Utvikling av en kvantitativ rekombinase Polymerase Amplification analysen med en intern positiv kontroll

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Crannell, Z. A., Rohrman, B., Richards-Kortum, R. Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control. J. Vis. Exp. (97), e52620, doi:10.3791/52620 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Kvantitativ nukleinsyre-amplifikasjon er en viktig teknikk for påvisning av miljømessig, matbårne, og vannbårne patogener samt for klinisk diagnostikk. Sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) er gull standard metode for sensitiv, spesifikk og kvantitativ påvisning av nukleinsyrer, for eksempel for HIV-1-virusbelastning testing, påvisning av bakterielle patogener, og screening for mange andre organismer 1 - 3. Under sanntids qPCR, primere forsterke patogen DNA i sykluser, og et fluorescerende signal blir generert som er proporsjonal med mengden av amplifisert DNA i prøven ved hver syklus. En prøve som inneholder en ukjent konsentrasjon av patogen-DNA kan kvantifiseres ved anvendelse av en standardkurve som vedrører den første DNA-konsentrasjonen av standardprøvene og det tidspunkt ved hvilket det fluorescerende signal når en viss terskelverdi (dvs. syklusen terskel, eller C T).

fire. Disse plattformer generelt gi resultater hurtigere og forsterke nukleinsyrene ved en lavere, enkelt temperatur, noe som kan oppnås med mindre kostbart og enklere utstyr. RPA, som er spesielt attraktivt for point-of-care anvendelser, forsterker DNA i minutter, krever en lav forsterkning temperatur (37 ° C), og forblir aktiv i nærvær av forurensninger 5,6. RPA analyser har blitt utviklet for et bredt spekter av bruksområder, inkludert mat analyse, deteksjon av patogen, kreft narkotika screening, og påvisning av biothreat agenter 7-12. Imidlertid har bruken av RPA for kvantifisering av nukleinsyrer vært begrenset 13,14.

I tidligere arbeid, det var shown at sanntids kvantitativ RPA (qRPA) er gjennomførbart 15. Her er en mer detaljert protokoll for anvendelse av sanntids kvantitativ RPA å kvantifisere ukjente prøver ved å bruke en standardkurve, en fremgangsmåte som er analog til kvantifisering ved hjelp av qPCR. Denne protokollen beskriver hvordan du utfører en RPA reaksjon på en termosykler å påvise HIV-1 DNA som en proof-of-concept, samt hvordan man skal utvikle en intern positiv kontroll (IPC) for å sikre at systemet fungerer som det skal. Datainnsamling ved hjelp av en termosykler eller mikroskop og dataanalyse for å konstruere en standardkurve ved hjelp av treningsdata blir også beskrevet. Endelig er fremgangsmåten for kvantifisering av ukjente prøver ved hjelp av standardkurve med en tilpasset skript påvist. Dette qRPA teknikk muliggjør kvantifisering av prøver med ukjente konsentrasjoner og har mange fordeler sammenlignet med tradisjonelle sanntid qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Programmer termosykler for Real-time qRPA Reaksjoner

  1. Opprett en ny protokoll i termosykleren programvare.
    1. Setter inn en pre-inkubering trinn: 39 ° C i 1 min.
    2. Legg et andre trinn: 39 ° C i 20 sekunder etterfulgt av en plate leser.
    3. Til slutt sette inn en "gå til" som gjentar det andre trinnet 59 flere ganger.
    4. Lagre protokollen.
  2. Lag en ny plate i "plate redaktør" -kategorien av programvaren. Velg brønner på platen som tilsvarer plasseringen av de RPA reaksjoner (Her bruker brønner A1, A4-A8, B1 og B4-B8).
    MERK: Det er ikke viktig om prøven type brønnene (f.eks "Standard", "NTC") er angitt, som dataanalyse er gjort ved hjelp av en egendefinert skript.
    1. For eksperimenter som bare inneholder HIV-1 DNA, velg "HEX" fluorophore for alle brønner. For eksperimentene inneholdende HIV-1-DNA og en intern positiv control, velge både "HEX" og "Fam" fluoroforene for alle brønner. Lagre tallerkenen.

2. Forbered for HIV-1 qRPA Eksperimenter

  1. Montere RPA reaksjoner i en utpekt pre-forsterkning arbeidsområde inneholder utpekt pipetter, pipettespisser, vortexer, og mini-sentrifuger, som for qPCR. Som RPA kan forsterke en enkelt kopi av DNA med så mye som ti størrelsesordener (data ikke vist), håndtere og avhende rør som inneholder post-forsterket DNA-produkter i en egen post-forsterkning området.
    1. Unngå kontakt mellom alle pre-amplifiseringsreagenser og post-amplifiseringsprodukter. Spray pre-forsterkning arbeidsområder og utstyr med 50% blekemiddel før og etter alle forsøk. Bruk et papirhåndkle for å tørke vekk overflødig blekemiddel.
  2. Kjøp fremover primer sekvensen 5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3 'og omvendt primersekvens 5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3 'fra kommersielle DNA-synthesizere. Kjøpe probesekvensen 5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA / HEX] GC [THF] C [DT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3 'fra kommersielle kilder. Lagre alle primere og prober ved 4 ° C i alikvoter ved en konsentrasjon på 10 uM før bruk.
    MERK: qRPA Analysen forsterker en unik HIV-1 sekvens. For denne proof-of-concept analysen, bruker plasmid pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr beskrevet av Sutton et al., Som inneholder målsekvensen 16. For qRPA forsøk ble plasmidet lagret ved 4 ° C i alikvoter inneholdende 1, 10, 10 2, 10 3 og 10 4 kopier pr ul i en buffer inneholdende 10 mM Tris, 0,1 mM EDTA ved pH 8,0, og 1 ng / ul humant genomisk bærer DNA (360486). Denne bærer DNA-konsentrasjonen tilsvarer DNA-konsentrasjon oppnås fra kommersielle serum DNA-ekstraksjon sett som brukes for HIV-1-diagnose 17. Disse HIV-1fortynninger ble anvendt som templater i qRPA reaksjoner for å bygge opp en standardkurve.

3. Monter en HIV-1 qRPA standardkurve

  1. Før montering av qRPA reaksjoner, fremstille pre-amplifikasjon arbeidsområde som beskrevet i trinn 2.1.1. Plasser en 96-vel kald blokk i lagring ved 4 ° C.
  2. Forberede reagenser for 12 reaksjoner:
    1. Flytt magnesiumacetat, rehydrering buffer, og 12 RPA reaksjons pellets til pre-forsterkning arbeidsområde.
    2. Tine magnesiumacetat og rehydrering buffer ved romtemperatur.
    3. Alikvoter 32,5 ul av magnesiumacetat (2,5 mL per reaksjon) til et mikrosentrifugerør.
    4. Forberede en 13x mester mix. Legg 383,5 mL av rehydrering buffer (29,5 mikroliter per reaksjon) til en egen mikrosentrifuge tube for master mix. Legg 41.6 mL nukleasefritt fritt vann (3,2 mikroliter per reaksjon) til master mix. Vortex master mix.
    5. Returnere magnesium acetamidometylte og rehydrering buffer til lagring ved -20 ° C.
    6. Flytt primer og sonde porsjoner fra kjøleskapet til den pre-forsterkning området, unngå eksponering for mye lys for å minimere fotobleking.
    7. Legg 27.3 mL hver av de 10 mikrometer forover og bakover primere (2,1 mL per primer per reaksjon) til master mix.
    8. Legg 7,8 mL av 10 mm HEX-merket HIV-1 DNA probe (0,6 mikroliter per reaksjon) til master mix.
    9. Returnere primere og probe til lagring.
  3. Samsvarplateoppsettet beskrevet i punkt 1.2, plasserer en enzym pellet i hver av de langt igjen rørene og en enzym pellet i hver av de fem langt rette rør av to lave åtte-brønns PCR rør strimler.
  4. Tilsett forsiktig 37,5 ul masterblanding til hvert rør inneholdende et enzym pellets, ved anvendelse av en ny pipettespiss for hvert rør og forsiktig omrøring av konsentrat-blanding og pelleten med spissen inntil pelleten fullstendig oppløst. Rør forsiktig for å unngå boble forming avom, og fjerne spissen forsiktig for å unngå tap av reaksjonsvolumet.
  5. Etter at alle enzym pellets har blitt utvannet med master mix, hente 96-vel kaldt kvartal fra 4 ° C lagring. Plasser PCR rør strimler i kulden blokken til chill master mix.
  6. Mens master mix er kjøling, legger termosykleren programvare med protokollen og plate beskrevet i kapittel 1.
  7. Skjær to strimler av klar plast mikro-segl lim til å være litt bredere enn de PCR-rørene, og hente to flate PCR rør stripe lokk.
  8. Hente seks mal delprøvene fra lagring (inneholder 0, 1, 10 1, 10 2, 10 3, eller 10 4 kopier av HIV-1 plasmid per mikroliter).
  9. Tilsett 10 mL av hver mal til rørene utpekt for denne malen konsentrasjon. Bruk en ny pipettespiss for hvert rør, forsiktig omrøring av løsningen med spissen for å blande master mix og mal. Sørg for å legge malen til riktig sted til match plateoppsettet beskrevet i punkt 1.2.
  10. Sørg for at en PCR rør stripe adapter for mikro er på plass.
  11. Dispensere 2,5 mL av magnesiumacetat i hvert rør lokk som vil bli plassert på et rør inneholdende en qRPA reaksjon.
  12. Forsiktig plassere et lokk på toppen av PCR-rørene, slik at de ikke er fullstendig forseglet, og kan fjernes. Den magnesiumacetat vil følge lokkene og være godt synlig ovenfra.
  13. Sett hvert PCR rør stripe med lokk inn i hver side av PCR rørholder. Lukk lokket av minifuge å spinne magnesiumacetat ut av lokkene og inn i RPA reaksjonen initiere RPA reaksjonen. Sentrifuger inntil alle bobler er eliminert, og all væske samles i bunnen av hvert rør (10 sek).
  14. Raskt fjerne PCR tube strimler og returnere dem til den kalde blokk å stanse qRPA reaksjoner.
  15. Fjern forsiktig lokkene for å hindre dannelse av sprøytetåke og forsegle hver PCR rør stripe med kuttbiter av klar mikro-forsegling film.
  16. Raskt gå til termosykleren og laste de to PCR rør strimler inn i termosykler i de stedene som samsvarer med plateoppsettet (brønner A1-B8). Lukk lokket på termosykler, klikk "Start Run", og utpeke et filnavn for forsøket.
    MERK: Selv om produsenten anbefaler omrøring av prøven etter 5 min inkubasjon, er dette trinn ikke nødvendig for denne analysen, og kan utelates.
  17. Etter kjøringen er fullført, velg "Innstillinger", "Baseline Setting", "No Baseline subtraksjon" for å vise rå fluorescens data. Eksportere data til et regnearkprogram ved å velge "Export", "Eksporter alle Sheets data til Excel." En fil med Tillegget »Kvantifisering Amplification Resultater" vil bli opprettet som inneholder rå sanntids fluorescens data.

4. Utvikle en intern positiv kontroll

  1. Velge en DNA-sekvens fra en art som er lite sannsynlig å finne i målet prøven. Sekvensen må være lengre enn target amplikon, slik at generering av target-sekvensen er foretrukket.
    MERK: For denne analysen, Cryptosporidium parvum, en tarmparasitt, ble valgt til å tjene som mal for generering av IPC sekvensen fordi denne organismen er lite sannsynlig å bli funnet i blod og var tilgjengelig i laboratoriet fra et annet prosjekt. For å generere IPC sekvens, trekke ut og rense DNA fra C. parvum oocyster som beskrevet andre steder 18.
  2. Kjøpe fremover (5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3 ') og revers (5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3 ') primere fra kommersielle kilder. IPC PCR-primere brukt i denne analysen er vist i figur 1, og inneholder en region som er komplementær til IPC mal DNA (f.eks C. parvum, lilla i figur 1) og en region som er komplementær til target organisme (f.eks, HIV-1, blå i figur 1).
  3. Utføre PCR ved bruk av primere og IPC templat DNA.
    1. Montere 50 mL PCR reaksjoner ved hjelp av Phusion Høy Fidelity DNA Polymerase reagenser i henhold til produsentens anvisninger, unntatt polymerase. Bruke 2 mL av DNA mal og Phusion Buffer HF.
    2. Tilsett Phusion polymerase til hver reaksjon etter en varm start ved 98 ° C, etterfulgt av 60 sek ved 98 ° C, etterfulgt av 40 sykluser på 15 sek ved 98 ° C, 30 sek ved 62 ° C og 30 sek ved 72 ° C med en sluttforlengelse ved 72 ° C i 5 min. Etter termisk sykling, hold prøver ved 4 ° C.
    3. Analysere prøver ved gelelektroforese på en 2% TAE-agarosegel, og deretter ekstrahere og rense DNA ved hjelp av QIAquick Gel Extraction Kit ifølge den protokoll som følger med mikrosentrifugesettet.
  4. Screen IPC kandidater for deres evne til å forsterke hjelp qRPA.
    1. Forbered qRPA reaksjoner som nevnt i § 3, ved hjelp av HIV-1 primere, en FAM-merket probe spesifikke for IPC (5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [DT-BHQ1 ] GGT TTT GTA ATT GGA A -3 '), og en total på 0, 10, 10 2, 10 3, 10 4 eller 10 5 kopier av hvert IPC kandidat per reaksjon, testing av alle konsentrasjoner i duplikat.
    2. Velg IPC kandidat som forsterker mest konsekvent og har den laveste grense-of-deteksjon.
  5. Co-amplifisere HIV-1 og koblingsapparatet for å bestemme den optimale konsentrasjonen av IPC-DNA.
    1. I likhet med § 3, kombinere følgende i hver 50 pl reaksjons: 29,5 mL av rehydrering buffer, 2,1 mL av RPA av forward primer [10 mm], 2,1 mL av RPA revers primer [10 mm], 0,6 mL av HIV-1 HEX -merket probe [10 uM], 10 ulav HIV-1 DNA ved varierende konsentrasjoner, 2,5 ul av magnesiumacetat, og en enzym-pellet. Stedet for å legge 3,2 mL nukleasefritt gratis vann slik det ble gjort i trinn 3.2.4, legger 0,6 mL av IPC FAM-merket probe [10 mm], og 2,6 mL av IPC DNA. Bruk IPC-konsentrasjonen som er grensen-of-deteksjon (LOD) når qRPA er utført med IPC-DNA alene (LOD definert som den laveste konsentrasjon hvor mengden av fluorescens signalgenerering er større enn den som genereres av den fluorescens som genereres av prøvene med ingen mål-DNA).
    2. Inkuber prøver ved å bruke den protokoll som er beskrevet i avsnitt 1.1.
    3. Hvis IPC ikke forsterker i hver prøve, vurdere å gjenta eksperimentet med en IPC konsentrasjon en størrelsesorden høyere. Den optimale konsentrasjon av IPC-DNA for HIV-1 analysen er 10 000 kopier / ul. Mens prøvene er gyldig dersom det enten er IPC eller HIV-1 DNA-amplifisering, oppviser en ideell IPC påvisbar forsterkning forhver reaksjon.

5. Bygge en standardkurve fra flere Experiments

  1. Sikre data for hvert forsøk har blitt eksportert til et regnearkprogram som beskrevet i punkt 3.13.
  2. Åpne og kjøre skriptet "JoVE_qRPA_standard_curve.m". Alle innganger er automatisk bedt i kommandovinduet. Etter skriptet startes, blir brukeren automatisk bedt om å utpeke den "Antall datafiler" brukes til å bygge standardkurven.
  3. I kommandovinduet skriver antall filer som skal brukes til å bygge standardkurven og trykk enter.
  4. Skriver i kommandovinduet antall prøver og antall replikater i hver trening fil (trykke inn etter hver oppføring).
    MERK: I plateoppsettet beskrevet i kapittel 1.2, var det seks prøver med ulike konsentrasjoner og to replikater av hver prøve).
  5. Skriver i kommandovinduet lavest DNEn konsentrasjon brukes til å bygge standardkurve (i log10 kopier) og trykk enter (for plateoppsettet beskrevet i kapittel 1.2, er den laveste mal konsentrasjon '1' log10 kopier).
  6. Skriv inn kommandovinduet forskjellen i konsentrasjon mellom hver standard (i log10 kopier) trykker på enter (for plateoppsettet beskrevet i kapittel 1.2, er konsentrasjonen intervall '1' log10 kopier).
  7. Etter å ha blitt bedt om det, skriver du inn "Slope terskel" i kommandovinduet og trykker på enter.
  8. I kommandovinduet skriver "Number (z) standardavvik over bakgrunnen for positiv terskel", og trykk deretter på enter. Typiske verdier for z varierer fra 1 til 5.
  9. Angi om dataene ble samlet inn ved hjelp av termosykler ('1'), * .tiff mikroskop bilder ('2'), eller * .jpg mikroskopbilder ('3') ved å taste nummeret "1", "2", eller "3", og pressing inn.
  10. Velger å sette en ny IPC terskel, eller å bruke en standardverdi for terskelen ved å skrive 'y' eller 'n' henholdsvis når du blir bedt.
  11. Deretter velger hver av regnearkfiler som brukes til å bygge standardkurven.
    MERK: Skriptet vil da automatisk importere HEX og FAM fluorescens data; avgjøre om hver reaksjon var gyldig (dvs. om fluorescenssignaler overskredet grensene for HEX eller FAM kanaler); bestemme r 2 koeffisient for en eksponentiell, lineær, og andre polynomet tilpasning; Tomten "log10 kopier versus syklusen terskel" for hver prøve brukes til å bygge standard kurve; og lage et regneark fil som inneholder essensielle variabler å gjenoppbygge standardkurven for valideringsforsøk uten at brukeren må taste inn alt av inngangsparametre igjen.

6. Analyse Validering og Kvantifisering av Ukjente prøver Brukestandardkurve

  1. Bruk script "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" for å estimere presisjonen og nøyaktigheten av analysen ved hjelp av prøver med kjente konsentrasjoner, eller bruke den for å kvantifisere prøver med ukjente konsentrasjoner.
    MERK: Fordi tidligere publisert forskning viste at en eksponensiell passform ga den beste r-squared koeffisient 18, dette skriptet benytter en eksponensiell form for standardkurven. Hvis en annen type passform er ønskelig, kan skriptet endres tilsvarende.
    1. Åpne og kjøre skriptet "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m". Etter skriptet startes, blir brukeren automatisk bedt om å oppgi alle innganger inn i kommandovinduet.
    2. Enter '1' for å validere en analyse ved hjelp av en standardkurve med kjente prøvekonsentrasjoner eller skriv '2' for å kvantifisere ukjente prøver.
    3. Når du blir bedt om, enten velge en lagret standardkurve eller bygge et nytt ved å taste the informasjon som automatisk ønsket i kommandovinduet (den samme informasjonen som er nødvendig for "JoVE_qRPA_standard_curve.m" script fra avsnitt 5).
    4. Skriv inn antall forsøk (dvs. regnearkfiler) for å analysere for validering / kvantifisering.

7. Forberedelse til datainnsamling ved hjelp av en fluorescens mikroskop og et oppvarmet Chip

  1. Sørg for at fluorescens mikroskop har en scene varmeapparat og en-Channel Precision Høy Stabilitet temperatur kontrolleren på plass.
  2. Sørg for at fluorescens mikroskop har et filter kube å opphisse og samle fluorescens fra hver fluorophore. Opphisse og samle FAM fluorescens generert under IPC DNA forsterkning gjennom en GFP filter (eksitasjon BP 470/40 nm, emisjon BP 520/50 nm). Opphisse og samle HEX fluorescens generert under HIV-1 DNA forsterkning gjennom en HEX filter (eksitasjon BP 530/30 nm, emisjon BP 575/40 nm).
  3. Bruke mikroskop script redigering programvare for å lage en automatisert algoritme for å kopiere data-innsamling på termosykler.
    1. Sett først en "Settings" skritt å stenge lukkeren. Neste legge til et "Exposure" skritt å stille inn eksponering 60 sek. Sett inn en "Snap" for å utføre 60 sek forsinkelse, som implementerer 1 min pre-inkubasjonstid. Legg en "Stille" skritt for å endre arbeidsgruppen til GFP filter. Sett inn en annen "Exposure" steg for å justere eksponeringen til 200 msek. Alle eksponeringer ved hjelp av GFP eller HEX filter kuber vil bli satt til 200 msek.
    2. Etter "Exposure" skritt, legge til en "Snap" og spesifisere kameraet som bildet vil bli tatt. Bruk en annen "Stille" skritt å stenge lukkeren og en "Lagre bilde" skritt for å lagre bildet til en brukerdefinert midlertidig mappe.
    3. Neste bryteren til HEX filter kuben ved hjelp av en annen "Stille" skritt og thno legge til en "Exposure" på 200 ms, en "Snap", og en "Lagre bilde" trinn.
    4. Gjenta denne prosessen 59 ganger med en initiell forsinkelse på 20 sek i stedet for 60 (tett skodde, vent 20 sek, bytte til GFP filter kube, satt eksponering til 200 msek, snap, tett skodde, lagre, bytte til HEX filter kube, fastsette eksponeringen til 200 msek, snap).
  4. Lag en chip som vil holde qRPA reaksjoner.
    1. For eksperimenter ved hjelp av mikroskop, bruke filen JoVE_qRPA_base.ai å kutte en 40 x 15 mm rektangulære bunnen av en plate av 1/8 "tykk sort akryl ved hjelp av en laser kutter satt til 100% kraft, 10% hastighet.
    2. Bruk filen JoVE_qRPA_well.ai å kutte reaksjons vel som består av en 10 x 10 mm i kvadrat med 5 mm diameter sirkulært hull skåret av en plate av 1,5 mm tykk, klar akryl.
    3. Montere opptil tre brønner til en enkelt base ved hjelp av superlim gel.
    4. Tørke over natten.

8. Datainnsamling og Analysis Ved hjelp av et fluorescensmikroskop

  1. Forberede mikroskop for datainnsamling ved å laste den automatisk datainnsamling script JoVE_AxioVision_Script.ziscript.
    1. Satt scenen varmeapparat til 48 ° C og forvarme reaksjonen chip på scenen varmer for ca 20 min. En temperatur på 48 ° C opprettholder en temperatur på 39 ° C i reaksjonsbrønn (data ikke vist).
    2. Ved hjelp av en 10X, 0,45 NA objektiv, fokusere på toppen av den indre kant av reaksjonen godt med GFP filteret på plass. Kantene av akryl er autofluorescent etter laserskjæring, og kan lett visualiseres. Etter fokusering, ikke justere høyden på objektbordet inntil alle data er samlet opp.
  2. Monter qRPA mester mix i en utpekt pre-forsterkning arbeidsområde som beskrevet i trinn 4.5.1. For hver prøve blande et enzym pellet, konsentrat-blanding, og HIV-1-DNA-templat i en mikrosentrifuge-rør. Legg 2,5 mL av magnesiumacetat til den første reaction og kort vortex.
  3. Raskt å transportere mikrosentrifugerør inneholdende qRPA prøven til fluorescens mikroskop.
    1. Nøye pipettere 30 ul av RPA reaksjonen i reaksjons godt uten å skape bobler. Plassere en dråpe av PCR-grade mineralolje over RPA reaksjonen for å forhindre fordampning.
    2. Plasser vel rett under mikroskop objektiv, ta vare å image bare sentrum av brønnen, ikke noen av auto-fluorescerende akryl kanter. Etter at brønnen er plassert, kjører automatisert skript 7. Skriptet genererer en JPEG-bilde ved hjelp av FAM filter kuben og ett JPEG-bilde med HEX filter cube hver 20 sek.
  4. Etter at manuset er ferdig, overfører disse bildene ut av den midlertidige lagringsmappe før du kjører flere prøver.
    1. Lag to mapper: 1 for hver fluorophore (dvs. "HEX" og "FAM '). Lagre begge mapper i samme overordnede mappen. I hvert fluorophoremappen oppretter du en mappe merket med antall DNA kopier tilstede i prøven (f.eks, 0, 10, etc.).
    2. Overføre alle filer med prefikset "HEX 'inn i tilsvarende undermappe i" HEX-mappen. Overføre alle filer med prefikset 'GFP' inn i tilsvarende undermappe i "FAM-mappen.
  5. Gjenta §§ 8.2 til 8.4 for qRPA reaksjoner med 0, 10, 10 2, 10 3, 10 4, og 10 5 HIV-1 DNA kopier.
  6. Etter innsamling av data for alle qRPA prøvene i et eksperiment, laste script "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m." Når du blir bedt av manuset, velger du den overordnede mappen som inneholder de to fluoroforpar mapper, som igjen inneholder bildene for hver konsentrasjon i undermapper.
    MERK: Skriptet vil automatisk generere et regneark fil i den overordnede katalogen der HEX fluorescens data vil bli lagret i et ark named 'HEX', og FAM fluorescens data vil bli lagret i et ark som heter 'FAM'. I hvert ark, blir syklusen som er oppført i kolonne B, og sanntids fluorescens data for økende konsentrasjoner av malen er gitt i kolonne C, D, osv. Hver sanntids fluorescens datum er den gjennomsnittlige fluorescens intensiteten av bildet som er tatt på det tidspunkt.
  7. Bruke standardspredningsdiagram funksjonen i regnearkprogram for å plotte cellene B2: H61 av "HEX 'og' FAM 'ark for å visualisere sanntids fluorescens og generere plott som ligner på de på figurene 2A, 2B, 3A og 3B.
    MERK: Regnearket generert i trinn 8.6 kan også brukes i skriptene "JoVE_qRPA_standard_curve.m" og "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før valg av en sekvens for å tjene som koblingsapparatet i qRPA eksperimenter med target (HIV-1) DNA, intern positiv kontroll (IPC) kandidater blir generert og screenet for deres evne til å forsterke i qRPA reaksjoner uten HIV-1 DNA tilstede. IPC kandidater er lengre enn målet (HIV-1) DNA for å hindre dannelse IPC fra ut-konkurrerende HIV-1 fragment formasjonen. Som vist i figur 2A, generering av to C. parvum IPC kandidater ble bekreftet ved tilstedeværelse av 415 og 435 bp bånd ved hjelp av gelelektroforese. I qRPA reaksjoner, jo kortere IPC kandidat oppviste liten forsterkning (figur 2B), mens den lengre kandidat gående forsterket når totalt 10 4 og 10 5 kopier var til stede (figur 2C). Således ble lenger kandidat valgt til å være IPC for HIV-1 qRPA eksperimenter.

Sanntids qRPA kan utføres ved hjelp av mål av interesse alene eller ved hjelpbåde målet og koblingsapparatet. Figur 3 viser et eksperiment på termosykler ved anvendelse av både HIV-1-DNA og C. parvum IPC. I dette eksperimentet, ble 2,6 x 10 4 kopier av IPC-DNA tilsatt til hver reaksjon, en konsentrasjon nær den IPC deteksjonsgrense, for å unngå å påvirke deteksjonsgrense på HIV-1-mål-DNA. Som vist i figur 3A, som viser HEX fluorescens data tilsvarende sanntids HIV-1 DNA-generering, er det tidspunkt ved hvilket påvisbar forsterkning begynner omvendt proporsjonal med den opprinnelige mål-konsentrasjon. Det er således tydelig forsterkning tidligere for høye konsentrasjoner av HIV-1 DNA og senere for lave konsentrasjoner av HIV-1 DNA. I motsetning til dette begynner påvisbar forsterkning av IPC-DNA på omtrent samme tid, fordi utgangs IPC-konsentrasjonen er den samme i alle prøver, som vist i figur 3B, som viser fluorescens-FAM data tilsvarende IPC DNA-produksjon i Than samme eksperiment. Hastigheten av fluorescens generering fra koblingsapparatet er omvendt proporsjonal med konsentrasjonen av HIV-1-DNA på grunn av konkurranse under amplifikasjon.

Med mål om å utvikle et felt-operable fluorescens leseren med qRPA reaksjoner, kan qRPA eksperimenter skal utføres på en oppreist fluorescens mikroskop med en scene varmeapparat og en-Channel Precision Høy Stabilitet temperaturregulator. 4A og 4B visnings HEX og FAM fluorescens data innsamlet på et mikroskop. Data som samles inn på mikroskopet ved hjelp av laser-cut chips demonstrere liten variasjon i baseline fluorescens og toppene og bunnene som kan være på grunn av fotobleking. Imidlertid bestemmer skriptet syklusen terskelen ved hjelp av hastigheten for forandring av fluorescens under den første forsterkning perioden, som er upåvirket av referanse fluorescens eller variasjon i fluorescens etter første amplifikasjon har oppstått. Som vist i Figur 4C, standardkurven bygget fra dette eksperimentet har en r 2 koeffisient på 0,990. Spesielt, blir koblingsapparatet forsterket kun for lave konsentrasjoner av HIV-1 DNA. Selv om dette problemet er forskjellig fra eksperimenter utført på termosykler, er alle prøvene fremdeles klassifisert som gjelder ved bruk av denne metoden.

Data fra flere forsøk under anvendelse av kjente målkonsentrasjoner kan bli kompilert til å konstruere en standardkurve, som deretter kan brukes til å vurdere assay ytelse eller kvantifisere prøver med ukjent konsentrasjon. Figur 5 viser data fra fem forsøk og en eksponensiell standardkurve ble generert ved hjelp av skriptet "JoVE_qRPA_standard_curve.m", om den første HIV-1 target-konsentrasjonen til det tidspunkt ved hvilket påvisbar forsterkning begynte. Figur 5 brukt 5 separate forsøk, hver med to qRPA reaksjoner på hver mal konsentrasjon for å bygge opp en standardkurve. Legg merke til at den eksponentiellefit har en høy r 2-koeffisient 0,959. Standardkurven ble så brukt til å forutsi konsentrasjonene av flere prøver med kjente konsentrasjoner av analyse validering hjelp av script "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" skript. Tabell 1 viser resultater for kvantifisering av 5 flere forsøk under anvendelse av standardkurven i figur 5. Legg merke til at algoritmen korrekt klassifisert alle prøver som inneholder HIV-1 DNA som positiv og 9 av 10 av de no-target-kontrollprøver som negative. I tillegg er det forutsagte gjennomsnittlige konsentrasjonen var innen en størrelsesorden av den riktige konsentrasjon og standardavviket for predikerte konsentrasjoner var mindre enn 0,5 log10 (kopier per reaksjon).

Figur 1
Figur 1:. Blokkdiagram av kvantitative RPA DNA mål QRPEn analyse forsterker to DNA-sekvenser flankert av identiske sekvenser som primere bind ("RPA forward" og "RPA reversere"). De amplifiserte sekvensene er 1) en sekvens innen HIV-1-genomet ("HIV-1") som blir detektert med "HIV-1-probe", og 2) en indre positiv kontroll-sekvens ("IPC (C. parvum)") inkludert i hver reaksjon som er oppdaget med "IPC-proben." IPC ble generert via PCR ved anvendelse av Cryptosporidium parvum genomet som templat og primere ("PCR forover" og "reverse PCR") som inneholder en region som er komplementær til C. parvum (lilla) og en region komplementær til HIV-1 (blå). Figur opprinnelig publisert i Analytical Chemistry 2014, gjengitt her med tillatelse 9.

Figur 2
Figur 2: (A) To IPC kandidater («Forover korte" og "forover lang ') og en kjent PCR positive kontrollsekvensen ble generert ved hjelp av PCR og visualisert på en agarosegel, hvor 415 bp og 435 bp bånd var synlige . (B) Den korte IPC kandidat oppviste liten forsterkning under sanntids RPA, mens (C) i lengre IPC kandidat forsterket konsistent ved totalt 10 4 og 10 5 kopier var tilstede. Figur opprinnelig publisert i Analytical Chemistry 2014, gjengitt her med tillatelse 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Typiske rå fluorescens data generert i løpet av co-amplification av HIV-1 DNA og IPC på en termosykler. (a) for HIV-1, utbruddet av påvisbar forsterkning, vist ved en tilsynelatende økning i fluorescens HEX, opptrer tidligere for høye konsentrasjoner av HIV-1 DNA. (B) For IPC, utbruddet av påvisbar forsterkning, vist ved en tilsynelatende økning i FAM fluorescens, skjer på omtrent samme tid uavhengig av HIV-1-DNA-konsentrasjon. Imidlertid er graden av FAM fluorescens generasjon omvendt proporsjonal med mengden av HIV-1 DNA til stede på grunn av konkurranse. Figur opprinnelig publisert i Analytical Chemistry 2014, gjengitt her med tillatelse 9.

Figur 4
Figur 4: Typiske rå fluorescens data generert ved samtidig amplifikasjon av HIV-1 DNA og IPC på et mikroskop (A) På samme måte som data generert på t.Han thermal cycler, utbruddet av påvisbart HIV-1 forsterkersystem som er vist ved hjelp av en tilsynelatende økning i fluorescens HEX, opptrer tidligere for høye konsentrasjoner av HIV-1 DNA. (B) IPC forsterkning på mikroskopet, vist ved FAM fluorescens, er åpenbar for lav HIV-1 DNA-konsentrasjoner, men ikke alltid tydelige i prøver med høye HIV-1 DNA-konsentrasjoner. (C) En standardkurve kan bygges ved hjelp av JoVE_standard_curve.m skript som gir en høy r 2 koeffisient.

Figur 5
Fig. 5: Typiske standardkurve for HIV-1 ved hjelp av JoVE_standard_curve.m skriptet, rå HEX fluorescens data generert under HIV-1-amplifikasjon blir prosessert for å bygge opp en standardkurve, som kan brukes til å forutsi den HIV-1-DNA-konsentrasjonen av ukjent prøver. Denne standardkurve (z = 1) ble generert ved hjelp av data fra fem experimentene, der seks konsentrasjoner ble testet ved hjelp av to replikater på hver konsentrasjon. Alle konsentrasjoner er gitt i log10 kopier. Figur opprinnelig publisert i Analytical Chemistry 2014, gjengitt her med tillatelse 9.

Figur 6
Fig. 6: Algoritme tunability Justere algoritmeparameterne endres standardkurve som brukes for å forutsi konsentrasjonen av ukjente prøver. Den JoVE_validation_and_quantification.m skriptet ble brukt til å forutsi konsentrasjonen av ukjente prøver ved hjelp z = 1 (rød) og z = 5 (blå). Alle konsentrasjoner er gitt i log10 kopier. Spådommer er mer nøyaktig for lave DNA-konsentrasjoner når z = 1; spådommer er mer nøyaktig for høye DNA-konsentrasjoner når z = 5. Ved å justere algoritmen parametere kan qRPA standardkurve være innstilt i henhold til kliniske behov. Figuropprinnelig publisert i Analytical Chemistry 2014, gjengitt her med tillatelse 9.

Eksempel Konsentrasjon Gjennomsnittlig Forut Konsentrasjon Standardavvik Prosent av prøvene identifisert som positiv
Ingen mål kontroller 0.1 0.3 10%
1 0.9 0.1 100%
2 2.2 0.5 100%
3 3 0.1 100%
4 3.7 0.1 100%
5 4.2 0.2 100%

Tabell 1: HIV-1 qRPA analysen validering Bruke standarder.rd kurve i figur 4, ble JoVE_validation_and_quantification.m skriptet som brukes til å forutsi konsentrasjoner (i log10 kopier) av prøver for 5 ytterligere forsøk. Tabell opprinnelig publisert i Analytical Chemistry 2014, gjengitt her med tillatelse 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å få meningsfulle kvantifisering data ved hjelp av MATLAB algoritmen, må brukeren velge hensiktsmessige inngangsverdier når du blir bedt. Etter initiering hvert skript i §§ 5 og 6, er alle inndatavariabler automatisk ønsket i kommandovinduet og utganger er automatisk generert. I avsnitt 5.7 blir brukeren bedt om å velge en skråning terskel. Verdien av helningen terskel påvirker kvadrat av korrelasjonskoeffisienten (R 2) på plass. Når du bruker rå fluorescens data eksportert fra en termosykler, verdier mellom 2.0 og 5.0 har en tendens til å gi en høy r 2 koeffisient. I punkt 5.8 brukeren må utpeke antall standardavvik over bakgrunnen for å sette den positive terskel. Å score en prøve som positiv eller negativ, bestemmer skriptet automatisk forskjellen Δ prøven mellom maksimum og minimum fluorescens for hver prøve ved hjelp av rå fluorescens data eksportert fra Thermal cycler. Den beregner gjennomsnittlig forskjell Δ bakgrunn og standardavvik σ bakgrunn for alle nei-målet kontrollprøver. En prøve positiv hvis Δ prøven er mer enn z × σ bakgrunn ovenfor Δ bakgrunn. I avsnitt 5.10 brukeren bestemmer om du vil bruke standardterskel eller angi en ny terskel. Hvis brukeren ønsker å sette en ny terskel, bestemme ny terskel eksperimentelt ved å utføre tre eksperimenter hver inneholder 12 RPA reaksjoner uten HIV-1 DNA tilstede. Satt terskelen på den gjennomsnittlige økningen i fluorescens intensitet fra disse eksperimentene pluss 3 standardavvik. Etter endt § 6, returnerer manuset JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m automatisk estimert DNA konsentrasjonen for hver qRPA reaksjon (i log10 kopier). Hvis skriptet bestemmer at ingen HIV-1 DNA som var til stede i prøven, er den beregnede konsentrasjon oppført som enten "Negative for hiv "eller" ugyldig ", avhengig av om det fluorescerende signal for intern positiv kontroll skredet terskelen (z x σ bakgrunn + Δ bakgrunn). Hvis brukeren validere standardkurve med kjente prøvekonsentrasjoner, vil skriptet også returnere en ekstra bord lik den i tabell 1.

For å utvikle en real-time RPA analyse som gir nøyaktig kvantifisering, er eksperimentell konsistens avgjørende. For eksempel bruker de samme primer og sonde porsjoner for både standardkurven og valideringsforsøk. Også unngår fryse-tine-sykluser ved å lagre primer og probe alikvoter ved 4 ° C mellom eksperimenter heller enn -20 ° C. Den aliquoter mal brukes for standardkurven, og valideringsforsøk er lagret på samme måte. RPA enzym pellets og reagenser fra samme parti er brukt i henhold til produsentens anbefalinger. Til slutt, becabruker RPA mangler ekte "sykluser" til nøyaktig kontroll frekvensen av forsterkning, er standardisering av brukeren går helt avgjørende. Ved montering reaksjoner, må brukeren alltid følge de samme trinnene i samme rekkefølge, tilbringer omtrent like mye tid på hvert trinn. Reaksjonene må alltid blandes forsiktig med en ny pipettespiss, og boblene må alltid være eliminert. Før forsterkning, må reaksjonene holdes på en jevn temperatur, og den termosykler eller mikroskop programvare må alltid være forberedt før du legger reaksjoner for å unngå forsterkning på sub-optimale temperaturer som kan påvirke kvantifisering. Enhver variasjon i den innledende reaksjonsbetingelser kan føre til inkonsistens i eksperimentelle resultater.

Ved bruk av et mikroskop for å samle inn data, må ytterligere variable styres for å minimalisere variasjoner i fluorescens-intensitet. Alle reaksjoner må plasseres i samme region på scenen varmere, og mikroskoppe må være fokusert i samme område av brønnen for hver prøve. Selv om disse praksis blir fulgt, kan fluorescens data samlet på et mikroskop vise variasjon pga lokale lyspunkter som naturlig dannes under RPA reaksjoner, bobledannelse innenfor reaksjonskamrene eller fotobleking som følge av gjentatt eksponering for eksitasjon lys. Påvirkningen av disse variablene er tydelig i fluorescens data som er samlet på mikroskopet (figurene 4A og 4B), som demonstrerer referanse variabilitet, topper og bunner. Disse funksjonene er fraværende fra fluorescens data samlet inn på termosykleren (figur 3A og 3B). Til syvende og sist, er datainnsamling på mikroskopet for proof-of-prinsippet formål og den endelige analysen vil bli gjennomført på et felt-operable fluorescens leseren med mer presis geometri og programvarekontroll som minimerer disse variablene.

En annen viktigaspekt av qRPA assay utviklingsprosessen er konsistens i databehandling. Protokollen som er beskrevet i metodedelen bruker skript for å behandle rå fluorescens data (som er lagret i et regneark-fil) samlet inn fra en termosykler eller mikroskop. Alle eksperimenter brukes til å bygge standardkurven må formateres identisk. Når du bruker en termosykler å samle inn data, må den samme platen layout brukes, og data fra brønner som ikke inneholder RPA reaksjoner må ikke eksporteres. Ved bruk av et mikroskop for å samle inn data, må formatet til dataene stemmer overens med formatet for dataene automatisk utført fra den termosykler. For eksempel må de ikke-target-kontrolldata være i cellene C2: C61, og data for å øke mal konsentrasjoner skal være i cellene D2: D61, E2: E61, etc. Hvis det er flere replikater av hver konsentrasjon i et eksperiment, 2 nd replikere fortynningsserier må bestilles fra venstre til høyre fra ingen mål kontroll (NTC) til høyeste konsentrasjon oglagret i kolonnene umiddelbart til høyre for en st replikere fortynningsserie. For eksempel, i plateoppsettet som brukes i seksjon 1.2 med to replikater for hver prøve, fluorescens-data for den første replikat av hver prøve i fortynningsserie må lagres i cellene C2: H61 og fluorescens-data for den andre replikat av hver prøve i fortynning serien må lagres i cellene I2: N61. For plateoppsettet som brukes i kapittel 1.2, er dette standardformatering ved eksport av data fra termosykleren programvare til et regneark.

Representative data levert fra HIV-1 qRPA forsøk viser proof-of-concept støtte som RPA kan anvendes for kvantifisering av nukleinsyre-konsentrasjonen i ukjente prøver. Klinisk nyttige HIV-1 virusbelastningstester har en klinisk område på minst 4 størrelsesordner, en nøyaktighet på 0,5 log10 kopier, og en ramme-for-detektering av minst 200 kopier 19,20. HIV-1-DNA-analysen beskrevet oppfyller disse criteria og er mest nøyaktig ved lave konsentrasjoner, som vist i tabell 1. Derfor, med inkluderingen av en revers transkriptase trinn, antyder disse resultatene at en HIV-1-RT-RPA-analysen kan ha potensial til å måle HIV-1-virusbelastning i kliniske prøver. Ved utvikling av en qRPA analyse, justerer algoritmen parametrene kan justere følsomheten og lineær dynamisk område, avhengig av kliniske behov. Figur 6 viser at justering z (en parameter som bestemmer terskelen for positive prøver) kan påvirke følsomhet og nøyaktighet ved lav og høy målkonsentrasjoner. Videre kan det være mulig å øke oppløsningen og nøyaktigheten av kvantifisering ved inkubering av reaksjonen ved en lavere temperatur, eller ved å bruke mindre magnesiumacetat, og reduserer dermed graden av forsterkning.

Dette bevis på konseptet qRPA Målingen kan brukes til å kvantifisere konsentrasjonen av prøver inneholdende HIV-1-DNA. Den qRPA analysen beskrevet i denne manuscript inneholder detaljerte instruksjoner om hvordan du monterer sanntid RPA reaksjoner, utvikle og screene en IPC, og behandle rå fluorescens data å bygge en standardkurve som kan brukes for å kvantifisere ukjente prøver. Med den detaljerte instruksjoner er inkludert, kan denne protokollen kan tilpasses for å kvantifisere DNA-konsentrasjon i en rekke prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Denne forskningen ble finansiert av et stipend fra Bill & Melinda Gates Foundation gjennom Grand Challenges i Global Health Initiative.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qRPA Assay
HIV-1 forward primer Integrated DNA Technologies custom DNA oligos 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 
HIV-1 reverse primer Integrated DNA Technologies custom DNA oligos 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ 
HIV-1 probe BioSearch Technologies  custom DNA oligos 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 
IPC probe BioSearch Technologies  custom DNA oligos 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate TwistDx TwistAmp exo
PCR tube strips BioRad TLS0801
PCR flat cap tube strips BioRad TCS0803
Micro-seal adhesive BioRad 558/MJ 
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Human male genomic DNA Applied Biosystems 360486
96 well cold-block Cole Parmer EW-36700-48
Thermal cycler BioRad CFX96
MiniFuge VWR 93000-196
Vortex VWR 58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 EMD Millipore 648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Promega V4321
Nuclease free water Ambion AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template Waterborne Inc P102C It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1
PCR long forward primer Integrated DNA Technologies custom DNA oligos 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR long reverse primer Integrated DNA Technologies custom DNA oligos 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase New England Biolabs M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
TAE 10X buffer EMD Millipore 574797
Agarose Sigma Aldrich A9539
Microscope Experiments
Upright fluorescence microscope Zeiss Zeiss Imager.J1
Stage heater Bioscience Tools TC-GSH
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller Bioscience Tools TC-1100S
FAM/GFP filter cube Zeiss filter set 38 (000000-1031-346) excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm
HEX filter cube Chroma 49014 excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm
Laser cutter Engraver's Network VLS3.60
1/8" black acrylic McMaster Carr 8505K113
1.5 mm clear acrylic McMaster Carr PD-72268940 
Super glue Office Depot Duro super glue 
PCR grade mineral oil Sigma Aldrich M8662-5VL
Data Analysis
Microsoft Excel Microsoft
MATLAB MATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” Included in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” Included in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” Included in SI
Adobe Illustrator Adobe
JoVE_qRPA_well.ai Included in SI
JoVE_qRPA_base.ai Included in SI
AxioVision software Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript Included in SI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yoon, J. -Y., Kim, B. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety. Sensors. 12, (8), 10713-10741 (2012).
  2. Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites. Journal of Microbiological Methods. 49, (3), 209-224 (2002).
  3. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75, (1), 1-4 (2013).
  4. Asiello, P. J., Baeumner, A. J. Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab on a Chip. 11, (8), 1420-1430 (2011).
  5. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology. 4, (7), 1115-1121 (2006).
  6. Krõlov, K., Frolova, J., et al. Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples. The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16, (1), 127-135 (2014).
  7. Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a, Puchades, R., Maquieira, A. Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis. Analytica Chimica Acta. 811, (1), 81-87 (2014).
  8. Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis. Malaria Journal. 13, (1), 99 (2014).
  9. Crannell, Z. A., et al. Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens. Analytical Chemistry. 86, (5), 2565-2571 (2014).
  10. Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA. Lab on a Chip. 12, (17), 3082 (2012).
  11. Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening. Talanta. 115, (1), 159-165 (2013).
  12. Euler, M., et al. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents. Journal of Clinical Microbiology. 51, (4), 1110-1117 (2013).
  13. Abd El Wahed, A., et al. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. PloS One. 8, (8), e71642 (2013).
  14. Escadafal, C., et al. Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, (3), e2730 (2014).
  15. Hutson, S. L., et al. T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest. PLoS ONE. 5, (11), 15 (2010).
  16. Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy. 8, (1), 118-129 (2003).
  17. DNA Extraction from Serum. Life Technologies. Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html (2014).
  18. Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification. Analytical Chemistry. 86, (12), (2014).
  19. Sollis, K. a, et al. Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples. PloS one. 9, (2), e85869 (2014).
  20. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. Department of Health and Human Services. Washington D.C. 1-166 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics