Medüller Timik epitel hücre proliferasyonu, farklılaşması ve Promiscuous Gen İfade Destekleme 3D Organotipik Co-kültür Modeli

1Division of Developmental Immunology, German Cancer Research Center (DKFZ), 2Genetics of Skin Carcinogenesis, German Cancer Research Center (DKFZ)
* These authors contributed equally
Published 7/30/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Pinto, S., Stark, H. J., Martin, I., Boukamp, P., Kyewski, B. 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression. J. Vis. Exp. (101), e52614, doi:10.3791/52614 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Intra-timik T hücre gelişimi, çeşitli stromal hücrelerin, yani olmayan T hücrelerden oluşan karmaşık bir üç boyutlu ağ örgüsü gerektirir. Sırayla, yani T hücre reseptör repertuarı oluşturma ve seçim ardından T hücre soyu taahhüt önce çevre içine ihracat, zorunlu kontrol noktaları geçerken timositleri son derece koordineli zamansal ve mekansal için bu iskelesi travers. Bu iskele oluşturan iki ana yerleşik hücre tipleri (cTECs) kortikal ve medüller timik epitel hücreleri (mTECs) bulunmaktadır. MTECs önemli bir özelliği, bir çok dokuya sınırlı bir antijenlerin olarak adlandırılan rasgele ifadesidir. Bu dokuya sınırlı antijenler, sırasıyla kendi kendine tolerans sonuçlanan mTECs ya timik dendritik hücreler tarafından doğrudan veya dolaylı olarak timositleri olgunlaşmamış sunulmaktadır.

CTECs ve mTECs gelişim yollarını ve fonksiyonlarını taklit in vitro uygun modeller şu anda lak vardırkral. Yeterli deneysel modellerin eksikliği, örneğin hala tam olarak hücresel ve moleküler düzeyde anlaşılmaktadır karışık gen ifadesinin, analiz engelliyordu. Biz ex vivo izole mTECs kültürüne 3D organotipik ko-kültür modeli uyarladı. Bu model, ilk olarak in vitro olarak, bir cilt eşdeğer üretmek üzere bir şekilde keratinosit yetiştirmek için geliştirilmiştir. , CD80 hi, Aire-pozitif mTECs, RANKL (ii) tepki ve FoxN1 (iii) sürekli ifadeye (i) çoğalması ve CD80 lo, Aire-negatif terminal farklılaşma: 3D model mtec biyoloji temel fonksiyonel özellikler korunmuş Aire ve CD80 hi mTECs doku kısıtlı genler.

Introduction

Geri kalan% 2 toplu timik stroma oluşturan çeşitli hücreler oluşur ise geliştirilmesi timositleri, timüs yaklaşık% 98 kadar olmak (yani, epitel hücreleri, dendritik hücreler, makrofajlar, B hücreleri, fibroblastlar, endotel hücreleri). Dış kortikal epitel hücreleri (cTECs) multipotent öncesi T hücreleri ve öz-MHC olumlu seçiminde kemik iliği, T hücre soyu indüksiyon yanlısı T hücrelerinin göçü temin olgunlaşmamış timositleri kısıtlı. İç medüller timik epitelyum hücreleri (mTECs) indükleyen negatif seçim ya da regülatör T hücre soyu içine sapma ya göre kendinden peptit / MHC kompleksleri için bir yüksek afiniteli TCR olan timositlerin tolerans indüksiyonu katılmaktadırlar. Merkezi tolerans indüksiyonu bağlamında, mTECs Böylece periferik öz yansıtma dokuya sınırlı bir kendi antijenlerine (TRA) çok geniş bir yelpaze ifade etmeleri açısından benzersizdir. Bu olay karışık gen ifadesi olarak adlandırılır (PGE)1,2.

Çeşitli kısa vadeli 2B kültür sistemleri değişmez ilk 2 gün içinde 3-6 MHC sınıf II, FoxN1 ve Aire gibi PGE kaybı ve anahtar düzenleyici moleküllerin sonuçlandı olarak bu büyüleyici hücre tipine En güncel çalışmalar, ex vivo izole hücrelerde güveniyor . Özellikle takımlar ve timus bozulmamış 3D ağda özellikleri 2B modellerinde eksik olan, ancak belirsiz kaldı. Yeniden birikme timik organ kültürü (RTOC) sağlam bir timik mikro-7, şu ana kadar, diğer yandan, sadece 3D, bir yandan, T hücresi gelişiminin çalışma sağlar sistemi ve stromal hücre biyolojisi, olmuştur. Bununla birlikte, RTOCs zaten fetal stromal hücrelerin bilgi girişini içerir ve 5-10 günlük bir maksimum kültür dönemi tahammül bir hücre kompleks bir karışımı içeren, örneğin, bazı sınırlamaları vardır.

in vitro kültür sistemlerinde indirgemeci eksikliği çalışma engellemiştirT hücre gelişimi ve timus organogenez çeşitli yönleri az değil moleküler PGE düzenlenmesi ve mTECs gelişimsel biyoloji ile ilişkisi.

Deri ve timus epitel hücrelerinin yapısal kuruluşun yakın ilişkililik sayesinde, in vitro keratinositlerin farklılaşması taklit ve böylece dermal eşdeğer oluşturmak için başlangıçta geliştirilmiş olan 3D organotipik kültürü (OTC) sistemi için seçti. OTC sistem keratinositler 8,9 numaralı seribaşı olan üzerine fibrin jel, içinde sıkışıp kalırlar dermal fibroblastlar ile kaplanmış inert iskele matriks oluşur. Burada, biz saflaştırılmış mTECs ile keratinositler yerini aldı. Bu modelin temel özellikleri korurken, biz belirli parametreleri optimize edilmiş.

MTECs çoğaldı kabul OTC modelinde, böylece yakından in vivo mTECs geliştirme taklit terminal farklılaşma yapıldı ve mtec kimlik ve PGE muhafaza

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışma Regierungspräsidium Karlsruhe etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Bütün hayvanlar, Almanya Kanser Araştırma Merkezi (DKFZ), spesifik patojenden serbest durumlar altında muhafaza edildi. Yaş 1 ila 7 gün arasında değişen tüm kültür deneyleri fare yavrular için kullanılmıştır.

Timustan mTECs 1. izolasyonu

Not: aşağıdaki gibi bazı modifikasyonlar ile, steril koşullar altında, daha önce tarif edildiği gibi 1, aşağıdaki sindirim adımları uygulandı.

  1. Fare yavrular başını kesmek ve timus çıkarın. RPMI 1640 ortamı (% 5 FCS ihtiva eden) ihtiva eden bir petri plakası buz üzerinde Thymi yerleştirin.
  2. ~ 5-30 ml RPMI ortamı ile bir yuvarlak tabanlı tüp içinde ince, küçük parçalar ve yerine Thymi kesin ve oda sıcaklığında 10 dakika süre ile bir mıknatıs kullanılarak karıştırılmıştır hafifçe.
  3. Bundan sonra, özellikle timositleri içeren süpernatant süzün ve collagena bir yuvarlak kalan doku sırayla sindirmek37 ° C'de 25 dakika her biri için kolajenaz / dispaz (0.2 mg / ml ile 1.2 U / ml nihai konsantrasyon), ardından 37 ° C'de her biri için (0.2 mg / ml ve son konsantrasyonu, dağılışı 57 U / ml), 15 dakika boyunca se tip IV, Thymi kadar manyetik karıştırma ile bir su banyosu içinde Cı tamamen sindirilir. Üç Thymi ikiye 1 ml enzim kullanın.
  4. Dokuya Pasteur pipeti ile bir kez her 7-10 dakikada bir çalkalayın. Kollajenaz / dispase fraksiyonları havuzu ve 70 mikron gazlı süzülür.
  5. Manyetik hücreye sıralama (MACS) tarafından mTECs zenginleştirin. Daha önce, 11 tarif edilen ve Şekil 1 'de gösterildiği gibi, ayırma, manyetik hücre tarafından mTECs arıtılmasını gerçekleştirin.
    NOT: anti-CD80-PE (16-10A1, 1 at kullanımı: 100 seyreltme) ve (1 at G8.8, kullanımı: 100 seyreltme), anti-EpCAM-bio 12 mTECs manyetik sıralama için aşağıdaki antikorları kullanılmıştır. MACS kullanarak Olgunlaşmamış ve olgun mTECs olarak tanımlandı: CD45 - EpCAM + CD80 - ve CD45 - CD80 + respectively.
  6. Aşağıdaki (Bölüm 2.3) açıklandığı gibi MACS saflaştırma (olgunlaşmamış mTECs saflığı = 83.1 ± 6.3% ve olgun mTECs = 79,23 ± 3.42%) ardından, organotipik kültürlerinin üzerine mTECs tohum.
  7. Alternatif olarak, CD45 MACS tükenmesi sonrasında (100 mikron memesi kullanarak) FACS sıralama mTECs aşağıdaki antikorlar kullanılarak: Anti-CD45-PerCP (30-F11, 1 at kullanımı: 100 seyreltme), anti-Ly51-FITC (6C3, 1 de kullanmak : 100 seyreltme), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, 1 ile kullanımı: 500 oranında seyreltilmiş) ile 1 anti-CD80-PE (16-10A1, kullanımı: 100 seyreltme). (Gün 4): propidium iyodür (5,000 1) kullanılarak ölü hücreleri hariç. Sırasıyla EpCAM + CD80 + - CD45 - - Ly51 - EpCAM + CD80 - ve PI - CD45 - Ly51 PI: FACS kullanarak Olgunlaşmamış ve olgun mTECs olarak tanımlandı.

2. 3D Organotipik Co-kültürler (OTC)

NOT: keratinocyt ve organotipik ekimi için 3D-dermal yapılarDaha önce tarif edildiği gibi 9,13 es hazırlandı. Tüm adımlar da hücreler, 2, 37 ° C de inkübe edildi ve% 5 bulundu. Şöyle mTECs kullanılarak OTC küçük değişiklikler ile hazırlandı.

  1. Insanlara özgü fibroblastlar hazırlanması
    Not: daha önce tarif edildiği gibi, 9, insan dermal fibroblastları de-epidermised dermişin eksplant kültürleri elde edildi.
    1. Kısaca, insan cildi (~ 5 cm uzunluğunda) şeritler kesildi ve termolisin, 4 ° C'de, O / N (10 mM Hepes, pH 7.4 ile birlikte tuzlu su içinde 0.5 mg / ml) ile tedavi.
    2. Bundan sonra, forseps kullanarak dermis epidermis ayırın.
    3. İnce 10 cm'lik petri plakasında küçük parçalar yerine dermis kesilir ve steril bir hava akımı altında 1-2 saat boyunca kurumaya bırakılır. DMEM% 20 FBS içeren düzenli eksplantlar tamamlayın.
    4. Out büyüyen fibroblastlar bölmek zaman konfluent eksplantlar ileri con plakaya uymak devam emin% 0.1 tripsin kullanarak (genellikle yaklaşık 3 hafta)akıbet ardışık mermi.
    5. Kadar DMEM 3 kat% 10 FBS aynı eksplantlardan fibroblastlar genişletin ve onları 14 cryo-korumaktadır. Her bir deney serisi için fibroblastlar aynı toplu kullanın.
      NOT: fibroblastlar dermal eşdeğeri set-up için ışımaya değildi.
  2. İskele hazırlanması
    1. Tam 12 iyi filtre ekler uyması için keskin bir 11 mm çaplı metal zımba kullanarak iyi sınırlı, çevrelerin içine 0.4-0.6 mm kalınlığında viskon, dokunmamış lifli malzeme (excel sayfasını destekleyen ürün detay) kesin. Sonra bir iskele olarak 12- kuyu filtre elemanı (polyester kılcal gözenek membran 3 mikron gözenek boyutu) içine yerleştirin. Steril 12 oyuklu plaka içine komple filtre setup yerleştirin.
    2. Fibrinojen ve trombin bir kombinasyonundan oluşan cerrahi bir fibrin yapışkan, fibrin jel kiti kullanılarak hazırlanır. Fibrinogen- olarak 8 mg / ml ve 10 kit trombin bileşeni önceden seyreltinsırasıyla birim / ml. Aşağıdaki gibi, bir 12-kuyucuklu plaka tek bir oyuk için devam edin.
      1. Ca2 + ve Mg + 2, pH 7.0, 100 ul olmayan fibrinojen 100 ul fosfat tamponlu tuz (PBS) ile (8 mg / ml) ile seyreltilir. 270.000 fibroblastlar içeren 100 ul FCS ile 100 ul trombin (10 birim / ml) ile seyreltilir.
      2. 2 mg / ml ve 2.5 ünite / ml trombin fibrinojen bir nihai konsantrasyonu ile sonuçlanan, (1 karışımı 1) 200 ul fibrinojen ekleme fibroblastlar iskele üzerine hücre-karışımı ihtiva eden trombin 200 ul için koyun. İyice karıştırın ve yumuşak pipetleme (Gün 1) ile iskele bütün alana eşit dağıtın.
        NOT: 37 ° C'de 30 dakika sonra fibroblastlar kuşatan bir pıhtı, tamamen iskele iç boşlukları dolduran ve düzgün bir üst yüzey oluşturan, meydana gelmiş olacaktır.
  3. MTECs ile ortak kültür
    1. Ön kültür için organ kültürleri daldırılmasıBir değiştirilen ortam içinde% 10 FBS, 50 ug / ml L-askorbik asit ve 1 ng / ml TGF-β1 ile DMEM, 4-5 gün süre ile her gün.
    2. Mtec tohumlama gününde, rFAD medyumla yerine (1: 1 DMEM + DMEM / F12),% 10 FBS ile, 10 -10 M kolera toksini, 0.4 mg / ml hidrokortizon, 50 ug / ml L-askorbik asit, RANK bağı nedenle fibroblastlar tarafından salgılanan serin proteaz ile erken fibrinolizi önlenmesi (0.1 ug / ml) ve 500 birim / ml Aprotinin,.
    3. 7-8 saat sonra, 250,000 mTECs tohumlayarak ko-kültürler-ayarlamak (tam mTECs, ya CD80 LO ve CD80 yüksek alt-gruplar), fibroblast iskele üst oyuk başına 100 ul'lik bir hacim içinde. Bir Neubauer odası (gün 4) kullanarak hücreleri sayın.
      NOT: timüs 3D organotipik kültürler hava kaldırdı olan cilt OTC aksine medyada submersed tüm zamanlarda.
    4. 24 saat inkübasyondan sonra, şimdi containi (adım 2.3.2) yukarıda belirtildiği gibi orta kültürleri (toplam orta değişimi) kaynağıng Aprotininin miktarlarda 250 ünite / ml (Gün 5) azalır.
    5. MTECs proliferatif aktivitesini değerlendirmek için, kültürler tahliye edilmeden önce 4 saat OTC (yani 6.7 uM / ml, / de 10 uM) edu ekleyin. Her kültürün numunesinin veya akışla iki bölüm halinde ya sayma K14 + Edu + hücreler tarafından, mTECs çoğalma endeksleri belirleyin keratin 14. co-boyanması ile birlikte Edu Görüntüleme Kit açıklandığı gibi OTC cryo bölümlerin boyama yapın sitometri (EDU akış sitometri, Bölüm 1.7 yerine Ly51-FITC bir 1'deki CDR1-PB 15 kullanın: 100 seyreltme ve 2.3.6.4).
    6. Ko-kültür 4-7 gün sonra, RNA izolasyonu, cryo-kesit veya FACS analizi (Gün 8-11) için OTC'leri ve işlemi sonlandırmak.
      1. Bir forseps kullanarak kuyu ucun filtreden iskele / dermal eşdeğer ayıran kültürleri sonlandırın.
      2. Cryo-kesit için, Ekim bileşik bütün OTC embed ve li dondurmacryo-kesit önce sterlin azot buharı. Kullanılana kadar -20 ° C 'de, bir kriyostat ve mağaza kullanılarak 5-7 mikron kalınlığında OTC bölümleri hazırlayın. Antikorlar: (100 seyreltme oranı: 1 de GP53, kullanım), ve anti-vimentin: cryo-kesitsel OTC immüno-histokimya için, anti-keratin 14 (1000 seyreltme AF64, kullanım 1 de) kullanın. İlgili ikincil antikorlar kullanılarak dolaylı immüno histokimya boyama gerçekleştirin.
      3. RNA izolasyonu için çözelti, 2 ml RNazsız tüpün vidalı kapak olarak (fenol ve guanidinyum tiyosiyanat ihtiva eden) Denatüre edici 1 ml. Bir neşter ile parçalar halinde tüm OTC kesin ve denatüre çözeltisi içeren tüp içine ekleyin. Mekanik bir 6.0 hızda 30 saniye boyunca iki kez FastPrep aleti ile OTC'leri parçalamak, 2 dakika boyunca (örnek, bu noktadan sonra -80 ° C'de muhafaza edilebilir) boyunca buz üzerinde arasında yerleştirin. -80 ° C'de donduruldu durumunda, buz üzerinde eritin. 4 ° C'de 10 dakika süreyle 11,500-13,000 rpm tüpler santrifüjleyin. Bir tüpe süpernatantı aktarın RT ve f de 5 dakika boyunca inkübeüretici tarafından tarif edildiği gibi asit guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanılarak ollow RNA izolasyonu protokolleri.
      4. FACS analizi için, iskele kaldırmak ve fibrin / fibroblast / mtec jelden membran ayırın. İnce bir neşter ile jel kesilmiş ve ~ bir FACS tüpü içinde 20 dakika o sindirimi ya da tamamen manyetik karıştırma ile bir su banyosu içinde 37 ° C 'de kolajenaz / dispaz, 2 ml ile sindirilmiş kadar. Bir kez, bir Pasteur pipeti her 5 dakikada enzim çözeltisi çalkalayın. Tam bir sindirimden sonra, 70 um filtre üzerinden bir hücre süspansiyonu filtre; 1,7 anlatılan ve akış sitometrisi ile analiz edildiği üzere antikorlar kullanılarak tek bir hücre süspansiyonu leke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz aslında keratinositlerde 9 in vitro uzun vadeli kültürü için geliştirilmiş olan 3D organotipik ko-kültür modeli (3D OTC) kabul etti. MACS zenginleştirilmiş mTECs (MACS zenginleştirme şeması Şekil 1 e bakınız), bir fibrin jel ve tutulu fibroblastlar içeren bir yapı iskelesi üzerine ekilmiştir. fibroblastlar in vitro mTECs destekleyen temel hücre dışı matriks (ECM) sağlarlar. MTECs hava maruz kalan in vivo ortamı (OTC set-up şeması Şekil 2) taklit olan keratinositler aksine batık kültürler içinde RANKL'ın varlığında 4-14 gün OTC olarak yetiştirildi.

Burada analiz Hem mtec altkümelerini (yani, CD80 lo ve CD80 hi mTECs) 14 güne kadar tüm kültür döneminde kurtuldu. MTECs keratin 14 ifadesi ile tanımlanır ve vimentin pozitif fibroblastlar kolayca ayırt edildi (Şekil 3B). İlginçtir, olgunlaşmamış ve olgun mTECs kültürde farklı şekillerde büyüdü. CD80 hi mTECs fibroblastlar tarafından ayrılmış, kompakt hücre birikmeleri oluşturulması eğiliminde iken, CD80 lo mTECs tipik haliyle, (fibroblastlar ile yakın bir temas halinde) iki katmanları oluşturulur. Bu modeller oldukça tekrarlanabilir idi.

Mtec alt kümeler kurtuldu ama edu dahil (Şekil 3C, 3D) ile değerlendirilen de 3D ​​OTC koşullarında çoğaldı değil. Ters CD80 hi mTECs 10 için de geçerlidir iken İlginç bir şekilde, CD80 lo mTECs RANKL mevcudiyetinde daha yüksek bir oranda çoğalmıştır.

CD80 güçlü bir yukarı-regülasyonu ile belirtilen Buna ek olarak, CD80 lo mTECs, kültür 4 gün içinde RANKL varlığında CD80 hi mTECs ayrışmıştır. farklılaşmış mTECs da Aire, FoxN1 (gen ve P 'nin ifadesi korunurrotein) ve promiscuously Aire-bağımsız ve bağımlı TRA 10 olarak ifade edilmiştir.

Figür 1
TECS Şekil 1. MACS zenginleştirme. Filtrelemeden sonra, mTECs manyetik hücre sıralama (MAC) kullanılarak timus tek bir hücre süspansiyonu zenginleştirildi. İlk olarak, hematopoetik hücre soyları, anti-CD45 mikroboncukları kullanılarak tükenmiş bulundu. CD45 - Hücreler daha sonra bir anti-PE mikro ardından, anti-CD80 PE antikoru ile inkübe edilmiştir. Olgunlaşmamış mTECs ve diğer stromal hücreler - akış CD80 içerdiği ise CD80 + -mature mTECs içeren elüat, OTC doğrudan kültüre oldu. MTECs ayrıca anti-EpCAM-bio antikor ve streptavidin mikroboncukları kullanılarak zenginleştirildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
3D OTC adım adım kurulum için 2. Düzeni rakam. Bir skafold matris 12-çukurlu bir filtre içine doğru yerleştirilmiştir. eksplante deriden dermal fibroblastları (270,000 hücre / OTC oyuk) (: fibrinojen ve trombin 1 oranında 1 oluşan) Bir fibrin jel içerisine aşılanmıştır. Bu dermal eşlenik (250,000 hücre / OTC oyuk) üzerine ekildi ve farklı besin (rFAD + besinler) ile zenginleştirilmiş ortamında kültive edilmiştir mTECs kadar, DMEM + besin 4-5 gün boyunca devam edildi.

Şekil 3,
Şekil 3. Büyüme modelleri ve OTC içinde mTECs çoğalması. zenginleştirilmiş CD80 lo mTECs fibroblastlar (A) ile yakın temas içinde bir çift-tabaka olarak büyürler WH ereas farklılaştırılmış CD80 hi mTECs hücre agrega veya dar kümeleri (B) olarak büyür. OTC'ler anti-keratin 14 (kırmızı) ve nükleer boyanma ile birlikte anti-vimentin antikorları (yeşil) (Hoechst, mavi) ile kültürün günde 4 etiketli. MTECs proliferasyonunu değerlendirmek için, OTC edu ile pulse edilmiştir (yani, 6.7 uM / ml, 10 uM / oyuk) önceden kültürler sona 4 saat karıştırıldı. OTC cryo kesitler daha sonra anti-keratin, 14 (yeşil) ile boyandı ve Edu-Click-iT Reaksiyon karışımı (kırmızı) nükleer boyanma (Hoechst, mavi) ile birlikte bulundu. Temsilcisi görüntüleri gösterilir Edu + CD80 lo mTECs (C) ve Edu + CD80 hi mTECs (D) çoğalan resmeden. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

"Cellspacing =" 0 "> Reaggregation timik organ kültürleri (RTOC) Organotipik ko-kültürler (OTC) Kolayca izlenebilir ve bir ölçüde bozulmamış 3D timik mimari kullanılarak manipüle edilebilir hücresel etkileşimleri çalışmak için Faydalı sistemi; aşılama üzerine düzgün organize bir yapı içine geliştirir. Yararlı sistemi bir fibrin iskele yakalanmış insan deri fibroblastları tarafından üretilen bir suni 3D ağda zenginleştirilmiş / saflaştırılan timik epitelial hücrelerin gelişimini ve farklılaşmasını çalışma. İyi timik epitelial hücreler ve kapsül nüfuz inhibitörleri veya değiştiriciler kullanılarak timositlerin gelişme çalışma için kurulmuştur. Müsait timus epitel gelişimini işlemek için ya TECS ile ko-kültür timosit gelişimini incelemek için. Sistemin bu yanaRTOC için faktörler tedarik ederken hava kaldırıldığında, zarın gözenek boyutu (0.8 um) çok önemlidir: büyük moleküller membran ve / veya kapsül yoluyla nüfuz edebilir. Kültür (başarıyla morfolino oligos kullanılarak test) maddeler / faktörlerin alımını kolaylaştıran medyada, içinde batık. Yetişkin ve doğum sonrası Tecs veya timositleri fetal RTOCs içine çivili edilebilir. Doğum sonrası Tecs yetişkin Tecs daha büyür; Fetal TECS henüz test edilmemiştir. Reaggregation ve katma istenen nüfusun entegrasyonu sağlamak için embriyonik E14-14.5 Thymi (optimum) gerektir; Fetal timik (alıcı) hücre bileşimini kontrol etmek zordur; RTOCs verici ya da alıcı hücreler olarak ya da floresan etiketli ya konjenik farelerin hücreleri gerektirir. Tek hücre / klonlar incelemek için mümkün; Sadece "kirleticiler" TECS desteklemek için ECM sağlamak için gerekli insan cildi fibroblastlar bulunmaktadır. Görüntüleme limited canlı iki foton mikroskopi derinliğini penetrasyon; FACS analizi veya sıralama mükellef; gen ekspresyon çalışmaları kültürden sonra arzu edilen hücre tipi FACS gerektirir. Görüntüleme tamamen erişilebilir; FACS analizi, immüno-histokimya ve gen ekspresyon çalışmaları için uygundur.

Tablo iki 3D timik kültür sistemleri arasında 1. karşılaştırılması.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RTOCs yanı sıra, 3D OTC TEC farklılaşma ve PGE bakım / indüksiyon diğer (i) ile karşılaştırıldığında (Tablo 1) 'basitleştirilmiş 3D kültürlerin' kullanımı açısından çok daha üstün tarafından olmuştur - fibroblastlar yalnız iskele olmaksızın; (Ii) 2 D sistemleri kullanan -, (iii) 3T3-J2 hücreleri TEC klonlar geliştirmek olup, burada, TECS 10 ile birlikte kültürlenmiş fibroblast / besleyici hücreleri ama PGE kaybolur (iv) Matrigel veya (v) ECM bileşenleri (yayınlanmamış veriler). PGE 3D OTC en fazla 7 gün muhafaza edilmiştir, bundan sonra en uygun zaman noktası olarak 4 gün, PGE azalmaya başlar. Diğer morfolojik TEC özellikleri kadar 14 gün için muhafaza edilmiştir. Şaşırtıcı, OTC bazen oluşan Hassall benzeri yapılar 10 tarafından görülen mtec farklılaşma son aşamasına destekledi.

yetişkin Thymi göre kültüründe hayatta kalmak için daha yüksek bir eğilimi olduğu gibi OTC için kullanılan Thymi genç doğum sonrası farelerden elde edilmiştir. TECS fro türetilmişHenüz OTCs test edilmemiştir Thymi m embriyonik. Daha çok, uzun sindirim dönemi (nedeniyle bazı epitopların bölünmeye karşı tripsin kullanarak değil) sonra hücreler MACS ziyade FACS sıralama hücreleri kullanarak daha uygun göründü. CD80 + mTECs ayrıca gelişmiş TEC saflıkta MACS sütunları (anti-PE boncuk) bir iki adım pozitif zenginleştirme protokolü kullanarak.

OTC kurulum için tam olarak 12 iyi kültür ekler içine sığacak yukarıda belirtildiği gibi viskon, dokunmamış elyaflı malzeme biter gevşek parçaları olmadan keskin, iyi sınırlı, daireler halinde kesilir veya tırtıklı olduğundan emin olmak için gereklidir. Seçenek olarak ise, bu BEMCOT- viskoz silecek M-3 (http://www.bemliese.com) halinde iskeleleri de kullanılabilir. OTC de boyutu da önemlidir ve 6 oyuklu ve 12 oyuklu biçimleri dışında levha biçimleri kullanılacak ise, test edilmelidir.

Fibrin jel fibrinojen ve trombin bileşenleri temas bilgilerini girer olmayan şekilde hazırlanmalıdırOTC üzerine set önce birbirleri ile t pipet alışverişi emin olun. Düzgün bir üst yüzeye oluşturulması için yapı iskelesi uzerine plaka iyice iki bileşeni karıştırın. Daima iskele düzgün pıhtı oluşumu için kontrol etmek ve pıhtılaşma için gerekli olan zaman iyi bir tahmin var olmayan bir kuyuda yanında bir test jel hazırlamak. OTC fibrin jel tamamen medya ile kültürleri vermeden önce pıhtılaşmış emin olun.

Akış ile tohumlanmış mTECs kolayca örneğin kültürlenen mTECs karakterizasyonu için kullanılabilir fibrin jel, enzimatik sindirimi (kolajenaz / dispaz) tarafından alınabilir kültürleri sitometrisi ya da PCR sona erdirilmesi üzerine.

Burada tarif edilen 3D OTC'ler çalışma veya işlemek birkaç TEC parametrelerini yani potansiyeline sahiptir: 1) siRNA, morfolino oligolar) mTECs gelişimsel yollar ve işlevleri yoluyla (çalışma ve / veya işlemek için; 2) geliştirilmesi T hücresinde mTECs rolünü incelemek içinment; 3) Kültür cTECs için; 4) timik kökenli kök hücre progenitör potansiyelini test etmek; 5) kültür, insan Tecs ve kök hücreler; 6) Tek TEC klonal deneyleri gerçekleştirmek için. 3D OTC'ler in vivo timus mikroçevresinin kısmını taklit ayrıntılı bir kültür tekniği temsil etmektedir. Mevcut OTC kurulumunda Tecs uygulanan herhangi bir ilave tahliller iyice test ve ayrı ayrı optimize edilmesi gerekir vurgulanmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir çıkar mali veya ticari çatışması beyan ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 mice  Charles River WIGA
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
CD45 Microbeads, mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Streptavidin Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) Ref. 12
CD80-PE antibody BD Pharmingen 553769
CD45-PerCP antibody BD Pharmingen 557235
Ly51-FITC antibody BD Pharmingen 553160
CDR1-Pacific Blue Ref. 15
Keratin 14 antibody Covance PRB-155P
Vimentin antibody Progen GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Molecular Probes (Invitrogen GmbH) A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Invitrogen C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit Invitrogen C10425
12-well filter inserts (thincerts) Greiner bio-one 657631
12-well plate Greiner 665180-01
Jettex 2005/45 ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
PBS Serva 47302.03
DMEM Lonza BE12-604F
DMEM/F12 Lonza BE12-719F
HEPES Gibco 15630-049 
FBS Gold GE Healthcare A11-151
Aprotinin (Trasylol) Bayer 4032037
Cholera toxin Biomol G117
Hydrocortisone Seromed (Biochrom) K3520
L-ascorbic acid Sigma A4034
TGF-ß1 Invitrogen PHG9214
RANKL R&D systems 462-TR-010
Thermolysin Sigma Aldrich  T-7902
OCT Compound TissueTek 4583
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) Invitrogen 10296028
FastPrep FP120 Thermo Scientific
Collagenase Type IV  CellSystems LS004189 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase) CellSystems LS002104 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I  Roche 11 284 932 001 25 µg/ml final conc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  2. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
  3. Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
  4. Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
  5. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  6. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  7. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. (2008).
  8. Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
  9. Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
  10. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  11. Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
  12. Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
  13. Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
  14. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
  15. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats