פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Crannell, Z. A., Rohrman, B., Richards-Kortum, R. Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control. J. Vis. Exp. (97), e52620, doi:10.3791/52620 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

הגברה חומצות גרעין הכמותית היא טכניקה חשובה לזיהוי של איכות הסביבה, foodborne, ופתוגנים שמקורן במים, כמו גם לאבחון קליני. תגובה בזמן אמת השרשרת של פולימראז כמותיים (qPCR) היא שיטת תקן הזהב לגילוי רגיש, ספציפי, וכמותי של חומצות גרעין, למשל, לHIV-1 בדיקה נגיפית עומס, זיהוי של חיידקים פתוגנים, ובדיקות סקר לאורגניזמים רבים אחרים - 1 3. במהלך זמן אמת qPCR, פריימרים להגביר DNA הפתוגן במחזורים, ואות ניאון שנוצרה היא פרופורציונאלי לכמות ה- DNA המוגבר במדגם בכל מחזור. מדגם המכיל ריכוז לא ידוע של DNA הפתוגן ניתן לכמת באמצעות עקומה סטנדרטית המתייחסת הריכוז הראשוני DNA של דגימות סטנדרטי והזמן שבו אות הניאון מגיעה לסף מסוים (כלומר, סף המחזור, או T C).

"Jove_content"> מכיוון שזמן אמת qPCR דורש ציוד יקר תרמית רכיבה על אופניים וכמה שעות כדי לקבל תוצאות, טכניקות הגברה בידוד תרמיות חלופיות, כגון הגברה פולימראז recombinase (RPA), פותחו 4. פלטפורמות אלה בדרך כלל מספקות תוצאות מהירות יותר ולהגביר חומצות גרעין בטמפרטורה נמוכה יותר, בודדת, אשר עשוי להיות מושלמת עם ציוד פחות יקר, יותר פשוט. RPA, שהוא אטרקטיבי במיוחד עבור יישומי נקודה של טיפול, מגביר DNA בדקות, דורש טמפרטורה נמוכה הגברה (37 ° C), ונשאר פעיל בנוכחות של זיהומי 5,6. מבחני RPA פותחו עבור מגוון רחב של יישומים, כוללים ניתוח מזון, זיהוי פתוגן, הקרנת סמים סרטן, וזיהוי של סוכני biothreat 7-12. עם זאת, שימוש בRPA לכימות של חומצות גרעין הוגבל 13,14.

בעבודה קודמת, זה היה shown שRPA כמותית בזמן אמת (qRPA) אינו ריאלי 15. כאן, פרוטוקול מפורט יותר ניתן לשימוש בזמן אמת RPA כמותיים לכמת דגימות ידועות באמצעות עקומה סטנדרטית, שיטה שדומה לכימות באמצעות qPCR. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע תגובת RPA על Cycler תרמית לגילוי DNA HIV-1 כהוכחה של קונספט, כמו גם כיצד לפתח שליטה פנימית חיובית (IPC) כדי להבטיח את המערכת מתפקדת כראוי. איסוף נתונים באמצעות Cycler תרמית או ניתוח מיקרוסקופ ונתונים לבניית עקומת סטנדרט באמצעות נתוני אימון גם מפורט. לבסוף, השיטה לכימות דגימות ידועות באמצעות העקומה סטנדרטית עם תסריט מותאם אישית באה לידי ביטוי. טכניקה זו מאפשרת qRPA כימות של דגימות בריכוזים לא ידועים ויש לו יתרונות רבים על פני זמן אמת מסורתי qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

תכנית 1. Cycler התרמי לתגובות qRPA בזמן אמת

  1. צור פרוטוקול חדש בתוכנת Cycler התרמית.
    1. הכנס צעד מראש דגירה: 39 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות.
    2. הוסף צעד שני: 39 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות ואחריו צלחת קריאה.
    3. לבסוף, הכנס "ללכת" שחוזר על השלב השני 59 פעמים יותר.
    4. שמור את הפרוטוקול.
  2. צור צלחת חדשה בכרטיסייה "עורך צלחת" של התוכנה. בחר בארות על הצלחת המתאימה למקומות מתגובות RPA (כאן, בארות שימוש A1, A4-A8, B1, וB4-B8).
    הערה: זה לא חשוב אם את סוג המדגם של הבארות (למשל, "תקן", "NTC") מצוין, כמו ניתוח הנתונים נעשה באמצעות סקריפט מותאם אישית.
    1. לניסויים המכילים DNA HIV-1 בלבד, בחר fluorophore "HEX" לכל הבארות. לניסויים המכילים DNA HIV-1 ושיתוף פנימי חיוביntrol, בחר את שניהם "HEX" וfluorophores "FAM" לכל הבארות. שמור את הצלחת.

2. הכן לניסויים בHIV-1 qRPA

  1. להרכיב תגובות RPA בסביבת עבודה לפני הגברה ייעודית המכילה טפטפות מיועדת, טיפים פיפטה, vortexer, ומיני-צנטריפוגה, כמו לqPCR. כRPA עשוי להגביר עותק יחיד של DNA על ידי ככל עשרה סדרי הגודל (מידע לא מוצג), לטפל ולהיפטר מצינורות המכילים מוצרי DNA מוגבר פוסט באזור לאחר הגברה ייעודית.
    1. למנוע מגע בין כל המגיבים מראש ההגברה והמוצרים לאחר ההגברה. תרסיס סביבות עבודה מראש הגברה וציוד עם אקונומיקה 50% לפני ואחרי כל הניסויים. השתמש במגבת נייר לנגב אקונומיקה עודפת.
  2. רצף פריימר קדימה רכישה 5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3 'ולהפוך רצף פריימר 5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3 'מסינתיסייזרים DNA מסחריים. לרכוש את רצף הבדיקה 5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA / HEX] GC [THF] C [DT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3 "ממקורות מסחריים. אחסן את כל צבעי היסוד ובדיקות בבית 4 ° C בaliquots בריכוז של 10 מיקרומטר לפני השימוש.
    הערה: assay qRPA מגביר רצף HIV-1 ייחודי. עבור assay הוכחה של קונספט זה, השתמש בpHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr פלסמיד שתואר על ידי et al סאטון. המכיל את רצף היעד 16. בניסויים qRPA, פלסמיד אוחסן על 4 מעלות צלזיוס בaliquots המכיל 1, 10, 10 2, 10 3, ו- 10 4 עותקים לμl במאגר המכיל 10 מ"מ טריס, 0.1 מ"מ EDTA ב- pH 8.0, וng / 1 DNA μl אדם הגנומי המוביל (360,486). ריכוז ה- DNA ספק זה שווה את ריכוז ה- DNA המתקבל מערכות חילוץ מסחריות DNA הסרום משמשות לאבחון HIV-1 17. HIV-1 אלהדילולים שמשו כתבניות בתגובות qRPA לבנות עקומה סטנדרטית.

3. להרכיב qRPA תקן Curve HIV-1

  1. לפני הרכבת תגובות qRPA, להכין את סביבת העבודה לפני ההגברה כמתואר בשלב 2.1.1. מניחים בלוק קר 96-גם באחסון על 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכן ריאגנטים עבור 12 תגובות:
    1. הזז את אצטט מגנזיום, חיץ להחזרת הנוזלים, ו -12 כדורי תגובת RPA לסביבת העבודה לפני ההגברה.
    2. להפשיר אצטט מגנזיום וחיץ להחזרת הנוזלים בטמפרטורת חדר.
    3. Aliquot 32.5 μl של אצטט מגנזיום (2.5 μl לכל תגובה) לצינור microcentrifuge.
    4. להכין תערובת 13x אדון. להוסיף 383.5 μl של החיץ להחזרת הנוזלים (29.5 μl לכל תגובה) לצינור microcentrifuge נפרד לתערובת האמן. להוסיף 41.6 μl של מים חופשיים nuclease (3.2 μl לכל תגובה) לתערובת האמן. מערבולת תערובת האמן.
    5. להחזיר את aceta מגנזיוםמאגר te והחזרת נוזלים לאחסון ב -20 ° C.
    6. הזז את aliquots פריימר והבדיקה מהמקרר לאזור קדם-ההגברה, הימנעות מחשיפה מוגזמת לאור כדי למזער photobleaching.
    7. להוסיף 27.3 μl כל אחד 10 מיקרומטר קדימה לאחור פריימרים (2.1 μl לפריימר לכל תגובה) לתערובת האמן.
    8. להוסיף 7.8 μl של חללית DNA 10 מיקרומטר שכותרתו HEX HIV-1 (0.6 μl לכל תגובה) לתערובת האמן.
    9. חזור פריימרים ולחקור לאחסון.
  3. התאמת פריסת הצלחת מתוארת בסעיף 1.2, מקום גלולה אנזים 1 בכל אחד מצינורות שמאל הקיצוני וגלול אנזים 1 בכל אחד 5 צינורות קצה שמאלי של 2 8-גם רצועות צינור עלייה נמוכה PCR.
  4. בזהירות להוסיף 37.5 μl של תערובת אמן לכל צינור המכיל גלולה אנזים, באמצעות קצה פיפטה חדש עבור כל צינור ובעדינות תוך ערבוב תערובת האמן וגלול עם הקצה עד גלולה נמס לגמרי. מערבבים בעדינות כדי למנוע formati בועהב, ולהסיר את הקצה בזהירות כדי למנוע כל אובדן של עוצמת התגובה.
  5. אחרי הכל כדורי האנזים כבר rehydrated עם תערובת האמן, לשלוף את הגוש קר 96-גם מאחסון C 4 מעלות. מניחים את רצועות צינור PCR בגוש הקר לצנן את תערובת האמן.
  6. בעוד תערובת האמן מתקררת, לטעון את תוכנת Cycler תרמית עם הפרוטוקול והצלחת המתואר בסעיף 1.
  7. לחתוך 2 רצועות של דבק מיקרו-חותם פלסטיק שקוף להיות מעט רחב יותר מאשר צינורות PCR, ולאחזר 2 מכסי רצועת צינור שטוחים PCR.
  8. אחזר 6 aliquots תבנית מאחסון (המכיל 0, 1, 10, 1, 10 2, 10 3, או 10 4 עותקים של פלסמיד HIV-1 לכל microliter).
  9. הוסף 10 μl של כל תבנית לצינורות המיועדים שלריכוז התבנית. השתמש קצה פיפטה חדש עבור כל צינור, בעדינות תוך ערבוב הפתרון עם הקצה כדי לערבב את תערובת ההורים ותבנית. הקפד להוסיף את התבנית למיקום הנכון למ 'Atch פריסת הצלחת מתוארת בסעיף 1.2.
  10. ודא שמתאם רצועת צינור PCR לmicrocentrifuge נמצא במקום.
  11. לוותר 2.5 μl של אצטט מגנזיום לכל מכסה צינור שיונח על צינור המכיל תגובת qRPA.
  12. מניח בעדינות את העפעפיים על גבי צינורות PCR כך שהם אינם אטומים לחלוטין וניתן להסיר. אצטט מגנזיום ידבק המכסים ולהיות ברור לעין מלמעלה.
  13. הכנס כל רצועת צינור PCR עם מכסים לכל צד של בעל צינור PCR. סגור את המכסה של minifuge להסתובב אצטט מגנזיום מהמכסים ולתגובת RPA, שיזם את תגובת RPA. צנטריפוגה עד שכל הבועות בוטלו וכל הנוזל שנאסף בחלק התחתון של צינור אחד (כ -10 שניות).
  14. להסיר במהירות את רצועות צינור PCR ולהחזיר אותם לבלוק הקר כדי לעצור את תגובות qRPA.
  15. מוציא בזהירות את המכסים כדי למנוע היווצרות תרסיס ולאטום כל רצועת צינור PCR עם החתךחתיכות של סרט מיקרו חותם ברור.
  16. במהירות ללכת לCycler התרמית ולטעון שתי רצועות צינור PCR לCycler התרמית במקומות פריסת הצלחת (בארות A1-B8) התאמה. סגור את המכסה של Cycler התרמית, לחץ על "התחל הפעלה", ולייעד את שם הקובץ לצורך הניסוי.
    הערה: למרות שהיצרן ממליץ התססה המדגם לאחר 5 דקות של דגירה, צעד זה אינו הכרחי עבור assay המסוים הזה ויכול להיות מושמט.
  17. לאחר הריצה תושלם, בחר באפשרות "הגדרות", "הגדרת Baseline," "לא Baseline חיסור" כדי להציג את נתוני הקרינה הגלם. לייצא את הנתונים לתוכנת גיליונות אלקטרוניים על ידי בחירה "יצוא", "לייצא את כל גיליונות נתונים ל- Excel." קובץ עם התוספת "תוצאות כימות הגברה" ייווצר המכיל את נתוני הקרינה בזמן אמת גלם.

4. פיתוח פנימי חיובי בקרה

  1. בחר רצף ה- DNA ממינים שלא סביר שנמצא במדגם היעד. הרצף צריך להיות ארוכה יותר מamplicon היעד כך שהדור של רצף היעד מועדף.
    הערה: לassay זה, parvum Cryptosporidium, טפיל מעיים, נבחר לכהן כתבנית לדור של רצף IPC כי האורגניזם זה לא סביר שאפשר למצוא בדם והיה זמין במעבדה מפרויקט אחר. כדי ליצור את רצף IPC, לחלץ ולטהר DNA מג ביצי parvum כפי שתוארו במקום אחר 18.
  2. לרכוש את קדימה (5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3 ') ולהפוך (5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3 ') פריימרים ממקורות מסחריים. פריימרים IPC PCR משמשים assay זה מוצגים באיור 1 ומכילים אזור אחד שהוא חינם לתבנית IPC DNA (למשל, parvum ג, באיור 1 סגול) ואזור אחד שהוא חינם לאורגניזם היעד (לדוגמא, HIV-1, כחול באיור 1).
  3. לבצע PCR באמצעות פריימרים ותבנית ה- DNA IPC.
    1. להרכיב 50 תגובות μl PCR באמצעות ריאגנטים ערכת Phusion גבוהים פידליטי DNA פולימראז על פי הוראות היצרן, לא כולל פולימראז. השתמש 2 μl של תבנית ה- DNA וPhusion המאגר HF.
    2. הוסף את פולימראז Phusion לכל תגובה אחרי התחלה חמה על 98 מעלות צלזיוס, ואחריו 60 שניות על 98 מעלות צלזיוס, ואחריו 40 מחזורים של 15 שניות על 98 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 62 מעלות צלזיוס, ו- 30 שניות על 72 מעלות C עם סיומת סופית על 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר רכיבה על אופניים תרמיים, להחזיק דגימות ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. ניתוח דגימות על ידי ג'ל אלקטרופורזה על 2% agarose ג'ל טה, ולאחר מכן לחלץ ולטהר DNA באמצעות ערכת חילוץ ג'ל QIAquick לפי פרוטוקול microcentrifuge כלול בהערכה.
  4. מסך מועמדי IPC ביכולתם להגביר שימוש בqRPA.
    1. הכן תגובות qRPA כפי שתואר בסעיף 3, באמצעות HIV-1 פריימרים, בדיקה שכותרתו FAM ספציפיים לIPC (5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [DT-BHQ1 ] GGT TTT GTA ATT GGA, וכן סך -3 ') של 0, 10, 10 2, 10 3, 10 4, או 10 5 עותקים של כל מועמד IPC לכל תגובה, בדיקה כל הריכוזים בשני עותקים.
    2. בחר את מועמד IPC שמגביר באופן עקבי ביותר ויש לו הגבול-של-גילוי הנמוך ביותר.
  5. Co-להגביר HIV-1 וIPC כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי של IPC DNA.
    1. בדומה לסעיף 3, לשלב הבא בכל תגובת 50 μl: 29.5 μl של חיץ להחזרת נוזלים, 2.1 μl של RPA של פריימר קדימה [10 מיקרומטר], 2.1 μl של RPA לאחור תחל [10 מיקרומטר], 0.6 μl של HEX HIV-1 בדיקה שכותרתו [10 מיקרומטר], 10 μlשל DNA HIV-1 בריכוזים שונים, 2.5 μl של אצטט מגנזיום, וגלולת אנזים 1. במקום להוסיף 3.2 μl של מים חופשיים nuclease כפי שנעשה בשלב 3.2.4, להוסיף 0.6 μl של תווית בדיקה-FAM IPC [10 מיקרומטר], ו -2.6 μl של IPC DNA. השתמש בריכוז IPC שהוא גילוי הגבול-של-(לוד) כאשר qRPA מתבצע עם DNA IPC לבד (לוד המוגדרת כריכוז הנמוך ביותר שבו כמות דור אות הקרינה היא גדולה יותר מזה שנוצר על ידי הקרינה שנוצרה על ידי הדגימות עם אין DNA יעד).
    2. דגירה הדגימות באמצעות הפרוטוקול המתואר בסעיף 1.1.
    3. אם IPC לא להגביר בכל מדגם, לשקול חזרה על הניסוי עם כדי ריכוז אחד IPC גודל גבוה. הריכוז האופטימלי של ה- DNA IPC עבור assay HIV-1 הוא 10,000 עותקים / μl. בעוד דגימות נחשבות תקפה אם יש או IPC או הגברה DNA HIV-1, באופן אידיאלי IPC מציג הגברה גילוי לכל תגובה.

5. בניית עקומת סטנדרט מניסויים מרובים

  1. להבטיח את הנתונים עבור כל ניסוי כבר מיוצא לתכנית גיליון אלקטרוני כמפורט בסעיף 3.13.
  2. לפתוח ולהפעיל את התסריט "JoVE_qRPA_standard_curve.m". כל התשומות תתבקש באופן אוטומטי בחלון הפקודה. לאחר התסריט הוא יזם, המשתמש מתבקש באופן אוטומטי ליעד "מספר קבצי נתונים" המשמש לבניית העקומה סטנדרטית.
  3. בחלון הפקודה, הקלד את מספר הקבצים שישמש לבניית עקומת הסטנדרט ולחצו תנטרו.
  4. הקלד בחלון הפקודה מספר הדגימות ומספר החזרות בכל קובץ הכשרה (לחץ על ENTER לאחר כל כניסה).
    הערה: בפריסת הצלחת המתוארת בסעיף 1.2, היו 6 דגימות עם ריכוזים שונים ו -2 חזרות של כל דגימה).
  5. הקלד בחלון הפקודה DN הנמוך ביותרריכוז שימש לבניית העקומה סטנדרטית (בlog10 עותקים) ולחץ ינטר (לפריסת הצלחת המתוארת בסעיף 1.2, ריכוז התבנית הנמוך ביותר הוא '1' log10 עותקים).
  6. הקלד את החלון הפקודה ההבדל בריכוז בין כל תקן (בlog10 עותקים) ולאחר מכן קש enter (לפריסת הצלחת המתוארת בסעיף 1.2, מרווח הריכוז הוא '1' log10 עותקים).
  7. לאחר בקשת האישור, הקלד את "סף המדרון" בחלון הפקודה ולחץ על Enter.
  8. בחלון הפקודה, הקלד את "מספר (z) סטיות תקן מעל הרקע לסף חיובי," ולאחר מכן לחץ על Enter. ערכים אופייניים עבור מגוון z 1-5.
  9. ציין אם הנתונים נאספו באמצעות Cycler התרמית ('1'), * תמונות מיקרוסקופ .tiff ('2'), או * מיקרוסקופ .jpg תמונות ('3') על ידי הקלדת המספר '1', '2,' או '3, "וpressing להיכנס.
  10. בחר להגדיר סף IPC חדש או להשתמש ערך ברירת מחדל עבור הסף על ידי ההקלדה 'y' או 'n' בהתאמה, כאשר תתבקשו לעשות זאת.
  11. הבא, בחר כל אחד מקבצי הגיליון האלקטרוני המשמשים לבניית העקומה סטנדרטית.
    הערה: התסריט באופן אוטומטי לייבא נתונים HEX וקרינת FAM; לקבוע אם כל תגובה הייתה בתוקף (כלומר, אם אותות הקרינה חריגה הספים לHEX או ערוצי FAM); לקבוע את מקדם r 2 למעריכים, ליניארי, ובכושר פולינום מסדר שני; עלילה "log10 עותקים לעומת סף מחזור" לכל מדגם המשמש לבניית העקומה סטנדרטית; וליצור קובץ גיליון אלקטרוני המכיל משתנים חיוניים כדי לבנות מחדש את העקומה סטנדרטית עבור ניסויי אימות ללא צורך למשתמש להזין מחדש את כל הפרמטרים הקלט שוב.

6. Assay אימות וכימות של דגימות ידועות שימושעקומת הסטנדרט

  1. השתמש בתסריט "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" להעריך את הדיוק ואת הדיוק של assay באמצעות דגימות בריכוזים ידועים או להשתמש בו כדי לכמת דגימות בריכוזים לא ידועים.
    הערה: מאחר שהמחקר שפורסם בעבר הראה כי כושר מעריכי הניב המקדם r בריבוע הטוב ביותר 18, התסריט הזה מנצל בכושר מעריכי לעקומה סטנדרטית. אם סוג של כושר שונה הוא רצוי, התסריט עשוי להיות שונה בהתאם.
    1. לפתוח ולהפעיל את התסריט "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m". לאחר התסריט הוא יזם, המשתמש מתבקש באופן אוטומטי להזין את כל התשומות לחלון הפקודה.
    2. הזן '1' כדי לאמת assay באמצעות עקומה סטנדרטית עם מדגם ריכוזים ידועים או להיכנס '2' לכמת דגימות ידועות.
    3. כשיתבקש, או לבחור עקומה סטנדרטית הצילה או לבנות אחד חדש על ידי הזנת המידע דואר ששדל באופן אוטומטי בחלון הפקודה (את אותו מידע שנדרש לתסריט "JoVE_qRPA_standard_curve.m" מסעיף 5).
    4. הקלידו את מספר הניסויים (כלומר, קבצי גיליון אלקטרוני) כדי לנתח לאימות / כימות.

7. הכנה לאיסוף נתונים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וצ'יפ מחומם

  1. ודא שיש מיקרוסקופ פלואורסצנטי דוד במה ובקר טמפרטורה 1-ערוץ Precision יציבות גבוהה במקום.
  2. ודא מיקרוסקופ פלואורסצנטי יש קוביית מסנן לרגש ולאסוף הקרינה מכל fluorophore. לרגש ולאסוף את הקרינה FAM נוצרה במהלך ההגברה IPC DNA דרך מסנן GFP (עירור BP 470/40 ננומטר, nm BP 520/50 פליטה). לרגש ולאסוף את הקרינה HEX שנוצרה במהלך ההגברה DNA HIV-1 דרך מסנן HEX (עירור BP 530/30 ננומטר, nm BP 575/40 פליטה).
  3. השתמש בתוכנת עריכת תסריט מיקרוסקופ כדי ליצור אלגוריתם אוטומטי לשכפל איסוף נתונים על Cycler התרמית.
    1. ראשון להכניס "הגדרות" צעד כדי לסגור את התריס. הבא להוסיף צעד "חשיפה" כדי להגדיר את החשיפה עד 60 שניות. הכנס "Snap" לביצוע עיכוב 60 שניות, אשר מיישם את התקופה שלפני הדגירה 1 דקות. הוסף צעד "הגדרה" כדי לשנות את קבוצת העבודה למסנן GFP. הכנס אחר צעד "חשיפה" על מנת להתאים את החשיפה ל -200 אלפיות שניים. כל החשיפות באמצעות GFP או קוביות מסנן HEX תוגדר 200 אלפיות שניים.
    2. לאחר השלב "חשיפה", להוסיף "Snap" ולציין את המצלמה שבה התמונה תילקח. השתמש בצעד נוסף "הגדרה" כדי לסגור את התריס וצעד "שמור תמונה" כדי לשמור את התמונה לתיקייה זמנית בהגדרת משתמש.
    3. מתג ליד קוביית מסנן HEX באמצעות צעד נוסף "הגדרה" והen להוסיף "חשיפה" ב- 200 אלפיות שני, "הצמד", וצעד "שמור תמונה".
    4. חזור על תהליך זה 59 פעמים עם עיכוב ראשוני של 20 שניות במקום 60 (תריס קרוב, לחכות 20 שניות, מתג לקוביית מסנן GFP, חשיפה, שקבעה 200 אלפיות שני, הצמד, קרוב תריס, לחסוך, מתג לקוביית מסנן HEX חשיפה שנקבעה, 200 אלפיות שני, הצמד).
  4. צור שבב שיחזיק תגובות qRPA.
    1. בניסויים באמצעות מיקרוסקופ, להשתמש בקובץ JoVE_qRPA_base.ai לחתוך 40 x 15 מ"מ בסיס מלבני מגיליון של "1/8 אקריליק השחור העבה, בעזרת סכין לייזר מוגדר כוח 100%, מהירות של 10%.
    2. השתמש בקובץ JoVE_qRPA_well.ai לחתוך תגובה גם בהיקף של ריבוע בגודל 10 x 10 מ"מ עם חור עגול בקוטר 5 מ"מ מגיליון של 1.5 מ"מ אקריליק ברור העבה.
    3. צרף עד שלוש בארות לבסיס יחיד באמצעות ג'ל דבק מגע.
    4. לילה יבש.

8. איסוף נתונים וAnalysis באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. הכן את המיקרוסקופ לאיסוף נתונים על ידי טעינת תסריט איסוף נתונים האוטומטי JoVE_AxioVision_Script.ziscript.
    1. הגדר את תנור שלב 48 ° C ומחמם את שבב התגובה על דוד הבמה לכ -20 דקות. הגדרת טמפרטורה של 48 מעלות צלזיוס שומרת על טמפרטורה של 39 מעלות צלזיוס בתגובה גם (מידע לא מוצג).
    2. באמצעות מטרת NA 10X, 0.45, להתמקד בחלק העליון של הקצה הפנימי של התגובה גם עם מסנן GFP במקום. הקצוות של אקריליק autofluorescent לאחר חיתוך לייזר ויכולים להיות דמיינו בקלות. לאחר ההתמקדות, לא להתאים את הגובה של הבמה מיקרוסקופ עד שכל הנתונים שנאספו.
  2. להרכיב תערובת אמן qRPA בסביבת עבודה לפני הגברה ייעודית כמתואר בשלב 4.5.1. עבור כל דגימה, לערבב גלולה אנזים, תערובת אמן, ותבנית ה- DNA HIV-1 בצינור microcentrifuge. להוסיף 2.5 μl של אצטט מגנזיום לreactio הראשוןn ובקצרה מערבולת.
  3. במהירות להעביר את צינור microcentrifuge המכיל מדגם qRPA למיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    1. בזהירות פיפטה 30 μl של תגובת RPA לתגובה גם מבלי ליצור בועות. הנח טיפה של שמן מינרלי כיתה PCR על תגובת RPA על מנת למנוע אידוי.
    2. מקם את גם ישירות מתחת למיקרוסקופ המטרה, מקפיד תמונה רק במרכז הבאר, לא כל קצות אקריליק אוטומטי ניאון. לאחר היטב ממוקם, להריץ את הסקריפט האוטומטי 7. התסריט יוצר תמונה אחת JPEG באמצעות קוביית מסנן FAM ואחד תמונת JPEG באמצעות קוביית מסנן HEX כל 20 שניות.
  4. לאחר התסריט הושלם, להעביר תמונות אלה מתוך תיקיית האחסון הזמנית לפני הפעלת דגימות נוספות.
    1. צור 2 תיקיות: 1 עבור כל fluorophore (כלומר, 'HEX' ו 'FAM'). אחסן את שני התיקיות באותה תיקיית אב. בכל fluorophoreתיקייה, צור תיקייה שכותרתו עם מספר עותקי DNA בדגימה (לדוגמא, 0, 10, וכו ').
    2. העבר את כל הקבצים עם 'HEX' הקידומת לתיקיית המשנה המקביל בתיקייה 'HEX'. העבר את כל הקבצים עם 'GFP' הקידומת לתיקיית המשנה המקביל בתיקייה 'FAM'.
  5. סעיפים חזרו על 8.2-8.4 לתגובות qRPA עם 0, 10, 10 2, 10 3, 10 4, ו -10 5 עותקי DNA HIV-1.
  6. לאחר איסוף הנתונים עבור כל דגימות qRPA בניסוי, לטעון את התסריט "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m." כאשר תתבקש על ידי התסריט, בחר את התיקייה המכילה את תיקיות הורה fluorophore 2, אשר בתורו להכיל את התמונות עבור כל ריכוז בתיקיות משנה.
    הערה: התסריט באופן אוטומטי ליצור קובץ גיליון אלקטרוני בספריית האב שבו נתוני הקרינה HEX יישמרו בנאמו גיליון"HEX 'אד, ונתוני הקרינה FAM יישמרו בגיליון בשם" FAM'. בכל גיליון, מספר המחזור מופיע בעמודת B, ונתוני הקרינה בזמן אמת להגדלת ריכוזים של תבנית ניתנים בעמודות C, D, וכו '. כל נתון הקרינה בזמן אמת הוא עוצמת הקרינה הממוצעת של התמונה שצולמה באותה נקודת הזמן.
  7. השתמש בפונקצית עלילת פיזור ברירת מחדל בתוכנת הגיליונות האלקטרוניים לתכנן B2 תאים: H61 של 'HEX' וגיליונות 'FAM' כדי להמחיש הקרינה בזמן אמת וליצור חלקות דומות לאלה ב2A דמויות, 2B, 3A, 3B ו.
    הערה: גם הגיליון האלקטרוני שנוצר בשלב 8.6 ניתן להשתמש בסקריפטים "JoVE_qRPA_standard_curve.m" ו- "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לפני בחירת רצף לשמש IPC בניסויי qRPA עם יעד מועמדי DNA (HIV-1), שליטה פנימית חיובית (IPC) נוצרים והוקרנו ביכולתם להגביר בתגובות qRPA ללא נוכחי DNA HIV-1. מועמדי IPC הם ארוכים יותר מהיעד (HIV-1) DNA כדי למנוע היווצרות IPC מהיווצרות amplicon HIV-1 מתחרה-out. כפי שניתן לראות באיור 2 א, הדור של שני C. מועמדי parvum IPC אומתו על ידי הנוכחות של 415 ולהקות 435 נ"ב באמצעות ג'ל אלקטרופורזה. בתגובות qRPA, מועמד IPC הקצר הציג הגברה קטנה (איור 2), בעוד שהמועמד כבר מוגבר באופן עקבי כאשר בסך הכל 10 4 ו -10 5 עותקים נכחו (איור 2 ג). כך, המועמד כבר נבחר להיות IPC לניסויי HIV-1 qRPA.

בזמן אמת qRPA יכול להתבצע באמצעות היעד של ריבית לבד או באמצעותשניהם היעד וIPC. איור 3 מראה ניסוי בCycler התרמית באמצעות שני DNA HIV-1 וג parvum IPC. בניסוי זה, 2.6 x 10 4 עותקים של IPC DNA נוספו לכל תגובה, ריכוז קרוב לגבול IPC של זיהוי, כדי להימנע מלהשפיע על המגבלה של זיהוי של ה- DNA היעד HIV-1. כפי שהודגם באיור 3 א, אשר מציג נתוני הקרינה HEX המתאימים לדור DNA בזמן אמת HIV-1, הזמן שבו הגברה גילוי מתחילה עומדים ביחס הפוך לריכוז היעד הראשוני. לפיכך, ההגברה ניכר קודם לכן לריכוזים גבוהים של DNA HIV-1 ומאוחר יותר לריכוזים נמוכים של ה- DNA HIV-1. בניגוד לכך, הגברה גילוי של IPC DNA מתחילה בערך באותו הזמן, כי ריכוז IPC מתחיל אותו הדבר בכל הדגימות, כפי שמוצג באיור 3, אשר מציג נתוני הקרינה FAM המתאימים לדור IPC DNA במהלך tהוא ניסוי. שיעור דור הקרינה מIPC הוא ביחס הפוך לריכוז של DNA HIV-1 בשל תחרות בהגברה.

במטרה לפתח קורא הקרינה שדה-נתיח עם תגובות qRPA, ניסויי qRPA עשויות להתבצע על מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף עם תנור במה ובקר טמפרטורה 1-ערוץ Precision יציבות גבוהה. נתונים HEX וקרינת FAM איור 4 א ותצוגת 4B נאספו במיקרוסקופ. נתונים שנאספו במיקרוסקופ באמצעות שבבים בחיתוך הלייזר להפגין שונות קלות בקרינה ופסגות ושקתות שיכולות להיות בגלל photobleaching תחילת המחקר. עם זאת, התסריט קובע את סף המחזור באמצעות שיעור שינוי של הקרינה בתקופת ההגברה הראשונית, שאינה מושפע מקרינה או השתנות בסיסית בקרינה לאחר ההגברה הראשונית התרחשה. כפי שניתן לראות בFiיש התרשים 4C, העקומה סטנדרטית הבנויה מניסוי זה r 2 מקדם של 0.990. יש לציין, IPC מוגבר רק לריכוזים נמוכים של ה- DNA HIV-1. למרות שהתנהגות זו שונה מניסויים שבוצעו על Cycler התרמית, כל הדגימות עדיין מסווגות כתקפות בשיטה זו.

נתונים מניסויים מרובים באמצעות ריכוזי יעד ידועים עשויים להיות הידור לבנות עקומה סטנדרטית, שניתן להשתמש בו כדי להעריך את ביצועי assay או לכמת דגימות בריכוזים לא ידועים. איור 5 מציג את הנתונים מחמישה ניסויים ועקומה סטנדרטית מעריכי שנוצרו באמצעות סקריפט "JoVE_qRPA_standard_curve.m", המתייחס ריכוז היעד הראשוני HIV-1 למועד שבי ההגברה גילוי החלה. איור 5 השתמש 5 ניסויים נפרדים, כל אחד 2 תגובות qRPA המכילות בכל ריכוז תבנית לבנות עקומה סטנדרטית. שים לב כי מעריכייש כושר r 2 מקדם גבוה של .959. עקומת הסטנדרט הייתה אז בשימוש כדי לחזות את הריכוזים של דגימות נוספות עם ריכוזים ידועים לאימות assay באמצעות התסריט "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m". טבלה 1 מציגה את תוצאות כימות ל5 ניסויים נוספים באמצעות העקומה סטנדרטית באיור 5. שים לב ש אלגוריתם מסווג בצורה נכונה את כל הדגימות המכילות DNA HIV-1 כחיובי ו9 מתוך 10 הדגימות לא-יעד-שליטה השלילית. בנוסף, הריכוז חזה הממוצע היה בתוך סדר הגודל של הריכוז הנכון וסטיית התקן לריכוזים חזו אחד פחות מ -0.5 log10 (עותקים לכל תגובה).

איור 1
איור 1:. תרשים בלוק של יעדים כמותיים DNA RPA QRPAssay מגביר שני רצפי DNA מוקף רצפים זהים לאשר פריימרים bind ("RPA קדימה" ו- "RPA הפוך"). הרצפים מוגברים הם 1) רצף בתוך הגנום HIV-1 ("HIV-1") שמזוהה עם "HIV-1 הבדיקה" ו -2) רצף שליטה פנימי חיובי ("IPC (parvum ג)") כלול בכל תגובה שמזוהית עם "הבדיקה IPC." IPC נוצר באמצעות PCR באמצעות הגנום parvum Cryptosporidium כתבנית ופריימרים ("PCR קדימה" ו- "PCR הפוך") המכיל אזור משלים לג parvum (סגול) ואזור משלים לHIV-1 (כחול). איור שפורסם במקור בכימית אנליטית 2014, הודפס מחדש כאן ברשות 9.

איור 2
איור 2: (א) שני מועמדי IPC ('קדימה קצרים' ו 'קדימה ארוך') ורצף שליטה ידוע PCR חיובי היו שנוצרו באמצעות PCR ומדמיינים על ג'ל agarose, שבו 415 נ"ב ולהקות 435 נ"ב היו גלויים . (ב) מועמד IPC הקצר הציג הגברה קטנה בזמן אמת RPA, ואילו מועמד IPC הארוך יותר (C) מוגבר באופן עקבי כאשר בסך הכל 10 4 ו -10 5 עותקים נכחו. איור שפורסם במקור בכימית אנליטית 2014, הודפס מחדש כאן ברשות 9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: נתוני הקרינה גלם אופייניים שנוצרו במהלך שיתוף מגברlification של DNA HIV-1 וIPC בCycler תרמית. (א) לHIV-1, את התחלתה של הגברה גילוי, שמוצג על ידי גידול ניכר בקרינת HEX, מתרחש מוקדם יותר לריכוזים גבוהים של DNA HIV-1. (ב) לIPC, תחילתה של הגברה גילוי, שמוצגת על ידי גידול ניכר בקרינת FAM, מתרחש בערך באותו הזמן, ללא קשר לריכוז ה- DNA HIV-1. עם זאת, השיעור של דור הקרינה FAM עומד ביחס הפוך לכמות הנוכחית DNA HIV-1 בשל תחרות. איור שפורסם במקור בכימית אנליטית 2014, הודפס מחדש כאן ברשות 9.

איור 4
איור 4: נתוני הקרינה גלם אופייניים שנוצרו במהלך שיתוף ההגברה של DNA HIV-1 וIPC במיקרוסקופ () בדומה לנתונים שנוצרו על t.הוא Cycler התרמית, תחילתה של הגברה HIV-1 לגילוי, שמוצגת על ידי גידול ניכר בקרינת HEX, מתרחשת מוקדם יותר לריכוזים גבוהים של DNA HIV-1. (ב) ההגברה IPC במיקרוסקופ, שמוצגת על ידי הקרינה FAM, היא לכאורה לריכוזים נמוכים DNA HIV-1, אבל לא תמיד ברורה בדגימות עם ריכוזים גבוהים DNA HIV-1. (ג) עקומה סטנדרטית ניתן לבנות באמצעות תסריטי JoVE_standard_curve.m שמניב r 2 מקדם גבוה.

איור 5
איור 5:. עקומת סטנדרט אופיינית עבור HIV-1 שימוש בתסריט JoVE_standard_curve.m, נתוני הקרינה HEX גלם שנוצרו במהלך ההגברה HIV-1 מעובד לבנות עקומה סטנדרטית, אשר עשוי לשמש כדי לחזות את ריכוז ה- DNA HIV-1 של לא ידוע דגימות. עקומה זו סטנדרטית (z = 1) נוצרה באמצעות נתונים מ -5 experimמציג, שבו 6 ריכוזים נבדקו באמצעות 2 משכפל בכל ריכוז. מקבלים את כל הריכוזים בlog10 עותקים. איור שפורסם במקור בכימית אנליטית 2014, הודפס מחדש כאן ברשות 9.

איור 6
איור 6:. Tunability אלגוריתם התאמת הפרמטרים האלגוריתם משנה את העקומה סטנדרטית המשמשת כדי לחזות את הריכוז של דגימות ידועות. תסריט JoVE_validation_and_quantification.m שימש לחזות את הריכוז של דגימות ידועות באמצעות z = 1 (אדום) וz = 5 (כחול). מקבלים את כל הריכוזים בlog10 עותקים. תחזיות מדויקות יותר לריכוזים נמוכים DNA כאשר z = 1; תחזיות מדויקות יותר לריכוזים גבוהים DNA כאשר z = 5. על ידי התאמת הפרמטרים האלגוריתם, עקומת סטנדרט qRPA עשוי להיות מכוונת בהתאם לצרכים קליניים. איורפורסם במקור בכימיה אנליטית 2014, הודפס מחדש כאן ברשות 9.

ריכוז מדגם ריכוז חזוי ממוצע סטיית תקן אחוזים מדוגמאות שזוהו כחיובי
אין בקרות יעד 0.1 0.3 10%
1 0.9 0.1 100%
2 2.2 0.5 100%
3 3 0.1 100%
4 3.7 0.1 100%
5 4.2 0.2 100%

טבלת 1: אימות assay HIV-1 qRPA שימוש standa.עקומת rd באיור 4, תסריט JoVE_validation_and_quantification.m שימשה לחזות את הריכוזים (בlog10 עותקים) של דגימות במשך 5 ניסויים נוספים. שולחן שפורסם במקור בכימית אנליטית 2014, הודפס מחדש כאן ברשות 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

על מנת לקבל נתונים כימות משמעותיים באמצעות אלגוריתם MATLAB, המשתמש חייב לבחור ערכי קלט מתאימים כאשר תתבקשו לעשות זאת. לאחר ביצוע כל תסריט בסעיפים 5 ו -6, כל משתני הקלט שנשלחים באופן אוטומטי בחלון הפקודה ותפוקות נוצרות באופן אוטומטי. בסעיף 5.7 המשתמש יתבקש לבחור סף מדרון. הערך של סף המדרון משפיע על הריבוע של מקדם המתאם (r 2) לכושר. כאשר משתמשים בנתוני הקרינה גלם מיוצאים מCycler תרמית, ערכים בין 2.0 ו -5.0 נוטים להניב r 2 מקדם גבוה. בסעיף 5.8 המשתמש חייב לציין את מספר סטיות תקן מעל הרקע כדי לקבוע את הסף החיובי. להבקיע מדגם כחיובי או שלילי, התסריט קובע באופן אוטומטי מדגם Δ ההבדל בין המקסימום ומינימום הקרינה עבור כל דגימה באמצעות נתוני הקרינה הגלם המיוצאים מTHERMACycler l. היא מחשבת את ההבדל הממוצע רקע Δ ורקע σ סטיית תקן עבור דגימות שליטה כל לא-יעד. מדגם נחשב חיובי אם מדגם Δ הוא יותר מz × רקע σ מעל רקע Δ. בסעיף 5.10 המשתמש מחליט אם להשתמש בסף ברירת המחדל או להגדיר סף חדש. אם המשתמש רוצה לקבוע רף חדש, לקבוע את הסף החדש בניסוי על ידי ביצוע ניסויים 3 כל 12 תגובות RPA המכילות ללא כל נוכחים DNA HIV-1. הגדר את הסף בעלייה הממוצעת בעוצמת הקרינה מהניסויים אלה בתוספת 3 סטיות תקן. לאחר שסיימתי את סעיף 6, תסריט JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m חוזר באופן אוטומטי את הריכוז המוערך DNA לכל תגובת qRPA (בlog10 עותקים). אם התסריט קובע כי אין DNA HIV-1 היה נוכח במדגם, המוערך הריכוז מופיע כאחד "Negative ל- HIV "או" לא חוקי, "תלוי אם אות הניאון לשליטה הפנימית החיובית גבוה מהסף (z × רקע σ + רקע Δ). אם משתמש אימות העקומה סטנדרטית עם מדגם ריכוזים ידועים, התסריט גם לחזור שולחן נוסף דומה לזה של טבלת 1.

על מנת לפתח assay RPA בזמן אמת המספק כימות מדויק, עקבי ניסיוני הוא קריטי. לדוגמא, השתמש באותה aliquots פריימר והבדיקה עבור שתי העקומה סטנדרטית וניסויים אימות. כמו כן להימנע להקפיא להפשיר מחזורים ידי אחסון aliquots פריימר והבדיקה על 4 מעלות צלזיוס בין ניסויים ולא -20 ° C. Aliquots התבנית המשמש לניסויים העקום ואימות הסטנדרטי מאוחסן באותו אופן. כדורי RPA אנזים וריאגנטים מאותו הרבה משמשים על פי המלצות היצרן. לבסוף, becaלהשתמש RPA חסר 'מחזורים' אמיתיים לשלוט במדויק את השיעור של הגברה, סטנדרטיזציה של צעדי משתמש היא הכרחית לחלוטין. כשהרכבת תגובות, המשתמש חייב תמיד לבצע את אותן הפעולות באותו סדר, מבלה בערך אותה הכמות של זמן בכל שלב. תגובות חייבים תמיד להיות מעורבות בעדינות עם קצה פיפטה חדש, ובועות חייבות תמיד להיות מסולקות. לפני ההגברה, תגובות חייבת להיות מוחזקות בטמפרטורה עולה בקנה אחד, וCycler התרמית או תוכנת מיקרוסקופ חייבת תמיד להיות מוכנה לפני טעינת תגובות כדי למנוע כל הגברה בטמפרטורות תת-אופטימליים שיכול להשפיע על כימות. כל וריאציה בתנאי התגובה הראשוניות עשויה להוביל לחוסר עקביות בתוצאות ניסוי.

בעת השימוש במיקרוסקופ כדי לאסוף נתונים, משתנים נוספים חייבים להיות מבוקרים כדי למזער את השונות בעוצמת הקרינה. כל התגובות חייבות להיות ממוקמות באותו האזור על חם הבמה, וmicroscoPE חייב להיות ממוקד באותו האזור של הבאר לכל מדגם. גם אם פרקטיקות אלה הן אחריו, נתוני הקרינה נאספו על מיקרוסקופ עשויים להפגין השתנות בשל כתמים בהירים היוצרים באופן טבעי מקומיים במהלך תגובות RPA, היווצרות בועה בתוך תאי התגובה, או photobleaching כתוצאה מחשיפה חוזרת ונשנית לעירור אור. ההשפעה של משתנים אלו באה לידי ביטוי בנתוני הקרינה נאספו על המיקרוסקופ (איורים 4 א ו -4 ב), המדגימים השתנות בסיסית, פסגות, ושקתות. תכונות אלה נעדרות מנתוני הקרינה נאספו על Cycler התרמית (איורים 3 א ו 3 ב '). סופו של דבר, איסוף נתונים על מיקרוסקופ הוא למטרות הוכחה של עיקרון בלבד וassay הסופי ייושם על קורא הקרינה שדה-נתיח עם גיאומטריה מדויקת יותר ושליטה בתוכנה שממזערת המשתנים הללו.

חשוב נוסףהיבט של תהליך פיתוח assay qRPA הוא עקביות בעיבוד נתונים. הפרוטוקול שתואר בסעיף השיטות משתמש בסקריפטים לעבד נתונים גולמיים הקרינה (מאוחסנים בקובץ גיליון אלקטרוני) שנאספו מCycler או מיקרוסקופ תרמית. כל הניסויים המשמשים לבניית עקומת הסטנדרט חייבים להיות מעוצבים באופן זהה. בעת השימוש בCycler תרמית כדי לאסוף נתונים, יש להשתמש באותה פריסת צלחת, ונתונים מבארות שאינו מכילים תגובות RPA לא חייבים להיות מיוצאים. בעת השימוש במיקרוסקופ כדי לאסוף נתונים, הפורמט של הנתונים חייב להיות תואם לפורמט של הנתונים המיוצאים באופן אוטומטי מCycler התרמית. לדוגמא, הנתונים לא-יעד-שליטה חייבים להיות בC2 תאים: C61, ונתונים להגדלת ריכוזי תבנית חייב להיות בתאי D2: D61, E2: E61, וכו 'אם יש חזרות מרובות של כל ריכוז בניסוי, סדרת דילול 2 nd לשכפל יש להזמין משמאל לימין מכל שליטת יעד (NTC) לריכוז הגבוה ביותר ונשמר בעמודות באופן מיידי לזכותו של רח '1 סדרת דילול לשכפל. לדוגמא, בפריסת צלחת שימוש בסעיף 1.2 עם 2 משכפל עבור כל דגימה, נתוני הקרינה ללשכפל 1 של כל דגימה בסדרת הדילול יש לשמור בתאי C2: נתוני H61 וקרינה ללשכפל 2 של כל דגימה ב סדרת הדילול יש לשמור בI2 תאים: N61. לפריסת צלחת שימוש בסעיף 1.2, זוהי ברירת המחדל עיצוב בעת יצוא נתונים מהתוכנה Cycler תרמית לגיליון אלקטרוני.

נציגי נתונים שסופקו מניסויי HIV-1 qRPA להפגין את תמיכת הוכחה של הקונספט שRPA עשוי לשמש לכימות של ריכוז חומצת גרעין בדגימות ידועות. יש לי בדיקות עומס שימושיות קליני HIV-1 נגיפיות טווח קליני של לפחות 4 סדרי גודל, דיוק של 0.5 log10 עותקים, וזיהוי גבול-של-של לפחות 200 עותקים 19,20. Assay DNA HIV-1 תאר פוגש cr אלהiteria והמדויק ביותר בריכוזים נמוכים, כפי שמוצגים בטבלה 1. לכן, עם הצטרפותם של צעד transcriptase הפוך, תוצאות אלו מצביעות על כך שassay HIV-1 RT-RPA ייתכן שיש לו את הפוטנציאל למדוד HIV-1 עומס נגיפי ב דגימות קליניות. בעת פיתוח assay qRPA, התאמת פרמטרי האלגוריתם רשאי לכוון את הטווח דינמי הרגישות וליניארי בהתאם לצרכים קליניים. איור 6 מראה כי התאמת z (פרמטר הקובע את הסף לדגימות חיוביות) יכולה להשפיע על הרגישות ודיוק בנמוכה וגבוה ריכוזי יעד. יתר על כן, ייתכן שניתן להגדיל את הרזולוציה ודיוק של כימות על ידי דוגרים תגובות בטמפרטורה נמוכה יותר או באמצעות אצטט מגנזיום פחות, ובכך להקטין את השיעור של הגברה.

הוכחה זו של assay qRPA מושג יכולה לשמש כדי לכמת את הריכוז של דגימות המכילות DNA HIV-1. Assay qRPA המתואר בma זהnuscript כולל הוראות מפורטות כיצד להרכיב תגובות RPA בזמן אמת, לפתח ומסך IPC, ולעבד את נתוני הקרינה גלם לבניית עקומה סטנדרטית שניתן להשתמש בי לכמת דגימות ידועות. עם ההוראות מפורטות כלולות, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם ללכמת ריכוז ה- DNA במגוון רחב של דוגמאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי מענק מקרן ביל ומלינדה גייטס באמצעות אתגרי Grand בHealth Initiative הגלובלי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qRPA Assay
HIV-1 forward primer Integrated DNA Technologies custom DNA oligos 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 
HIV-1 reverse primer Integrated DNA Technologies custom DNA oligos 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ 
HIV-1 probe BioSearch Technologies  custom DNA oligos 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 
IPC probe BioSearch Technologies  custom DNA oligos 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate TwistDx TwistAmp exo
PCR tube strips BioRad TLS0801
PCR flat cap tube strips BioRad TCS0803
Micro-seal adhesive BioRad 558/MJ 
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Human male genomic DNA Applied Biosystems 360486
96 well cold-block Cole Parmer EW-36700-48
Thermal cycler BioRad CFX96
MiniFuge VWR 93000-196
Vortex VWR 58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 EMD Millipore 648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Promega V4321
Nuclease free water Ambion AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template Waterborne Inc P102C It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1
PCR long forward primer Integrated DNA Technologies custom DNA oligos 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR long reverse primer Integrated DNA Technologies custom DNA oligos 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase New England Biolabs M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
TAE 10X buffer EMD Millipore 574797
Agarose Sigma Aldrich A9539
Microscope Experiments
Upright fluorescence microscope Zeiss Zeiss Imager.J1
Stage heater Bioscience Tools TC-GSH
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller Bioscience Tools TC-1100S
FAM/GFP filter cube Zeiss filter set 38 (000000-1031-346) excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm
HEX filter cube Chroma 49014 excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm
Laser cutter Engraver's Network VLS3.60
1/8" black acrylic McMaster Carr 8505K113
1.5 mm clear acrylic McMaster Carr PD-72268940 
Super glue Office Depot Duro super glue 
PCR grade mineral oil Sigma Aldrich M8662-5VL
Data Analysis
Microsoft Excel Microsoft
MATLAB MATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” Included in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” Included in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” Included in SI
Adobe Illustrator Adobe
JoVE_qRPA_well.ai Included in SI
JoVE_qRPA_base.ai Included in SI
AxioVision software Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript Included in SI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yoon, J. -Y., Kim, B. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety. Sensors. 12, (8), 10713-10741 (2012).
  2. Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites. Journal of Microbiological Methods. 49, (3), 209-224 (2002).
  3. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75, (1), 1-4 (2013).
  4. Asiello, P. J., Baeumner, A. J. Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab on a Chip. 11, (8), 1420-1430 (2011).
  5. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology. 4, (7), 1115-1121 (2006).
  6. Krõlov, K., Frolova, J., et al. Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples. The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16, (1), 127-135 (2014).
  7. Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a, Puchades, R., Maquieira, A. Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis. Analytica Chimica Acta. 811, (1), 81-87 (2014).
  8. Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis. Malaria Journal. 13, (1), 99 (2014).
  9. Crannell, Z. A., et al. Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens. Analytical Chemistry. 86, (5), 2565-2571 (2014).
  10. Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA. Lab on a Chip. 12, (17), 3082 (2012).
  11. Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening. Talanta. 115, (1), 159-165 (2013).
  12. Euler, M., et al. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents. Journal of Clinical Microbiology. 51, (4), 1110-1117 (2013).
  13. Abd El Wahed, A., et al. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. PloS One. 8, (8), e71642 (2013).
  14. Escadafal, C., et al. Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, (3), e2730 (2014).
  15. Hutson, S. L., et al. T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest. PLoS ONE. 5, (11), 15 (2010).
  16. Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy. 8, (1), 118-129 (2003).
  17. DNA Extraction from Serum. Life Technologies. Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html (2014).
  18. Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification. Analytical Chemistry. 86, (12), (2014).
  19. Sollis, K. a, et al. Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples. PloS one. 9, (2), e85869 (2014).
  20. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. Department of Health and Human Services. Washington D.C. 1-166 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics