Long Term Intravital multiphoton Microscopy Imaging af immunceller i rask som syg Lever Brug CXCR6.Gfp Reporter Mus

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., Ergen, C., Kohlhepp, M., Mossanen, J. C., Schneider, C., Vogt, M., Tolba, R. H., Trautwein, C., Martin, C., Tacke, F. Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice. J. Vis. Exp. (97), e52607, doi:10.3791/52607 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lever inflammation som reaktion på skade er en meget dynamisk proces, der involverer infiltration af distinkte undertyper af leukocytter, herunder monocytter, neutrofiler, T-celle-delmængder, B-celler, naturlige dræberceller (NK) og NKT-celler. Intravital mikroskopi af leveren til overvågning immuncellemigrering er særligt udfordrende på grund af de høje krav til prøveforberedelse og fiksering, optisk opløsning og langsigtet dyr overlevelse. Alligevel kunne dynamikken i inflammatoriske processer samt cellulære interaktionsundersøgelser give vigtige oplysninger til bedre at forstå indledningen, progression og regression af inflammatorisk leversygdom. Derfor er en meget følsom og pålidelig metode blev etableret for at undersøge migration og celle-celle-vekselvirkninger i forskellige immunceller i muselever over lange perioder (ca. 6 timer) ved intravital to-foton laser scanning mikroskopi (TPLSM) i kombination med intensiv pleje overvågning.

ent "> Den angivne fremgangsmåde indbefatter en blid forberedelse og stabil fiksering af leveren med minimal forstyrrelse af organ, langsigtede intravital billeddannelse ved hjælp af flerfarvet multiphoton mikroskopi med næsten ingen fotoblegning eller fototoksiske virkninger over en periode på op til 6 timer, så sporing af specifikke leukocytundergrupper, og stabile billeddiagnostiske betingelser på grund af omfattende overvågning af mus vitale parametre og stabilisering af cirkulation, temperatur og gasudveksling.

For at undersøge lymfocytmigration ved leverbetændelse CXCR6.gfp knock-in-mus blev udsat for intravital billeddannelse af leveren under baseline betingelser og efter akut og kronisk leverskade induceret ved intraperitoneal injektion (r) carbontetrachlorid (CCI4).

CXCR6 er en kemokinreceptor udtrykt på lymfocytter, primært på Natural Killer T (NKT) -, Natural Killer (NK) - og undergrupper af T-lymfocytter som CD4 T-celler, men også slimhinder associeredeated invariant (MAIT) T-celler 1. Efter den vandrende mønster og positionering af CXCR6.gfp + immunceller tilladt et detaljeret indblik i deres ændrede adfærd på leverskade og dermed deres potentielle engagement i sygdomsprogression.

Introduction

Visualiseringen af celler og cellulære funktioner i hele organer eller endda hele organismer har været af stor interesse for mere end 50 år, herunder stort set alle dele af kroppen 2. Derfor nogle tidlige undersøgelser, der allerede er ansat intravital billeddannelse af leveren 3,4. Der findes imidlertid flere begrænsninger ajour om langsigtet stabil høj opløsning billeddannelse af levervæv.

På grund af den anatomiske placering af leveren i tæt kontakt med membranen og mavetarmkanalen 5, den mest almindelige problem for mikroskopisk intravital billeddannelse er bevægelse på grund af respiration og, i mindre omfang, peristaltisk af tarmkanalen 6. I sammenligning med andre faste organer, lever kirurgi er en særlig udfordring. På grund af den tætte mikrovaskulære struktur, kan kirurgisk manipulation føre til massive blødende læsioner, nedsat mikrocirkulation 7 og også aktivering af bosiddende immune celler såsom Kupffer-celler 8. Derfor mekanisk fiksering af vævet som offentliggjort andetsteds 6,9 kan forventes at påvirke den intravital mikroskopi billeddannelse.

I en sund lever, 10-15% af det samlede blodvolumen bor i leveren vaskulatur, og organet modtager omkring 25% af den samlede minutvolumen 10, gør organet stærkt modtagelige for ændringer i kredsløbet (f.eks udsving blodtryk ). Derfor vil forstyrrelser i det hepatiske blodgennemstrømning som følge af f.eks shear stress, forskydning, skade ved overdreven væv håndtering eller centraliseret cirkulation føre til kunstige ændringer i leukocyt vandringsadfærd, nedsat lever- iltning og dermed yderligere skade lever, påvirker leveren immunreaktioner samt som orgel bevarelse og den samlede levetid af dyret.

Tidlige mikroskopiske undersøgelser var baseret på intravital epifluorescens microscopy, men flere tekniske begrænsninger, såsom foto blegning og lav indtrængningsdybde begrænse brugen af denne teknik for langsigtet lever imaging 4,11,12. Med udviklingen af multiphoton mikroskopi i 1990'erne, blev begrænsningerne i foto blegning eller indtrængningsdybde primært løst, da denne nye metode var teknisk i stand til at udføre billeddiagnostiske undersøgelser i næsten alle organer i henhold til det virkelige liv situationer 13-15. Men de vigtigste tilbageværende udfordringer med hensyn til lever imaging var: ånde bevægelser, autofluorescens af levervæv, sikring uændret blodgennemstrømningen i de hepatiske sinusoider, og især stabil billeddannelse i længere perioder på flere timer 16.

Selvom flere undersøgelser rettet funktionen og migration af forskellige leukocytter i leveren 17, fx NKT-celler 18-20, T-celler 21,22, lever makrofager 23,24 eller neutrofiler 25, langsigtet multiphoton microscopy billeddannelse endnu ikke blevet oprettet, en opgave endnu mere udfordrende i dyr med akut eller kronisk leversygdom på grund af den eksisterende skader og derfor højere følsomhed over for yderligere skader 26. Men overvågning vandrende adfærd og cellulære funktion af leukocytter i leveren i realtid giver nye indsigter i deres særlige rolle i lever homeostase og sygdom 27.

Kemokinreceptoren CXCR6 udtrykkes på flere lymfocytundergrupper, herunder naturlige dræberceller (NK-celler), NKT-celler og nogle T-cellepopulationer 18,28. Tidligere undersøgelser af mus har indikeret, at CXCR6 og dens beslægtede ligand CXCL16 kan styre patruljering af NKT celler på lever sinusoids under homøostase. Derfor har anvendelsen af CXCR6.gfp mus (der bærer en knock-in for grønt fluorescerende protein [GFP] i CXCR6 locus) blevet beskrevet at undersøge migrationen af lymfocytter i forskellige organer, såsom hjernen 29og også leveren 18,20, viser forøget infiltration af CXCR6.gfp celler efter inflammation.

Med metoden i denne undersøgelse var det muligt at følge disse processer i en lang periode under stabiliserede forhold. Den intravital multiphoton baseret procedure tilladt imaging, der var meget reproducerbar med minimal forstyrrelse af dyre- og orglet; optimeret til langsigtet dyr overlevelse ved omfattende overvågning efterfulgt af nøje kontrol med åndedræt og cirkulation; og meget fleksibel og let at også vedtage andre parenkymale organer såsom nyrer og milt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Forsøgene blev udført i overensstemmelse med den tyske lovgivning om dyreforsøg efter "Vejledning til pleje og anvendelse af forsøgsdyr« (NIH publikation, 8. udgave, 2011), og direktiv 2010/63 / EU om beskyttelse af dyr anvendes til videnskabelige formål (Den Europæiske Unions Tidende, 2010). Officiel tilladelse blev givet fra det statslige pasning af dyr og kontorbrug (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Tyskland).

BEMÆRK: Trin, der kan udelades for kortvarig imaging (f.eks snap shots, 3-D stakke eller også kort varighed time-lapse mikroskopi) er markeret med en stjerne (*) for at reducere forberedelsestid og forenkle den kirurgiske protokol. Imaging kan også udføres uden omfattende overvågning og cirkulation kontrol, hvis det er nødvendigt, men overlevelse tid vil blive markant reduceret.

1. Mikroskop Opsætning og præoperativ Forberedelse (5-10 min)

  1. Tænd systemet (mikroskop, magt Lab, laser, varmepude, klimakammer, web cam, sprøjtepumpe enhed, respirator).
  2. Forbind O 2 levering til Isofluran Vapor og indstille Isofluran niveau til 1,5 Vol% (v / v), forbindelse til et lille dyr respirator.
    1. For kort sigt billeddannelse, opretholde anæstesi ved hjælp isofluran, efter den indledende ip anæstesi induktion (se trin 2.2). Så brug 2 Vol% (v / v) Isofluran, og holde den billeddannende tid under 2 timer for at sikre en stabil lever mikrocirkulationen.
  3. Sæt åndedræt til 120-140 respiratoriske cyklusser / min med et volumen på 150-200 pi.
  4. Opsætning mus agarose scenen. Forbered 100 ml 3% (w / v) agarose, hælde det i en skål (ca. 10 cm x 15 cm base) i en vinkel på 40 °.
  5. Opsætning kirurgisk arbejdsområde indsamle den nødvendige instrumentering. For at forhindre mikrobiel infektion desinficere instrumenter anvendelse af en 1% opløsning af Sekusept Forte S (9,9% w / v) Glutaral 9,8% w / v, Formaldehyde for 5 min før forsøget (figur 1A).
  6. Opnå resterende komponenter: hud desinfektionsmiddel (f.eks 10% povidon-iod-opløsning), liver etape (stakke & bro), agaroseopløsning (3% (w / v) i PBS), sprøjtepumpe med 5% (w / v) glukose (G-5), sprøjtepumpe med bedøvende opløsning I (Ketamin 0,1 mg / ml, xylazin 0,5 mg / ml, Fentanyl 5 ug / ml), vatpinde, n-butyl-2-Cyanoacrylat og 1x PBS. Sæt agarose etape fad i inkubation kammer til forvarmning.

2. Tracheotomi (10-15 min)

  1. Brug C57BL / 6 mus fra i hus avl vejer 25-28 g. Hus musene under særlige patogenfrie forhold i overensstemmelse med de FELASA retningslinjer i et temperatur- og luftfugtighed-kontrolleret miljø med en 12 timers lys / 12 timer mørke cyklus. Tillad dyr fri adgang til standard mus kost (Sniff Standard gnaver Diet) og vand ad libitum.
  2. Bedøver musen ved initial intraperitoneal (ip) injektion af 250 pi bedøvende opløsning II (Ketamin 0,1 mg / ml, xylazin 1 mg / ml, buprenorphin 10 ug / ml).
    1. * For vedligeholdelse under intravital billeddannelse, bedøvende opløsning I kontinuerligt administrere ved kontinuerlig IP-injektion (Ketamin 0,1 mg / ml, xylazin 0,5 mg / ml, Fentanyl 5 ug / ml) under anvendelse af en sprøjtepumpe enhed med en strømningshastighed på 0,2 ml / time i kombination med inhalativ isofluran 0,5 Vol% (v / v).
    2. Tjek reflekser efter 5 min (f.eks knivspids fod pad med tang), desinficere huden for tracheotomi, start præparat, hvis musen er i kirurgisk tolerant anæstesi tilstand.
    3. Anvend øjet beskyttende creme (f.eks Dexpanthenol 50 mg / g) for at forhindre hornhinden tørrer ud (figur 1B).
  3. Fiksere musen på forberedelse bordet udsætte ventrale side med tape for ekstremiteterne; blidt overstrække hals, fiksere i denne stilling, f.eks., ved hjælp af en elastik hooked to fortænder.
    1. Desinficer hud og pels ved hjælp af povidon jod løsning, ved at anvende desinfektionsmiddel med en vatpind.
  4. Udfør indledende hud cut (0,5-1 cm længde) direkte under hagen (figur 1C)
    1. Dissekere forsigtigt bindevæv mellem spytkirtlerne (figur 1D).
    2. Rive forsigtigt åbne muskuløs rør omkring luftrøret (figur 1E, F).
  5. Placer kirurgisk tråd under luftrøret til senere ventilationsrøret fiksering (figur 1G).
    1. Åbent luftrøret med mikro-saks mellem brusk ringe udfører et T-formet indsnit (figur 1 H)
  6. Placer ventilationsrøret i luftrøret gennem snittet (~ 0,5 cm). For at skubbe røret fremad, Grib caudale ende med små anatomiske pincet og forsigtigt videre røret i luftrøret (Figur 1I)
  7. Fiksere røret med kirurgisk tråd (f.eks (figur 1J, K).
  8. Seal skåret med vævslim (f.eks n-butyl-2-Cyanoacrylat) (figur 1 I).
  9. Fiksere røret i spidsen med tape.

3. laparatomi (15-20 min)

  1. Placer musen på varmepude for at forhindre hypotermi. Shave maven, forsigtigt fjerne hår fra huden. Desinficer barberet hud og pels ved hjælp af povidon jod løsning.
  2. Udfør en lille hud skåret under brystbenet anvendelse af kirurgiske sakse (figur 2A). Forlæng snittet sideværts under ribbenene på begge sider, ætsende alle synlige blodkar for at forhindre blødning.
  3. Udføre forsigtigt et lille snit på linea alba under brystbenet, åbne bughinden (figur 2B). Udvid snittet til begge sider ved hjælp af cauteriztion til at forebygge blødninger (figur 2C, D).
  4. Placer musen i agarose fase skål (figur 2E). Placer stakke af passende højde på begge sider af mus (som regel 12-14 dækglas) (figur 2F).
  5. Placer respiratorisk trigger sensor under øvre ryg til at synkronisere mikroskopet med åndedræt. Aktivering trigger (figur 2G).
  6. Placer kirurgisk tråd (5-0) gennem brystbenet at trække ribben (Figur 2i).
  7. Skær forsigtigt ligament forbinder leveren og membranen (falciforme ligament) samt leveren og mavetarmkanalen ved hjælp af buede kirurgiske sakse. Skær falciforme ligament ned til aorta (figur 2J).

4. Prøve Setup (10-15 min)

  1. Placer musen på den højre side med en vinkel på 45 ° for nem adgang til store leverlap.
  2. Tilføj mellemstationer bro under ribbenene, som dækker den abdominalehulrum. Fremstilling en bro ved hjælp af en standard dækglas med tape belægning til dækning skarpe kanter (figur 2K).
  3. Placer store leverlap på scenen. Glide forsigtigt dobbelt bold stylus sonde eller en polstret spatel under leveren, og hold i toppen af ​​orglet med en våd vatpind eller vådt væv. Løft lap på dias og forsigtigt træk. Lobe kan bøjes eller foldes. Giv ekstra omhyggelig med at kun blid manipulation af leveren (figur 2L).
  4. Placer lateral støtter indsatser, fx bunker af små dækglas (20 mm x 20 mm), omtrent samme højde af leveren lap ud for det at støtte dækglas.
  5. Placer store dækglas (24 mm x 50 mm) på leveren lap. Sørg for, at dækslet slip er orienteret så vandret som muligt (Figur 2 M).
    BEMÆRK: Dækslet slip bør være i kontakt med vævet uden at klemme den. Tjek for synlige tegn på svækket blodgennemstrømning (hvid væv). Hvis microcircfolkning er afbrudt, tilsættes yderligere støtte indsatser.
  6. * Place to uafhængige intraperitoneale katetre (Figur 2 N) for langsigtet anæstesi og G-5-programmet. Installer katetre sideværts i underlivet siden af ​​bagbenene.
    BEMÆRK: De intraperitoneale katetre kan være selvstændige foretaget ved at forbinde 27 g nåle med fleksibel silikone slange (figur 3).
  7. * Fiksér nål med en løkke af 5-0 kirurgisk tråd på huden for at undgå utilsigtet forskydning.
  8. * Fastgør sprøjten pumpe med anæstesi løsning I kateter 1, sæt strømningshastighed til 0,2 ml / time; vedhæfte sprøjte pumpe med G-5 til kateteret 2, indstillet strømningshastighed til 0,1 ml / time.

5. Mouse Overvågning

  1. * Anbring EKG-elektroder i front- og hind ekstremiteter (figur 4A).
  2. * Vedhæft udløb slange til CO2-niveau sensor.
  3. Tilføj ekstern temperaturføler forbundet til varmepude (figur 4C).

6. Indlejring og vævsfiksering (5-10 min)

  1. Forbered 100 ml 3% (w / v) agarose i 1X PBS. Indkapsle leveren, når temperaturen er 41 ° C under anvendelse af en 5 ml sprøjte og en 18 G nål (figur 5A).
  2. Hæld resterende agarose på dækglas og omkring mus (figur 5B, C). Vent agarose er fuldt gelatineret.
  3. Fjern overskydende agarose ved hjælp af Heidemann spatel, forbereder en Viewfield stor nok til at scanne forberedt lever lap (figur 5D, E).

7. Imaging

  1. Overfør musen ind mikroskop klimakammer.
  2. Tilføj 50-100 ml 1X PBS (forvarmet på 37 ° C).
  3. Dæk prøve fad for at forhindre fordampning (figur 5F).
  4. * Reducer inhalativ isofluran til 0,5 Vol% (v / v).
  5. * Begynd overvågningssoftware, optagelse EKG, puls og eksspiratorisk CO2.
  6. Start billeddannelse: Åbn laSer skodder, identificere se Interesseområder definere øvre og nedre grænse for Z-stakke, og start tid bortfalder optagelse. Juster Z-stakke om nødvendigt at korrigere Z-drift (f.eks. Som følge af ændringer i blodtrykket eller temperatur udsving, figur (5G).
    BEMÆRK: Efter afslutning af den billeddannende periode, eller hvis omsætning eller bedøvelse af dyrene bliver ustabil, ofrer mus ved cervikal dislokation (uden opvågning fra anæstesi).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at validere vores intravital TPLSM tilgang vi udsat CXCR6 GFP / + mus til intravital TPLSM billeddannelse. Mus blev enten ubehandlet som baseline kontrol eller underkastes en enkelt intraperitoneal injektion af tetrachlormethan (CCL 4) for at inducere akut leverskade 20.

Video sekvenser blev taget over en periode på 2-5 timer, og cellerne blev spores over tid på grund af deres grønne fluorescens. For at vise generelle cellulære motilitet blev alle spor, der blev fundet under den procedure, afbildet som en overlejret billede (figur 6A). Mens celler under udgangsbetingelserne viste langdistance vandring langs leveren sinusoids mod den centrale vene, 18 timer efter CCI4 behandling af CXCR6 + / GFP celler viste allerede delvist værdiforringede bevægelsesmønstre. Selv om nogle hurtig bevægelse celler var stadig til stede i leveren sinusoider flere fokusområder var synlige med celler,havde ændret sig fra tilfældig migration til lokal scanning, hvilket indikerer en kemotaktiske respons rekruttere celler til området skade. Effekten var endnu mere udtalt efter 36 timer, viser en næsten fuldstændig anholdelse af CXCR6 + celler med næsten ingen aktive migration. Mens under udgangsbetingelserne mest migrerende celler havde variable hastigheder migration med tilfældige retningsændringer, viste CCI4 behandlede dyr celler, der kun blev langsomt kravler samt nogle frit bevægelige celler patruljerer sinusoider efter 18 timer, men ikke efter 36 timer. Brug af farvekodede spor migration, kunne celle hastighed visualiseres direkte at vurdere effekten af CCl4 behandling. Den Hæmmede migration var også synlig i den normaliserede spor diagram (figur 6B), der viser, at 18 timer efter CCl4 mængden af langdistance spor såvel som den gennemsnitlige banelængde markant reduceret, men efter 36 timer ikke motile celler kunne påvises nogen mere. På linje wed disse resultater, den cellulære forskydning, som beskriver en celles evne til frit at patruljere vaskulaturen faldt over tid, hvilket indikerer en indfangning af cellerne 36 timer efter CCl4 behandling på stedet af hepatocellulær skade (Figur 6C).

For at følge den vandrende adfærd CXCR6 + / GFP celler i leveren nærmere, blev migration hastighed repræsentative individuelle celler plottet til at visualisere deres niveau af motilitet over tid. Vi og andre tidligere beskrevne flere forskellige bevægelsesmønstre af CXCR6 + / GFP-celler: Aktiv tilfældig gennemsøgning med en stikning rullende mønster, der viser faser af cellulær motilitet og tidsmæssige hvilende stater; instrueret cellulær rekruttering med celler scanning et område af interesse, men stadig i stand til aktiv gennemgang; totale cellulære arrest ledsaget af aktivering af immunceller 18,20. Mens mus uden behandling primært viste celler, der var frit Motile med hastigheder på op til 15 pm / sek, fremvist CXCR6 + / GFP celler i mus behandlet med CCI4 markant reduceret cellemigration hastighed og delvis anholdelse allerede efter 18 timer og fuld vandrende anholdelse efter 36 timer (figur 7A). I overensstemmelse med den enkelt celle analyse, de statistiske data om alle celler i en sekvens afslørede faldende samlet migration hastighed efter CCI4 behandling (figur 7B), som også blev lignede ved gennemsnitlige spor hastigheder (Figur 7C) og spore maksimale migration hastigheder (figur 7D), viser, at den fremgangsmåde, var egnet til at beskrive forskellene i cellemigration og positionering i udviklingen leversygdom.

Figur 1
Figur 1:. Tracheotomi af mus (A) kirurgisk udstyr anvendt til fremstilling. 1x standard trommenn tang, 1x Semken pincet, 1x Dumont No.7 pincet, Graefe pincet (savtakket, 2x straight / 1x buede), 2x Blair retraktorer (4 strenget (stump)), dobbelt bold stylus sonde (f.eks Amalgam burnisher 3PL), Heidemann spatel HD2, nåleholder (Mathieu eller Halsey), 1x små kirurgiske sakse (skarp / sløv, 1xcurved, 1x straight), mikro-saks (f.eks Vännäs Spring saks), 1x lille dyr Cauter, vatpinde, øjet beskyttende Salve, kirurgisk tråd, n-butyl-2-Cyanoacrylatglue. (B) øjne er beskyttet ved hjælp af et øje beskyttende salve. (C) Indledende snit hud for luftrøret forberedelse. (D) Dissektion af bindevæv mellem mandibulære spytkirtler. (E) Exposition af luftrøret. (F) Dissektion af muskelvævet omkring trachea. (G) Placering af kirurgisk tråd under luftrøret til fiksering af rør. (H) Tracheal snit ved hjælp microscissors mellem øvre brusk ringe. (I) Insertion af ventilationsrøret i trachea. (J) Anbringelse af kranie kirurgisk tråd for at løse rør til huden. (K) Dobbelt fiksering af røret. (I) Tætning kirurgisk snit ved hjælp af n-butyl-2-Cyanoacrylat. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Laparatomi og lever sammensætning (A) Initial indsnit hud blev blodkar ætses for at forhindre overdreven blødning. (B) Åbning af bughinden under brystbenet. (C) Forlængelse af peritoneal snit ved hjælp cautery enhed. (D) Forsegling af epigastriske fartøjer. ( g> E) Yderligere udvidelse af peritoneal indsnit under ribbenene. (F) Placering af dyr i agarose fase skålen. (F) Placering af support stakke. (G) Placering af respiratorisk trigger sensor. (H) Opsætning af trigger tærskel for respiration synkroniseret billeddannelse. (I) Brystbenet fiksering at trække ribben ved hjælp af kirurgisk tråd. (J) Frakobling af galdeblæren fra mellemgulvet og dissektion af falciforme ligament. (K) Placering af iscenesættelse dækglas. (L) Placering af leverlap på scenen. (M) Placering af dækglas på lever lap. (N) Placering af IP-kateter til langsigtet anæstesi. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3 "src =" / files / ftp_upload / 52607 / 52607fig3.jpg "/>
Figur 3:. Intraperitoneal kateter 27 g nåle i forbindelse med fleksible silikoneslanger.

Figur 4
Figur 4: Overvågning af musen. (A) Placering af EKG-elektroder (grøn, rød, blå kabler). Nåle til EKG detektion placeres subkutant som vist. (B) Overvågning af EKG (rød), expiratory CO 2 (blå) og puls (rød), der viser langsigtet progression (til venstre) og den faktiske måling (til højre). (C) Køle motor til varme pad kontrol. Temperaturen er indstillet til 36 ° C. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

ve_content "FO: keep-together.within-side =" altid "> Figur 5
Figur 5: Lever indlejring og billeddannelse. (A) Integrering af lever lap. 3% agarose i PBS injiceres ved 41 ° C under dækglasset ved anvendelse af en 2 ml injektionssprøjte med en 18G nål. (B) Lever lap er fuldt integreret i agarose at minimere bevægelse artefakter. (C) Forsegling af bughinden med resterende agarose for at undgå dehydrering. (D) Fjernelse af agarose dækker mikroskop synsfelt efter fuld gelatinering. (E) Fremstilling af Viewfield. F Regulering af Z-niveau og evaluering af prøve blodgennemstrømning ved hjælp af lysmikroskopi. (D) Cover skål for at forhindre overdreven fordampning. Cover løftes på billedet for at vise setup. Klik her for at se et størreversion af denne figur.

Figur 6
Figur 6:. Sporing af CXCR6 GFP / + celler i kronisk leverskade efter CCI4 injektion Mus blev injiceret ip med 0,6 ml / kg CCI4 opløst i solsikkeolie 18 timer eller 36 timer før billeddannelse. På dagen for eksperimentet, blev musene udsat for intravital TPLSM som beskrevet. (A) Still billeder af celle sporing. Spor fra alle tidspunkter blev overlejret at vise cellulære motilitet og fordrivelse. Billeder blev taget med en enkelt stråle Titan Saphire Laser ved 840 nm og en TPLSM mikroskop. Områder blev scannet tager 3-5 Z-stakke med en indtrængningsdybde 70 pm med en samplingfrekvens på ca. 30 sekunder pr scan cyklus. Spor var farvekodede for at vise migration hastighed (lyseblå: langsomme eller fastsiddende celler lilla: bevægelige celler). Scale barer: 100 μM. (B) XY-diagrammer over stier normaliseret for deres oprindelse viser spor retningsbestemmelse og banelængde (um). (C) Samlet forskydning af celler fra deres oprindelse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 7
Figur 7: Migration statistik over CXCR6 GFP / + celler efterfulgt af intravital TPLSM i levervæv i baseline og CCI4 behandlede mus Celler blev analyseret for deres migration hastighed patruljerer leveren.. (A) repræsentant hastighed enkelte celler fulgt over tid. Speed ​​blev målt på hvert tidspunkt og afbildet for hver ramme individuelt. Linjer repræsenterer individuelle celler. Y-akserne er skaleret efter maksimal migration hastighed. (B) Statistical analyse af A. Frame specifikke hastigheder fra alle celler blev grupperet og analyseret i baseline og CCI4 behandlede mus. (C) Gennemsnitlig spor hastighed blev beregnet pr spor og data fra alle spor blev grupperet til analyse. (D) Maksimal hastighed på hvert spor blev afbildet og analyseret. Alle forsøg blev udført i grupper af 3 dyr, og resultater blev bekræftet i to uafhængige forsøg. *** P <0,001 (to-halet uparret Student t-test). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Formålet med vores undersøgelse var at udvikle en meget standardiseret, stabil og reproducerbar metode til intravital TPLSM billeddannelse af leveren. Intravital billeddannelse i almindelighed har givet værdifuld indsigt i cellulære opførsel under virkelige liv betingelser efter målsøgende og interaktion mellem forskellige leukocytpopulationer i udvikling, homeostase og sygdom. Men den noget udfordrende anatomiske position af leveren, skyldes som respiratorisk og peristaltisk tarm bevægelse direkte overføres til leveren samt deres høje skrøbelighed sammenlignet med andre faste organer indførte en række udfordringer for en stabil langsigtet intravital billeddannelse. I de senere år har mange eksperimentelle studier i mus viste den meget dynamiske karakter af immun celle infiltration i såret lever 28, med store bidrag fra hjemmehørende eller infiltrere monocytter / makrofager 30-32, neutrofiler 33 eller forskellige lymfocytundergrupper 34,35. Men most af disse data blev afledt af end-point analyser (f.eks flerfarvet flowcytometri efter ofre de dyr). Indtil nu kun få undersøgelser findes der beskriver dynamikken i cellulær trafik i leverbetændelse hjælp flerfarvet intravital billeddannelse. Brug omvendte mikroskoper omgår nødvendigheden af fiksering og fugtgivende af leveren på grund af den faste adhæsion af væv til glas bunden 24. Men da mange multiphoton mikroskoper er bygget som opretstående billeddannende systemer, er der behov for mere omfattende forberedelse og fiksering metoder til at stabilisere væv til tidspunktet for billeddannelse. Sædvanligvis har specialfremstillede mellemstationer systemer blevet beskrevet for vævsfiksering 6, 36,37, dog med disse er det afgørende at validere leveren mikrocirkulationen, da selv minimal pres på væv påvirker sinusformet blodgennemstrømning med endnu mere alvorlige effekter på syge lever 38 .

Derfor følgende punkter var annonceklædt i opsætningen af denne metode til at optimere resultaterne af in vivo TPLSM billeddannelse: Forbedring af kvaliteten af præparatet ved minimeret prøve forstyrrelse og afbrydelse af mikrocirkulationen skyldes håndtering spørgsmål og øget dyr overlevelse; intensiv overvågning og efterfølgende tilpasning af anæstesi, respiration og stabilisering af kredsløbet yderligere forbedret dyr overlevelse og minimerede fysiologiske artefakter, fx forårsaget af ubalance i blodets pH. Kontrolleret åndedræt i kombination med udløst billeddannelse var vigtigt at fjerne bevægelsesartefakter grund synkronisering af mikroskopet med respiratoriske cyklusser. Den indlejring af orglet i agarose indeholdende fysiologiske saltkoncentrationer var gavnligt at forsigtigt fiksere orglet efter fremstilling uden yderligere mekanisk manipulation og forhindrede også dehydrering af prøven. De fleste protokoller for leveren mikroskopi kun giver utilstrækkelige metoder til sta ble, langsigtet anæstesi. Imidlertid kunne overlevelsen af ​​dyrene blive væsentligt forbedret med anæstesi protokollen i henhold her og i kombination med overvågningen var tilstrækkelig til at sikre overlevelse på op til 8 timer. Alternative metoder er generelt egnede til at visualisere processer inden for en periode på op til 3 timer, såsom neutrofil invasion 39, men mangler muligheden for at billedet længerevarende processer såsom monocyt eller lymfocyt invasion 22 eller endda celleproliferation 6. Forståelse af dynamikken i rekruttering, infiltration og cellulære interaktion under akut og kronisk leverbetændelse kan give mere detaljeret indblik i udviklingen og progressionen af ​​leversygdom. Ved at bruge denne forbedrede forståelse af immunpatologi vil det være muligt at designe behandlinger langt mere raffineret i forhold til at løse de målcellerne af interesse frem for at bruge fx ikke-selektive immunosuppressive tilgange.

ove_content "> For at løse den positionering, sjælevandring og interaktion af leukocytter, er der behov for billeder i høj kvalitet til præcis 4D sporing af cellerne i leveren kar og levervæv 18,20,40.

Metoden giver vi her kan anvendes ved hjælp af fælles laboratoriereagenser og udstyr, hvilket gør det både let at håndtere og omkostningseffektiv med minimal forstyrrelse af prøven. For at opretholde de fysiologiske betingelser for musen til så længe som muligt, er det nødvendigt at finjustere respirationsvolumen og frekvens for at styre iltning og blod CO 2 niveauer. Men på grund af den kontinuerlige infusion af væsker i peritoneum er der mindst en tentativ forsyning stabilisere omløb, EKG og hjerte frekvensmålinger kun tillade en delvis kontrol vedrørende stabilisering af kredsløbet. Ved at implementere direkte blodtryk kontrol og central venøs væske program er det sandsynligt, at den afgørende PARAMETERS kan stabiliseres yderligere, hvilket fører til yderligere styrkelse af stabilitet og overlevelse.

Selv under stærkt kontrollerede betingelser, billeddannelse af dyr, der har været udsat for leverskader modeller, der almindeligvis anvendes i mus såsom acetaminophen inducerede leverskade, CCI4 induceret leverskade eller kosten induceret fedtlever sygdom stadig en udfordring. På grund af den væsentlige funktion af leveren i metaboliske tilstand kontrol og sin centrale placering i kredsløbet, at ændringer i leveren funktionalitet eller mikrocirkulationen direkte konsekvenser langsigtede overlevelse af dyrene, derfor begrænsning af muligheden opnå lange TPLSM video-sekvenser af stærkt beskadigede organer, f.eks med alvorlige blødninger eller ødelagt mikrovaskulatur. Også i alvorligt ændret lever microanatomy som i modeller med omfattende nekroser, er det stadig svært at studere celle-celle-interaktioner og lokal opdeling af inflammatoriske celleaggregater, fordi ingen stanen indstillet "counter-farvning" for anatomiske strukturer (såsom hæmatoxylin-farvning i konventionel mikroskopi eller DAPI farvning i immunfluorescens) er tilgængelig for intravital TPLSM.The kvaliteten af ​​de oplysninger, som er den billeddannende proces yderligere afhænger af mærkningen intensiteten af ​​cellerne og den mikroskopiske opsætning.

Adskillige fremgangsmåder findes til at visualisere GFP + -celler i leveren. Den højeste fluorescens med meget lav baggrundsfluorescens opnås mellem 900 og 920 nm excitationsbølgelængde. Den næsten fuldstændig tab af lever baggrundsfluorescens ikke tillader at undersøge placeringen af ​​cellerne i leveren, når den ikke brug af yderligere fartøjets bane, såsom dextran eller lectin. Derfor besluttede vi at billedet de vandrende leukocytter ved en bølgelængde på 840 nm, hvilket giver det bedste forhold mellem GFP signal og detaljeret, men ikke for lyst lever baggrund fluorescens.

Tilsammen har intrAVITAL TPLSM imaging system indført i denne undersøgelse kan anvendes til en bred vifte af lever specifikke intravital mikroskopi spørgsmål. Med denne fremgangsmåde, TPLSM billeddannelse i andre faste organer, såsom nyrer, lever, blære, tarm eller bugspytkirtel er muligt med kun mindre modifikationer af de kirurgiske procedurer og væv iscenesættelse, derfor giver en meget fleksibel tilgang til at undersøge langsigtede vandrende processer celler i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetics
Buprenorphine Essex Pharma 997.00.00 Analgeticum, 0.1 mg/kg
Fentanyl Rotex Medica charge: 30819
Fluovac anesthesia system Harvard Apparatus 34-1030
Glucose 5% Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser Eickemeyer 4802885
Isoflurane Forene Abbott B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution DeltaSelect GmbH PZN 00765145
Ketamin 10% ceva Charge: 36217/09
Xylazin 2% medistar Charge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20 ml Syringe BD Plastipak
250 ml Erlenmeyer flask Schott Duran 21 226 36
25 ml Beaker 2x Schott Duran 50-1150
2 ml syringe BD Plastipak
4-0 Vicryl suture Ethicon V7980
Agarose commercially available
Bepanthen Eye and Nose ointment Bayer Vital GmbH 6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit Fine Science Tools Inc. 18010-00
Cotton Gauze swabs Fuhrmann GmbH 32014
Cover Slip 24x50 mm ROTH 1871
Durapore silk tape 3M 1538-1
Feather disposable scalpel Feather 02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID Smiths medical 800/100/200
Histoacryl Braun 1050052 5x 0.5 ml
Leukoplast BSN Medical Inc.
Microscope Slides ROTH 1879
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum Antiseptica GmbH 72PAH200
Sterican needle 18 G x 1 B. Braun 304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1 B. Braun 4657705
Tissue paper commercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PL Gatz 0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 Storz&Klein S-01134
Dumont No.7 forceps Fine Science Tools Inc. 91197-00
Graefe forceps curved x1 Fine Science Tools Inc. 11151-10
Graefe forceps straight x2 Fine Science Tools Inc. 11050-10
Heidemann spatula HD2 Stoma 2030.00
Needle holder Mathieu Fine Science Tools Inc. 12010-14
Scissor Fine Science Tools Inc. 14074-11
Semken forceps Fine Science Tools Inc. 11008-13
Small surgical scissors curved Fine Science Tools Inc. 14029-10
Small surgical scissors straight Fine Science Tools Inc. 14028-10
Standard pattern forceps Fine Science Tools Inc. 11000-12
Vannas spring scissors Fine Science Tools Inc. 15000-08
Equipment
ECG Trigger Unit Rapid Biomedical 3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer AD Instruments
Minivent Typ 845 Harvard Apparatus 73-0043
Multiphoton microscope Trimscope I LaVision
Perfusor Compact B. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorder AD Instruments PL3508
Temperature controlled heating pad Sygonix 26857617
Temperature sensor comercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box Life Imaging Services

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117, (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
  3. Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10, (11), 955 (1969).
  4. Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82, (33), 575-578 (1970).
  5. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24, (4), 307-318 (2011).
  6. Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75, (3), 307-315 (2011).
  7. Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
  8. Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280, (6), G1076-G1082 (2001).
  9. Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45, (5), 544-553 (2010).
  10. Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50, (5), 497-506 (1977).
  11. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99, (11), 2782-2790 (1997).
  12. Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172, (1), 45-53 (2004).
  13. Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (20), 10763-10768 (1996).
  14. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75, (4), 2015-2024 (1998).
  15. Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62, (2), 137-145 (2003).
  16. Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91, (4), 281-289 (2013).
  17. McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23, (6), 2212-2217 (2003).
  18. Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3, (4), (2005).
  19. Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180, (4), 2024-2028 (2008).
  20. Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190, (10), 5226-5236 (2013).
  21. Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43, (2), 306-315 (2006).
  22. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28, (2), 271-284 (2008).
  23. Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40, (1), 117-123 (2010).
  24. Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, (3), e1000805 (2010).
  25. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, (6002), 362-366 (2010).
  26. Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89, (6), 419-432 (2008).
  27. Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14, (10), 996-1006 (2013).
  28. Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10, (6), 509-536 (2011).
  29. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352, (1-2), 89-100 (2010).
  30. Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50, (1), 261-274 (2009).
  31. Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55, (3), 898-909 (2012).
  32. Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (46), E3186-E3195 (2012).
  33. Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60, (4), 782-791 (2014).
  34. Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59, (2), 630-642 (2014).
  35. Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61, (9), 1323-1329 (2012).
  36. McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205, (4), 915-927 (2008).
  37. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34, (5), 807-819 (2011).
  38. Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24, (1), 13-20 (2008).
  39. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17, (11), 1381-1390 (2011).
  40. Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4, (3), e4693 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics