Udvikling af en kvantitativ rekombinase Polymerase amplifikationsanalyse med et indre Positiv kontrol

1Department of Bioengineering, Rice University
* These authors contributed equally
Published 3/30/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Crannell, Z. A., Rohrman, B., Richards-Kortum, R. Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control. J. Vis. Exp. (97), e52620, doi:10.3791/52620 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Kvantitativ nukleinsyreamplifikation er en vigtig teknik til påvisning af miljø-, fødevarebårne og vandbårne patogener samt til klinisk diagnostik. Real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) er guldstandarden metode til følsomme, specifikke og kvantitativ påvisning af nukleinsyrer, fx for HIV-1 viral afprøvning belastning påvisning af bakterielle patogener, og screening for mange andre organismer 1 - 3. I realtid qPCR primere opformere patogen DNA i cyklusser, og et fluorescerende signal genereres, der er proportional med mængden af ​​amplificeret DNA i prøven ved hver cyklus. En prøve indeholdende en ukendt koncentration af patogen DNA kan kvantificeres ved hjælp af en standardkurve, der relaterer den oprindelige DNA-koncentration af standardprøver og det tidspunkt, hvor det fluorescerende signal når en vis tærskel (dvs. tærskelværdien cyklus eller C T).

polymerase amplifikation (RPA), er blevet udviklet 4. Disse platforme generelt giver resultater hurtigere og amplificere nukleinsyrer ved en lavere, enkelt temperatur, der kan opnås med billigere, enklere udstyr. RPA, hvilket er særlig attraktivt for point-of-care-programmer, forstærker DNA i minutter, kræver en lav forstærkning temperatur (37 ° C), og forbliver aktiv i nærværelse af urenheder 5,6. RPA assays er blevet udviklet til en bred vifte af applikationer, herunder mad analyse påvisning af patogener, cancer drug screening, og afsløring af biothreat agenter 7-12. Imidlertid har brug af RPA til kvantificering af nukleinsyrer været begrænset 13,14.

I tidligere arbejde, det var shown at real-time kvantitativ RPA (qRPA) er mulig 15. Her er en mere detaljeret protokollen i henhold til at bruge real-time kvantitativ RPA at kvantificere ukendte prøver ved hjælp af en standardkurve, en metode, der er analog med kvantificering hjælp qPCR. Denne protokol beskriver, hvordan man udfører en RPA reaktion på en termisk variator til at påvise HIV-1 DNA som et proof-of-concept, samt hvordan man kan udvikle en intern positiv kontrol (IPC) at sikre, at systemet fungerer korrekt. Dataindsamling ved hjælp af en termisk cykler eller mikroskop og dataanalyse til at konstruere en standardkurve ved hjælp træningsdata også detaljeret. Endelig er metoden til kvantificering ukendte prøver ved hjælp af standardkurven med en brugerdefineret script demonstreret. Dette qRPA teknik muliggør kvantificering af prøver med ukendte koncentrationer og har mange fordele frem for traditionelle realtid qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Programmer den termiske variator for real-time qRPA Reaktioner

  1. Opret en ny protokol i den termiske cycler software.
    1. Indsæt en forinkubationstrin: 39 ° C i 1 min.
    2. Tilføj et andet trin: 39 ° C i 20 sekunder efterfulgt af en plade læser.
    3. Endelig indsætte en "gå til", der gentager det andet trin 59 gange mere.
    4. Gem protokollen.
  2. Opret en ny plade i "plade editor" fanen af ​​softwaren. Vælg brønde på pladen, der svarer til placeringerne af RPA reaktioner (her betjene brønde A1, A4-A8, B1 og B4-B8).
    BEMÆRK: Det er ikke vigtigt, om prøven typen af brøndene (fx "Standard", "NTC") er angivet, da dataanalyse sker ved hjælp af en brugerdefineret script.
    1. For forsøg, der indeholder HIV-1-DNA alene, skal du vælge "HEX" fluorofor for alle brønde. For eksperimenter, der indeholder HIV-1-DNA og en intern positiv control Vælg både "HEX" og "FAM" fluoroforer til alle brønde. Gem pladen.

2. Forbered for HIV-1 qRPA Eksperimenter

  1. Saml RPA reaktioner i en udpeget pre-forstærkning arbejdsområde indeholder udpegede pipetter, pipettespidser, Vortexer og mini-centrifuge, som for qPCR. Som RPA kan forstærke en enkelt kopi af DNA med så meget som ti størrelsesordener (data ikke vist), håndtere og bortskaffe rør indeholdende efterfølgende-amplificerede DNA-produkter i et bestemt post-forstærkning område.
    1. Undgå kontakt mellem alle pre-amplifikationsreagenser og post-amplifikationsprodukter. Spray pre-forstærkning arbejdsområder og udstyr med 50% blegemiddel før og efter alle forsøg. Brug et stykke køkkenrulle til at tørre væk overskydende blegemiddel.
  2. Køb fremadrettet primer 5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3 'og revers primer sekvens 5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3 'fra kommercielle DNA synthesizere. Køb probesekvensen 5'TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA / HEX] GC [THF] C [DT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3 "fra kommercielle kilder. Opbevar alle primere og prober ved 4 ° C i portioner ved en koncentration på 10 uM før brug.
    BEMÆRK: qRPA analysen forstærker en unik HIV-1-sekvensen. Til dette proof-of-concept-assay, brug plasmidet pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr beskrevet af Sutton et al, som indeholder målsekvensen 16.. For qRPA eksperimenter blev plasmidet opbevaret ved 4 ° C i portioner indeholdende 1, 10, 10 2, 10 3, og 10 4 kopier pr pi i en buffer indeholdende 10 mM Tris, 0,1 mM EDTA ved pH 8,0 og 1 ng / pi humant genomisk bærer-DNA (360.486). Denne bærer DNA-koncentration svarer til DNA-koncentrationen opnået fra kommercielle serum DNA-ekstraktion kits anvendes til HIV-1 diagnose 17. Disse HIV-1fortyndinger blev anvendt som skabeloner i qRPA reaktioner til at bygge en standardkurve.

3. Saml en HIV-1 qRPA standardkurve

  1. Før montering af qRPA reaktioner forberede pre-forstærkning arbejdsområde som beskrevet i trin 2.1.1. Placer en 96-godt kold blokeret opbevaring ved 4 ° C.
  2. Forbered reagenser til 12 reaktioner:
    1. Flyt magnesiumacetat, den rehydrering buffer, og 12 RPA reaktion pellets til pre-forstærkning arbejdsområde.
    2. Optø magnesiumacetat og rehydrering buffer ved stuetemperatur.
    3. Alikvot 32,5 pi magnesiumacetat (2,5 pi per reaktion) til et mikrocentrifugerør.
    4. Forbered en 13x mester mix. Tilføj 383,5 pi af rehydrering buffer (29,5 pi per reaktion) til en separat mikrocentrifugerør til master mix Tilføj 41.6 pi nukleasefrit vand (3,2 gi pr reaktion) til master mix. Vortex mester mix.
    5. Retur magnesium acetate og rehydrering puffer til opbevaring ved -20 ° C.
    6. Flyt primer og probe portioner fra køleskabet til den præ-forstærkning område, undgå overdreven udsættelse for lys for at minimere fotoblegning.
    7. Tilføj 27.3 pi hver af de 10 pM forward og reverse primere (2,1 pi per primer per reaktion) til master mix.
    8. Tilføj 7,8 ul af 10 uM HEX-mærket HIV-1 DNA-probe (0,6 gi pr reaktion) til master mix.
    9. Retur primere og probe til opbevaring.
  3. Matchende pladen layout beskrevet i afsnit 1.2, skal du placere 1 enzym pellet i hver af den yderste venstrefløj rør og 1 enzym pellet i hver af de 5 langt højre rør af 2 lave 8-brønds PCR-rør strimler.
  4. Derefter tilsættes forsigtigt 37,5 pi masterblanding til hvert rør indeholdende et enzym pellet, ved hjælp af en ny pipettespids til hvert rør og forsigtigt omrøring master mix og pellet med spidsen, indtil pellet er helt opløst. Rør forsigtigt for at forhindre boble formatiom, og fjern spidsen forsigtigt for at forebygge tab af reaktionen volumen.
  5. Når alle enzym piller er blevet rehydreret med master mix, hente 96 brønde kold blok fra 4 ° C opbevaring. Placer PCR-rør strips i den kolde blok til nedkøling master mix.
  6. Mens master mix køling, indlæse termiske cykler software med protokollen og plade beskrevet i afsnit 1.
  7. Skær 2 strimler af klar plast mikro-sæl lim til at være lidt bredere end PCR-rør, og hente 2 fladskærms PCR rør strimler låg.
  8. Hent 6 skabelon portioner fra lager (indeholdende 0, 1, 10 1, 10 2, 10 3, eller 10 4 kopier af HIV-1-plasmid per mikroliter).
  9. Tilføj 10 pi hver skabelon til rørene udpeget til det template koncentration. Brug en ny pipettespids til hvert rør, forsigtigt omrøring af opløsningen med spidsen at blande master mix og skabelon. Vær sikker på at tilføje skabelonen til den korrekte placering til match pladen layout beskrevet i afsnit 1.2.
  10. Kontroller, at et PCR-rør strimmel adapter til mikrocentrifuge er på plads.
  11. Dispenser 2,5 pi magnesiumacetat i hvert rør låg, der skal placeres på et rør indeholdende en qRPA reaktion.
  12. Forsigtigt placere låg på toppen af ​​PCR-rør, således at de ikke er fuldstændig forseglet og kan fjernes. Den magnesiumacetat vil overholde lågene og være klart synlig fra oven.
  13. Sæt hver PCR rør strimmel med låg ind i hver side af PCR-rør indehaveren. Luk låget af minifuge at dreje magnesiumacetat af lågene og ind i RPA reaktion, indledning af RPA reaktion. Centrifugeres indtil alle bobler fjernes, og al væske opsamles i bunden af ​​hvert rør (ca. 10 sek).
  14. Fjern hurtigt PCR rør strips og returnere dem til den kolde blok til standse qRPA reaktioner.
  15. Fjern forsigtigt låg for at forhindre aerosoldannelse og forsegle hver PCR-rør strimmel med snittetstykker af klar mikro-forseglingsfilm.
  16. Hurtigt gå til termiske cykler og indlæse de to PCR-rør strimler i den termiske variator i de steder der matcher plade layout (brønde A1-B8). Luk låget af termiske cykler, skal du klikke på "Start Run", og udpege et filnavn til eksperimentet.
    BEMÆRK: Selvom producenten anbefaler omrøring af prøven efter 5 minutters inkubation, er dette trin ikke nødvendigt for denne særlige assay og kan udelades.
  17. Når kørslen er færdig, skal du vælge "Indstillinger", "Baseline Indstilling," "Nej Baseline Subtraktion" for at vise de rå fluorescensdata. Eksportere data til et regneark ved at vælge "Export", "Eksporter alle datablade til Excel." En fil med tillægget "Kvantificering Amplification resultater" vil blive oprettet som indeholder de rå realtid fluorescensdata.

4. Udvikle en intern positiv kontrol

  1. Vælg en DNA-sekvens fra en art, der er usandsynligt at finde i målet prøven. Sekvensen skal være længere end målamplikonet så generation af målsekvensen er begunstiget.
    BEMÆRK: denne analyse, Cryptosporidium parvum, en intestinal parasit, blev valgt til at tjene som skabelon for generation af IPC-sekvensen, fordi denne organisme er usandsynligt at finde i blod og var til rådighed i laboratoriet fra et andet projekt. For at generere IPC-sekvensen, udvinde og oprense DNA fra C. parvum oocyster som beskrevet andetsteds 18.
  2. Køb den fremad (5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3 ') og omvendt (5'CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3) primere fra kommercielle kilder. IPC PCR-primere, der anvendes i dette assay er vist i figur 1 og indeholder en region, der er komplementær til IPC skabelon DNA (fx C. parvum, lilla i figur 1) og en region, der er komplementær til målorganismen (f.eks HIV-1, blå i figur 1).
  3. Udfør PCR under anvendelse af primerne og IPC template DNA.
    1. Saml 50 pi PCR-reaktioner ved hjælp af Phusion High-Fidelity DNA Polymerase reagenser ifølge producentens instruktioner, bortset fra polymerase. Brug 2 pi DNA-skabelon og Phusion Buffer HF.
    2. Tilsæt Phusion polymerase til hver reaktion efter en varm start ved 98 ° C efterfulgt af 60 sekunder ved 98 ° C efterfulgt af 40 cykler af 15 sekunder ved 98 ° C, 30 sekunder ved 62 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C med en endelig forlængelse ved 72 ° C i 5 min. Efter termisk cykling, holde prøverne ved 4 ° C.
    3. Analysere prøver ved gelelektroforese på en 2% TAE-agarosegel, og derefter udvinde og oprense DNA under anvendelse af QIAquick Gel Extraction Kit ifølge mikrocentrifuge protokol følger medsættet.
  4. Screen IPC kandidater til deres evne til at forstærke hjælp qRPA.
    1. Forbered qRPA reaktioner som beskrevet i afsnit 3, ved hjælp af HIV-1-primere, en FAM-mærket probe specifikke for IPC (5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] t [THF] t [DT-BHQ1 ] GGT TTT GTA ATT GGA A -3), og i alt 0, 10, 10 2, 10 3, 10 4, eller 10 5 eksemplarer af hver IPC kandidat pr reaktion, teste alle koncentrationer i to eksemplarer.
    2. Vælg IPC kandidat, der forstærker mest konsekvent og har den laveste grænse-of-detektion.
  5. Co-amplifikation af HIV-1 og IPC at bestemme den optimale koncentration af IPC-DNA.
    1. Svarende til afsnit 3, kombinere følgende i hver 50 pi reaktion: 29,5 pi rehydrering buffer, 2,1 pi RPA af forward primer [10 pM], 2,1 pi RPA revers primer [10 pM], 0,6 pi HIV-1 HEX -mærket probe [10 pM] 10 piaf HIV-1-DNA ved forskellige koncentrationer, 2,5 pi magnesiumacetat og 1 enzym pellet. Stedet for at tilsætte 3,2 pi nuclease frit vand som det blev gjort i trin 3.2.4, tilsættes 0,6 pi IPC FAM-mærkede probe [10 pM], og 2,6 pi IPC DNA. Brug IPC koncentration, der er grænsen-of-detektion (LOD) når qRPA udføres med IPC DNA alene (LOD defineret som den laveste koncentration, hvor mængden af ​​fluorescens signal generation er større end den, der genereres af fluorescens genereres af prøver med ingen mål-DNA).
    2. Inkuber prøverne ved hjælp af protokollen beskrevet i afsnit 1.1.
    3. Hvis IPC ikke forstærke i hver prøve, overveje at gentage forsøget med en IPC koncentration en størrelsesorden højere. Den optimale koncentration af IPC-DNA til HIV-1-assayet er 10.000 kopier / pi. Mens prøver betragtes som gyldige, hvis der enten er IPC eller HIV-1 DNA-amplifikation, ideelt IPC udviser påviselig forstærkning forhver reaktion.

5. Opbygning af en standardkurve fra flere eksperimenter

  1. Sikre data for hvert forsøg er blevet eksporteret til et regnearksprogram som beskrevet i afsnit 3.13.
  2. Åbn og køre scriptet "JoVE_qRPA_standard_curve.m". Alle indgange er automatisk bedt i kommandovinduet. Efter scriptet startes, bliver brugeren automatisk bedt om at udpege "Antal datafiler" bruges til at bygge standardkurven.
  3. I kommandovinduet, skal du skrive det antal filer, der skal bruges til at bygge standardkurven og tryk enter.
  4. Indtast kommandovinduet antallet af prøver og antallet af gentagelser i hver træning fil (tryk på ENTER efter hver indtastning).
    BEMÆRK: I pladen layout er beskrevet i afsnit 1.2, der var 6 prøver med forskellige koncentrationer og 2 gentagelser af hver prøve).
  5. Indtast kommandoen vinduet laveste DNEn koncentration bruges til at opbygge standardkurven (i log10 kopier) og tryk enter (for pladen layout beskrevet i afsnit 1.2, den laveste skabelon koncentrationen er '1' log10 kopier).
  6. Indtast kommandovinduet forskellen i koncentration mellem hver standard (i log10 kopier) og derefter trykke på enter (for pladen layout beskrevet i afsnit 1.2, at koncentrationen interval er "1" log10 kopier).
  7. Efter at være blevet bedt om det, skal du skrive "Slope tærskel" i kommando vinduet og trykke på enter.
  8. I kommandovinduet, skal du skrive "Number (z) standardafvigelser over baggrunden for positive tærskel", og tryk derefter på enter. Typiske værdier for z området fra 1 til 5.
  9. Angiv, om blev indsamlet data ved hjælp af termiske cykler ('1'), * .tiff mikroskop billeder ('2'), eller * .jpg mikroskop billeder ('3') ved at skrive nummeret »1 ',' 2, ' eller »3« og pressing ind.
  10. Vælg at indstille en ny IPC tærskel eller at anvende en standardværdi for tærsklen ved at skrive 'Y' eller 'n, ", når det blev bedt om det.
  11. Dernæst skal du vælge hvert af de regneark filer, der bruges til at bygge standardkurven.
    BEMÆRK: Scriptet vil derefter automatisk importere HEX og FAM fluorescensdata; afgøre, om hver reaktion var gyldig (dvs. om fluorescenssignalerne oversteg tærsklerne for HEX eller FAM kanaler); bestemme r 2 koefficienten for en eksponentiel, lineær, og anden ordens polynomium; plot "log10 kopier versus tærsklen cyklus" for hver prøve bruges til at bygge standardkurven; og oprette et regneark fil, der indeholder væsentlige variabler til at genopbygge den standardkurve for validering eksperimenter uden at brugeren skal indtaste alle de inputparametre igen.

6. Assay Validering og kvantificering af ukendte prøver Brugstandardkurven

  1. Brug scriptet "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" for at vurdere præcision og nøjagtighed af analysen ved hjælp af prøver med kendte koncentrationer eller bruge den til at sætte tal på prøver med ukendte koncentrationer.
    Bemærk: Da tidligere offentliggjorte forskning viste, at en eksponentiel pasform gav den bedste R-kvadreret koefficient 18, dette script anvender en eksponentiel egnet til standardkurven. Hvis en anden type fit er ønsket, kan scriptet ændres i overensstemmelse hermed.
    1. Åbn og køre scriptet "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m". Efter scriptet startes, bliver brugeren automatisk bedt om at indtaste alle input i kommandovinduet.
    2. Indtast "1" for at validere en analyse ved hjælp af en standardkurve med kendte prøvekoncentrationer eller indtaste '2' for at kvantificere ukendte prøver.
    3. Når du bliver bedt, skal du enten vælge en gemt standardkurve eller bygge et nyt ved at indtaste the oplysninger, der automatisk anmodet i kommandovinduet (de samme oplysninger, der kræves til "JoVE_qRPA_standard_curve.m" script fra afsnit 5).
    4. Indtast antallet af forsøg (dvs. regneark filer) for at analysere for validering / kvantificering.

7. Forberedelse til dataindsamling Ved hjælp af en fluorescens mikroskop og en opvarmet Chip

  1. Sørg for fluorescens mikroskop har en scene varmelegeme og 1-Channel Precision High Stabilitet temperatur controller på plads.
  2. Sørg for fluorescens mikroskop har et filter terning at begejstre og indsamle fluorescens fra hver fluorofor. Excite og indsamle FAM fluorescens genereres under IPC DNA-amplifikation gennem et GFP-filter (excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm). Excite og indsamle HEX fluorescens genereres under HIV-1 DNA-amplifikation gennem et HEX-filter (excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm).
  3. Brug mikroskopet script redigering software til at skabe en automatiseret algoritme til at replikere dataindsamling på den termiske variator.
    1. Indsæt først en "Settings" skridt for at lukke lukkeren. Næste tilføje en "Exposure" trin for at indstille eksponering til 60 sek. Sæt en "Snap" for at udføre 60 sek forsinkelse, som gennemfører 1 min før inkubationstid. Tilføj en "Indstilling" skridt for at ændre arbejdsgruppen til GFP filter. Indsæt en anden "Exposure" skridt for at justere eksponeringen til 200 ms. Alle engagementer ved hjælp af GFP eller HEX filter terninger vil blive sat til 200 ms.
    2. Efter "Exposure" trin, tilføje en "Snap" og angiv kameraet med som billedet vil blive taget. Brug en anden "Indstilling" skridt for at lukke lukkeren og en "Gem billede" skridt for at gemme billedet i en brugerdefineret midlertidig mappe.
    3. Næste kontakten til HEX filter terning bruge en anden "Indstilling" trin og thda Tilføj en "Exposure" på 200 ms, en "Snap," og en "Gem billede" skridt.
    4. Gentag denne proces 59 gange med en indledende forsinkelse på 20 sek i stedet for 60 (tæt lukker, vent 20 sek, skifte til GFP filter terning, indstille eksponering til 200 ms, snap tæt lukker, gemme, skifte til HEX filter terning, indstille eksponering til 200 ms, snap).
  4. Opret en chip der vil holde qRPA reaktioner.
    1. For forsøg med mikroskopet, bruge filen JoVE_qRPA_base.ai at skære en 40 x 15 mm rektangulær bund fra en plade af 1/8 "tyk sort akryl hjælp af en laser cutter sat til 100% effekt, 10% hastighed.
    2. Brug filen JoVE_qRPA_well.ai at skære reaktion godt består af en 10 x 10 mm kvadrat med en 5 mm diameter cirkulært hul skåret fra en plade på 1,5 mm tyk klar akryl.
    3. Monter op til tre brønde til en enkelt base ved hjælp af superlim gel.
    4. Tørre natten over.

8. Dataindsamling og Analysis hjælp af et fluorescensmikroskop

  1. Forbered mikroskopet for dataindsamling ved at indlæse den automatisk dataindsamling script JoVE_AxioVision_Script.ziscript.
    1. Indstil fase varmeren til 48 ° C og forvarme reaktionen chip på scenen varmeapparat til omkring 20 min. En temperaturindstilling på 48 ° C opretholder en temperatur på 39 ° C i reaktionen godt (data ikke vist).
    2. Ved hjælp af en 10X, 0,45 NA mål, fokus på toppen af ​​den indre kant af reaktionen godt med GFP filter på plads. Kanterne af akryl er autofluorescerende efter laserskæring og let kan visualiseres. Efter fokusering, ikke justere højden på mikroskopbordet indtil indsamles alle data.
  2. Saml qRPA mester mix i en udpeget pre-forstærkning arbejdsområde som beskrevet i trin 4.5.1. For hver prøve blandes et enzym pellet, master mix, og HIV-1-DNA skabelon i et mikrocentrifugerør. Tilføj 2,5 pi magnesiumacetat til den første reaction og kort vortex.
  3. Hurtigt transportere mikrocentrifugerør indeholdende qRPA prøven til fluorescensmikroskop.
    1. Pipette forsigtigt 30 pi af RPA reaktion i reaktionen godt uden at skabe bobler. Anbring en dråbe PCR-grade mineralolie over RPA reaktion for at forhindre fordampning.
    2. Placer godt direkte under mikroskop mål, idet man kun billede centrum af brønden, ikke nogen af ​​auto-fluorescerende akryl kanter. Efter godt er placeret, skal du køre den automatiserede script 7. Scriptet genererer et JPEG-billede ved hjælp af FAM filter terning og en JPEG-billede ved hjælp af HEX filter terning hver 20 sek.
  4. Når scriptet er færdig, overføre disse billeder ud af den midlertidige mappe opbevaring før du kører yderligere prøver.
    1. Opret 2 mapper: 1 for hver fluorofor (dvs. "HEX" og "FAM). Opbevar begge mapper i samme overordnede mappe. I hver fluoroformappe, oprette en mappe mærket med det antal DNA-kopier til stede i prøven (fx 0, 10, etc.).
    2. Overfør alle filer med præfikset »HEX 'i den tilsvarende undermappe i mappen" HEX ". Overfør alle filer med præfikset »GFP 'i den tilsvarende undermappe i mappen" FAM.
  5. Gentag Sektioner 8,2-8,4 for qRPA reaktioner med 0, 10, 10 2, 10 3, 10 4, og 10 5 HIV-1-DNA-kopier.
  6. Efter opsamling af data for alle qRPA prøver i et eksperiment, indlæse scriptet "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m." Når du bliver bedt om af scriptet, skal du vælge den overordnede mappe, der indeholder de 2 fluoroforen mapper, som igen indeholder billederne for hver koncentration i undermapper.
    BEMÆRK: Scriptet vil automatisk generere et regneark fil i det overordnede bibliotek, hvor HEX fluorescensdata vil blive gemt i et ark named 'HEX ", og FAM fluorescensdata vil blive gemt i et ark med navnet' FAM. I hvert ark, er antallet af cykler er angivet i kolonne B, og realtids-fluorescensdata for stigende koncentrationer af template er angivet i kolonne C, D, osv. Hver realtid fluorescens datum er den gennemsnitlige fluorescensintensitet af billedet opfanget ved at tidspunkt.
  7. Brug standard scatter plot funktion i regnearksprogram at plotte cellerne B2: H61 af "HEX" og "FAM" ark til at visualisere realtid fluorescens og generere grunde svarende til dem i figur 2A, 2B, 3A og 3B.
    BEMÆRK: regneark frembragt i trin 8.6, kan også anvendes i scripts "JoVE_qRPA_standard_curve.m" og "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før valg en sekvens at tjene som IPC i qRPA eksperimenter med target (HIV-1) DNA, intern positiv kontrol (IPC) ansøgere genereres og screenes for deres evne til at forstærke i qRPA reaktioner uden HIV-1-DNA til stede. IPC kandidater er længere end målet (HIV-1) DNA for at forhindre IPC dannelse fra ud-konkurrerende HIV-1 amplicon formation. Som vist i figur 2A, generering af to C. parvum IPC kandidater blev verificeret ved tilstedeværelsen af 415 og 435 bp bånd ved hjælp af gelelektroforese. I qRPA reaktioner kortere IPC kandidat udviste lidt amplifikation (figur 2B), mens den længere kandidat konsekvent forstærket, når i alt 10 4 og 10 5 kopier var til stede (figur 2C). Således blev længere kandidat valgt til at være IPC for HIV-1 qRPA eksperimenter.

Real-time qRPA kan udføres ved anvendelse målet af interesse alene eller ved hjælp afbåde målet og IPC. Figur 3 viser et eksperiment på den termiske cycler under anvendelse af både HIV-1-DNA og C. parvum IPC. I dette eksperiment blev der tilsat 2,6 x 10 4 kopier af IPC-DNA til hver reaktion, en koncentration tæt på IPC detektionsgrænsen, at undgå at påvirke grænsen for påvisning af HIV-1-mål-DNA. Som vist i figur 3A, som viser HEX fluorescensdata svarer til realtid HIV-1-DNA generation, det tidspunkt, hvor påviselig forstærkning begynder er omvendt proportional med den oprindelige målkoncentration. Således amplifikation fremgår tidligere for høje koncentrationer af HIV-1-DNA og senere for lave koncentrationer af HIV-1-DNA. I modsætning hertil påvises amplifikation af IPC-DNA begynder på omtrent samme tid, fordi udgangsmaterialet IPC koncentrationen er den samme i alle prøver, som vist i figur 3B, som viser FAM fluorescensdata svarende til IPC DNA generation under than samme eksperiment. Hastigheden af ​​fluorescens generation fra IPC er omvendt proportional med koncentrationen af ​​HIV-1-DNA på grund af konkurrencen under amplifikation.

Med det mål at udvikle et felt-operabel fluorescens læser med qRPA reaktioner kan qRPA eksperimenter udføres på en opretstående fluorescensmikroskop med en scene varmelegeme og 1-Channel Precision High Stabilitet temperaturregulator. Figur 4A og 4B display HEX og FAM fluorescensdata indsamlede på et mikroskop. Data indsamlet på mikroskopet ved hjælp af laser-cut chips demonstrere mindre variation i baseline fluorescens og toppe og dale, der kan være på grund af fotoblegning. Imidlertid scriptet afgør, hvornår cyklus ved hjælp af hastigheden af ​​ændringen af ​​fluorescens i den indledende forstærkning periode, som er upåvirket af basisliniefluorescensen eller variation i fluorescens efter den indledende amplifikation har fundet sted. Som det ses i Fifigur 4C standardkurven bygget fra dette eksperiment har en R 2 koefficient på 0.990. Især er IPC amplificerede kun lave koncentrationer af HIV-1-DNA. Selv om denne opførsel adskiller sig fra forsøg udført på den termiske cycler er alle prøver stadig er klassificeret som gyldig ved hjælp af denne metode.

Data fra flere forsøg under anvendelse af kendte målkoncentrationer kan udarbejdes til at konstruere en standardkurve, som derefter kan anvendes til at vurdere assay ydeevne eller kvantificere prøver med ukendte koncentrationer. Figur 5 viser data fra fem eksperimenter og en eksponentiel standardkurve genereret under anvendelse af scriptet "JoVE_qRPA_standard_curve.m" vedrørende den oprindelige HIV-1 målkoncentration til det tidspunkt, hvor detekterbar amplifikation begyndte. figur 5 anvendes 5 separate forsøg, som hver indeholder 2 qRPA reaktioner på hver skabelon koncentration at opbygge en standardkurve. Bemærk, at den eksponentiellefit har en høj R 2 koefficient på 0,959. Standardkurven blev derefter anvendt til at forudsige koncentrationen af yderligere prøver med kendte koncentrationer for assay ved anvendelse af et script "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" script. Tabel 1 viser kvantificering resultater for 5 yderligere forsøg under anvendelse af standardkurven i figur 5. Bemærk, at algoritme korrekt klassificeret alle prøver, som indeholder HIV-1 DNA som positive og 9 ud af 10 af de ikke-target-kontrolprøver som negative. Desuden var den gennemsnitlige forventede koncentration var inden for en størrelsesorden af ​​den korrekte koncentration og standardafvigelsen for forudsagte koncentrationer var mindre end 0,5 log10 (kopier pr reaktion).

Figur 1
Figur 1:. Blokdiagram af kvantitative RPA DNA-mål QRPEt assay forstærker to DNA-sekvenser flankeret af identiske sekvenser, som primere binder ("RPA fremad" og "RPA omvendt"). De amplificerede sekvenser er 1) en sekvens i HIV-1-genomet ("HIV-1"), der er detekteret med "HIV-1 probe" og 2) en intern kontrol sekvens positive ("IPC (C. parvum)") inkluderet i hver reaktion, påvises med "IPC probe." IPC blev genereret via PCR under anvendelse af Cryptosporidium parvum genom som en skabelon og primere ("PCR fremad" og "PCR reverse"), der indeholder en region komplementær til C. parvum (lilla) og en region komplementær til HIV-1 (blå). Figur oprindeligt udgivet i Analytical Chemistry 2014 genoptrykt her med tilladelse 9.

Figur 2
Figur 2: (A) to IPC ansøgere ('Forward Short "og" Forward Long «) og en kendt PCR positiv sekvens kontrol blev dannet ved anvendelse af PCR og visualiseret på en agarosegel, hvor 415 bp og 435 bp bånd var synlige . (B) Den korte IPC kandidat udviste lidt forstærkning i realtid RPA, mens (C) længere IPC kandidat forstærkes konsekvent, når i alt 10 4 og 10 5 eksemplarer var til stede. Figur oprindeligt udgivet i Analytical Chemistry 2014 genoptrykt her med tilladelse 9. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Typiske rå fluorescens data genereret ved samtidig amptil forbehold af HIV-1-DNA og IPC på en termisk cykler. (A) for HIV-1, indtræden af påviselig forstærkning, vist ved en tilsyneladende stigning i HEX fluorescens, optræder tidligere for høje koncentrationer af HIV-1 DNA. (B) For IPC, indtræden af påviselig forstærkning, vist med en tilsyneladende stigning i FAM fluorescens forekommer ved omtrent samme tid uafhængigt af DNA-koncentrationen HIV-1. Men hastigheden af ​​FAM fluorescens generation er omvendt proportional med mængden af ​​HIV-1-DNA til stede på grund af konkurrencen. Figur oprindeligt udgivet i Analytical Chemistry 2014 genoptrykt her med tilladelse 9.

Figur 4
Figur 4: Typiske rå fluorescensdata genereret under co-amplificering af HIV-1-DNA og IPC på et mikroskop (A) Svarende til data genereret på t.han thermocycler, indtræden af ​​påviselig hiv-1 forstærkning, vist ved en tilsyneladende stigning i HEX fluorescens, optræder tidligere for høje koncentrationer af HIV-1 DNA. (B) IPC forstærkning på mikroskopet, vist ved FAM fluorescens, fremgår for lav HIV-1 DNA-koncentrationer, men ikke altid synlige i prøver med høje HIV-1 DNA-koncentrationer. (C) En standardkurve kan bygges ved hjælp af de JoVE_standard_curve.m scripts, der giver en høj r 2 koefficient.

Figur 5
Figur 5:. Typisk standardkurve for HIV-1 Brug JoVE_standard_curve.m script, rå HEX fluorescensdata genereres under HIV-1 forstærkning forarbejdes til at bygge en standardkurve, som kan anvendes til at forudsige HIV-1 DNA-koncentration af ukendt prøver. Denne standardkurve (z = 1) blev genereret ved hjælp af data fra 5 experimenser, hvor 6 koncentrationer blev testet ved hjælp af 2 replikater for hver koncentration. Alle koncentrationer er angivet i log10 kopier. Figur oprindeligt udgivet i Analytical Chemistry 2014 genoptrykt her med tilladelse 9.

Figur 6
Figur 6:. Algoritme justerbarhed Justering af algoritmeparametrene ændrer standardkurve anvendes til at forudsige koncentrationen af ukendte prøver. Den JoVE_validation_and_quantification.m script blev brugt til at forudsige koncentrationen af ​​ukendte prøver ved hjælp af z = 1 (rød) og z = 5 (blå). Alle koncentrationer er angivet i log10 kopier. Forudsigelser er mere nøjagtig for lave DNA-koncentrationer, når z = 1; forudsigelser er mere nøjagtig for høje DNA-koncentrationer, når z = 5. Ved at justere algoritmeparametrene kan qRPA standardkurve blive tunet de kliniske behov. Figuroprindeligt udgivet i Analytical Chemistry 2014 genoptrykt her med tilladelse 9.

Prøvekoncentration Gennemsnit forventede koncentration Standardafvigelse Procent af prøver identificeres som positive
Ingen kontrol target 0.1 0,3 10%
1 0,9 0.1 100%
2 2.2 0,5 100%
3 3 0.1 100%
4 3.7 0.1 100%
5 4.2 0.2 100%

Tabel 1: HIV-1 qRPA assay validering Brug af stan.rd kurve i figur 4, blev JoVE_validation_and_quantification.m script anvendes til at forudsige koncentrationen (i log10 kopier) af prøver til 5 yderligere eksperimenter. Tabel oprindeligt udgivet i Analytical Chemistry 2014 genoptrykt her med tilladelse 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at opnå meningsfuld kvantificering af data ved hjælp af MATLAB algoritme, skal brugeren vælge passende input værdier, når du bliver bedt om. Efter opstart hver script i punkt 5 og 6, er alle input variabler automatisk anmodet i kommandovinduet og udgange er automatisk genereret. I afsnit 5.7 brugeren bedt om at vælge en skråning tærskel. Værdien af tærskelværdien hældning påvirker kvadratet af korrelationskoefficienten (R2) af pasform. Ved brug af rå fluorescensdata eksporteres fra et termisk cykler, værdier mellem 2,0 og 5,0 tendens til at give en høj r 2 koefficient. I afsnit 5.8 skal brugeren udpege det antal standardafvigelser over baggrunden for at indstille den positive tærskel. Scorer en prøve som positiv eller negativ, scriptet bestemmer automatisk forskellen Δ prøven mellem den maksimale og minimale fluorescens for hver prøve ved hjælp af de rå fluorescensdata eksporteres fra Thermal cycler. Den beregner den gennemsnitlige forskel Δ baggrund og standardafvigelse σ baggrund for alle ingen målgruppen kontrolprøver. En prøve betragtes som positiv, hvis Δ prøve er mere end z × σ baggrund over Δ baggrund. I afsnit 5.10 brugeren beslutter om du vil bruge den tærskel misligholdelse eller indstille en ny tærskel. Hvis brugeren ønsker at sætte en ny tærskel, fastlægge nye tærskel eksperimentelt ved at udføre 3 eksperimenter hver indeholdende 12 RPA reaktioner uden HIV-1-DNA til stede. Indstil tærsklen til den gennemsnitlige stigning i fluorescensintensitet fra disse forsøg plus 3 standardafvigelser. Efter at have afsluttet § 6, scriptet JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m automatisk returnerer den anslåede DNA koncentration for hver qRPA reaktion (i log10 kopier). Hvis scriptet bestemmer, at der ikke HIV-1-DNA var til stede i prøven, er den estimerede koncentration angivet som enten "Neunderbalance for HIV "eller" ugyldig ", afhængigt af, om det fluorescerende signal til den interne positive kontrol oversteg tærskelværdien (Z x σ baggrund + Δ baggrund). Hvis brugeren validere standard kurve med kendte prøvekoncentrationer, vil scriptet også returnere en yderligere tabel, der svarer til tabel 1.

For at udvikle en real-time RPA assay, der giver nøjagtig kvantificering, eksperimenterende konsistens er afgørende. For eksempel bruger de samme primer og probe portioner for både standard kurve og validering eksperimenter. Også undgå fryse-tø cykler ved lagring af primer og probe portioner ved 4 ° C mellem forsøg snarere end -20 ° C. Template alikvoter anvendt til standardkurven og validering eksperimenter lagres på samme måde. RPA enzym piller og reagenser fra samme parti anvendes i overensstemmelse med producentens anbefalinger. Endelig becabruge RPA mangler sande 'cykler' for at præcist at kontrollere hastigheden af ​​forstærkning, standardisering af brugernes skridt er absolut nødvendighed. Ved samling reaktioner, skal brugeren altid følge de samme trin i den samme rækkefølge, bruger omtrent samme mængde tid på hvert trin. Reaktioner skal altid blandes forsigtigt med en ny pipettespids, og bobler skal altid fjernes. Før forstærkning må reaktioner holdes på et ensartet temperatur, og den termiske cykler eller mikroskop software skal altid være forberedt, før du lægger reaktioner for at undgå opformering ved suboptimale temperaturer, der kan påvirke kvantificering. Enhver variation i de indledende reaktionsbetingelser kan føre til inkonsekvens i eksperimentelle resultater.

Ved anvendelse af et mikroskop for at indsamle data, skal yderligere variabler styres for at minimere variation i fluorescensintensitet. Alle reaktioner skal placeres i samme region på scenen varmere og microscope skal fokusere på det samme område af brønden for hver prøve. Selv om denne praksis følges, kan fluorescens data indsamlet på et mikroskop udviser variation på grund af lokale lyspunkter, der naturligt dannes under RPA reaktioner, bobledannelse inden reaktionskamrene eller fotoblegning følge af gentagen eksponering for excitationslys. Indflydelsen af disse variabler er tydeligt i fluorescens data indsamlet på mikroskopet (figur 4A og 4B), som viser baseline variabilitet, toppe og bølgedale. Disse funktioner er fraværende fra fluorescens data indsamlet på den termiske variator (figur 3A og 3B). I sidste ende, dataindsamling på mikroskopet er for proof-of-principle kun til og den endelige analyse vil blive gennemført på en mark-operabel fluorescens læser med mere præcise geometri og software kontrol, der minimerer disse variabler.

En anden vigtigaspekt af qRPA analysen udviklingsprocessen er sammenhæng i databehandling. Det er beskrevet i metodeafsnittet protokollen bruger scripts til at behandle rå fluorescensdata (gemt i et regneark fil) indsamlet fra et termisk cykler eller mikroskop. Alle eksperimenter bruges til at bygge standardkurven skal formateres ens. Når du bruger en termisk variator til at indsamle data, skal den samme plade layout skal bruges, og data fra boringer, der ikke indeholder RPA reaktioner må ikke eksporteres. Når du bruger et mikroskop for at indsamle data, skal formatet for de data, matcher formatet for de data automatisk eksporteret fra den termiske cycler. For eksempel skal de ikke-target-styredata være i cellerne C2: C61, og data for at øge skabelon koncentrationer skal være i celler D2: D61, E2: E61, etc. Hvis der er flere gentagelser af hver koncentration i et eksperiment, den 2. kopiere fortyndingsrække skal bestilles venstre til højre fra intet mål kontrol (NTC) til højeste koncentration oggemt i kolonnerne umiddelbart til højre for den 1. replikere fortyndingsrække. For eksempel i pladen layout, der anvendes i afsnit 1.2 med 2 replikater for hver prøve skal fluorescensdata for 1. gentagelse af hver prøve i fortyndingsrække gemmes i celler C2: H61 og fluorescensdata for 2. gentagelse af hver prøve i fortyndingsrækken skal gemmes i celler I2: N61. For pladen layout, der anvendes i punkt 1.2, dette er standard formatering når eksport af data fra den termiske cycler software til et regneark.

Repræsentative data fra HIV-1 qRPA eksperimenter viser proof-of-concept support, som RPA kan anvendes til kvantificering af nukleinsyre i ukendte prøver. Klinisk nyttige HIV-1-virus byrden tests har en klinisk rækkevidde på mindst 4 størrelsesordener, en præcision på 0,5 log10 kopier og en grænse-of-detektering af mindst 200 eksemplarer 19,20. HIV-1-DNA-assay beskrevet opfylder disse criteria og er mest nøjagtig ved lave koncentrationer, som vist i tabel 1. Derfor, med inddragelse af en revers transkriptase trin, tyder disse resultater på, at en HIV-1 RT-RPA assay kan have potentiale til at måle HIV-1 viral belastning i kliniske prøver. Ved udvikling af en qRPA assay justere algoritmen parametre kan tune følsomhed og lineært dynamisk område afhængigt af det kliniske behov. Figur 6 viser, at en tilpasning z (en parameter, der bestemmer grænsen for positive prøver) kan påvirke følsomheden og nøjagtigheden ved lave og høje målkoncentrationer. Endvidere kan det være muligt at øge opløsningen og nøjagtigheden af ​​kvantificering ved inkubering reaktioner ved en lavere temperatur eller ved hjælp af mindre magnesiumacetat og dermed mindske hastigheden af ​​amplifikation.

Denne proof of concept qRPA assay kan anvendes til at kvantificere koncentrationen af ​​prøver indeholdende HIV-1-DNA. Den qRPA assay er beskrevet i denne manuscript indeholder detaljerede instruktioner om, hvordan du samler realtid RPA reaktioner, udvikle og screene en IPC, og behandle rå fluorescensdata at bygge en standardkurve, der kan bruges til at kvantificere ukendte prøver. Med detaljerede instruktioner inkluderet, kan denne protokol tilpasset til at kvantificere DNA-koncentration i en lang række af prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Denne forskning er finansieret af en bevilling fra Bill & Melinda Gates Foundation gennem Grand Udfordringer i Global Health Initiative.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qRPA Assay
HIV-1 forward primer Integrated DNA Technologies custom DNA oligos 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 
HIV-1 reverse primer Integrated DNA Technologies custom DNA oligos 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ 
HIV-1 probe BioSearch Technologies  custom DNA oligos 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 
IPC probe BioSearch Technologies  custom DNA oligos 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate TwistDx TwistAmp exo
PCR tube strips BioRad TLS0801
PCR flat cap tube strips BioRad TCS0803
Micro-seal adhesive BioRad 558/MJ 
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Human male genomic DNA Applied Biosystems 360486
96 well cold-block Cole Parmer EW-36700-48
Thermal cycler BioRad CFX96
MiniFuge VWR 93000-196
Vortex VWR 58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 EMD Millipore 648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Promega V4321
Nuclease free water Ambion AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template Waterborne Inc P102C It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1
PCR long forward primer Integrated DNA Technologies custom DNA oligos 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR long reverse primer Integrated DNA Technologies custom DNA oligos 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase New England Biolabs M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
TAE 10X buffer EMD Millipore 574797
Agarose Sigma Aldrich A9539
Microscope Experiments
Upright fluorescence microscope Zeiss Zeiss Imager.J1
Stage heater Bioscience Tools TC-GSH
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller Bioscience Tools TC-1100S
FAM/GFP filter cube Zeiss filter set 38 (000000-1031-346) excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm
HEX filter cube Chroma 49014 excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm
Laser cutter Engraver's Network VLS3.60
1/8" black acrylic McMaster Carr 8505K113
1.5 mm clear acrylic McMaster Carr PD-72268940 
Super glue Office Depot Duro super glue 
PCR grade mineral oil Sigma Aldrich M8662-5VL
Data Analysis
Microsoft Excel Microsoft
MATLAB MATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” Included in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” Included in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” Included in SI
Adobe Illustrator Adobe
JoVE_qRPA_well.ai Included in SI
JoVE_qRPA_base.ai Included in SI
AxioVision software Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript Included in SI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yoon, J. -Y., Kim, B. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety. Sensors. 12, (8), 10713-10741 (2012).
  2. Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites. Journal of Microbiological Methods. 49, (3), 209-224 (2002).
  3. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75, (1), 1-4 (2013).
  4. Asiello, P. J., Baeumner, A. J. Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab on a Chip. 11, (8), 1420-1430 (2011).
  5. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology. 4, (7), 1115-1121 (2006).
  6. Krõlov, K., Frolova, J., et al. Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples. The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16, (1), 127-135 (2014).
  7. Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a, Puchades, R., Maquieira, A. Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis. Analytica Chimica Acta. 811, (1), 81-87 (2014).
  8. Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis. Malaria Journal. 13, (1), 99 (2014).
  9. Crannell, Z. A., et al. Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens. Analytical Chemistry. 86, (5), 2565-2571 (2014).
  10. Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA. Lab on a Chip. 12, (17), 3082 (2012).
  11. Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening. Talanta. 115, (1), 159-165 (2013).
  12. Euler, M., et al. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents. Journal of Clinical Microbiology. 51, (4), 1110-1117 (2013).
  13. Abd El Wahed, A., et al. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. PloS One. 8, (8), e71642 (2013).
  14. Escadafal, C., et al. Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, (3), e2730 (2014).
  15. Hutson, S. L., et al. T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest. PLoS ONE. 5, (11), 15 (2010).
  16. Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy. 8, (1), 118-129 (2003).
  17. DNA Extraction from Serum. Life Technologies. Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html (2014).
  18. Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification. Analytical Chemistry. 86, (12), (2014).
  19. Sollis, K. a, et al. Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples. PloS one. 9, (2), e85869 (2014).
  20. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. Department of Health and Human Services. Washington D.C. 1-166 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats