Cathétérisme cardiaque chez la souris pour mesurer le volume de pression Relation: Étudier les effets Bowditch

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Zhang, B., Davis, J. P., Ziolo, M. T. Cardiac Catheterization in Mice to Measure the Pressure Volume Relationship: Investigating the Bowditch Effect. J. Vis. Exp. (100), e52618, doi:10.3791/52618 (2015).

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Abstract

Les modèles animaux qui imitent les troubles cardiaques humains ont été créés pour tester des stratégies thérapeutiques potentielles. Un élément clé de l'évaluation de ces stratégies consiste à examiner leurs effets sur la fonction cardiaque. Il existe plusieurs techniques pour mesurer en mécanique in vivo cardiaque (par exemple, l'échocardiographie, les relations pression / volume, etc.). Par rapport à l'échocardiographie, ventriculaire en temps réel à gauche (LV) pression / analyse du volume via le cathétérisme est plus précise et perspicace dans l'évaluation de la fonction ventriculaire gauche. En outre, l'analyse LV volume / pression fournit la capacité d'enregistrer instantanément des changements lors des manipulations de la contractilité (par exemple, de stimulation, de β-adrénergique) et les insultes pathologiques (par exemple, l'ischémie / reperfusion). En plus du maximum (+ dP / dt) et minimale (-dP / dt) taux de variation de pression dans le LV, une évaluation précise de la fonction ventriculaire gauche via plusieurs indices indépendants de la charge (par exemple, la pression systolique de finrelation de volume et de la précontrainte recrutable travail systolique) peuvent être atteints. La fréquence cardiaque a un effet significatif sur la contractilité VG tels qu'une augmentation de la fréquence cardiaque est le principal mécanisme pour augmenter le débit cardiaque (par exemple, l'effet Bowditch). Ainsi, lorsque l'on compare les paramètres hémodynamiques entre les groupes expérimentaux, il est nécessaire d'avoir la fréquence cardiaque de façon semblable. En outre, une caractéristique de nombreux modèles cardiomyopathie est une diminution de la réserve contractile (ie, diminution de l'effet Bowditch). Par conséquent, des informations vitales peuvent être obtenues en déterminant les effets de l'augmentation de la fréquence cardiaque sur la contractilité. Nos et d'autres données ont démontré que la synthase neuronale de l'oxyde nitrique (NOS1) souris knock-out a diminué la contractilité. Ici, nous décrivons la procédure de mesure de la pression LV / volume avec augmentation de la fréquence cardiaque en utilisant le modèle de souris knock-out NOS1.

Introduction

Le but du cœur est de pomper le sang dans tout le corps afin de répondre aux besoins métaboliques de l'organisme. Depuis ces demandes fluctuent constamment (par exemple, au cours de l'exercice), le cœur doit s'adapter (à savoir, augmenter le débit cardiaque). Le cœur a conçu de nombreuses voies pour accomplir cet exploit. La manière amorcer le coeur atteint ce fait par une augmentation de la fréquence cardiaque (par exemple, l'effet Bowditch) 1. Autrement dit, comme une augmentation de la fréquence cardiaque, il en résulte une augmentation de la contractilité et de l'augmentation du débit cardiaque. Ainsi, la fonction cardiaque est extrêmement dépendant de la fréquence cardiaque. Malheureusement, la maladie cardiaque (par exemple, infarctus du myocarde, l'hypertrophie, etc.) les résultats de la fonction cardiaque pauvre dans laquelle le cœur par conséquent ne sera pas en mesure de répondre aux exigences métaboliques de l'organisme. La maladie cardiaque est la principale cause de morbidité et de mortalité dans la société occidentale. Les modèles animaux qui récapitulent beaucoup cardiomy humainopathies sont utilisés pour étudier les mécanismes moléculaires et de tester des thérapies potentielles. Pour discerner ces mécanismes et de déterminer si une thérapie peut être viable, les enquêteurs doivent évaluer la fonction cardiaque in vivo.

Il ya plusieurs manières d'évaluer la fonction cardiaque in vivo (par exemple, l'échocardiographie, IRM, etc.), qui mesurent régulièrement la fraction d'éjection, la fraction de raccourcissement, le débit cardiaque, etc. Cependant, ces paramètres sont extrêmement dépendantes postcharge, précharge, et le rythme cardiaque en plus de la contractilité 2. Contractilité mesure est indispensable pour comprendre les propriétés intrinsèques du cœur dans son environnement natif. Le maximum (dP / dt max) taux de développement de pression nous amène un pas de plus vers la compréhension de la contractilité. Malheureusement, dP / dt dépend aussi de la fréquence cardiaque et de chargement conditions 3. Par conséquent techniques ont été développées pour mesurer la charge (et le rythme cardiaque, voir beloe) indices indépendants de la contractilité du myocarde (c.-à-télésystolique relation pression-volume (ESPVR) et de la précharge recrutable travail systolique (PRSW)) 4-6. ESPVR décrit la pression maximale qui peut être développée par le ventricule à tout volume LV donné. La pente de ESPVR représente l'élastance télésystolique (SEE). PRSW est la régression linéaire de travail de course (zone délimitée par la boucle PV) avec le volume en fin de diastole. Ces procédures sont une mesure plus exacte et précise de la contractilité par rapport à des paramètres hémodynamiques tels que la fraction d'éjection, le débit cardiaque et le volume systolique. ESPVR PRSW et peuvent être obtenus par le blocage temporaire de la veine cave inférieure (VCI). Le blocage de l'IVC peut être réalisée avec un coffre fermé pour éviter l'effet de changement de la pression intrapleurale sur la fonction cardiaque.

L'augmentation de la fréquence cardiaque augmente également contraction et la relaxation 1. Ainsi, lorsque l'on compare la fonction cardiaque entre experimental groupes (par exemple, ± dP / dt), la fréquence cardiaque doivent être similaires. Toutefois, les taux cardiaques similaires habituellement ne se produisent pas dans chaque animal en raison de diverses conditions (maladie, l'intervention de la recherche, etc.). Il convient de noter que l'anesthésie (injectable et inhalé) abaisse la fréquence cardiaque. Comme la fréquence cardiaque est un déterminant majeur de la contractilité, l'anesthésie sera considérablement affecter la contractilité. Pour cette raison, nous décrivons notre procédure. En outre, une caractéristique de beaucoup de cardiomyopathies est une réserve contractile diminué (ie, un effet Bowditch diminué). Par conséquent, la fonction cardiaque doit être mesurée sur une plage de fréquences cardiaques. Nous décrivons ici comment utiliser un stimulateur (avec un coffre fermé) pour obtenir ces effets.

En plus de la fréquence cardiaque, l'oxyde nitrique (NO) est également un modulateur important de la contractilité 7. Le NO est produit par des enzymes appelées NO synthase (NOS). Nous et d'autres avons montré que des souris avec des huitièmes de finale de la NOS neuronale (NOS1 et in vivo l'hémodynamique cardiaque 8,9. Cette souris est utilisé pour démontrer la mesure de la contractilité du ventricule gauche via la procédure d'analyse de pression LV / Volume effectuée à différents rythmes cardiaques.

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Protocol

NOTE: Ce protocole d'animal a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Ohio State University. Cette procédure peut être utilisée sur n'importe quel souris dans laquelle le diamètre interne de l'artère carotide est assez grand pour insérer le cathéter. Utilisez la souris qui sont au-dessus de 16 g (~ que 2 mois plus âgés).

1. Préparation de la souris pour cathétérisme

  1. Sceller tous les instruments et les fournitures chirurgicales dans un sachet de stérilisation. Stériliser le sachet dans une machine d'autoclave. Maintenir un champ stérile tout au long de la procédure et de porter des gants stériles.
  2. Anesthésier les souris avec de la kétamine (55 mg / kg) plus xylazine (15 mg / kg) par injection intraperitoneale.
    NOTE: L'ensemble de la procédure mesurer à la fois la pression / volume à différentes fréquences cardiaques et ESPRV prend moins de 20 min. Si un délai supplémentaire est nécessaire (par exemple, plus de 30 min), ¼ donner une dose supplémentaire de l'anesthésie toutes les 30 min.
  3. Retirer les cheveux dans la r antérieureégion du cou et de la poitrine à l'aide cheveux lotion démaquillante (par exemple, Nair) et du ruban adhésif les membres de la souris sur la plate-forme de mousse. Confirmer un état d'anesthésie profonde par un pincement de l'orteil.
  4. Insérez une sonde rectale pour surveiller la température du corps (37 ± 1 ° C), et de maintenir l'aide d'un coussin chauffant thermo-régulée (située entre le champ opératoire et de plate-forme).
  5. Préparer une longueur de 4-0 suture (~ 10 cm). Boucle de suture autour des incisives supérieures et la bande à plate-forme. Cela permet de garder le cou droit.
  6. Stériliser la zone chirurgicale en tamponnant la zone avec de la Bétadine et 75% d'alcool trois fois.

2. cathétérisme

  1. Préparer le cathéter par trempage préalable la pointe dans une solution saline ou de l'eau distillée (37 ° C) pendant au moins 30 minutes avant de l'utiliser (selon les instructions du fabricant) pour acclimater la membrane du capteur de pression pour l'environnement biologique humide et pour éviter la dérive du signal de pression et négatif des enregistrements de pression.
  2. Faire un longitudinale de 0,8 cm incision entre la mâchoire inférieure et le sternum dans la région antérieure du cou. Avec les beaux ciseaux, séparer le tissu conjonctif de la peau musculaire pour exposer la trachée situé sous le muscle stemohyoideus.
  3. Séparer la graisse et le tissu musculaire sur le côté droit de la trachée avec des pinces courbes pour exposer l'artère carotide droite.
    NOTE: L'artère carotide est la plus grande artère de la région antérieure du cou, contient du sang rouge vif, et est pulsatile. Ne pas confondre avec la veine jugulaire qui est parallèle à l'artère carotide. La veine jugulaire est rouge et non pulsatile sombre. En outre, lors de l'isolement de l'artère carotide, l'utilisateur doit être conscient de ne pas endommager le nerf pneumogastrique.
  4. Retirez la graisse de l'artère carotide droite avec la pince courbes. Si il existe de ramification du navire qui sera opérationnel empêcher cette technique, les couper avec un cautère Bovie pour dissocier l'artère carotide.Séparer autant que possible les tissus sous l'artère carotide en utilisant une pince incurvés.
  5. Coupez deux 5 cm 6-0 fils de soie. Passer chaque fil de soie sous l'artère carotide droite.
  6. Placez un fil près de la partie proximale et l'autre près de la partie distale de l'artère. Faites un noeud serré sur le fil à la partie distale, et faire un noeud lâche sur le fil à la partie proximale.
  7. Bloquer le flux sanguin par le serrage de la partie proximale de l'artère à l'aide d'une pince vasculaire petite hémostatique (placer la pince ci-dessous le fil proximale). La région étanche de l'artère sera rempli de sang le rendant facile à effectuer l'étape 2.8.
  8. Percer un petit trou dans l'artère carotide droite entre les deux fils (mais plus proche de filet distal) avec une aiguille 26 G. Insérer le cathéter dans l'artère carotide. Légèrement serrer le noeud lâche à la partie proximale de l'artère carotide sur le cathéter pour maintenir en place.
    REMARQUE: Utilisation de la ponction à l'aiguille est préférable comparéeà ciseaux incision. En effectuant un noeud serré dans la partie distale de l'artère en premier, puis le serrage de la partie proximale, l'artère sera entièrement remplie de sang. Il est donc très facile de pointer à travers le vaisseau sanguin. En outre, la taille de l'aiguille (26 G) perfore l'artère avec un trou qui correspond bien à la taille du cathéter. Lorsqu'on utilise la méthode de ciseaux incision, il est plus difficile de contrôler la taille de l'incision. Cependant, la méthode choisie devrait être dépend sur lequel on le chirurgien se sent plus à l'aise avec.
  9. Commencer l'enregistrement des signaux de pression comme dans l'étape 3.
  10. Desserrer la pince hémostatique et continuer vers l'avant l'insertion du cathéter dans le ventricule gauche. Si une certaine résistance est vécue lorsque avancer le cathéter, tirez-le doucement en arrière et essayer à nouveau progresser. Pour une souris pesant ~ 18-25 g, la durée estimée du cathéter qui est inséré est de 18 mm.
    NOTE: Le signal de pression artérielle fluctue de 70 à 120 mm Hg. Une fois que til cathéter dans le ventricule gauche de la forme des changements de signal de pression et la pression fluctue de 0 à 120 mm Hg (représenté sur la figure 1). La fonction cardiaque va se stabiliser à l'intérieur de 2-3 min après l'insertion du cathéter.
  11. Surveiller en permanence la température du corps, le niveau d'anesthésie, et le taux de respiration.

3. Acquisition de données

  1. Utilisez le logiciel LabChartPro 7 (ou un logiciel similaire). Utilisez l'option de WorkFlow du module PV LabChart boucle. Grâce à ce module, sélectionnez le réglage par défaut de pression et de boucles de volume.
  2. Mise en place de trois canaux: un canal pour la pression, un canal pour le volume, et un canal de la fréquence cardiaque. Définir plages d'échelle des paramètres ci-dessus comme 0-150 mm Hg, 0-100 ul et 0-800 battement / min, respectivement.
  3. Appuyez sur la touche de démarrage pour l'enregistrement.

4. Effet Bowditch

  1. Faire une incision de 1 cm dans la zone de précordiale parallèle à la manubrium. Couper la couche de muscle et expose l'espace intercostal l'aide de ciseaux.
  2. En utilisant une impulsion stimulateur carré, régler les paramètres suivants: tension de 2 V, durée de 2 ms, et activer le mode de répétition.
  3. Maintenir l'électrode négative avec une pince et l'insérer à travers le quatrième espace intercostal à la région apicale du cœur. Tenir l'électrode positive avec une pince et l'insérer dans le deuxième espace intercostal à la région de l'oreillette droite du cœur.
  4. Allumez le stimulateur et changer la fréquence à stimuler le cœur de 4 Hz (240 battements / min) jusqu'à 10 Hz (600 battements / min). A chaque nouvelle fréquence cardiaque, stimuler le cœur pendant 1 min avant la collecte des données.

5. Générer le ESPVR et PRSW

  1. Couper le tissu de la peau et le muscle perpendiculaire à la manubrium dans la région abdominale avec des ciseaux. Ouvrez le enterocoelia et exposer le foie.
  2. Faites glisser le costarum arcus vers la tête en utilisant la traction métallique.
  3. Poussez délicatement le foie vers le bas avecun coton-tige. Veillez à ne pas trop pousser à affecter la cavité thoracique. Cela va changer la fonction cardiaque.
  4. Couper le ligament falciforme du foie avec des ciseaux pour exposer la veine cave inférieure sus-hépatique (IVC).
  5. Utilisez une pince courbes de serrer rapidement la IVC pendant 5 secondes pour bloquer le retour du sang vers l'oreillette droite. La pression ventriculaire gauche et le volume va tomber en raison de l'afflux réduite vers le cœur. Dans générer ces valeurs, ne pas utiliser des boucles en dessous de 60 mm Hg. Le 60 mm Hg est en référence à la pression systolique.
    NOTE: Cette valeur est fixée à 60 mm Hg parce que cela va provoquer une baisse significative de la pression de perfusion de diminuer considérablement la perfusion coronaire et affecter la contractilité.

6. Etalonnage du volume

  1. Hépariner la souris avec 0,1 ml de 1: 5000 solution d'héparine (dilué avec une solution saline normale) par injection intraperitoneale.
  2. Retirer le cathéter de l'artère carotide. Lorsque le cathéter est retiré from l'artère carotide, de sang héparine suinte du trou où le cathéter a été inséré.
  3. Recueillir ce sang pour le calibrage du volume en utilisant une seringue de 1 ml. Remplir chaque puits dans l'étalonnage cuvette.
  4. Retirer coeur d'euthanasier la souris via exsanguination.
  5. Positionner le cathéter dans chaque puits et obtenir une valeur stable unité de volume relatif (ERF). Générer une courbe standard en utilisant les différents volumes et aux valeurs normalisées ERF de chaque puits.
  6. Convertir l'ERF enregistré à ul.

7. Traitement des données

  1. Pour examiner l'effet Bowditch, sélectionnez l'état d'équilibre de pression / volume de traces de chaque fréquence cardiaque. Cliquez sur l'analyse de base pour obtenir des données.
  2. Pour les données ESPVR et PRSW, sélectionnez les premiers ~ traces 15 pression / volume, cliquez sur l'analyse d'occlusion dans le logiciel pour générer le ESPVR (pente de la pression développée par le LV à la fin de diastole volume) et PRSW (la régression linéaire de travail de la course à la fin de diastolevolume) de ski.
  3. Accorder une attention à la forme des boucles. Assurez-vous que la boucle est fermée sans points anguleux ou des torsions. Ceci est un signe de la pose du cathéter impropre ou bruit excessif. Vérifiez périodiquement boucles pendant l'expérience pour garantir des données appropriées de pression et de volume sont générés.

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Representative Results

La bonne insertion du cathéter dans le ventricule gauche est une étape importante pour atteindre des valeurs de pression et de volume appropriées. Représenté sur la figure 1, en ​​utilisant LabChart Pro 7, est le changement de la forme d'onde de pression (forme et valeurs) lorsque le cathéter passe de l'artère dans le ventricule.

Après insertion correcte du cathéter dans le ventricule gauche, la pression (P) et le volume (V) valeurs obtenues seront ensuite utilisées pour générer les boucles PV (représentés sur la figure 2).

En utilisant ces valeurs de pression, des mécanismes qui modifient la contractilité peuvent être étudiés. Illustré à la figure 3 est un exemple de la façon dont la pression et les changements de volume que l'augmentation de la fréquence cardiaque. Dans cet exemple, l'augmentation du taux de 300 à 600 battements / min, la pression LV augmenté de 80 à 100 mm Hg, tandis que les volumes diastolique et systolique LV diminué. Représenté sur la Figure 4 est la fréquence cardiaque la dépendance des taux maximum et minimum de développement de pression (dP / dt). Comme l'augmentation de la fréquence cardiaque, le fait de les taux maximaux et minimaux de développement de pression. Ce type d'analyse de données peut également être utilisé pour étudier les organismes de réglementation de la contractilité. Nos données démontrent que NOS1 - / - souris ont diminué les taux maximaux et minimaux du développement de la pression par rapport au type sauvage (WT) les souris (Figure 4). Par conséquent, huitièmes de finale de NOS1 en résulte un effet Bowditch diminué.

En utilisant les valeurs de pression et de volume obtenues au cours de l'occlusion IVC, nous pouvons également obtenir une mesure de la contractilité indépendante de la charge. Illustré à la figure 5, sont calculés SEE et valeurs de PRSW (mesurée à 420 battements / min) pour WT et NOS1 - / - souris. Ces données suggèrent que NOS1 - / - souris ont diminué par rapport à la contractilité souris WT.

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Figure 1:. Les signaux de pression et de volume telles que détectées à l'aide du module PV LabChart boucle Les variations du signal de pression lorsque le cathéter est positionné dans le LV. Le signal de la pression artérielle (en haut) a fluctué de 80 à 120 mm Hg. Une fois que le cathéter a été placé dans le ventricule gauche, la forme des changements de signaux de pression et de la pression fluctué de 0 à 120 mm Hg. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Génération de PV boucles en utilisant le module PV LabChart boucle. GAUCHE) Données représentatifs de la pression (en haut), le volume (au milieu) et la fréquence cardiaque (en bas). Ces valeurs de pression LV / volume sont utilisés pour Generate la boucle de PV en traçant la pression (P) contre le volume (V). (Droite) Illustration de boucles générés par les données sur la gauche. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:.. Effet de la fréquence cardiaque sur la pression et le volume LV données représentatives démontrant les changements de pression et de volume de LV avec l'augmentation de la fréquence cardiaque en utilisant la boucle Module PV LabChart S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: KO NOS1 (Souris) souris ont diminué en réserve de la fonction cardiaque et contractile vivo rapport au type sauvage (WT), NOS1 - - NOS1 - /. / - Souris ont maximale significativement plus faible (dP / dt max) et minimum (DP / min dt) de taux de pression développement avec l'augmentation de la fréquence cardiaque. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. * P <0,05 par rapport à WT par ANOVA, n = 5 souris / groupe.

Figure 5
Figure 5: KO NOS1 (de NOS1 - / -) souris ont diminué la contractilité. GAUCHE) pression représentatif / boucles de volume obtenues au cours de la veine cave inférieure occlusion. Notez que la forme appropriée de chaque boucle. Les lignes épaisses sont les télésystolique relation de volume à la pression (ESPVR). DROITE) Par rapport au type sauvage (WT) les souris, NOS1 - / - souris ont une élastance diminué fin systolique (SEE) et de la précharge du travail systolique recrutable (PRSW). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. * P <0,05 vs WT via test t non apparié, n = 5 souris / groupe.

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Discussion

Une étape cruciale pour cette technique pour obtenir une mesure fiable de la contractilité est le placement correcte du cathéter dans le LV. Si le cathéter est pas placé correctement, lorsque les contrats le LV les murs peuvent communiquer avec le cathéter résultant en des valeurs très élevées, et non physiologique, pression provoquant irréguliers boucles PV forme. Si nécessaire, le cathéter peut être tourné pour réaliser le placement correct. Une autre étape clé de cette technique est de vous assurer que la souris a reçu une anesthésie appropriée. Si la souris est sur anesthésié, cela va grandement diminuer la fonction cardiaque. Une souris avec une fréquence cardiaque inférieure à ~ 250 battements / min peut être considérée comme terminée anesthésié. En outre, le volume de sang que le cœur pompe de la souris est faible ce qui rend difficile d'obtenir des volumes précis. Il est important de calibrer le volume de chaque souris. Pour l'étalonnage de volume, nous avons décrit la technique de calibrage de la cuvette. Il ya d'autres méthodes qui sont également utilisés pour calibrer les volumes (c.-calcul du volume de course en utilisant une sonde d'écoulement dans l'aorte thoracique descendante) 10.

Il ya beaucoup de limitations de l'utilisation de cette méthode chez la souris; tout en raison de sa petite taille du corps. Par exemple, cette technique nécessite des compétences microchirurgicale précise. En outre, cette technique se traduit par une perte de sang, ce qui pourrait changer la fonction cardiaque. Massive perte de sang peut être évité en faisant avancer le cathéter à travers le système vasculaire par rapport aux autres méthodes (par exemple, le perçage du ventricule gauche). Ici, nous décrivons l'ensemble de la procédure en détail avec des détails essentiels pour éviter ces problèmes.

Analyse Pression / volume est une approche importante pour enquêter sur la contractilité vivo. L'exécution de cette technique chez les souris est significatif car il ya de nombreux avantages par rapport aux autres espèces (coûts, manipulation génétique, etc.). Depuis la fréquence cardiaque est un déterminant important de la fonction cardiaque 1 et affectée par anesthesia, nous avons présenté des mesures supplémentaires pour assurer que les fréquences cardiaques comparables sont obtenus pour permettre une comparaison valable entre les groupes. En outre, en utilisant cette technique de boucle PV modifiée, un enquêteur est en mesure de tester directement l'effet Bowditch. Pour ces raisons, nous décrivons comment effectuer cette technique dans la souris pour obtenir des mesures précises de la contractilité in vivo à des fréquences cardiaques.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xlyzine 100 mg/ml Ana Sed 4821
Katamin 50 mg/ml Ketalar 310006
Heparin APP Pharmaceuticals 6003922
4-0 silk thread Surgical specialties SP102
6-0 silk thread Surgical specialties MBKF270
Forceps Fine Science Tools 11251-10
Curve forceps Fine Science Tools 11274-20
Scissors Fine Science Tools 14090-09
Vascular clamp Fine Science Tools 18555-03
Microscope World precision instruments PZM-3
Pressure catheter Millar instruments SPR-839
Pressure and volume system Millar instruments MPVS-300
PowerLab4/35 AD instruments N12128
LabchartPro 7 AD instruments
Temperature controller CWE TC-1000
Stimulator Grass SD-5
Sterile glove Micro-Touch 1305018821
Hair remover lotion Nair
Betadine surgical scrub Veterinary NDC 6761815401
Alcohol Decon Laboratories 2801
Bovie cautery Bovie AA29
1 ml Syringe (26 G needle) BD 8017299

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References

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