3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

1Division of Developmental Immunology, German Cancer Research Center (DKFZ), 2Genetics of Skin Carcinogenesis, German Cancer Research Center (DKFZ)
* These authors contributed equally
Published 7/30/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Pinto, S., Stark, H. J., Martin, I., Boukamp, P., Kyewski, B. 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression. J. Vis. Exp. (101), e52614, doi:10.3791/52614 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Intra-Thymus-T-Zell-Entwicklung erfordert ein kompliziertes dreidimensionales Maschenwerk aus verschiedenen Stromazellen, dh Nicht-T-Zellen. Thymocyten durchqueren dieses Gerüst in einem hoch koordinierten zeitliche und räumliche Ordnung, während sequentiell vorbei obligatorischen Kontrollpunkte, dh T-Zelllinie Engagement, gefolgt von T-Zell-Rezeptor-Repertoire und Auswahl vor der Ausfuhr in die Peripherie. Die beiden wichtigsten ansässigen Zelltypen bilden dieses Gerüst sind kortikalen (CTEC) und Mark Thymusepithelzellen (mTEZ). Ein Schlüsselmerkmal der mTEZ ist die sogenannte Promiscuous Expression zahlreicher gewebe beschränkten Antigenen. Diese gewebe beschränkten Antigenen präsentiert werden, um Thymozyten direkt oder indirekt durch unreife mTEZ oder Thymus-dendritische Zellen, die jeweils resultierenden Selbsttoleranz.

Geeignete in vitro Modelle emuliert die Entwicklungswege und Funktionen der CTEC und mTEZ liegen noch lacKönig. Dieser Mangel an angemessenen experimentellen Modellen hat zum Beispiel beeinträchtigt die Analyse der Promiscuous Genexpression, die immer noch schlecht auf zellulärer und molekularer Ebene verstanden wird. Wir angepasst 3D organotypischen Co-Kultur-Modell zur Kultur ex vivo isolierten mTEZ. Dieses Modell wurde ursprünglich entwickelt, um Keratinozyten derart zu kultivieren, um eine Hautäquivalents in vitro zu erzeugen. Das 3D-Modell beibehalten wichtigsten Funktionsmerkmale mTEC Biologie: (i) die Proliferation und terminale Differenzierung von CD80 lo, Aire-negative in CD80 hallo, Aire-positive mTEZ, (ii) Reaktionsfähigkeit auf RANKL, und (iii) nachhaltige Ausdruck FOXN1, Aire und gewebe eingeschränkt Gene in CD80 hallo mTEZ.

Introduction

Entwicklung von Thymozyten machen etwa 98% des Thymus, die restlichen 2% bestehen aus einer Vielzahl von Zellen, die zusammen bilden den Thymus-Stroma (dh Epithelzellen, dendritischen Zellen, Makrophagen, B-Zellen, Fibroblasten, Endothelzellen). Die äußeren kortikalen Epithelzellen (CTEC) beschaffen Einwanderung von Pro-T-Zellen aus dem Knochenmark, T-Zell-Linie Induktion in multi pre-T-Zellen und positive Selektion von selbst MHC beschränkt unreifen Thymozyten. Die inneren Mark Thymusepithelzellen (mTEZ) in Toleranzinduktion dieser Thymozyten mit einer hochaffinen TCR Selbst Peptid / MHC-Komplexen durch entweder induzierende negative Selektion oder deren Abweichung in den regulatorischen T-Zelllinie beteiligt. Im Zusammenhang mit der zentralen Toleranzinduktion sind mTEZ, daß sie ein breites Spektrum von gewebe beschränkt Selbst-Antigene (TAA), die so Spiegeln des peripheren selbst exprimieren einzigartig. Dieses Phänomen wird als Promiscuous Genexpression (pGE)1,2.

Die meisten aktuellen Studien zu diesem faszinierenden Zelltyp verlassen sich auf ex vivo isolierten Zellen, wie verschiedene kurzfristige 2D-Kultursystemen unweigerlich zum Verlust von PGE und Schlüsselregulator Moleküle wie MHC-Klasse II, FOXN1 und Aire in den ersten 2 Tagen 3-6 geführt . Es blieb jedoch unklar, welche bestimmte Komponenten und Funktionen des intakten 3D Geflecht des Thymus in 2D-Modelle fehlt. Die Reaggregation Thymus-Organkultur (RTOC) bisher das einzige 3D-System, das die Untersuchung der T-Zell-Entwicklung ermöglicht, einerseits und stromal cell biology, auf der anderen Seite war, in einer intakten Thymus Mikro 7. Dennoch haben RTOCs bestimmte Beschränkungen, das heißt sie enthalten bereits eine komplexe Mischung von Zellen, erfordern die Eingabe von fötalen Stromazellen und ertragen einer maximalen Kultivierungsdauer von 5 bis 10 Tagen.

Der Mangel an reduktionistischen in vitro Kultursystemen hat das Studium behindertmehrere Aspekte der T-Zell-Entwicklung und Thymus Organogenese nicht zuletzt die molekulare Regulation von PGE und seiner Beziehung zu der Entwicklungsbiologie mTEZ.

Durch die enge Bezogenheit der strukturierten Organisation der Epithelzellen der Haut und der Thymus, entschieden wir uns für ein 3D organotypische Kultur (OTC) System, das ursprünglich entwickelt worden war, um die Differenzierung von Keratinozyten in vitro nachzuahmen und so eine dermale Äquivalent. Die OTC-System besteht aus einem inerten Gerüstmatrix mit dermalen Fibroblasten, die in einem Fibrin-Gel, auf die Keratinozyten ausgesät 8,9 gefangen sind überlagert. Hier ersetzt wir Keratinozyten mit gereinigtem mTEZ. Und dabei die grundlegenden Merkmale dieses Modells optimierten wir bestimmte Parameter.

In der angenommenen OTC Modell mTEZ vermehrt unterzog terminalen Differenzierung und gepflegt mTEC Identität und PGE, somit eng in vivo mTEZ Entwicklung nachahmt

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Regierungspräsidium Karlsruhe zugelassen. Alle Tiere wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen am Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) untergebracht ist. Für alle Kulturexperimenten Maus Jungtieren, die von 1 bis 7 Tage alt verwendet.

1. Isolierung von mTEZ aus Thymus

HINWEIS: Die folgenden Schritte Verdauung wurden wie zuvor 1 unter sterilen Bedingungen mit einigen Modifikationen wie folgt beschrieben durchgeführt.

  1. Enthaupten die Maus Welpen und nehmen Sie den Thymus. Setzen Sie den Thymi auf Eis in einer Petri Platte mit RPMI 1640-Medium (enthaltend 5% FCS).
  2. Schneiden Sie die Thymi in feine, kleine Stücke schneiden und in einem Rundrohr mit ~ 5-30 ml RPMI-Medium und sanft umrühren mit einem Magneten für 10 min bei RT
  3. Danach dekantiert die überstehende, die hauptsächlich Thymozyten und verdauen die verbleibende Gewebe nacheinander mit einer Runde collagenaSE-Typ IV (0,2 mg / ml und 57 U / ml Endkonzentration concentartion) für 15 min bei 37 ° C, gefolgt von Collagenase / Dispase (0,2 mg / ml und 1,2 U / ml Endkonzentration) für jeweils 25 min bei 37 & deg; C in einem Wasserbad unter magnetischem Rühren bis zum Thymi vollständig verdaut. Verwenden Sie 1 ml Enzym pro zwei vor drei Thymi.
  4. Man schüttelt das Gewebe einmal alle 7-10 min mit einer Pasteurpipette. Bündeln die Kollagenase / Dispase Fraktionen und durch ein 70 & mgr; m Gaze.
  5. Bereichern die mTEZ durch magnetische Zellsortierung (MACS). Führen die Reinigung von mTEZ durch magnetische Zellsortierung wie zuvor 11 beschrieben und in Abbildung 1 dargestellt.
    HINWEIS: Bei Magnetsortierung mTEZ verwendeten wir die folgenden Antikörper: anti-CD80-PE (16-10A1, Einsatz bei Verdünnung 1: 100) und Anti-EpCAM-bio (G8.8, Einsatz bei Verdünnung 1: 100) 12. Unreifen und reifen mTEZ mit MACS wurden wie folgt definiert: CD45 - EpCAM + CD80 - und CD45 - CD80 + JEWEILIGENEly.
  6. Nach Reinigung MACS (Reinheit von unreifen mTEZ = 83,1 ± 6,3% und reifen mTEZ = 79,23 ± 3,42%), die Samen mTEZ auf die organotypischen Kulturen, wie unten beschrieben (Abschnitt 2.3).
  7. Alternativ Art mTEZ durch FACS (unter Verwendung von 100 & mgr; m Düse) nach CD45 MACS Erschöpfung mit den folgenden Antikörpern: anti-CD45-PerCP (30-F11, Einsatz bei 1: 100 Verdünnung), Anti-Ly51-FITC (6C3, verwenden Sie bei 1 : 100-Verdünnung), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, Verwendung einer 1: 500 Verdünnung) und Anti-CD80-PE (16-10A1, Verwendung bei 1: 100 Verdünnung). Ausschließen toten Zellen mit Propidiumiodid (1: 5.000) (Tag 4). Unreifen und reifen mTEZ mit FACS wurden wie folgt definiert: - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - und PI - CD45 - Ly51 - PI EpCAM + CD80 + sind.

2. 3D Organotypische Co-Kulturen (OTCs)

HINWEIS: Die 3D-Hautkonstrukte für organotypischen Kultivierung keratinocytes wurden wie zuvor beschrieben hergestellt, 9,13. Bei allen Schritten wurden die Zellen bei 37 ° C inkubiert und 5% CO 2. Die OTCs Verwendung mTEZ wurden mit leichten Modifikationen, wie folgt hergestellt.

  1. Herstellung von menschlichen Fibroblasten
    HINWEIS: Die humanen Hautfibroblasten wurden aus Explantatkulturen von de-epidermised Dermis wie zuvor 9 beschrieben, erhalten.
    1. Kurz gesagt, geschnittenen Streifen der menschlichen Haut (~ 5 cm Länge) und behandle mit Thermo (0,5 mg / ml in Kochsalzlösung mit 10 mM Hepes pH 7,4) O / N bei 4 ° C.
    2. Danach trennen Sie die Epidermis von der Dermis mit einer Pinzette.
    3. Fein in einer 10 cm Petrischale schneiden die Lederhaut in kleine Stücke, Ort und lassen Sie sie für 1-2 Stunden unter einem sterilen Luftstrom trocknen. Ergänzen die Explantate regelmäßig mit DMEM, das 20% FBS.
    4. Teilen Sie die aus wachsenden Fibroblasten bei konfluenten (in der Regel etwa 3 Wochen) mit 0,1% Trypsin, sicherzustellen, dass die Explantate weiterhin auf die Platte für weitere con haftenaufeinander folgenden Runden der Auswuchs.
    5. Erweitern Sie die Fibroblasten aus dem gleichen Explantate für bis zu 3-mal in DMEM mit 10% FBS und Kryo-bewahren 14. Verwenden Sie die gleiche Charge von Fibroblasten für jede Versuchsreihe.
      HINWEIS: Die Fibroblasten wurden nicht für den Aufbau der Hautäquivalente bestrahlt.
  2. Vorbereitung des Scaffold
    1. Schneiden Sie die 0,4-0,6 mm dicken Viskose, Vliesfasermaterial (Produktdetails bei der Unterstützung der Excel-Tabelle) in gut abgegrenzten Kreise mit einem scharfen 11 mm Durchmesser Metall Puncher genau in 12-Well-Filtereinsätze passen. Dann legen Sie sie in den 12-Well-Filtereinsatz (Polyester kapillare Porenmembran, 3 & mgr; m Porengröße) als Gerüst. Setzen Sie den kompletten Filter-Setup in eine sterile 12-Well-Platte.
    2. Vorbereiten des Fibringels Verwendung eines Fibrinkleber-Kit für die Chirurgie bestehend aus einer Kombination von Fibrinogen und Thrombin. Pre-Verdünnung des Fibrinogen- sowie die Thrombin-Komponente des Kits bis 8 mg / ml und 10Einheiten / ml. Für eine einzelne Vertiefung einer 12-Well-Platte wie folgt vorgehen.
      1. 100 ul verdünnte Fibrinogen (8 mg / ml) mit 100 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca 2+ und Mg 2+, pH 7,0. Verdünnter 100 ul Thrombin (10 Einheiten / ml) mit 100 ul FCS enthaltenden 270.000 Fibroblasten.
      2. Verzichtet werden 200 ul Thrombin Fibroblasten enthaltende zell mischen auf das Stützgerüst, wozu 200 & mgr; l Fibrinogen hinzuzufügen (1: 1-Mischung), was zu einer Endkonzentration von Fibrinogen von 2 mg / ml und Thrombin von 2,5 Einheiten / ml. Gut mischen und gleichmäßig zu verteilen über die gesamte Fläche des Gerüsts durch vorsichtiges Pipettieren (Tag 1).
        HINWEIS: Nach 30 Minuten bei 37 ° C ein Gerinnsel umschließt den Fibroblasten gebildet haben, Füllen vollständig die Innenräume des Gerüsts und eine glatte obere Oberfläche.
  3. Co-Kultur mit mTEZ
    1. Für Vorkultur, Tauchen Sie das Organkulturen inDMEM mit 10% FBS, 50 & mgr; g / ml L-Ascorbinsäure und 1 ng / ml TGF-β1 mit einem Mediumwechsel alle zwei Tage für 4-5 Tage.
    2. Am Tag der Aussaat mTEC Ersetzen des Mediums durch RFAD Medium (1: 1 DMEM + DMEM / F12) mit 10% FBS, 10 -10 M Choleratoxin, 0,4 mg / ml Hydrocortison, 50 & mgr; g / ml L-Ascorbinsäure, RANK-Ligand (0,1 ug / ml) und 500 Einheiten / ml Aprotinin, wodurch frühreifen Fibrinolyse von Serinproteasen durch Fibroblasten sezerniert.
    3. 7-8 Stunden später, die Co-Kulturen Set-up durch Impfen 250.000 mTEZ (entweder komplett mTEZ oder CD80 lo und CD80 hallo Untergruppen) in einem Volumen von 100 ul pro Vertiefung auf der Oberseite des Fibroblasten-Gerüst. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung einer Neubauer Kammer (Tag 4).
      HINWEIS: Zu allen Zeiten der Thymus 3D organotypischen Kulturen werden in den Medien im Gegensatz zu Haut OTCs, die Klima aufgehoben sind untergetaucht.
    4. Nach 24 Stunden Inkubation, liefern die Kulturen mit Medium (insgesamt Trägeraustausch) wie oben (Schritt 2.3.2) genannte jetzt haltendeng reduzierten Mengen Aprotinin, 250 Einheiten / ml (Tag 5).
    5. Um die proliferative Aktivität von mTEZ beurteilen, fügen EdU (6,7 & mgr; M / ml, das heißt 10 & mgr; / Vertiefung) zu OTCs für 4 Stunden vor der Beendigung der Kultur. Führen Sie die Färbung von OTC Kryo-Abschnitte, wie in der EdU Imaging Kit in Kombination mit Co-Färbung von Keratin 14 in zwei Abschnitte einer jeden Kultur Probe oder durch Strömungs beschrieben Bestimmen Sie die proliferative Indizes mTEZ, entweder durch Zählen der K14 + EdU + Zellen Durchflusszytometrie (EDU Durchflusszytometrie, Abschnitt 1.7, aber statt Ly51-FITC verwendet CDR1-PB 15 bei einer 1: 100 Verdünnung und 2.3.6.4).
    6. Nach 4-7 Tagen der Co-Kultur, kündigen die OTCs und Verfahren zur RNA-Isolierung, Kryo-Schnitte oder FACS-Analyse (Tag 8-11).
      1. Beenden der Kulturen mit einer Pinzette, Abtrennen der Gerüst / dermales Äquivalent vom Filter des Bohrlochs Einfügen.
      2. Für Kryo-Schnitte, betten die gesamte OTC in OCT-Verbindung und frieren in liquid Stickstoffdampf vor dem Kryo-Schnitte. Bereiten Sie 5-7 um dicke OTC Abschnitte mit einem Kryostaten und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Für Immuno-Histochemie von Kryo-geschnitten OTCs ein anti Keratin 14 (AF64, Verwendung einer 1: 1000 Verdünnung) und anti-Vimentin (GP53, die Verwendung einer 1: 100 Verdünnung) Antikörper. Führen Sie die indirekte Immunhistochemie Färbung mit entsprechenden Sekundärantikörper.
      3. Für die RNA-Isolierung, 1 ml Denaturierungslösung (enthält Phenol und Guanidiniumthiocyanat) in einer Schraubkappe eines 2 ml RNase frei Rohr. Schneiden Sie die gesamte OTC in Stücke mit einem Skalpell und fügen Sie in das Röhrchen mit Denaturierungslösung. Mechanisch zerkleinern das OTCs mit FastPrep Instrument zweimal für 30 Sekunden bei einer Geschwindigkeit von 6,0, legen Sie in zwischen auf Eis für 2 min (die Probe bei -80 ° C nach diesem Punkt gespeichert werden). Wenn bei -80 ° C eingefroren, aufgetaut auf Eis. Zentrifugieren der Rohre an 11,500-13,000 Upm 10 min bei 4 ° C. Den Überstand in ein frisches Röhrchen, Inkubation für 5 min bei RT und follow RNA Isolation Protokolle unter Verwendung von sauren Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion, wie vom Hersteller beschrieben.
      4. Für die FACS-Analyse, entfernen Sie das Gerüst und trennen Sie die Membran aus dem Fibrin / Fibroblasten / mTEC Gel. Feinschnitt das Gel mit einem Skalpell und verdauen in einem FACS-Röhrchen für ~ 20 min oder bis vollständig mit 2 ml Collagenase / Dispase bei 37 ° C in einem Wasserbad unter magnetischem Rühren verdaut. Rühren der Enzymlösung mit einer Pasteurpipette einmal alle 5 min. Nach der vollständigen Verdauung, filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 & mgr; m-Filter; Flecken auf der Einzelzellsuspension mit den Antikörpern, wie in 1.7 beschrieben, und mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Wir nahm eine 3D organotypischen Co-Kultur-Modell (3D OTC), die ursprünglich für die in-vitro-Langzeitkultur von Keratinozyten 9 entwickelt hatte. MACS-angereicherten mTEZ (siehe MACS Anreicherung Schema Abbildung 1) wurden auf ein Gerüst aus einer Fibrin-Gel und eingeschlossene Fibroblasten ausgesät. Die Fibroblasten stellen die wesentlichen extrazellulären Matrix (ECM), welche mTEZ in vitro. MTEZ wurden in OTCs für 4-14 Tage in Gegenwart von RANKL in Submerskulturen Gegensatz Keratinozyten, die Luft ausgesetzten imitiert ihre in vivo-Umgebung (siehe OTC-Set-up-Schema Abbildung 2) sind kultiviert.

Beide Teilmengen mTEC hier analysiert (dh CD80 lo und CD80 hallo mTEZ) überlebt während der gesamten Kulturdauer von bis zu 14 Tagen. MTEZ wurden von Keratin 14-Expression identifiziert und waren leicht von Vimentin-positive Fibroblasten (Abbildung 3B). Interessanterweise stieg unreifen und reifen mTEZ in verschiedene Muster in der Kultur. Die CD80 lo mTEZ typischerweise gebildet Doppelschichten (in engem Kontakt mit Fibroblasten), während CD80 hallo mTEZ eher kompakten Zellaggregate durch Fibroblasten begrenzt zu bilden. Diese Muster waren sehr gut reproduzierbar.

Gang MTEC Teilmengen nicht nur überlebt, sondern auch unter 3D OTC Bedingungen vermehrt wie von Edu Einbau (Abbildung 3c, 3d) bewertet. Interessanterweise proliferierte die CD80 lo mTEZ mit einer höheren Rate in Anwesenheit von RANKL, während das Umgekehrte für CD80 hallo mTEZ 10 betrug.

Zusätzlich CD80 lo mTEZ in CD80 hallo mTEZ in Anwesenheit von RANKL innerhalb von 4 Tagen Kultur unterschieden, da durch die starke Hochregulierung von CD80 gekennzeichnet. Die differenzierten mTEZ die Expression von Aire, FOXN1 (Gen und p erhalten auchrotein) sowie wahllos Ausdruck Aire-unabhängigen und -abhängigen TRAs 10.

Abbildung 1
Abbildung 1. MACS Anreicherung von TECs. Nach dem Filtrieren wurden mTEZ aus dem Thymus Einzelzellsuspension unter Verwendung von magnetischen Zellsortierung (MACS) angereichert. Zunächst wurden die hämatopoetischen Zelllinien unter Verwendung von anti-CD45 Microbeads verarmt. Die CD45 - Zellen wurden dann mit anti-CD80 PE Antikörper inkubiert, gefolgt von Anti-PE Microbeads. Das Eluat, das CD80 + -mature mTEZ direkt auf der OTCs kultiviert, während die Durchfluss enthaltenen CD80 - unreife mTEZ und andere Stromazellen. MTEZ wurden weiter unter Verwendung von anti-EpCAM-bio-Antikörper und Streptavidin-Mikroperlen angereichert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Schema für die schrittweise Einstellung des 3D-OTCs. Gerüstmatrix wurde in eine 12-Well-Filtereinsatz platziert. Die dermalen Fibroblasten aus explantierten Haut (270.000 Zellen / OTC Vertiefung) wurden in ein Fibringel (: 1 Verhältnis von Fibrinogen und Thrombin, die aus 1) beimpft. Diese dermalen Äquivalente wurden für 4-5 Tage mit DMEM + Nährstoffen aufrechterhalten, bis mTEZ (250.000 Zellen / OTC Vertiefung) wurden auf ausgesät und mit Medium mit unterschiedlichen Nährstoff (RFAD + Nährstoffe) angereichert kultiviert.

Figur 3
Abbildung 3. Wachstumsmuster und die Proliferation von mTEZ im OTCs. Das angereicherte CD80 lo mTEZ neigen als bi-Schicht in engem Kontakt mit den Fibroblasten (A), wachsen wh ereas die differenzierte CD80 hallo mTEZ wachsen als Zellaggregate oder engen Clustern (B). OTCs wurden am Tag 4 der Kultur mit anti-Keratin-14 (rot) und anti-Vimentin-Antikörper (grün) sowie eine Kernfärbung (Hoechst, blau) markiert. Die Proliferation von mTEZ zu bewerten, wurden die OTCs mit EdU gepulst (6,7 & mgr; M / ml, das heißt 10 & mgr; / Vertiefung) für 4 Stunden vor der Beendigung der Kultur. Die OTC Kryo-Schnitte wurden dann mit Anti-Keratin 14 (grün) angefärbt und EDU-Klicken-iT Reaktionsmischung (magenta) zusammen mit Kernfärbung (Hoechst, blau). Repräsentative Bilder zeigen wuchernden EdU + CD80 lo mTEZ (C) und EdU + CD80 hallo mTEZ (D) gezeigt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

"Cellspacing =" 0 "> Reaggregation Thymus Organkulturen (RTOC) Organotypischen Co-Kulturen (OTC) Nützliches System zur zellulären Interaktionen, die leicht überwacht und manipuliert mit einem weitgehend intakten Thymus 3D-Architektur werden zu studieren; entwickelt sich zu einer gut organisierten Struktur nach Transplantation. Nützliches System für die Entwicklung und Differenzierung von angereichertem / gereinigte Thymusepithelzellen in einer künstlichen 3D Geflecht durch menschliche Hautfibroblasten in einem Fibrin-Gerüst eingeschlossen erzeugt studieren. Für die Untersuchung der Entwicklung des Thymusepithelzellen und Thymozyten mit Inhibitoren oder Modifikatoren, die die Kapsel eindringen gut etabliert. Zugänglich Thymus Epithelienentwicklung manipulieren oder Thymocyten-Entwicklung in Co-Kultur mit TECs studieren. Da das Systemluft angehoben wird, wird die Porengröße der Membran (0,8 um) entscheidende Faktoren bei der Zuführung zu der RTOC: größere Moleküle können nicht durch die Membran und / oder Kapsel eindringen. Kultur wird in Medien, die Aufnahme von Stoffen / Faktoren erleichtert getaucht (mit Morpholino-Oligos erfolgreich getestet). Erwachsene und postnatale TECs oder Thymozyten können in fetalen RTOCs versetzt werden. Post-Natal TECs wachsen besser als erwachsene TECs; fetale TECs noch nicht getestet. Erfordern embryonalen E14-14.5 Thymi (optimal) zur Reaggregation und Integration des Mehr gewünschte Population zu ermöglichen; schwierig, den fetalen Thymus (Akzeptor) Zellzusammensetzung zu steuern; RTOCs erfordern Zellen entweder von fluoreszenzmarkierten oder kongenen Mäusen als Donor oder Akzeptor-Zellen. Möglich, einzelne Zellen / Klone zu studieren; nur "Verunreinigungen" sind Menschen erforderlich, um ECM, die TECs zu unterstützen Haut-Fibroblasten. Imaging limited, um Tiefe von Live-Zwei-Photonen-Mikroskopie Penetration; zugänglich FACS-Analyse oder Sortieren; Genexpressionsstudien erfordern FACS-Sortierung der gewünschten Zelltyp nach Kultur. Uneingeschränkt zugänglich Bildgebung; geeignet für die FACS-Analyse, Immunhistochemie und Genexpressionsstudien.

Tabelle 1. Vergleich zwischen zwei 3D-Thymus-Kultursystemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neben RTOCs, haben die 3D-OTCs weit überlegen in Bezug auf die TEC Differenzierung und PGE Wartung / Induktion (Tabelle 1) im Vergleich zu anderen (i) "vereinfachte 3D-Kulturen" mit Hilfe gewesen - Fibroblasten allein, ohne das Gerüst; (Ii) 2D-Systeme mit - Fibroblasten / Feeder-Zellen co-kultiviert mit TECs 10, (iii) 3T3-J2-Zellen bei TEC Klone zu entwickeln, aber pGE verloren geht, (iv) Matrigel oder (v) ECM-Komponenten (unveröffentlichte Daten). PGE wurde für bis zu 7 Tage in der 3D-OTCs gehalten, 4 Tage ist das optimale Zeitpunkt danach beginnt pGE zu sinken. Andere morphologische Eigenschaften TEC wurden für bis zu 14 Tage gehalten. Interessanterweise die OTCs unterstützte das Endstadium der mTEC Differenzierung von den gelegentlich gebildet Hassall artigen Strukturen 10 zu sehen.

Die für OTCs verwendet Thymi wurden von jungen postnatalen Mäusen, da sie eine höhere Neigung zu in Kultur überleben im Vergleich zu erwachsenen Thymi. TECs abgeleitet from embryonalen Thymi noch nicht in OTCs getestet. Mehr noch, nach der langen Verdauungszeit (nicht unter Verwendung von Trypsin durch Spaltung bestimmter Epitope) die Zellen erschienen mehr lebensfähig mit MACS anstatt FACS-Sortierung Zellen. Mit Hilfe eines zweistufigen positive Bereicherung Protokoll über MACS Säulen (anti-PE Perlen) der CD80 + mTEZ zusätzlich verbessert TEC Reinheit.

Für die OTC-Setup ist es wichtig, sicherzustellen, dass der Viskose, Vliesfasermaterial in scharfe, gut abgegrenzte Kreise ohne lose Fragmente Enden abgeschnitten oder gezackt, wie oben angegeben, dass genau in 12-Well-Kultureinsätze passen. Alternativ können Gerüste wie BEMCOT- Viskose Wischer M-3 (http://www.bemliese.com) ebenfalls verwendet werden. Die gut Größe für den OTC ist auch entscheidend und sollte überprüft werden, wenn andere als 6-Loch-und 12-Well-Formate Plattenformate verwendet werden.

Die Fibrin-Gel sollten darauf vorbereitet sein, dass die Fibrinogen und Thrombin-Komponenten nicht in contac komment miteinander, bevor sie auf dem OTC eingestellt, stellen Sie sicher, um die Pipettenspitze auszutauschen. Mischen Sie die beiden Komponenten gründlich in der Platte über das Gerüst, um eine glatte Oberfläche zu bilden. Immer in einem gut vorbereiten einen Test Gel neben ohne Gerüst, um eine ordnungsgemäße Gerinnselbildung zu prüfen und um eine gute Schätzung der Zeit für die Blutgerinnung erforderlich ist. Stellen Sie sicher, dass das Fibrin-Gel in der OTC vollständig, bevor die Versorgung der Kulturen mit Medien geronnen.

Bei Beendigung der Kulturen die gesetzten mTEZ kann leicht durch enzymatische Verdauung (Kollagenase / Dispase) des Fibrin-Gel, die zur Charakterisierung von kultivierten mTEZ zB verwendet werden können abgerufen werden, durch Durchflusszytometrie oder PCR

Die hierin beschriebenen 3D OTCs hat das Potenzial, einige Parameter TEC nämlich studieren oder zu manipulieren: 1) zu untersuchen und / oder zu manipulieren (via siRNA, Morpholino Oligos) Entwicklungswege und Funktionen der mTEZ; 2) um die Rolle des mTEZ in T-Zell-Entwicklung zu untersuchenment; 3) die Kultur CTEC; 4), um die Vorläufer Potenzial der Thymus-Stammzellen zu testen; 5), um die menschliche Kultur TECs und Stammzellen; 6) Einzel TEC klonale Assays durchzuführen. Die 3D-OTCs stellen eine aufwendige Kulturtechnik Emulation Teil der in vivo-Mikroumgebung Thymus. Es sollte betont werden, dass zusätzliche Assays TECs im aktuellen OTC Einrichtung angewendet werden müssen gründlich getestet und separat optimiert werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, keine finanzielle oder kommerzielle Interessenkonflikt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 mice  Charles River WIGA
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
CD45 Microbeads, mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Streptavidin Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) Ref. 12
CD80-PE antibody BD Pharmingen 553769
CD45-PerCP antibody BD Pharmingen 557235
Ly51-FITC antibody BD Pharmingen 553160
CDR1-Pacific Blue Ref. 15
Keratin 14 antibody Covance PRB-155P
Vimentin antibody Progen GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Molecular Probes (Invitrogen GmbH) A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Invitrogen C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit Invitrogen C10425
12-well filter inserts (thincerts) Greiner bio-one 657631
12-well plate Greiner 665180-01
Jettex 2005/45 ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
PBS Serva 47302.03
DMEM Lonza BE12-604F
DMEM/F12 Lonza BE12-719F
HEPES Gibco 15630-049 
FBS Gold GE Healthcare A11-151
Aprotinin (Trasylol) Bayer 4032037
Cholera toxin Biomol G117
Hydrocortisone Seromed (Biochrom) K3520
L-ascorbic acid Sigma A4034
TGF-ß1 Invitrogen PHG9214
RANKL R&D systems 462-TR-010
Thermolysin Sigma Aldrich  T-7902
OCT Compound TissueTek 4583
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) Invitrogen 10296028
FastPrep FP120 Thermo Scientific
Collagenase Type IV  CellSystems LS004189 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase) CellSystems LS002104 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I  Roche 11 284 932 001 25 µg/ml final conc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  2. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
  3. Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
  4. Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
  5. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  6. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  7. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. (2008).
  8. Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
  9. Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
  10. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  11. Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
  12. Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
  13. Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
  14. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
  15. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats