Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

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Immunology and Infection

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Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., Ergen, C., Kohlhepp, M., Mossanen, J. C., Schneider, C., Vogt, M., Tolba, R. H., Trautwein, C., Martin, C., Tacke, F. Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice. J. Vis. Exp. (97), e52607, doi:10.3791/52607 (2015).

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Abstract

Fegato infiammazione come risposta al danno è un processo altamente dinamico che coinvolge l'infiltrazione di distinti sottotipi di leucociti tra cui monociti, neutrofili, sottogruppi di cellule T, cellule B, natural killer (NK) e le cellule NKT. Microscopia intravitale del fegato per monitorare la migrazione delle cellule immunitarie è particolarmente difficile a causa degli elevati requisiti per quanto riguarda la preparazione del campione e la fissazione, risoluzione ottica e animale sopravvivenza a lungo termine. Tuttavia, la dinamica dei processi infiammatori così come studi di interazione cellulare potrebbe fornire informazioni fondamentali per comprendere meglio l'iniziazione, la progressione e la regressione della malattia epatica infiammatoria. Pertanto, un metodo altamente sensibile ed affidabile è stato istituito per studiare migrazione e cellula-cellula-interazioni di diverse cellule immunitarie in fegato di topo per lunghi periodi (circa 6 ore) di intravitale due fotoni microscopia a scansione laser (TPLSM) in combinazione con terapia intensiva monitoraggio.

ent "> Il metodo fornito comprende una preparazione dolce e fissazione stabile del fegato con il minimo turbamento dell'organo; di imaging intravitale lungo termine utilizzando la microscopia multicolor multiphoton praticamente senza photobleaching o effetti fototossici per un periodo di tempo massimo di 6 ore, consentendo il monitoraggio di specifici sottoinsiemi di leucociti, e le condizioni di imaging stabile a causa monitoraggio estensivo di topo parametri vitali e la stabilizzazione della circolazione, la temperatura e lo scambio di gas.

Per studiare la migrazione dei linfociti su infiammazione del fegato CXCR6.gfp knock-in topi sono stati sottoposti a esami del fegato intravitale in condizioni basali e dopo danno epatico acuto e cronico indotto da un'iniezione intraperitoneale (s) di tetracloruro di carbonio (CCL 4).

CXCR6 è un recettore per chemochine espressi sui linfociti, soprattutto su Natural Killer T (NKT) -, Natural Killer (NK) - e sottoinsiemi di linfociti T come le cellule T CD4 ma anche Associ mucoseATED invariante cellule (MAIT) T 1. Seguendo il modello migratorio e il posizionamento di CXCR6.gfp + cellule immunitarie permesso una visione dettagliata del loro comportamento alterato sul danno epatico e quindi il loro potenziale coinvolgimento nella progressione della malattia.

Introduction

La visualizzazione delle cellule e funzioni cellulari di organi interi o persino interi organismi è stato di grande interesse per più di 50 anni, tra cui quasi tutte le parti del corpo 2. Pertanto, alcuni primi studi già impiegati l'imaging intravitale del fegato 3,4. Tuttavia, alcune limitazioni esistono aggiornati riguardo a lungo termine ad alta risoluzione stabile di imaging di tessuto epatico.

A causa della posizione anatomica del fegato in stretto contatto con il diaframma e il tratto gastrointestinale 5, il problema più comune per l'imaging microscopico intravitale è movimento dovuto alla respirazione e, in misura minore, peristaltica del tratto intestinale 6. In confronto ad altri organi solidi, chirurgia epatica è particolarmente impegnativo. A causa della struttura microvascolare densa, manipolazione chirurgica può portare a massicce lesioni emorragiche, alterata microcircolazione 7 e anche l'attivazione di residente icellule mmune come le cellule di Kupffer 8. Pertanto, fissaggio meccanico del tessuto come pubblicato altrove 6,9 rischia di interferire con imaging microscopia intravitale.

In un fegato sano, 10-15% del volume totale del sangue risiede all'interno del sistema vascolare del fegato, e l'organo riceve circa il 25% della gittata cardiaca complessiva 10, rendendo l'organo altamente sensibili alle variazioni di circolazione (ad esempio, variazioni di pressione sanguigna ). Di conseguenza, le interruzioni nel flusso epatico causa ad esempio, shear stress, spostamento, lesioni da uso eccessivo tessuto o circolazione centralizzata porterà ad alterazioni artificiali in leucociti comportamento migratorio, ridotta ossigenazione del fegato e quindi ulteriori danni al fegato, che colpisce fegato risposte immunitarie come pure come conservazione dell'organo e la durata complessiva dell'animale.

I primi studi microscopici erano basati su mi epifluorescenza intravitalemicroscopia, ma molti vincoli tecnici, quali foto sbiancamento e la profondità di penetrazione bassa limitano l'uso di questa tecnica per il lungo termine l'imaging del fegato 4,11,12. Con lo sviluppo della microscopia multiphoton nel 1990, le limitazioni della foto sbianca o profondità di penetrazione erano principalmente risolti, come questo nuovo metodo era tecnicamente in grado di svolgere studi di imaging in quasi tutti gli organi sotto situazioni reali 13-15. Tuttavia, le principali sfide rimanenti rispetto all'imaging fegato sono stati: i movimenti del respiro, autofluorescenza di tessuto epatico, che fissano inalterato il flusso di sangue nelle sinusoidi epatici, e di imaging particolarmente stabile per un periodo di diversi hr 16 più lunghi.

Anche se diversi studi hanno affrontato la funzione e la migrazione dei vari leucociti nel fegato 17, ad esempio, NKT cellule 18-20, le cellule T 21,22, i macrofagi del fegato 23,24 o neutrofili 25, a lungo termine multiphoton mImaging icroscopy non era ancora stato stabilito con successo, un compito ancora più impegnativo in animali affetti da malattia epatica acuta o cronica a causa dei danni esistente e quindi maggiore suscettibilità a ulteriori danni 26. Tuttavia, il monitoraggio comportamento migratorio e la funzione cellulare dei leucociti nel fegato in tempo reale consente nuove intuizioni nel loro ruolo specifico nella omeostasi del fegato e malattie 27.

Il CXCR6 recettore delle chemochine è espresso in diverse sottopopolazioni linfocitarie, tra cui natural killer (NK), le cellule NKT e alcune popolazioni di cellule T 18,28. Precedenti studi sui topi hanno indicato che CXCR6 e la sua CXCL16 ligando affine possono controllare il pattugliamento delle cellule NKT su sinusoidi del fegato durante l'omeostasi. Di conseguenza, l'uso di topi CXCR6.gfp (portando un knock-in della proteina fluorescente verde [GFP] nel locus CXCR6) è stata descritta per studiare la migrazione dei linfociti in vari organi come il cervello 29e anche il fegato 18,20, mostrando aumento infiltrazione di cellule CXCR6.gfp su infiammazione.

Con il metodo fornito in questo studio è stato possibile seguire questi processi per un lungo periodo di tempo in condizioni stabilizzate. La procedura basata multiphoton intravitale permesso di imaging che era altamente riproducibile con il minimo turbamento dell'animale e l'organo; ottimizzata per il lungo termine animali sopravvivenza da un ampio monitoraggio seguito da vicino il controllo della respirazione e della circolazione; e altamente flessibile e facile da adottare anche ad altri organi parenchimatosi come il rene, milza.

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Protocol

NOTA: Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la normativa tedesca in materia di studi sugli animali in seguito alla 'Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio "(pubblicazione NIH, 8 ° edizione, 2011) e la direttiva 2010/63 / UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici (Gazzetta ufficiale dell'Unione europea, 2010). Permesso ufficiale è stata concessa dal governativa cura degli animali e uso ufficio (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Germania).

NOTA: I passaggi che possono essere omessi per l'imaging a breve termine (ad esempio, scattare colpi, 3-D pile o anche breve durata microscopia time-lapse) sono contrassegnati con un asterisco (*) per ridurre i tempi di preparazione e semplificare il protocollo chirurgico. Imaging può anche venire eseguito senza ampio controllo e monitoraggio circolazione se necessario, tuttavia, il tempo di sopravvivenza sarà notevolmente ridotto.

1. Setup Microscopio e Pre-chirurgia Preparazione (5-10 kmn)

  1. Sistema Accendere (microscopio, potere Lab, laser, rilievo di riscaldamento, camera climatica, web cam, dispositivo pompa a siringa, respiratore).
  2. Collegare O 2 alimentazione isoflurano vapore e impostare il livello Isoflurano al 1,5 Vol% (v / v), la connessione a un piccolo respiratore animali.
    1. Per l'imaging a breve termine, a mantenere l'anestesia con isoflurano solo dopo l'induzione dell'anestesia iniziale ip (vedi punto 2.2). Quindi utilizzare 2 Vol% (v / v) isoflurano, e tenere il tempo di imaging di sotto di 2 ore per garantire la stabilità microcircolazione fegato.
  3. La respirazione a 120-140 cicli respiratori / min Set con un volume di 150-200 ml.
  4. Impostare palco del mouse agarosio. Preparare 100 ml di 3% (w / v) agarosio, versando in un piatto (di circa 10 cm x 15 cm base) con un angolo di 40 °.
  5. Impostare area di lavoro chirurgica raccogliere la strumentazione necessaria. Per prevenire l'infezione microbica, disinfettare strumenti utilizzando una soluzione all'1% di Sekusept Forte S (9,9% w / v), Glutaral 9,8% w / v, Formaldeide per 5 minuti prima dell'esperimento (Figura 1A).
  6. Ottenere rimanenti componenti: disinfettante della pelle (ad esempio, 10% di soluzione di povidone iodio), fegato (fase pile e bridge), soluzione di agarosio (3% (w / v) in PBS), pompa a siringa con 5% (w / v) soluzione di glucosio (G-5), pompa a siringa con soluzione anestetica I (ketamina 0,1 mg / ml, Xilazina 0,5 mg / ml, fentanil 5 mg / ml), tamponi di cotone, n-butil-2-Cyanoacrylat, e 1x PBS. Mettere piatto fase agarosio nella camera di incubazione per il preriscaldamento.

2. tracheotomia (10-15 min)

  1. Utilizzare C57BL / 6 topi da casa da riproduzione di almeno 25-28 g. Casa topi in condizioni specifiche esenti da organismi patogeni, in conformità con le linee guida FELASA, in un ambiente a temperatura e umidità controllata con 12 ore di luce / 12 hr ciclo scuro. Consentire animali l'accesso gratuito alla dieta standard topi (Sniff standard roditore Diet) e acqua ad libitum.
  2. Anestetizzare il mouse initial intraperitoneale (ip) iniezione di 250 microlitri della soluzione di anestetico II (ketamina 0,1 mg / ml, Xilazina 1 mg / ml, Buprenorfina 10 mcg / ml).
    1. * Per manutenzione durante l'imaging intravitale, continuamente amministrare soluzione anestetica I di iniezione continua ip (ketamina 0,1 mg / ml, Xilazina 0,5 mg / ml, fentanil 5 mg / ml) utilizzando un dispositivo pompa a siringa con una portata di 0,2 ml / hr in combinazione con inalazione isoflurano 0,5 Vol% (v / v).
    2. Controllare riflessi dopo 5 min (es pizzico zampe con le pinze), disinfettare la pelle per tracheotomia, iniziare la preparazione se il mouse è in stato di anestesia chirurgica tollerante.
    3. Applicare occhio crema protettiva (ad esempio, Dexpantenolo 50 mg / g) per evitare di cornea si secchi (Figura 1B).
  3. Fissare il mouse sulla tabella di preparazione esporre lato ventrale con del nastro adesivo per le estremità; tirare troppo delicatamente collo, fissare in questa posizione, ad es., usando un elastico agganciato to gli incisivi.
    1. Disinfettare la pelle e la pelliccia con una soluzione di iodio povidone, applicando il disinfettante con un batuffolo di cotone.
  4. Eseguire il taglio della pelle iniziale (0,5-1 cm di lunghezza) direttamente sotto il mento (Figura 1C)
    1. Sezionare con cura il tessuto connettivo tra ghiandole salivari (Figura 1D).
    2. Attenzione allo strappo aperto muscolare tubo circostante trachea (Figura 1E, F).
  5. Mettere filo chirurgico sotto la trachea per dopo tubo di ventilazione fissaggio (Figura 1G).
    1. Aprire trachea con micro-forbici tra gli anelli cartilaginei che svolgono una incisione a forma di T (Figura 1 H)
  6. Inserire tubo di ventilazione nella trachea attraverso l'incisione (~ 0.5 cm). Per spingere il tubo in avanti, afferrare fine caudale con piccole pinze anatomiche e far avanzare delicatamente il tubo nella trachea (Figura 1I)
  7. Fissare il tubo con filo chirurgico (es (Figura 1J, K).
  8. Taglio Seal con colla tissutale (ad esempio, n-butil-2-Cyanoacrylat) (Figura 1L).
  9. Fissare il tubo alla testa con del nastro adesivo.

3. laparotomia (15-20 min)

  1. Posizionare il mouse sul tappetino di riscaldamento per evitare l'ipotermia. Shave addome, rimuovere con attenzione i capelli dalla pelle. Disinfettare la pelle rasata e pelliccia utilizzando una soluzione di iodio povidone.
  2. Eseguire una piccola pelle tagliata sotto lo sterno con le forbici chirurgiche (Figura 2a). Estendere il taglio lateralmente sotto le costole su entrambi i lati, cauterizzare tutti i vasi sanguigni visibili per prevenire le emorragie.
  3. Eseguire accuratamente un piccolo taglio alla linea alba sotto lo sterno, aprendo il peritoneo (Figura 2B). Estendere il taglio di entrambi i lati con cauterizzione per prevenire le emorragie (Figura 2C, D).
  4. Posizionare il mouse nel piatto fase agarosio (Figura 2E). Inserire pile di altezza adeguata su entrambi i lati del mouse (solitamente 12-14 coprioggetto) (Figura 2F).
  5. Posizionare sensore di trigger respiratorio sotto parte superiore della schiena per sincronizzare il microscopio con la respirazione. Attivare unità di innesco (Figura 2G).
  6. Mettere filo chirurgico (5-0) con lo sterno di ritrattare costole (Figura 2i).
  7. Tagliare con cautela legamento che collega il fegato e il diaframma (Legamento falciforme), così come il fegato e il tratto gastrointestinale con le forbici chirurgiche curve. Tagliare il legamento falciforme verso l'aorta (Figura 2J).

4. Configurazione di esempio (10-15 min)

  1. Posizionare il mouse sul lato destro con un angolo di 45 ° per un facile accesso al grande lobo epatico.
  2. Aggiungere scena ponte sotto le costole, che copre il addominalecavità. Fabbricazione un ponte utilizzando un vetrino di serie con rivestimento del nastro adesivo per coprire spigoli vivi (Figura 2K).
  3. Luogo grande lobo epatico sul palco. Scivolare delicatamente doppia sfera della sonda stilo o una spatola imbottita sotto il fegato e tenere la parte superiore dell'organo con un tampone di cotone bagnato o tessuto bagnato. Sollevare lobo sul vetrino e applicare gentile trascinare. Lobe può essere piegato o piegata. Fornire attenzione a solo delicata manipolazione del fegato (Figura 2L).
  4. Posizionare pali laterali di supporto, ad esempio, pile di piccoli slittamenti di copertura (20 mm x 20 mm), pari a circa la stessa altezza del lobo epatico accanto ad essa per sostenere vetrino.
  5. Mettere grande vetrino (24 mm x 50 mm) sul lobo epatico. Assicurarsi che la copertura di slittamento è orientato più orizzontale possibile (Figura 2M).
    NOTA: Il vetrino deve essere in contatto con il tessuto senza schiacciarla. Verificare la presenza di segni visibili di compromissione del flusso sanguigno (tessuto bianco). Se MICROCIRClamento è perturbato, aggiungere ulteriore supporto pali.
  6. * Inserire due cateteri intraperitoneali indipendenti (Figura 2N) per l'anestesia a lungo termine e G-5 applicazione. Installare cateteri lateralmente nel basso addome accanto agli arti posteriori.
    NOTA: I cateteri intraperitoneale possono essere fatto da sé, collegando 27 aghi G con tubi in silicone flessibile (Figura 3).
  7. * Fixate ago con un anello di 5-0 filo chirurgico alla pelle per evitare spostamenti accidentali.
  8. * Collegare pompa a siringa con soluzione di anestesia I CATETERE 1, portata impostato a 0,2 ml / h; collegare pompa a siringa con G-5 a catetere 2, portata impostato a 0,1 ml / h.

5. Monitoraggio mouse

  1. * Elettrodi ECG posto in estremità anteriore e posteriori (figura 4a).
  2. * Collegare il tubo di scadenza di CO 2 sensore di livello.
  3. Aggiungi il sensore di temperatura esterna collegata al pad di calore (Figura 4C).

6. Integrazione e Tissue Fixation (5-10 min)

  1. Preparare 100 ml di 3% (w / v) agarosio in 1X PBS. Incorpora fegato quando la temperatura è a 41 ° C con una siringa da 5 ml e un ago da 18 G (Figura 5A).
  2. Versare agarosio rimanente sul coprioggetto e intorno al mouse (Figura 5B, C). Attendere fino agarosio è completamente gelatinizzato.
  3. Rimuovere agarosio in eccesso con la spatola Heidemann, la preparazione di un Viewfield abbastanza grande per eseguire la scansione del lobo epatico predisposto (Figura 5D, E).

7. Imaging

  1. Trasferire il mouse nella camera microscopio clima.
  2. Aggiungere 50-100 ml di PBS 1x (preriscaldata a 37 ° C).
  3. Coprire piatto del campione per evitare l'evaporazione (figura 5F).
  4. * Ridurre isoflurano inalazione al 0,5 Vol% (v / v).
  5. * Avviare il software di monitoraggio, la registrazione ECG, frequenza cardiaca e CO 2 espiratorio.
  6. Inizio di imaging: aprire lapersiane ser, identificano i campi di vista di interesse, definiscono limite superiore e inferiore per Z-stack, e avviare la registrazione lasso di tempo. Regolare Z-stack, se necessario, correggere Z-drift (ad es. A causa di cambiamenti nella pressione sanguigna o la variazione di temperatura, Figura (5G).
    NOTA: Al termine del periodo di imaging o se la circolazione o anestesia degli animali diventa instabile, sacrificare i topi da dislocazione cervicale (senza risveglio dall'anestesia).

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Representative Results

Per convalidare il nostro approccio TPLSM intravitale, abbiamo sottoposto CXCR6 GFP / + topi per l'imaging intravitale TPLSM. I topi sono stati o non trattata come controlli di base o sottoposti a una singola iniezione intraperitoneale di tetracloruro di carbonio (CCL 4) per indurre un danno epatico acuto 20.

Le sequenze video sono state scattate in un periodo di tempo di 2-5 ore, e le cellule sono state tracciate nel corso del tempo a causa della loro fluorescenza verde. Per mostrare la motilità cellulare generale, tutte le tracce che sono stati rilevati nel corso del procedimento sono state tracciate come immagine sovrapposta (Figura 6A). Mentre le cellule in condizioni basali hanno mostrato la migrazione a lunga distanza lungo le sinusoidi del fegato verso la vena centrale, 18 ore dopo il CCl 4 trattamento delle cellule + / GFP CXCR6 hanno mostrato modelli già parzialmente deteriorati movimento. Sebbene alcune cellule rapido movimento erano ancora presenti nelle sinusoidi epatici, diverse aree focali erano visibili con cellule cheera cambiato dalla migrazione casuale scansione locale, che indica una risposta chemiotattica reclutare le cellule alla superficie della ferita. L'effetto è stato ancora più pronunciata dopo 36 ore, con un arresto quasi totale di + cellule CXCR6 praticamente senza migrazione attiva. Mentre in condizioni basali maggior parte delle cellule migranti avevano velocità di migrazione variabile con cambi di direzione casuale, CCl 4 animali trattati hanno mostrato le cellule che sono state solo lentamente strisciando così come alcune cellule liberamente motili pattugliare le sinusoidi dopo 18 ore ma non dopo 36 ore. Utilizzando le tracce di migrazione colorati, velocità delle cellule potrebbe essere visualizzato direttamente per valutare l'effetto del trattamento CCl 4. La migrazione alterata era anche visibile nel diagramma pista normalizzata (Figura 6B), dimostrando che 18 ore dopo CCl 4 del numero di lunga distanza tracce nonché la durata media pista era marcatamente ridotta, mentre dopo 36 ore senza cellule mobili erano rilevabili qualsiasi di più. In linea with questi risultati, lo spostamento cellulare, che descrive la capacità di una cellula per pattugliare liberamente vascolatura, diminuzione nel tempo, indicando un intrappolamento delle cellule 36 ore dopo CCl 4 trattamento al sito del danno epatocellulare (figura 6C).

Per seguire il comportamento migratorio di cellule CXCR6 + / GFP nel fegato in maggior dettaglio, la velocità di migrazione di cellule singole rappresentativi è tracciata per visualizzare il livello di motilità nel tempo. Noi e gli altri precedentemente descritti diversi modelli movimento distinto di cellule + / GFP CXCR6: crawling casuale attiva con un incollaggio modello rolling, che mostra le fasi della motilità cellulare e gli stati quiescenti temporali; diretto reclutamento con cellule scansione di una zona di interesse, ma ancora capace di strisciare attiva; arresto totale cellulare accompagnata da immune 18,20 attivazione cellulare. Mentre i topi senza trattamento hanno mostrato principalmente cellule che erano MOTI liberamentele con velocità fino a 15 micron / sec, cellule CXCR6 + / GFP in topi trattati con CCl 4 visualizzata velocità di migrazione delle cellule e l'arresto parziale già dopo 18 ore e completo arresto migratori notevolmente ridotto dopo 36 ore (Figura 7A). In linea con l'analisi di singole cellule, i dati statistici di tutte le cellule all'interno di una sequenza rivelato diminuzione della velocità di migrazione globale dopo CCl 4 trattamento (Figura 7B), che è stato anche assomigliava da velocità medie delle tracce (Figura 7C) e tenere traccia di velocità massime di migrazione (Figura 7D), dimostrando che l'approccio era adatto a descrivere le differenze di migrazione cellulare e il posizionamento nello sviluppo di malattie del fegato.

Figura 1
Figura 1:. Tracheotomia del mouse (A) apparecchi chirurgici utilizzati per la preparazione. Patter standard di 1xn pinze, pinze 1x Semken, pinze 1x Dumont No.7, pinze Graefe (seghettato, 2x diritto / 1x curve), divaricatori 2x Blair (4 punte (smussato)), la sonda stilo doppia sfera (per esempio, Amalgam burnisher 3PL), Heidemann spatola HD2, porta aghi (Mathieu o Halsey), piccole forbici chirurgiche 1x (sharp / smussato, 1xcurved, 1x rette), micro-forbici (per esempio, Vännäs Primavera forbici), 1x piccoli Cauter animali, tamponi di cotone, occhio Salve protettivo, chirurgica filo, n-butil-2-Cyanoacrylatglue. (B) gli occhi sono protetti con una pomata di protezione degli occhi. (C) taglio pelle iniziale per la preparazione trachea. (D) dissezione del tessuto connettivo tra ghiandole salivari sottomascellari. (E) Esposizione della trachea. (F) dissezione del tessuto muscolare trachea circostante. (G) Collocamento di filo chirurgico sotto trachea per la fissazione del tubo. (H) Tracheal incisione utilizzando microscissors tra anelli cartilaginei superiori. (I) Inserimento del tubo di ventilazione nella trachea. (J) Posizionamento del filo chirurgico cranica per fissare il tubo per la pelle. (K) Doppio fissaggio del tubo. (I) di tenuta incisione chirurgica con n-butil-2-Cyanoacrylat. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2:. Laparatomia e il fegato di preparazione (A) incisione cutanea iniziale, i vasi sanguigni sono stati cauterizzata per prevenire un eccessivo sanguinamento. (B) Apertura del peritoneo sotto lo sterno. (C) Estensione del taglio peritoneale mediante unità cauterizzazione. (D) tenuta di vasi epigastrici. ( g> E) Ulteriore estensione dell'incisione peritoneale sotto le costole. (F) Posizionamento di animali nella fase piatto agarosio. (F) Collocamento di pile di sostegno. (G) Il posizionamento del sensore di trigger respiratorio. (H) Impostazione di soglia di intervento per la respirazione sincronizzata imaging. (I) la fissazione Sterno a ritrattare costole con filo chirurgico. (J) disconnessione della cistifellea dal diaframma e la dissezione del legamento falciforme. (K) Collocamento di scena vetrino. (L) Posizionamento del lobo epatico sul palco. (M) Posizionamento di coprioggetto sul lobo epatico. (N) posizionamento di catetere ip per l'anestesia a lungo termine. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3:. Catetere intraperitoneale 27 G aghi collegati con un tubo flessibile in silicone.

Figura 4
Figura 4: Monitoraggio del mouse. (A) Posizionamento degli elettrodi ECG (verde, rosso, cavi blu). Aghi di rilevamento ECG sono posti sottocutanea come mostrato. (B) Monitoraggio di ECG (rosso), espiratorio CO 2 (blu) e la frequenza cardiaca (rosso) che mostra la progressione a lungo termine (a sinistra) e misura reale (a destra). (C) controllata centralina per il controllo del rilievo di calore temperatura. La temperatura è impostata a 36 ° C. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 5
Figura 5: Fegato embedding e imaging. (A) Integrazione del lobo epatico. 3% agarosio in PBS viene iniettato a 41 ° C sotto il vetrino utilizzando una siringa 2 ml con un ago 18G. (B) Fegato lobo è completamente integrato in agarosio per ridurre al minimo gli artefatti di movimento. (C) tenuta del peritoneo con il restante agarosio per prevenire la disidratazione. (D) Rimozione di agarosio campo microscopio copertura di vista dopo la piena gelatinizzazione. (E) Preparazione di Viewfield. Regolazione F di livello Z e la valutazione di campione del flusso sanguigno con microscopio ottico. (D) Piatto di copertura per evitare l'eccessiva evaporazione. La copertura è sollevato nella foto per dimostrare l'installazione. Clicca qui per vedere una più grandeversione di questa figura.

Figura 6
Figura 6:. Monitoraggio di CXCR6 GFP / + cellule nel danno epatico cronico dopo CCl 4 iniezione topi sono stati iniettati ip con 0,6 ml / kg CCl 4 disciolto in olio di girasole 18 ore o 36 ore prima di imaging. Il giorno dell'esperimento, i topi sono stati sottoposti a TPLSM intravitale come descritto. (A) Le immagini fisse di rilevamento delle cellule. Tratto da tutti i punti di tempo sono stati sovrapposti per dimostrare la motilità e spostamento cellulare. Le immagini sono state scattate con un singolo fascio Titan Saphire laser a 840 nm e un microscopio TPLSM. Aree sono stati digitalizzati prendendo 3-5 Z-stack con una profondità di penetrazione di 70μm con una frequenza di campionamento di circa 30 secondi per ogni ciclo di scansione. Tracce erano codice colore per visualizzare la velocità di migrazione (azzurro: in movimento lento o cellule sessili; viola: cellule mobili). Bar Scala: 100 μ; M. (B) XY-diagrammi dei percorsi normalizzati per la loro origine mostra pista direzionalità e lunghezza della traccia (micron). (C) Cilindrata totale di cellule dalla loro origine. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7: le statistiche di migrazione di CXCR6 GFP / + cellule seguita da TPLSM intravitale in tessuto epatico in basale e CCl 4 topi trattati Le cellule sono stati analizzati per la loro velocità di migrazione pattugliare il fegato.. (A) Velocità rappresentativa di singole cellule seguita nel tempo. Connessione stata misurata ad ogni tempo e tracciata per ogni fotogramma singolarmente. Linee rappresentano le singole celle. Assi Y vengono scalati in base alla velocità massima di migrazione. (B) Stanalisi atistical di A. telaio velocità specifici da tutte le cellule sono stati raggruppati e analizzati in basale e CCl 4 topi trattati. (C) La velocità media brano è stato calcolato per traccia e dati provenienti da tutte le tracce sono stati raggruppati per l'analisi. (D) Velocità massima di ogni traccia è stata tracciata e analizzata. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in gruppi di 3 animali ei risultati sono stati confermati in due esperimenti indipendenti. *** P <0.001 (due code Student t-test spaiato). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Lo scopo del nostro studio è stato quello di sviluppare un metodo altamente standardizzato, stabile e riproducibile per l'imaging intravitale TPLSM del fegato. Imaging intravitale in generale ha dato preziose informazioni sul comportamento cellulare in condizioni di vita reale seguenti homing e l'interazione di diverse popolazioni di leucociti nello sviluppo, omeostasi e la malattia. Tuttavia, la posizione anatomica piuttosto impegnativa del fegato, a causa della quale respiratorio e movimento intestinale peristaltica direttamente trasmessi al fegato così come la loro elevata fragilità rispetto ad altri organi solidi imposto varie sfide per l'imaging intravitale stabile a lungo termine. Negli ultimi anni, molti studi sperimentali nei topi hanno rivelato la natura altamente dinamica di infiltrazione di cellule immunitarie nel fegato danneggiato 28, con importanti contributi di residenti o infiltrazione monociti / macrofagi, neutrofili 30-32 33 o varie sottopopolazioni linfocitarie 34,35. Tuttavia, most di questi dati sono stati ricavati da analisi end-point (ad esempio, il flusso multicolore citometria dopo sacrificare gli animali). Fino ad ora solo pochi studi esistono descrivere le dinamiche del traffico cellulare durante l'infiammazione del fegato utilizzando multicolor di imaging intravitale. Utilizzando microscopi invertiti elude la necessità per il fissaggio e l'idratazione del fegato a causa della ferma adesione del tessuto al vetro fondo 24. Tuttavia, poiché molti microscopi multiphoton sono costruiti come sistemi di imaging verticali, sono necessari più elaborati preparazione e fissaggio metodi per stabilizzare il tessuto per il tempo di imaging. Comunemente, sistemi di stadiazione su misura sono stati descritti per il fissaggio del tessuto 6, 36,37, ma con essi è fondamentale per convalidare la microcircolazione epatica, poiché la pressione anche minima sul tessuto colpisce sinusoidale flusso di sangue con effetti ancora più gravi sul fegato malato 38 .

Pertanto, i seguenti punti sono stati annunciovestito con la messa a punto di questo metodo per ottimizzare i risultati ottenuti in vivo TPLSM di imaging: Migliorare la qualità della preparazione da perturbazioni del campione ridotto al minimo e la rottura del microcircolo a causa di problemi di gestione e una maggiore sopravvivenza degli animali; monitoraggio terapia intensiva e il successivo adattamento di anestesia, la respirazione e la stabilizzazione della circolazione ulteriormente rafforzata animale sopravvivenza e artefatti fisiologici minimizzato, ad esempio, causati da squilibri di pH del sangue. La respirazione controllata in combinazione con l'imaging innescata era essenziale per eliminare gli artefatti di movimento a causa della sincronizzazione del microscopio con i cicli respiratori. L'incorporamento di organo di agarosio contenenti concentrazioni saline fisiologiche era vantaggioso per fissare delicatamente l'organo dopo la preparazione senza ulteriore manipolazione meccanica e impedito anche la disidratazione del campione. La maggior parte dei protocolli utilizzati per la microscopia fegato forniscono metodi solo insufficienti per sta ble, anestesia lungo termine. Tuttavia, la sopravvivenza degli animali potrebbe essere significativamente migliorata con il protocollo di anestesia fornite qui e in combinazione con il monitoraggio è stato sufficiente a garantire la sopravvivenza fino a 8 ore. Metodi alternativi sono generalmente adatti a visualizzare i processi entro un periodo di tempo fino a 3 ore, come l'invasione dei neutrofili 39, ma non hanno la possibilità di immagine più processi duraturi, come monociti o linfociti invasione 22 o anche la proliferazione cellulare 6. Capire le dinamiche di reclutamento, infiltrazione e interazioni cellulari durante acuta e cronica infiammazione del fegato può fornire indicazioni più dettagliate per lo sviluppo e la progressione della malattia epatica. Utilizzando questo migliore comprensione della immunopatologia sarà possibile progettare terapie molto più raffinato in termini di affrontare le cellule bersaglio di interesse piuttosto che utilizzare approcci immunosoppressivi esempio non selettivi.

ove_content "> Per affrontare il posizionamento, la trasmigrazione e l'interazione dei leucociti, sono necessarie immagini di alta qualità per il monitoraggio 4D accurata delle cellule all'interno del sistema vascolare del fegato e del fegato tessuti 18,20,40.

Il metodo forniamo qui può essere applicato utilizzando reagenti di laboratorio comuni e le attrezzature, rendendo più facili da gestire e il costo efficiente con il minimo turbamento del campione. Per mantenere le condizioni fisiologiche del mouse per il più a lungo possibile, è necessario mettere a regolare il volume respiratorio e frequenza per controllare l'ossigenazione del sangue e CO 2 livelli. Sebbene dovuta alla infusione continua di liquidi nel peritoneo c'è almeno una fornitura tentativo di stabilizzare le misurazioni di circolazione, ECG e frequenza cardiaca consentire solo un controllo parziale relativo alla stabilizzazione della circolazione. Implementando controllo diretto della pressione arteriosa e venosa centrale dell'applicazione liquido è probabile che il paramet vitaleERS è possibile stabilizzare ancor più, portando ad un ulteriore potenziamento della stabilità e sopravvivenza.

Anche in condizioni altamente controllate, immagini di animali che sono stati sottoposti a modelli di danno epatico comunemente utilizzati nei topi come il paracetamolo indotto danni al fegato, CCl 4 danno epatico indotto o indotta malattia del fegato grasso alimentare rimane difficile. A causa della funzione essenziale del fegato nel controllo dello stato metabolico e la sua posizione centrale nella circolazione, alterazioni della funzionalità epatica o microcircolo direttamente impatti sopravvivenza a lungo termine degli animali, limitando quindi la possibilità di ottenere lunghe TPLSM video-sequenze di pesantemente organi danneggiati, ad esempio con emorragie gravi o microcircolo distrutto. Inoltre, in microanatomia fegato gravemente alterati come nei modelli con ampie necrosi, resta difficile studiare cellula-cellula-interazioni e compartimentazione locale di aggregati di cellule infiammatorie, perché nessun stanstandardizzata "contro-colorazione" per le strutture anatomiche (come ematossilina-colorazione in microscopia convenzionale o colorazione DAPI in immunofluorescenza) è disponibile per intravitale qualità TPLSM.The dei dati ottenuti con il procedimento di imaging ulteriore dipende dall'intensità etichettatura delle cellule e la configurazione microscopica.

Diversi approcci esistono per visualizzare le cellule GFP + nel fegato. La fluorescenza più alto con sfondo molto basso fluorescenza è ottenuto tra 900 e 920 nm di lunghezza d'onda di eccitazione. La perdita quasi completa a sfondo fegato fluorescenza non consente di indagare il posizionamento delle cellule nel fegato, quando non si utilizza inseguitori vaso aggiuntive come destrano o lectina. Pertanto, abbiamo deciso di immagine leucociti che migrano alla lunghezza d'onda di 840 nm, dando il miglior rapporto tra il segnale GFP e dettagliato, ma non troppo brillante sfondo fegato fluorescenza.

Nel loro insieme, l'intrsistema di imaging Avital TPLSM introdotto in questo studio può essere applicato ad un'ampia gamma di fegato specifiche domande microscopia intravitale. Con questo approccio, TPLSM immagini in altri organi solidi come reni, fegato, vescica, intestino o il pancreas è fattibile con solo lievi modifiche delle procedure chirurgiche e staging tessuto, fornendo quindi un approccio altamente flessibile per studiare processi migratori lungo termine di cellule in vivo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetics
Buprenorphine Essex Pharma 997.00.00 Analgeticum, 0.1 mg/kg
Fentanyl Rotex Medica charge: 30819
Fluovac anesthesia system Harvard Apparatus 34-1030
Glucose 5% Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser Eickemeyer 4802885
Isoflurane Forene Abbott B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution DeltaSelect GmbH PZN 00765145
Ketamin 10% ceva Charge: 36217/09
Xylazin 2% medistar Charge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20 ml Syringe BD Plastipak
250 ml Erlenmeyer flask Schott Duran 21 226 36
25 ml Beaker 2x Schott Duran 50-1150
2 ml syringe BD Plastipak
4-0 Vicryl suture Ethicon V7980
Agarose commercially available
Bepanthen Eye and Nose ointment Bayer Vital GmbH 6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit Fine Science Tools Inc. 18010-00
Cotton Gauze swabs Fuhrmann GmbH 32014
Cover Slip 24x50 mm ROTH 1871
Durapore silk tape 3M 1538-1
Feather disposable scalpel Feather 02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID Smiths medical 800/100/200
Histoacryl Braun 1050052 5x 0.5 ml
Leukoplast BSN Medical Inc.
Microscope Slides ROTH 1879
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum Antiseptica GmbH 72PAH200
Sterican needle 18 G x 1 B. Braun 304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1 B. Braun 4657705
Tissue paper commercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PL Gatz 0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 Storz&Klein S-01134
Dumont No.7 forceps Fine Science Tools Inc. 91197-00
Graefe forceps curved x1 Fine Science Tools Inc. 11151-10
Graefe forceps straight x2 Fine Science Tools Inc. 11050-10
Heidemann spatula HD2 Stoma 2030.00
Needle holder Mathieu Fine Science Tools Inc. 12010-14
Scissor Fine Science Tools Inc. 14074-11
Semken forceps Fine Science Tools Inc. 11008-13
Small surgical scissors curved Fine Science Tools Inc. 14029-10
Small surgical scissors straight Fine Science Tools Inc. 14028-10
Standard pattern forceps Fine Science Tools Inc. 11000-12
Vannas spring scissors Fine Science Tools Inc. 15000-08
Equipment
ECG Trigger Unit Rapid Biomedical 3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer AD Instruments
Minivent Typ 845 Harvard Apparatus 73-0043
Multiphoton microscope Trimscope I LaVision
Perfusor Compact B. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorder AD Instruments PL3508
Temperature controlled heating pad Sygonix 26857617
Temperature sensor comercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box Life Imaging Services

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References

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