3D Organotypische Co-cultuur Model Supporting Medullary Thymic epitheelcelproliferatie, Differentiatie en Promiscuous Gene Expression

1Division of Developmental Immunology, German Cancer Research Center (DKFZ), 2Genetics of Skin Carcinogenesis, German Cancer Research Center (DKFZ)
* These authors contributed equally
Published 7/30/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Pinto, S., Stark, H. J., Martin, I., Boukamp, P., Kyewski, B. 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression. J. Vis. Exp. (101), e52614, doi:10.3791/52614 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Intra-thymus T cel ontwikkeling vereist een ingewikkelde driedimensionale maaswerk uit verschillende stromale cellen, dwz niet-T-cellen. Thymocyten doorkruisen deze steiger in een sterk gecoördineerde temporele en ruimtelijke orde, terwijl achtereenvolgens passeren verplichte check points, dwz T-cel lineage inzet, gevolgd door T-cel-receptor repertoire generatie en selectie vóór de uitvoer in de periferie. De twee belangrijkste bewoner celtypes vormen deze steiger zijn corticale (cTECs) en medullaire thymus epitheelcellen (mTECs). Een belangrijk kenmerk van mTECs is de zogenaamde promiscue expressie van verschillende weefsel-beperkte antigenen. Deze weefsel beperkte antigenen worden gepresenteerd aan thymocyten direct of indirect onvolwassen door mTECs of thymus dendritische cellen, respectievelijk resulterend in zelf-tolerantie.

Geschikte in vitro modellen emuleren de ontwikkelingstrajecten en functies van cTECs en mTECs zijn lacking. Dit gebrek aan adequate experimentele modellen is bijvoorbeeld bemoeilijkt de analyse van promiscue genexpressie, die nog steeds slecht begrepen op cellulair en moleculair niveau. We pasten een 3D organotypische co-cultuur model tot cultuur ex vivo geïsoleerde mTECs. Dit model werd oorspronkelijk ontworpen om keratinocyten kweken op zodanige wijze dat een huidequivalent in vitro genereren. Het 3D-model behouden belangrijke functionele kenmerken van MTEC biologie: (i) proliferatie en terminale differentiatie van CD80 lo, Aire-negatief in CD80 hi, Aire-positieve mTECs, (ii) respons op RANKL, en (iii) aanhoudende expressie van FoxN1, aire en weefsel beperkt genen in CD80 hi mTECs.

Introduction

Ontwikkeling thymocyten maken ongeveer 98% van de thymus, terwijl de resterende 2% uit diverse cellen die tezamen vormen het thymus stroma (bijvoorbeeld epitheliale cellen, dendritische cellen, macrofagen, B-cellen, fibroblasten, endotheelcellen). De buitenste corticale epitheelcellen (cTECs) verwerven immigratie van pro-T-cellen van het beenmerg, T cellijn inductie bij multipotente pre-T-cellen en positieve selectie van zelf-MHC beperkte onrijpe thymocyten. De binnenste medullaire thymus epitheelcellen (mTECs) zijn betrokken bij inductie van de thymocyten met hoge affiniteit TCR voor zelf-peptide / MHC-complexen door ofwel induceren negatieve selectie of de afwijking in de regulatoire T-cellijn. In het kader van de centrale tolerantie inductie, mTECs zijn uniek in dat ze drukken een breed spectrum van weefsel beperkt zelf-antigenen (TRA) dus mirroring de perifere zelf. Dit fenomeen wordt promiscue genexpressie genoemd (PGE)1,2.

De meeste huidige studies over deze fascinerende celtype afhankelijk ex vivo geïsoleerde cellen, diverse korte 2D kweeksystemen steeds resulteerde in het verlies van PGE en belangrijke regulator moleculen zoals MHC klasse II, FoxN1 en Aire binnen de eerste 2 dagen 3-6 . Het bleef echter onduidelijk welke bepaalde componenten en eigenschappen van het intacte 3D maaswerk van de thymus ontbraken in 2D modellen. De re-aggregatie thymus orgaankweek (RTOC) heeft tot nu toe de enige 3D-systeem dat de studie van T-celontwikkeling mogelijk maakt, enerzijds, en stromale celbiologie, daarentegen is, in een intacte thymus micromilieu 7. Toch RTOCs bepaalde beperkingen, dat wil zeggen, zij bevatten reeds een complex mengsel van cellen, input nodig foetale bindweefselcellen en doorstaan ​​een maximale kweekperiode van 5-10 dagen.

Het ontbreken van reductionistisch in vitro kweeksystemen heeft de studie van belemmerdverschillende aspecten van de T-cel ontwikkeling en thymus organogenese niet in het minst de moleculaire regulatie van PGE en haar relatie tot de ontwikkelingsbiologie van mTECs.

Door de nauwe verbondenheid van de gestructureerde organisatie van de epitheelcellen van de huid en de thymus, hebben we gekozen voor een 3D organotypische cultuur (OTC) systeem dat oorspronkelijk was ontwikkeld om de differentiatie van keratinocyten in vitro na te bootsen en zo een dermale equivalent. De OTC bestaat uit een inerte scaffold matrix bedekt met dermale fibroblasten die zijn gevangen in een fibrinegel, waarop keratinocyten geënt 8,9. Hier hebben we vervangen keratinocyten met gezuiverd mTECs. Terwijl de fundamentele kenmerken van dit model, we geoptimaliseerd bepaalde parameters.

In de vastgestelde OTC model mTECs verspreidden, onderging terminale differentiatie en onderhouden Mtec identiteit en PGE, dus nauw nabootsen in vivo mTECs ontwikkeling

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deze studie is goedgekeurd door de ethische commissie van het Regierungspräsidium Karlsruhe. Alle dieren werden gehuisvest onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden bij de Duitse Cancer Research Center (DKFZ). Voor alle kweekexperimenten muis pups van 1 tot 7 dagen oud werden gebruikt.

1. Isolatie van mTECs van Thymus

Opmerking: De volgende digestie stappen werden uitgevoerd zoals eerder is beschreven 1 onder steriele omstandigheden met enkele wijzigingen, opgenomen.

  1. Onthoofden de muis pups en verwijder de thymus. Plaats de thymi op ijs in een Petri plaat met RPMI 1640 medium (met 5% FCS).
  2. Snijd de thymi in fijne, reepjes en plaats in een buis met ronde bodem ~ 5-30 ml RPMI-medium en voorzichtig roeren met een magneet voor 10 min bij kamertemperatuur.
  3. Daarna, decanteren de bovenstaande die hoofdzakelijk thymocyten en te verteren de resterende weefsel opeenvolgend met een ronde van COLLAGENAse type IV (0,2 mg / ml en 57 U / ml uiteindelijk concentartion) gedurende 15 min elk bij 37 ° C, gevolgd door collagenase / dispase (0,2 mg / ml en 1,2 U / ml eindconcentratie) gedurende 25 min elk bij 37 ° C in een waterbad onder magnetisch roeren totdat de thymi volledig gedigereerd. Met 1 ml enzyme per 2-3 thymi.
  4. Schud het weefsel eens 7-10 minuten met een Pasteur pipet. Pool de collagenase / dispase breuken en filteren door middel van een 70 um gaas.
  5. Verrijk de mTECs door magnetische celsortering (MACS). Voer de zuivering van mTECs door magnetische celsortering zoals eerder 11 beschreven en is getoond in figuur 1.
    OPMERKING: Bij magnetische sortering van mTECs gebruikten we de volgende antilichamen: anti-CD80-PE (16-10A1, gebruikt bij 1: 100 verdunning) en anti-EpCAM-bio (G8.8, gebruikt bij 1: 100 verdunning) 12. Onvolwassen en volwassen mTECs met MACS werden gedefinieerd als: CD45 - EpCAM + CD80 - en CD45 - CD80 + respectively.
  6. Na MACS zuivering (zuiverheid van onrijpe mTECs = 83,1 ± 6,3% en volwassen mTECs = 79,23 ± 3,42%), het zaad van de mTECs op de organotypische culturen zoals hieronder beschreven (paragraaf 2.3).
  7. Alternatief sorteren mTECs met FACS (met 100 um nozzle) na CD45 MACS depletie met de volgende antilichamen: anti-CD45-PerCP (30-F11, gebruikt bij 1: 100 verdunning), anti-Ly51-FITC (6C3, gebruikt bij 1 : 100 verdunning), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, gebruikt bij 1: 500 verdunning) en anti-CD80-PE (16-10A1, gebruikt bij 1: 100 verdunning). Uitsluiten dode cellen met behulp van propidiumjodide (1: 5.000) (dag 4). Onvolwassen en volwassen mTECs met FACS werden gedefinieerd als: PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - en PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 +, respectievelijk.

2. 3D Organotypische Co-culturen (OTC)

LET OP: De 3D-dermal constructies voor organotypische teelt van keratinocytes werden bereid zoals eerder beschreven 9,13. Bij alle stappen werden cellen geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO 2. De OTC's gebruiken mTECs werden als volgt bereid met geringe modificaties.

  1. Voorbereiding van de menselijke fibroblasten
    OPMERKING: De menselijke dermale fibroblasten werden verkregen uit explantkweken van-de epidermised dermis zoals eerder 9 beschreven.
    1. Kortom, gesneden stroken menselijke huid (~ 5 cm lang) en behandel met thermolysine (0,5 mg / ml in zoutoplossing met 10 mM Hepes pH 7,4) O / N bij 4 ° C.
    2. Daarna, scheid de epidermis van de dermis behulp van een tang.
    3. Fijn gesneden de dermis in kleine stukjes, plaats in een 10 cm Petri plaat en laten drogen gedurende 1-2 uur onder een steriele luchtstroom. Vul het explantaten regelmatig DMEM met 20% FBS.
    4. Splits de-out groeiende fibroblasten wanneer confluent (meestal rond de 3 weken) met 0,1% trypsine ervoor te zorgen dat de explantaten blijven houden aan de plaat voor verdere conopeenvolgende rondes van uitgroei.
    5. Vouw de fibroblasten uit dezelfde explantaten tot 3 maal in DMEM met 10% FBS en cryo-behouden ze 14. Gebruik dezelfde partij fibroblasten voor elke experimentele serie.
      LET OP: De fibroblasten werden niet bestraald voor de set-up van de dermale equivalenten.
  2. Bereiding van de steiger
    1. Snijd de 0,4-0,6 mm dik viscose, geweven vezelmateriaal (productdetails in de ondersteuning van excel sheet) in goed afgebakend cirkels met een scherp 11 mm diameter metalen puncher om precies te passen in 12 goed filter inserts. Plaats deze dan in de 12- goed filter insert (polyester capillaire porie membraan, 3 micrometer poriegrootte) als een schavot. Plaats het volledige filter opstelling in een steriele 12-well plaat.
    2. Bereid de fibrine gel met een fibrinelijm-kit voor chirurgie bestaande uit een combinatie van fibrinogeen en trombine. Pre-verdun het fibrinogeen en de thrombine-component van de kit tot 8 mg / ml en 10eenheden / ml, respectievelijk. Voor een enkel putje van een 12-well plaat als volgt.
      1. Verdun 100 pi fibrinogeen (8 mg / ml) met 100 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca 2 + en Mg2 +, pH 7,0. Verdun 100 ui thrombine (10 eenheden / ml) met 100 ul FCS bevattende 270.000 fibroblasten.
      2. Breng 200 pi van het thrombine met fibroblasten cell-mix op de scaffold waaraan 200 pi fibrinogeen toe (1: 1 mengsel), resulterend in een uiteindelijke concentratie van fibrinogeen van 2 mg / ml en 2,5 eenheden trombine / ml. Meng goed en verdeel gelijkmatig over het hele gebied van de steiger door zachte pipetteren (dag 1).
        OPMERKING: Na 30 min bij 37 ° C een prop omsluit de fibroblasten wordt gevormd, vult volledig de binnenruimten van de steiger en het vormen van een glad bovenvlak.
  3. Co-cultuur met mTECs
    1. Voor pre-cultuur, dompel het orgel culturenDMEM met 10% FBS, 50 ug / ml L-ascorbinezuur en 1 ng / ml TGF-β1 met een mediumverversing om de dag gedurende 4-5 dagen.
    2. Op de dag van MTEC zaaien Vervang het medium rFAD medium (1: 1 DMEM + DMEM / F12) met 10% FBS, 10 -10 M choleratoxine, 0,4 mg / ml hydrocortison, 50 ug / ml L-ascorbinezuur, RANK-ligand (0,1 ug / ml) en 500 eenheden / ml aprotinine, waardoor vroegtijdige fibrinolyse door serine proteasen vanuit fibroblasten voorkomen.
    3. 7-8 uur later, set-up van de co-kweken van zaaien 250.000 mTECs (hetzij volledig mTECs of CD80 en CD80 hi lo subsets), in een volume van 100 gl per putje bovenop de fibroblast scaffold. Tel de cellen met behulp van een Neubauer kamer (dag 4).
      LET OP: Te allen tijde de thymus 3D organotypische culturen worden ondergedompeld in de media in tegenstelling tot de huid OTC's die voorzien zijn opgeheven.
    4. Na 24 uur incubatie, leveren de culturen met medium (totaal medium uitwisseling) zoals hierboven (stap 2.3.2) genoemd nu containing verlaagde bedragen van aprotinine, 250 eenheden / ml (Dag 5).
    5. Om de proliferatieve activiteit van mTECs beoordelen voeg edu (6,7 uM / ml, dat wil zeggen, 10 pM / putje) aan OTC's voor 4 uur voor beëindiging van het kweken. Voer de kleuring van OTC cryo-profielen zoals beschreven in de EDU Beeldverwerkingskit combinatie met co-kleuring van keratine 14. Bepaal de proliferatieve indices van mTECs, hetzij door het tellen van de K14 + EDU + cellen in twee secties van elke kweek specimen of de stroming cytometrie (EDU flowcytometrie, paragraaf 1.7 maar in plaats van Ly51-FITC gebruikt CDR1-PB 15 bij een 1: 100 verdunning en 2.3.6.4).
    6. Na 4-7 dagen van de co-cultuur, beëindigen de OTC's en het proces voor de RNA-isolatie, cryo-snijden of FACS-analyse (dag 8-11).
      1. Beëindig de kweken met een pincet, het scheiden van de scaffold / dermale equivalenten voor filter van de put insert.
      2. Voor cryo-snijden, insluiten het gehele OTC in OCT verbinding en bevriezen in liquid stikstofdamp voordat cryo-snijden. Bereid 5-7 pm dikke secties OTC behulp van een cryostaat en bewaar bij -20 ° C tot gebruik. Voor immuno-histochemie van cryo-sectioned OTC's gebruiken anti-keratine 14 (AF64 gebruik bij 1: 1000 verdunning), en anti-vimentine (GP53, gebruikt bij 1: 100 verdunning) antilichamen. Voer de indirecte immuno-histochemie kleuring met behulp van respectieve secundaire antilichamen.
      3. Voor RNA-isolatie, voeg 1 ml denaturerende oplossing (bevattende fenol en guanidinium thiocyanaat) in een schroefdop van 2 ml RNase-free tube. Snijd de gehele OTC in stukken met een scalpel en voeg in de buis bevattende denaturerende oplossing. Mechanisch versnipperen de OTC's met FastPrep instrument tweemaal gedurende 30 seconden bij een snelheid van 6,0, plaatsen tussen op ijs gedurende 2 minuten (het monster kan worden opgeslagen bij -80 ° C na dit punt). Indien bij -80 ° C ingevroren, ontdooid op ijs. Centrifugeer de buizen bij 11,500-13,000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C. Breng het supernatant naar een nieuwe buis, incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en fOLLOW RNA-isolatie protocollen middels zuur guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie zoals beschreven door de fabrikant.
      4. Voor FACS analyse, verwijder het schavot en scheiden de membraan van de fibrine / fibroblast / Mtec gel. Fijngesneden de gel met een scalpel en verteren in een FACS buis ~ 20 minuten of totdat het volledig gedigereerd met 2 ml collagenase / dispase bij 37 ° C in een waterbad onder magnetisch roeren. Schud de enzymoplossing met een Pasteur pipet eens 5 min. Na volledige digestie, filter de celsuspensie door een 70 urn filter; vlek de enkele celsuspensie met de antilichamen zoals beschreven in 1.7 en geanalyseerd door flow cytometrie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We heeft een 3D organotypische co-cultuur model (3D OTC), die oorspronkelijk was ontwikkeld voor in vitro lange termijn cultuur van keratinocyten 9. MACS-verrijkte mTECs (zie MACS verrijking schema Figuur 1) werden gezaaid op een steiger bestaande uit een fibrine gel en ingesloten fibroblasten. De fibroblasten geven de essentiële extracellulaire matrix (ECM) ondersteunen mTECs in vitro. MTECs werden in OTC's gekweekt voor 4-14 dagen in de aanwezigheid van RANKL in ondergedompelde culturen in tegenstelling tot de keratinocyten, die de lucht blootgesteld nabootsen van hun in vivo omgeving (zie OTC set-up schema Figuur 2) zijn.

Beide Mtec subsets hier geanalyseerd (dwz CD80 lo en CD80 hi mTECs) overleefden gedurende de hele cultuur periode van maximaal 14 dagen. MTECs werden geïdentificeerd door keratine 14 expressie en waren gemakkelijk te onderscheiden van vimentine-positieve fibroblasten (Figuur 3B). Interessant, onvolwassen en volwassen mTECs groeide in verschillende patronen in de cultuur. De CD80 lo mTECs typisch gevormd bi-lagen (in nauw contact met fibroblasten), terwijl de CD80 hi mTECs neiging om compact celaggregaten afgebakend door fibroblasten te vormen. Deze patronen zijn zeer reproduceerbaar.

De MTEC subsets niet alleen overleefd, maar ook verspreid onder 3D OTC voorwaarden zoals vastgesteld door Edu incorporatie (figuur 3C, 3D). Interessant is dat de CD80 lo mTECs verspreidden met een hogere snelheid in aanwezigheid van RANKL, terwijl het omgekeerde het geval van CD80 hi mTECs 10.

Bovendien CD80 lo mTECs onderverdeeld in CD80 hi mTECs in aanwezigheid van RANKL binnen 4 dagen kweek zoals blijkt uit de sterke opregulatie van CD80. De gedifferentieerde mTECs onderhouden ook de uitdrukking van Aire, FoxN1 (gen en pProtein) eveneens promiscue expressie Aire-onafhankelijke en afhankelijke TRA 10.

Figuur 1
Figuur 1. MACS verrijking van TEC. Na filtreren werden mTECs verrijkt uit de thymus enkele celsuspensie met behulp van magnetische celsortering (MACS). Eerst werden de hematopoietische cellijnen verarmd gebruik van anti-CD45 Microkralen. De CD45 - cellen werden vervolgens geïncubeerd met anti-CD80 PE antilichaam, gevolgd door anti-PE Microkralen. Het eluaat dat CD80 + -mature mTECs was direct gekweekt op de OTC's, terwijl de doorstroom bevatte CD80 - immature mTECs en andere stromale cellen. MTECs werden verder verrijkt met behulp van anti-EpCAM-bio antilichaam en streptavidine Microbeads. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Regeling voor de stapsgewijze opbouw van de 3D-OTC's. Een scaffold matrix werd in een 12-well filter insert. De dermale fibroblasten uit geëxplanteerde skin (270.000 cellen / OTC putje) werden geënt in een fibrine-gel (bestaande uit 1: 1 verhouding van fibrinogeen en thrombine). Deze dermale equivalenten werden opgelopen voor 4-5 dagen met DMEM + voedingsstoffen tot mTECs (250.000 cellen / OTC well) werden geënt op de top en gekweekt met medium verrijkt met verschillende voedingsstoffen (rFAD + voedingsstoffen).

Figuur 3
Figuur 3. groeipatronen en proliferatie van mTECs in de OTC's. Het verrijkte CD80 lo mTECs neiging om te groeien als een bi-laag in nauw contact met de fibroblasten (A), wh ereas de gedifferentieerde CD80 hi mTECs groeien als celaggregaten of strakke clusters (B). OTC's werden gelabeld op dag 4 van de cultuur met anti-keratine 14 (rood) en anti-vimentine antilichamen (groen) samen met de nucleaire kleuring (Hoechst, blauw). Om de verspreiding van mTECs evalueren werden de OTC's gepulseerd met EDE (6,7 uM / ml, dat wil zeggen, 10 pM / putje) gedurende 4 uur voor de beëindiging van de kweken. De OTC cryo-plakjes werden vervolgens gekleurd met anti-keratine 14 (groen) en EDU-Click-iT reactiemengsel (magenta) samen met de nucleaire kleuring (Hoechst, blauw). Representatieve beelden beeltenis uitdijende EDU + CD80 lo mTECs (C) en EDU + CD80 hi mTECs (D) getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

"Cellspacing =" 0 "> Reaggregation thymus orgel culturen (RTOC) Organotypische co-culturen (OTC) Nuttige systeem om cellulaire interacties die gemakkelijk kunnen worden gecontroleerd en gemanipuleerd met een grotendeels intact 3D thymus architectuur te bestuderen; ontwikkelt zich tot een goed georganiseerde structuur op enten. Nuttig systeem voor de ontwikkeling en differentiatie van verrijkte / gezuiverde thymus epitheelcellen bestuderen in een kunstmatig 3D maaswerk gegenereerd door menselijke huidfibroblasten ingevangen in een fibrine scaffold. Gevestigde voor de studie van de ontwikkeling van de thymus epitheelcellen en thymocyten gebruik remmers of modificatoren, die de capsule dringen. Vatbaar voor thymus epitheelcellen ontwikkeling te manipuleren of te thymocyt ontwikkeling in co-cultuur studeren bij TEC. Aangezien het systeemis voorzien opgeheven, het membraan poriegrootte (0,8 micrometer) is van cruciaal belang bij de levering van factoren aan de RTOC: grotere moleculen kunnen niet doordringen door het membraan en / of capsule. Cultuur wordt ondergedompeld in de media, die de opname van stoffen / factoren faciliteert (met succes getest met morfolino oligo's). Volwassen en postnatale TEC of thymocyten kunnen worden verrijkt in foetale RTOCs. Postnatale TECs beter groeien dan volwassen TEC; foetale TEC's nog niet getest. Vereist embryonale E14-14.5 thymi (optimaal) om voor reaggregation en integratie van de toegevoegde gewenste populatie; moeilijk de foetale thymus (acceptor) celsamenstelling controleren; RTOCs vereisen cellen van ofwel fluorescent gelabelde of congene muizen donor of acceptor cellen. Mogelijk om enkele cellen / klonen te bestuderen; slechts 'verontreinigingen' zijn menselijke huid fibroblasten nodig om ECM ter ondersteuning van de TEC te bieden. Imaging limited om de diepte van de live twee-foton microscopie penetratie; vatbaar voor FACS-analyse of sorteren; genexpressie studies nodig FACS sorteren van het gewenste type cel na cultuur. Volledig toegankelijk voor beeldvorming; geschikt voor FACS-analyse, immuno-histochemie, en genexpressie studies.

Tabel 1. Vergelijking tussen twee 3D thymus kweeksystemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Naast RTOCs zijn de 3D ​​OTC's qua TEC differentiatie en PGE onderhoud / inductie (Tabel 1) in vergelijking met andere (i) "vereenvoudigde 3D ​​cultures 'met verreweg superieur - fibroblasten alleen zonder het skelet; (Ii) 2D systemen met - fibroblasten / feeder-cellen samen gekweekt met TEC 10, (iii) 3T3-J2 cellen waarbij TEC klonen ontwikkelen, maar PGE verloren, (iv) Matrigel of (v) ECM componenten (ongepubliceerde gegevens). PGE werd gehandhaafd voor maximaal 7 dagen in de 3D-OTC's, 4 dagen wordt de optimale tijd-point daarna PGE begint te dalen. Andere morfologische TEC features werden gehandhaafd voor maximaal 14 dagen. Intrigerend de OTC's ondersteunde het eindstadium van MTES differentiatie gezien door de soms Hassall gevormde structuren 10.

De thymi voor OTC's waren afkomstig van jonge postnatale muizen ze een sterkere neiging om te overleven in kweek dan bij volwassen thymi. TEC's afgeleid from embryonale thymi nog niet getest in OTC's. Meer nog, na de lange spijsvertering periode (niet met behulp van trypsine vanwege splitsing van bepaalde epitopen) de cellen meer levensvatbaar bleek met MACS eerder dan FACS sorteren van cellen. Met behulp van een twee-staps positieve verrijking protocol over MACS kolommen (anti-PE kralen) van CD80 + mTECs bovendien verbeterd TEC zuiverheid.

Voor de OTC setup is het essentieel om ervoor te zorgen dat de viscose, geweven vezelmateriaal is in scherpe, goed afgebakend cirkels snijden zonder losse fragmenten of gekartelde uiteinden, zoals hierboven vermeld, dat precies in 12 goed cultuur inserts. Alternatief kan scaffolds zoals BEMCOT- viscose wisser M-3 (http://www.bemliese.com) worden gebruikt. De goede maat voor de OTC is ook kritisch en moet worden getest, wanneer dat geen 6-well en 12-well formaat plaatformaten te gebruiken.

De fibrine gel moet zodanig worden opgesteld dat de fibrinogeen en trombine componenten niet in contac doen koment met elkaar voordat ze worden ingesteld op de OTC, zorg ervoor dat de pipetpunt uit te wisselen. Meng de twee componenten zorgvuldig in de plaat over de steiger op een glad bovenoppervlak vormen. Bereiden altijd een test gel samen in een goed zonder steiger om te controleren voor een goede stolselvorming en een goede schatting van de tijd die nodig is voor de stolling te hebben. Zorg ervoor dat de fibrine gel in de OTC volledig is gestold voordat het leveren van de culturen met de media.

Bij beëindiging van het kweken de geënte mTECs gemakkelijk kan worden gepakt door enzymatische digestie (collagenase / dispase) van de fibrine gel, die kan worden gebruikt voor de karakterisering van gekweekte mTECs bijvoorbeeld door flow cytometrie of PCR

De 3D-OTC's die hierin beschreven heeft de potentie om te weten studeren of manipuleren meerdere TEC parameters: 1) na te gaan en / of manipuleren (via siRNA, morfolino oligo) ontwikkelingspaden en functies van mTECs; 2) de rol van mTECs T cellen bestuderen ontwikkelingment; 3) tot cultuur cTECs; 4) de progenitor mogelijkheden van thymus afgeleide stamcellen te testen; 5) tot cultuur mens TEC en stamcellen; 6) om enkele TEC klonale tests uit te voeren. De 3D-OTC's vertegenwoordigen een uitgebreide cultuur techniek emuleren een deel van de in vivo thymus micromilieu. Er zij op gewezen dat aanvullende analyses toegepast TEC in de huidige OTC installatie moet grondig getest en afzonderlijk geoptimaliseerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen financiële of commerciële belangenverstrengeling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 mice  Charles River WIGA
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
CD45 Microbeads, mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Streptavidin Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) Ref. 12
CD80-PE antibody BD Pharmingen 553769
CD45-PerCP antibody BD Pharmingen 557235
Ly51-FITC antibody BD Pharmingen 553160
CDR1-Pacific Blue Ref. 15
Keratin 14 antibody Covance PRB-155P
Vimentin antibody Progen GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Molecular Probes (Invitrogen GmbH) A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Invitrogen C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit Invitrogen C10425
12-well filter inserts (thincerts) Greiner bio-one 657631
12-well plate Greiner 665180-01
Jettex 2005/45 ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
PBS Serva 47302.03
DMEM Lonza BE12-604F
DMEM/F12 Lonza BE12-719F
HEPES Gibco 15630-049 
FBS Gold GE Healthcare A11-151
Aprotinin (Trasylol) Bayer 4032037
Cholera toxin Biomol G117
Hydrocortisone Seromed (Biochrom) K3520
L-ascorbic acid Sigma A4034
TGF-ß1 Invitrogen PHG9214
RANKL R&D systems 462-TR-010
Thermolysin Sigma Aldrich  T-7902
OCT Compound TissueTek 4583
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) Invitrogen 10296028
FastPrep FP120 Thermo Scientific
Collagenase Type IV  CellSystems LS004189 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase) CellSystems LS002104 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I  Roche 11 284 932 001 25 µg/ml final conc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  2. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
  3. Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
  4. Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
  5. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  6. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  7. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. (2008).
  8. Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
  9. Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
  10. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  11. Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
  12. Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
  13. Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
  14. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
  15. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats