1 B. Braun 304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1 B. Braun 4657705
Tissue paper commercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PL Gatz 0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 Storz&Klein S-01134
Dumont No.7 forceps Fine Science Tools Inc. 91197-00
Graefe forceps curved x1 Fine Science Tools Inc. 11151-10
Graefe forceps straight x2 Fine Science Tools Inc. 11050-10
Heidemann spatula HD2 Stoma 2030.00
Needle holder Mathieu Fine Science Tools Inc. 12010-14
Scissor Fine Science Tools Inc. 14074-11
Semken forceps Fine Science Tools Inc. 11008-13
Small surgical scissors curved Fine Science Tools Inc. 14029-10
Small surgical scissors straight Fine Science Tools Inc. 14028-10
Standard pattern forceps Fine Science Tools Inc. 11000-12
Vannas spring scissors Fine Science Tools Inc. 15000-08
Equipment
ECG Trigger Unit Rapid Biomedical 3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer AD Instruments
Minivent Typ 845 Harvard Apparatus 73-0043
Multiphoton microscope Trimscope I LaVision
Perfusor Compact B. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorder AD Instruments PL3508
Temperature controlled heating pad Sygonix 26857617
Temperature sensor comercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box Life Imaging Services

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117, (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
  3. Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10, (11), 955 (1969).
  4. Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82, (33), 575-578 (1970).
  5. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24, (4), 307-318 (2011).
  6. Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75, (3), 307-315 (2011).
  7. Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
  8. Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280, (6), G1076-G1082 (2001).
  9. Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45, (5), 544-553 (2010).
  10. Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50, (5), 497-506 (1977).
  11. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99, (11), 2782-2790 (1997).
  12. Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172, (1), 45-53 (2004).
  13. Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (20), 10763-10768 (1996).
  14. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75, (4), 2015-2024 (1998).
  15. Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62, (2), 137-145 (2003).
  16. Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91, (4), 281-289 (2013).
  17. McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23, (6), 2212-2217 (2003).
  18. Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3, (4), (2005).
  19. Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180, (4), 2024-2028 (2008).
  20. Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190, (10), 5226-5236 (2013).
  21. Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43, (2), 306-315 (2006).
  22. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28, (2), 271-284 (2008).
  23. Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40, (1), 117-123 (2010).
  24. Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, (3), e1000805 (2010).
  25. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, (6002), 362-366 (2010).
  26. Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89, (6), 419-432 (2008).
  27. Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14, (10), 996-1006 (2013).
  28. Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10, (6), 509-536 (2011).
  29. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352, (1-2), 89-100 (2010).
  30. Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50, (1), 261-274 (2009).
  31. Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55, (3), 898-909 (2012).
  32. Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (46), E3186-E3195 (2012).
  33. Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60, (4), 782-791 (2014).
  34. Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59, (2), 630-642 (2014).
  35. Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61, (9), 1323-1329 (2012).
  36. McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205, (4), 915-927 (2008).
  37. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34, (5), 807-819 (2011).
  38. Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24, (1), 13-20 (2008).
  39. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17, (11), 1381-1390 (2011).
  40. Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4, (3), e4693 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics