דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר

1Division of Developmental Immunology, German Cancer Research Center (DKFZ), 2Genetics of Skin Carcinogenesis, German Cancer Research Center (DKFZ)
* These authors contributed equally
Published 7/30/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Pinto, S., Stark, H. J., Martin, I., Boukamp, P., Kyewski, B. 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression. J. Vis. Exp. (101), e52614, doi:10.3791/52614 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

פיתוח תא T תוך-הרתי דורש meshwork תלת-ממדי מורכב מורכב מתאי סטרומה שונים, כלומר, תאים שאינם-T. Thymocytes לעבור פיגום זה בצו של זמן ומרחב מתואם מאוד בעת שעברה ברצף נקודות בדיקת חובה, כלומר, מחויבות שושלת תא T, ואחריו דור רפרטואר קולט תא T ובחירה לפני יצואם לפריפריה. שני סוגי תאי התושב גדולים ויוצרים פיגום זה הם תאים בקליפת המוח (cTECs) והלשדיים הרתי אפיתל (mTECs). תכונה מרכזית של mTECs היא הביטוי המופקר כביכול של אנטיגנים-מוגבל רקמות רבות. אנטיגנים-מוגבל רקמות אלו מוצגים לה בוסר thymocytes במישרין או בעקיפין על ידי mTECs או תאים דנדריטים הרתי, בהתאמה וכתוצאה מכך סובלנות עצמית.

דגמים מתאימים במבחנה חיקוי המסלולים ופונקציות ההתפתחותי של cTECs וmTECs הם Lac כרגעהמלך. זה חוסר מודלים ניסיוניים נאותים יש למשל הקשו הניתוח של ביטוי גנים מופקר, שעדיין הוא הבין היטב ברמה התאית ומולקולרית. מתאמנים את מודל 3D organotypic שיתוף תרבות לתרבות לשעבר vivo mTECs המבודד. מודל זה תוכנן במקור כדי לטפח קרטינוציטים בדרך כגון כדי ליצור מקבילה עור במבחנה. מודל 3D נשמר תכונות פונקציונליות מרכזיות של ביולוגיה Mtec: התפשטות (i) ובידול מסוף של CD80 lo, Aire-השלילי להיי CD80, mTECs Aire-החיובי, (ii) היענות לRANKL, וכן (iii) ביטוי מתמשך של FoxN1, Aire וגנים-מוגבל רקמה בmTECs היי CD80.

Introduction

thymocytes פיתוח מהווה כ 98% מהתימוס, ואילו 2% הנותרים מורכב ממגוון רחב של תאים שביחד מרכיב את סטרומה הרתי (כלומר, תאי אפיתל, תאים דנדריטיים, מקרופאגים, תאי B, fibroblasts, תאי האנדותל). התאים החיצוניים של קליפת המוח אפיתל (cTECs) להשיג הגירה של תאים פרו-T ממח העצם, האינדוקציה שושלת תא T בתאים טרום-T multipotent וסלקציה חיובית של עצמי MHC מוגבל thymocytes בשל. התאים הפנימיים הלשדיים הרתי אפיתל (mTECs) מעורבים באינדוקצית סובלנות של thymocytes אלה עם זיקה גבוהה TCR למתחמי פפטיד העצמי / MHC או על ידי בחירה שלילית התרמה או הסטייה שלהם לשושלת תא T רגולטורים. בהקשר של אינדוקציה סובלנות מרכזית, mTECs הם ייחודיים בכך שהם מבטאים מגוון רחב של-אנטיגנים עצמי מוגבל רקמה (Tras) כך שיקוף עצמי ההיקפית. תופעה זו נקראת ביטוי גנים מופקר (PGE)1,2.

המחקרים העדכניים ביותר בסוג התא מרתק זו מסתמכים על תאים מבודדים vivo לשעבר, כמו מערכות תרבות 2D לטווח קצר שונות הביאו תמיד בהפסד של PGE ומולקולות רגולטור מפתח כמו כיתת MHC II, FoxN1 וAire בתוך 2 הימים הראשונים 3-6 . זה נשאר עם זאת ברור, שרכיבים ותכונות של meshwork 3D שלם של בלוטת התימוס מסוימים היו חסרות במודלי 2D. התרבות מחדש צבירת הרתי האיבר (RTOC) לא הייתה כל כך הרבה במערכת רק 3D, המאפשרת חקר התפתחות תאי T, מצד אחד, וביולוגיה של תא סטרומה, ומצד שני, במייקרו-סביבת הרתי שלם 7. ובכל זאת, יש לי RTOCs מגבלות מסוימות, כלומר, הם כבר מכילים תערובת מורכבת של תאים, דורשים ההזנה של תאי סטרומה עובריים ולסבול תקופה תרבות מקסימלי של 5 עד 10 ימים.

חוסר רדוקציוניסט במערכות תרבות מבחנה עכב את המחקר שלכמה היבטים של organogenesis פיתוח התא והרתי T לפחות רגולציה לא המולקולרית של PGE והקשר שלה לביולוגיה התפתחותית של mTECs.

בשל הקרבה-ההתייחסות של הארגון המובנה של תאי האפיתל של עור והתימוס, בחרנו מערכת 3D תרבות organotypic (OTC) שפותח במקור כדי לחקות את הבידול של קרטינוציטים במבחנה ובכך ליצור מקבילה עורי. מערכת OTC מורכבת ממטריצת פיגום אינרטי מעולף עם fibroblasts עורי שלכודים בג'ל הפיברין, על שקרטינוציטים הם זורעים 8,9. כאן, החלפנו קרטינוציטים עם mTECs המטוהר. תוך שמירה על התכונות הבסיסיות של מודל זה, אנו מותאמים פרמטרים מסוימים.

במודל OTC אימץ mTECs התרבו, עבר התמיינות מסוף ומתוחזק זהות Mtec וPGE, מחקה וכך באופן הדוק בפיתוח mTECs vivo

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של קרלסרוהה Regierungspräsidium. כל בעלי החיים שוכנו בתנאי הפתוגן ללא ספציפיים במרכז הגרמני לחקר הסרטן (DKFZ). לכל גורי עכבר ניסויי התרבות החל 1-7 ימים של גיל היו בשימוש.

1. בידוד של mTECs מקורנית

הערה: שלבי העיכול הבאים בוצעו כפי שתואר לעיל 1 בתנאים סטריליים עם כמה שינויים כדלקמן.

  1. לערוף את גורי העכבר ולהסיר את בלוטת התימוס. מניחים את thymi על קרח בצלחת פטרי המכילה בינוני RPMI 1640 (FCS המכיל 5%).
  2. חותך את thymi לחתיכות דקות, קטנות ומקום בצינור תחתון עגול עם ~ 5-30 מיליליטר תקשורת RPMI ומערבב בעדינות באמצעות מגנט במשך 10 דקות ב RT
  3. לאחר מכן, למזוג supernatant המכיל בעיקר thymocytes ולעכל את רצף הרקמה שנותר עם סיבוב של collagena אחדIV se הסוג (0.2 מ"ג / מיליליטר ו -57 U / ml concentartion הסופי) במשך 15 דקות כל אחד על 37 מעלות צלזיוס, ואחריו collagenase / dispase (0.2 מ"ג / מיליליטר וריכוז סופי 1.2 U / ml) במשך 25 דקות כל אחד ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עם ערבוב מגנטי עד thymi מתעכל לגמרי. השתמש אנזים 1 מיליליטר ל02:58 thymi.
  4. להתסיס את הרקמה אחת לדקות 7-10 עם פיפטה פסטר. בריכת collagenase / השברים dispase ולסנן דרך גזה 70 מיקרומטר.
  5. להעשיר את mTECs ידי תא מגנטי מיון (MACS). לבצע הטיהור של mTECs ידי תא מגנטי מיון כפי שתואר לעיל 11, ומוצג באיור 1.
    הערה: למיון מגנטי של mTECs השתמשנו בנוגדנים הבאים: אנטי CD80-PE (16-10A1, שימוש ב1: 100 דילול) ואנטי-EpCAM-יו (G8.8, שימוש ב1: 100 דילול) 12. mTECs בוגר והבשל באמצעות MACS הוגדר כ: CD45 - EpCAM + CD80 - CD45 ו-- CD80 + respectivאיליי.
  6. לאחר טיהור MACS (טוהר mTECs בוגר = 83.1 ± 6.3% וmTECs הבוגר = 79.23 ± 3.42%), זרע mTECs על תרבויות organotypic כמתואר להלן (סעיף 2.3).
  7. לחלופין, סוג mTECs ידי FACS (באמצעות 100 זרבובית מיקרומטר) לאחר דלדול CD45 MACS באמצעות הנוגדנים הבאים: אנטי CD45-PerCP (30-F11, שימוש ב1: 100 דילול), אנטי-Ly51-FITC (6C3, להשתמש ב1 : 100 דילול), אנטי-EpCAM-Alexa647 (G8.8, שימוש ב1: 500 דילול) ושימוש אנטי CD80-PE (16-10A1, בשעה 1: 100 דילול). תכלול תאים מתים באמצעות יודיד propidium (1: 5,000) (יום 4). mTECs בוגר והבשל באמצעות FACS הוגדר כ: PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - וPI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 +, בהתאמה.

2. 3D Organotypic שיתוף תרבויות (OTCs)

הערה: בונה 3D-עורי לטיפוח organotypic של keratinocytes הוכן כפי שתואר לעיל 9,13. בכל צעדי תאים הודגרו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. OTCs באמצעות mTECs הוכן עם שינויים קלים באופן הבא.

  1. הכנת fibroblasts האדם
    הערה: fibroblasts עורי האנושי התקבל מתרבויות explant של הדרמיס-epidermised דה כפי שתואר לעיל 9.
    1. בקיצור, לחתוך רצועות של עור אנושי (~ 5 סנטימטר אורך) ולטפל בthermolysin (0.5 מ"ג / מיליליטר מלוחים עם 10 7.4 מ"מ Hepes pH) O / N ב 4 ° C.
    2. לאחר מכן, להפריד את העור מהעור באמצעות מלקחיים.
    3. דק לחתוך את העור לחתיכות קטנות, מקום בצלחת פטרי 10 סנטימטרים ולאפשר לו להתייבש במשך 1-2 שעות בזרימת אוויר סטרילי. להשלים את explants באופן קבוע עם DMEM המכיל 20% FBS.
    4. לפצל fibroblasts צמיחה החוצה כאשר מחוברות (בדרך כלל סביב 3 שבועות) באמצעות טריפסין 0.1% ולוודא כי explants ימשיך לדבוק הצלחת לקון נוסףסיבובי secutive של תולדה.
    5. הרחב את fibroblasts מאותו explants עד 3 פעמים בDMEM עם 10% FBS וcryo-לשמר אותם 14. השתמש באותה הקבוצה של פיברובלסטים לכל סדרת ניסויים.
      הערה: fibroblasts לא היו מוקרן להגדרה של שווה עורי.
  2. הכנת הפיגום
    1. חותך את 0.4-0.6 מ"מ ויסקוזה העבה, חומר סיבי לא ארוג (פרטי מוצר בתמיכת גיליון Excel) לעיגולים מסומנים היטב באמצעות אגרופן מתכת בקוטר 11 מ"מ חד שיתאים בדיוק ל -12 מוסיף גם מסנן. אז למקם אותו לתוך 12 הוספת מסנן היטב (הקרום הנקבובית נימי פוליאסטר, גודל 3 מיקרומטר נקבובית) כפיגום. מניחים את התקנת מסנן המלאה לתוך צלחת 12 גם סטרילי.
    2. הכן את הג'ל הפיברין באמצעות דבק הפיברין-ערכה לניתוח המורכב משילוב של פיברינוגן ותרומבין. טרום לדלל fibrinogen- כמו גם תרומבין-הרכיב של הערכה 8 מ"ג / מיליליטר ו -10יחידות / מיליליטר, בהתאמה. וליחיד של צלחת 12 גם פעל באופן הבא.
      1. לדלל 100 פיברינוגן μl (8 מ"ג / מיליליטר) עם 100 שנאגרו מלוח פוספט μl (PBS) ללא Ca 2 + Mg 2 + ו, pH 7.0. לדלל 100 תרומבין μl (10 יחידות / מיליליטר) עם FCS 100 μl מכיל 270,000 fibroblasts.
      2. לוותר 200 μl של תרומבין המכיל fibroblasts תא-לערבב על הפיגום, ולכך יש להוסיף פיברינוגן μl 200 (1: 1 תערובת), וכתוצאה מכך ריכוז סופי של פיברינוגן של 2 מ"ג / מ"ל ​​ושל תרומבין של 2.5 יחידות / מיליליטר. מערבבים היטב ולהפיץ באופן שווה על פני כל השטח של הפיגום על ידי pipetting העדין (יום 1).
        הערה: לאחר 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס קריש מצרף fibroblasts יהיה יצר, מילוי לחלוטין החללים הפנימיים של הפיגום ויצר משטח עליון חלק.
  3. תרבות משותפת עם mTECs
    1. לטרום-תרבות, submerse תרבויות האיבר בDMEM עם 10% FBS, חומצת 50 מיקרוגרם / מיליליטר L-אסקורבית וng 1 / מיליליטר TGF-β1 עם שינוי בינוני בכל יום אחר במשך 4-5 ימים.
    2. ביום זריעת Mtec, להחליף את המדיום על ידי מדיום rFAD (1: 1 DMEM + DMEM / F12) עם 10% FBS, 10 -10 רעלן הכולרה, 0.4 מ"ג / מיליליטר הידרוקורטיזון, חומצה אסקורבית L-M 50 מיקרוגרם / מיליליטר, יגנד RANK (0.1 מיקרוגרם / מיליליטר) ו -500 יחידות / מיליליטר של Aprotinin, ובכך מונע פירוק פיברין מוקדמים על ידי פרוטאזות סרין מופרש על ידי fibroblasts.
    3. 7-8 שעות מאוחר יותר, הגדרת שיתוף התרבויות על ידי זריעת 250,000 mTECs (או mTECs מלא, או CD80 הפלא ותת היי CD80), בהיקף של 100 לכל גם μl על גבי פיגום פיברובלסטים. ספירת התאים באמצעות תא נויבאואר (יום 4).
      הערה: בכל עת תרבויות organotypic 3D התימוס הם טבלו בתקשורת בניגוד OTCs עור אשר-הרים אוויר.
    4. אחרי 24 שעות דגירה, לספק את התרבויות עם מדיום (תמורה כוללת בינונית) כאמור לעיל (שלב 2.3.2) עכשיו containing כמות מופחת של Aprotinin, 250 יחידות / מיליליטר (יום 5).
    5. על מנת להעריך את פעילות השגשוג של mTECs, להוסיף edu (6.7 מיקרומטר / מיליליטר, כלומר, 10 מיקרומטר / טוב) לOTCs במשך 4 שעות לפני סיום התרבויות. לבצע צביעת cryo-סעיפי OTC כפי שתואר בערכת edu ההדמיה בשילוב עם שיתוף הכתמה של קרטין 14. קביעת מדדי השגשוג של mTECs, או על ידי תאי K14 + edu + לספור בשני חלקים של כל דגימת תרבות או על ידי זרימה cytometry (edu cytometry זרימה, סעיף 1.7, אבל במקום Ly51-FITC להשתמש 15 CDR1-PB בדילול 1: 100 ו2.3.6.4).
    6. בעקבות 4-7 ימים של התרבות המשותפת, לסיים את OTCs ותהליך לבידוד RNA, cryo-חתך או ניתוח FACS (יום 8-11).
      1. לסיים את התרבויות באמצעות מלקחיים, הפרדה המקבילה פיגום / עורי מהמסנן של להכניס גם.
      2. לקריו-חתך, להטביע את כל OTC במתחם OCT ולהקפיא בliאדי חנקן לירות לפני cryo-חתך. הכן 5-7 מיקרומטר חלקים עבים OTC באמצעות cryostat ולאחסן ב -20 ° C עד שימוש. לאימונו-היסטוכימיה של OTCs בחתך cryo להשתמש אנטי-קרטין 14 (AF64, שימוש ב1: 1,000 דילול), ואנטי-vimentin (GP53, שימוש ב1: 100 דילול) נוגדנים. לבצע צביעת אימונו-היסטוכימיה העקיפה באמצעות נוגדנים משני בהתאמה.
      3. לבידוד RNA, להוסיף 1 מיליליטר Denaturing פתרון (המכיל פנול וthiocyanate guanidinium) בכובע בורג של צינור חופשי 2 מיליליטר RNase. חותך את כל OTC לחתיכות עם אזמל ולהוסיף לתוך הצינור המכיל פתרון denaturing. מכאני לגרוס OTCs עם מכשיר FastPrep פעמיים למשך 30 שניות במהירות של 6.0, מקום בין על קרח למשך 2 דקות (המדגם ניתן לאחסן ב -80 ° C לאחר שלב זה). אם קפוא ב -80 ° C, להפשיר על קרח. צנטריפוגה הצינורות ב11,500-13,000 סל"ד במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את supernatant לצינור טרי, דגירה של 5 דקות ב RT וFפרוטוקולי בידוד RNA ollow באמצעות מיצוי thiocyanate-פנול, כלורופורם guanidinium חומצה כפי שתואר על ידי היצרן.
      4. לניתוח FACS, להסיר את הפיגום ולהפריד את הקרום מהפיברין / פיברובלסטים / ג'ל Mtec. דק לחתוך ג'ל עם אזמל ולעכל אותו בצינור FACS ל~ 20 דקות או עד שעכל לחלוטין עם 2 מיליליטר של collagenase / dispase על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עם ערבוב מגנטי. להתסיס את פתרון האנזים עם פיפטה פסטר פעם כל 5 דקות. לאחר עיכול שלם, לסנן את ההשעיה התא דרך מסנן 70 מיקרומטר; להכתים את ההשעיה התא בודדת באמצעות הנוגדנים כפי שתואר ב1.7 ולנתח ידי cytometry זרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנחנו אימצנו מודל 3D organotypic התרבות המשותפת (3D OTC) שפותח במקור לתרבות לטווח ארוכה במבחנה של קרטינוציטים 9. mTECs המועשר MACS (ראה איור תכנית העשרת MACS 1) היו זורעים על פיגום הכולל ג'ל הפיברין ופיברובלסטים בפח. Fibroblasts לספק המטריצה ​​חיונית תאית (ECM) התומכת mTECs במבחנה. MTECs עובדו בOTCs ל4-14 ימים בנוכחות RANKL בתרבויות שקועות בניגוד קרטינוציטים, שהם מחקים את הסביבה שלהם in vivo (ראה איור תכנית הגדרת OTC 2) נחשף אוויר.

שני תת Mtec ניתח כאן (כלומר, CD80 הפלא וCD80 mTECs היי) שרדו במשך כל תקופת התרבות של עד 14 ימים. MTECs זוהו על ידי קרטין 14 ביטוי והיה בקלות להבחין בין fibroblasts vimentin-חיובי (איור 3B). מעניין לציין, mTECs בוגר והבשל גדל בדפוסים שונים בתרבות. CD80 lo mTECs נוצר בדרך כלל דו-שכבות (בקשר הדוק עם fibroblasts), בעוד mTECs היי CD80 נטה ליצור אגרגטים תא קומפקטיים מופרדים על ידי fibroblasts. דפוסים אלה היו מאוד לשחזור.

תת Mtec שרד לא רק, אלא גם התרבו בתנאי 3D OTC כפי שהוערך על ידי התאגדות edu (איור 3 ג, 3D). מעניין לציין, CD80 lo mTECs התרבו בשיעור גבוה יותר בנוכחות RANKL, בעוד ההפך היה נכון לmTECs היי CD80 10.

בנוסף, CD80 lo mTECs מובחן לmTECs היי CD80 בנוכחות RANKL בתוך 4 ימים של תרבות, כפי שצוין על ידי עד-הרגולציה החזקה של CD80. MTECs המובחן נשמר גם הביטוי של Aire, FoxN1 (גן ועמ 'rotein), כמו גם אבחנה הביע Aire-עצמאי ו-dependent Tras 10.

איור 1
העשרת 1. MACS איור של Tecs. לאחר סינון, mTECs היו מועשר מהשעית התא בודדת התימוס באמצעות תא מגנטי מיון (MACS). ראשית, שושלות תאי hematopoietic היו מדולדלים באמצעות אנטי CD45-microbeads. CD45 - התאים אז הודגרו עם נוגדן אנטי CD80 PE, ואחריו נגד PE-microbeads. Eluate מכיל CD80 + -mature mTECs היה ישירות בתרבית על OTCs, ואילו זרימה דרך הכיל CD80 - mTECs בוגר ותאי סטרומה אחרים. MTECs היו מועשר נוסף באמצעות microbeads הנוגדן וstreptavidin אנטי EpCAM-ביו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. תכנית להתקנה בשלבים של OTCs 3D. מטריצת פיגום הוצבה להוספת מסנן 12 גם. Fibroblasts עורי עור explanted (270,000 תאים / OTC גם) היו מחוסן לג'ל הפיברין (בהיקף של 1: 1 יחס של פיברינוגן ותרומבין). שווי עורי אלה שנגרמו ל4-5 ימים עם DMEM + חומרים מזינים עד mTECs (250,000 תאים / OTC גם) היו זורעים על גבי ותרבותי עם המדיום מועשר בחומרים מזינים שונים (rFAD + חומרים מזינים).

איור 3
איור 3. דפוסי צמיחה והתפשטות של mTECs בתוך OTCs. CD80 lo mTECs המועשר נוטה לגדול כדו שכבתי בקשר הדוק עם fibroblasts (), ש"ש ereas לגדול mTECs היי CD80 המובחן כאגרגטים תא או אשכולות הדוקים (B). OTCs תויגו ביום 4 של תרבות עם 14 אנטי-קרטין (אדום) ונוגדנים נגד vimentin (ירוק), יחד עם כתמים גרעיניים (Hoechst, כחול). כדי להעריך את ההתפשטות של mTECs, OTCs היו פעמו עם edu (6.7 מיקרומטר / מיליליטר, כלומר, 10 מיקרומטר / טוב) עבור 4 שעות לפני הסיום של התרבויות. קריו-סעיפי OTC אז הוכתמו 14 אנטי-קרטין (ירוק), ותערובת תגובת edu-לחץ-IT (מגנטה) יחד עם כתמים גרעיניים (Hoechst, כחול). תמונות נציגם מתארים מתרבות edu + CD80 lo mTECs (C) וedu ​​+ CD80 mTECs היי (ד) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Cellspacing =" 0 "> תרבויות איבר הרתי צירוף-מחדש (RTOC) שיתוף תרבויות Organotypic (OTC) מערכת שימושית ללמוד אינטראקציות הסלולר שיכול להיות במעקב בקלות ומניפולציות באמצעות ארכיטקטורת הרתי 3D שלמה ברובו; מתפתח למבנה מאורגן כראוי על השתלה. מערכת שימושית ללמוד התפתחות והתמיינות של תאים מועשר / מטוהרים הרתי אפיתל בmeshwork 3D מלאכותי שנוצר על ידי fibroblasts עור האנושי וממולכד בפיגום הפיברין. ובכן הוקם לחקר התפתחותם של תאי אפיתל הרתי וthymocytes באמצעות מעכבים או מכפילי, אשר חודרים את הקפסולה. נוח לתפעל פיתוח אפיתל התימוס או ללמוד פיתוח thymocyte בשיתוף התרבות עם Tecs. מאז המערכתהוא-הרים אוויר, הגודל הנקבובית קרום (0.8 מיקרומטר) הוא קריטי כאשר אספקת גורמים לRTOC: מולקולות גדולות יותר עשויות שלא לחדור דרך הקרום ו / או כמוסה. תרבות היא שקועה בתקשורת, המאפשרת ספיגה של חומרים / גורמים (בהצלחה נבדקה באמצעות oligos morpholino). למבוגרים וTecs או thymocytes לאחר לידה יכולים להיות ממוסמרים לRTOCs העוברי. Tecs לאחר הלידה לגדול יותר טוב מאשר Tecs המבוגר; Tecs העוברי עדיין לא נבדק. דורש thymi העוברי E14-14.5 (אופטימלי), כדי לאפשר לצירוף-מחדש ואינטגרציה של האוכלוסייה הוסיפה הרצויה; קשה לשלוט על הרכב תא הרתי העוברי (acceptor); RTOCs דורש תאים מעכברים או כותרת או congenic fluorescently כתאי תורם או acceptor. ניתן ללמוד תאים / שיבוטים אחד; רק "מזהמים" הם fibroblasts עור אנושי נדרש לספק ECM לתמוך Tecs. Limite הדמיהד לחדיר לעומק של שני פוטונים במיקרוסקופ החי; ניתנים לניתוח FACS או מיון; מחקרי ביטוי גנים דורשים מיון FACS של סוג התא הרצוי לאחר התרבות. באופן מלא נגיש להדמיה; מתאים לניתוח FACS, חיסוני היסטוכימיה, ומחקרי ביטוי גנים.

טבלה 1. השוואה בין שתי מערכות תרבות הרתי 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לצד RTOCs, OTCs 3D היה עדיף בהרבה על ידי במונחים של בידול TEC ותחזוקה / אינדוקציה PGE (טבלה 1) בהשוואה לאחרים (i) "תרבויות 3D פשוטות" באמצעות - fibroblasts לבד בלי הפיגום; (Ii) מערכות 2D באמצעות - תאי פיברובלסטים / מזין שיתוף תרבותי עם Tecs 10, (iii) תאי 3T3-J2 בי השיבוטים TEC לפתח, אבל PGE הולכים לאיבוד, (iv) matrigel או (v) רכיבי ECM (נתונים שלא פורסמו). PGE נשמר לעד 7 ימים בOTCs 3D, להיות נקודת הזמן האופטימלית לאחר מכן 4 ימים, PGE מתחיל לרדת. תכונות מורפולוגיות TEC אחרות נשמרו לעד 14 ימים. מעניין לגלות שOTCs נתמך בשלב הסופי של בידול Mtec ראה במבנים כמו Hassall-נוצרו לעתים 10.

Thymi משמש לOTCs נגזרו מעכברים לאחר לידה צעירה כמו שיש להם נטייה גבוהה יותר לשרוד בתרבות לעומת thymi המבוגר. Tecs נגזר הלוך ושובעוברי מ 'thymi עדיין לא נבדק בOTCs. יותר מכך, לאחר תקופה הארוכה העיכול (לא באמצעות טריפסין בשל מחשוף של אפיטופים מסוימים) התאים הופיעו קיימא יותר באמצעות MACS ולא תאי מיון FACS. שימוש בפרוטוקול העשרה חיובית שני שלבים בעמודות MACS (חרוזים אנטי-PE) של טוהר TEC השתפר גם CD80 + mTECs.

להתקנת OTC זה חיוני כדי לוודא ושיסקוזה, חומר סיבי לא ארוג היא לחתוך לעיגולים חדים, מסומנים היטב בלי שברים רופפים או משוננת קצוות כאמור לעיל שיתאימו בדיוק ל -12 מוסיף גם התרבות. לחלופין, יכולים לשמש גם פיגומים כגון מגב ויסקוזה BEMCOT- M-3 (http://www.bemliese.com). הגודל כן לOTC הוא גם קריטי וצריך להיבדק, אם יש להשתמש בפורמטי צלחת אחרים מאשר פורמטי 6 היטב ו- 12 היטב.

ג'ל הפיברין צריך להיות מוכן באופן שרכיבי פיברינוגן ותרומבין לא מגיעים לאנשי קשרלא אחד עם השני לפני שנקבע על OTC, הקפד להחליף את קצה פיפטה. מערבבים את שני מרכיבים יסודי בצלחת מעל הפיגום ליצירת משטח עליון חלק. תמיד להכין ג'ל מבחן לצד ובללא פיגום כדי לבדוק היווצרות קריש דם תקינה ויש הערכה טובה של הזמן הדרוש לקרישת. ודא כי ג'ל הפיברין בOTC יש קרוש לחלוטין לפני אספקת התרבויות עם תקשורת.

עם סיום התרבויות mTECs זרע יכול להאסף בקלות על ידי עיכול אנזימטי (collagenase / dispase) של הג'ל הפיברין, אשר יכול לשמש לאפיון של mTECs התרבותי למשל, על ידי cytometry זרימה או PCR

יש OTCs 3D המתואר במסמך זה הפוטנציאל ללמוד או לתפעל מספר פרמטרים TEC כלומר: 1) ללמוד ו / או לתפעל (באמצעות siRNA, oligos morpholino) מסלולים ופונקציות ההתפתחותי של mTECs; 2) כדי ללמוד את התפקיד של mTECs בתא T לפתחment; 3) לcTECs התרבות; 4) על מנת לבחון את פוטנציאל האב של תאי גזע המופק הרתי; 5) לTecs אדם התרבות ותאי גזע; 6) לבצע מבחני משובטים TEC יחידים. 3D OTCs מייצג טכניקת תרבות משוכללת חיקוי חלק מin vivo microenvironment התימוס. יודגש כי כל מבחני נוספים להחיל Tecs בהתקנת OTC הנוכחי יצטרכו להיבדק ביסודיות ומותאמת בנפרד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שום ניגוד כספי או מסחרי של עניין.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 mice  Charles River WIGA
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
CD45 Microbeads, mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Streptavidin Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) Ref. 12
CD80-PE antibody BD Pharmingen 553769
CD45-PerCP antibody BD Pharmingen 557235
Ly51-FITC antibody BD Pharmingen 553160
CDR1-Pacific Blue Ref. 15
Keratin 14 antibody Covance PRB-155P
Vimentin antibody Progen GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Molecular Probes (Invitrogen GmbH) A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Invitrogen C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit Invitrogen C10425
12-well filter inserts (thincerts) Greiner bio-one 657631
12-well plate Greiner 665180-01
Jettex 2005/45 ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
PBS Serva 47302.03
DMEM Lonza BE12-604F
DMEM/F12 Lonza BE12-719F
HEPES Gibco 15630-049 
FBS Gold GE Healthcare A11-151
Aprotinin (Trasylol) Bayer 4032037
Cholera toxin Biomol G117
Hydrocortisone Seromed (Biochrom) K3520
L-ascorbic acid Sigma A4034
TGF-ß1 Invitrogen PHG9214
RANKL R&D systems 462-TR-010
Thermolysin Sigma Aldrich  T-7902
OCT Compound TissueTek 4583
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) Invitrogen 10296028
FastPrep FP120 Thermo Scientific
Collagenase Type IV  CellSystems LS004189 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase) CellSystems LS002104 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I  Roche 11 284 932 001 25 µg/ml final conc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  2. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
  3. Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
  4. Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
  5. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  6. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  7. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. (2008).
  8. Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
  9. Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
  10. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  11. Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
  12. Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
  13. Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
  14. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
  15. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats