שיטה פשוטה וזולה לקביעה קרה רגישות והסתגלות בעכברים

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Gereau IV, R. W. A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52640, doi:10.3791/52640 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

מדידת היענות קרה במכרסמים היא חשובה לשיפור הבנתנו את המנגנונים האפשריים של רגישות קרה בבני אדם תחת שני תנאים נורמלים ופתולוגיים. קר Plantar Assay (CPA), שפותח במקור לפני מספר שנות 1, נועדה ליצור תגובות לשחזור, חד-משמעיות עכבריות התנהגות לגירוי קר נשא בRT. יותר שיפורים האחרונים של assay זה אפשרו את המדידה לשחזור של רגישות קרה במגוון רחב של טמפרטורות 2. שני הגרסאות גם נועדו להיות יחסית תפוקה גבוהה, וזול לשימוש.

התקדמות רבה נעשה בהבנת המנגנונים של רגישות קרה באמצעות שיטות התנהגותיות אחרות. שיטה אחת היא מבחן אידוי אצטון, הכולל מספיג או ריסוס אצטון על כפת העכבר ומדידת משך זמן שמבלה העכבר מצליף 3,4 הכפה. לרוע המזל,התגובות לאידוי אצטון הם מבולבלות על ידי התחושה הרטובה והריח של אצטון. כמו כן, הגירוי הקר שחל במבחן אידוי אצטון יכול להשתנות בהתאם לכמות של אצטון מיושם, וקשה לכמת. לבסוף, יש לי עכברים ללא כל פגע תגובות מינימליות לאצטון בתחילת המחקר, מה שהופך את זה אי אפשר למדוד שיכוך כאבים בהיעדר רגישות יתר בשיטה זו.

נוסף assay הקלאסי לתגובות קרות הוא assay קפיצי זנב, שבו זמן האחזור לנסיגה נמדד לאחר הזנב הוא שקוע ב5,6 מים קרים. בעוד התגובות התנהגותיות בassay זה הן חד משמעיות וassay מודד תגובות לטמפרטורה מסוימת, בעלי החיים חייבים להיות מרוסנים במהלך בדיקה, אשר יכולה לשנות את היענות קרה באמצעות מנגנוני מתח מושרה היטב תיארו משכך כאבים 7.

כלי נוסף נפוץ הוא מבחן הצלחת הקר, המודד את ההתנהגותתגובות של עכברים אחרי שהם מונחים על צלחת מקורר פלטייה 8-10. בעוד כלי זה מספק מידע על תגובות של בעלי חיים בטמפרטורות מסוימות, יש לו גם נעשה שימוש לא עקבי; קבוצות שונות מדדו סוגים שונים של תגובות הכוללים מספר הקפיצות 8,11, חביון התגובה הראשונה 8,11- 13, ומספר הכפה מרים 11,13,14 עם תוצאות שונות מאוד. Assay הצלחת הקר הוא גם תפוקה נמוכה יחסית כמו שרק חיה אחת יכול להיבדק בכל פעם, וזה דורש מכשיר פלטייה יקר ושביר.

מבחן העדפת טמפרטורת 2-הצלחת הוא נגזר נפוץ של מבחן הצלחת הקרה שמודד את הכמות היחסית של זמן שבעלי חיים להוציא על 2 צלחות מחוברות של טמפרטורות שונות 9,15- 17. assay הנפוץ דומה נוסף הוא assay שיפוע התרמית, שבו כמות הזמן שמבלים עכברים באזורי טמפרטורה שוניםהנע בין 5 ° C ו -45 ° C על צלחת מתכת ארוכה נמדד 16. בעוד מבחני אלה מאפשרים השוואה של טמפרטורות, לא ברור אם ההתנהגות מייצגת סלידת טמפרטורה או להעדפת טמפרטורה.

לבסוף, assay הצלחת קרה הדינמי נעשה שימוש כדי למדוד כמה עכברים להגיב לשינויים בטמפרטורות הסביבה 18. שיטה זו כוללת הצבת עכברים במכשיר פלטייה RT וramping אותו עד 1 ° C תוך מדידה כמה העכברים לקפוץ או ללקק את כפותיהם בטמפרטורות צלחת שונות. אמנם זה בוחן כיצד עכברים להסתגל לסביבת קירור, הוא אינו מספק דרך לבדוק כמה עכברים להגיב לגירוי קר בהגדרה של טמפרטורת סביבה קרירה. בנוסף, הוא דורש ציוד יקר לביצוע ואינו מספק דרך להסתגל לעכברי ציוד הבדיקה לפני מדידת הרגישות הקרה שלהם.

כדי להשלים את מבחני האלה, רו"ח בדיקות acclimaתגובות טד לגירוי קור מוגדר היטב במגוון רחב של תחומי טמפרטורה, או בתהליך של הסתגלות לטמפרטורות סביבה קרה. זה יכול לבדוק עד 14 עכברים בכל פעם עם המנגנון הנוכחי שלנו, עם הפוטנציאל להיות scaled עד בזול לבדיקת תפוקה גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל פרוטוקולי העכבר היו בהתאם למכונים לאומי לבריאות הנחיות ואושרו על ידי ועדת בעלי החיים הלימודים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון (סנט לואיס, מיזורי).

1. הכנת צלחת הבדיקה ומארזים

  1. לנקות את משטח הזכוכית.
  2. Secure תרמי הבדיקה חוט T-הסוג אל פני השטח באמצע צלחת הזכוכית עם קלטת מעבדה.
  3. הנח את המארזים של בעלי החיים על צלחת הזכוכית בשורה אחת יחד אמצע הצלחת.
  4. השחל את תרמי הבדיקה דרך מתחם בעלי החיים המרכז ולחבר אל אוגר נתונים. הפעל אוגר נתונים על תוך כיבוי אוטומטי תכונת הכיבוי, ולצרף את אוגר נתונים למחשב באמצעות הכבל המסופק.
    1. אם הקלטת טמפרטורת הצלחת במהלך הניסוי, לפתוח את התוכנה לוגר נתונים כדי להתחיל בהקלטת טמפרטורות צלחת.
    2. במידת צורך, להתאים את התוכנה מחדשכבל טמפרטורת צלחת אחת לשנייה.
    3. להתחיל בהקלטת טמפרטורות באמצעות התוכנה ארוזה עם אוגר נתונים התרמי.
  5. הפרד את המארז עם מוסיף שחור כדי למנוע אינטראקציה חזותית בין עכברים.
  6. עמדה משקפת מתחת לזכוכית כך שהחלק התחתון של המארזים גלוי ממצב של ישיבה נוח.

2. התחממות / קירור צלחת הזכוכית

  1. מלא תיבות אלומיניום עם מים מחוממים, קרח רטוב, או קרח יבש ולמקם אותם כראוי על צלחת הזכוכית (גם מנות רדיד אלומיניום מלאים בקרח יבש יכולות לשמש כדי לקרר את הזכוכית; איור 1) 2.
    1. לבדיקה ב 30 מעלות צלזיוס, מקם את קופסות האלומיניום כ 0.25 '' ממארזי בעלי החיים (איור 2) 2.
      1. הגדר circulator מים מחומם בכל צד של צלחת הזכוכית. הגדר את circulator ל45-60 מעלות צלזיוס, ואותנודואר זה כדי למלא את תיבות אלומיניום עם זרם קבוע של מים חמים (איור 1 ג) 2.
      2. מקם את circulators כך שהמים החמים מתיבות האלומיניום מנקז ישירות בחזרה למאגר של circulator בכל צד (איור 1 ג) 2.
    2. לבדיקה ב RT, לעזוב את התיבות ריק (איור 2) 2.
    3. לבדיקה בגיל 17 ° C, למקם את התיבות כ 0.25 '' ממארזי בעלי החיים משני הצדדים ולמלא עם קרח רטוב (איור 2) 2.
    4. לבדיקה ב 12 ° C, למקם את התיבות כ -1.25 '' ממארזים מכל צד ולמלא עם קרח יבש (איור 2) 2.
    5. לבדיקה ב5 מעלות צלזיוס, למקם את התיבות כ 0.25 '' ממארזים מכל צד ולמלא עם קרח יבש (איור 2) 2.
      1. כאשר קירור הכוס בקרח יבש, לוודא שיש אוורור מספיק כדי למנוע הצטברות CO 2 בחדר.
  2. חכה לזכוכית להגיע לטווח הטמפרטורה הרצוי.
  3. הוסף את העכברים למארזים על הצלחת.
    הערה: מחולל רעש לבן ניתן להשתמש כדי להקטין מטרדי רעש.
  4. חכה לעכברים להסתגל.
    הערה: במתקן שלנו זה לוקח בערך 2.5 שעות, אך עשויים להשתנות באופן משמעותי המבוסס על דיור בעלי חיים ותנאי טיפול.
  5. לשמור על הזכוכית במגוון הטמפרטורה הרצויה על ידי הבטחה כי התיבות נשמרות מלאה מים התחממו, קרח רטוב, או קרח יבש.
    הערה: עם המנגנון שלנו את התיבות צריכה להיות ומילא עם קרח בערך כל 90 דקות.
    הערה: למצב C ° 17, זה מועיל לרוקן את רוב המים מקופסות האלומיניום דרך חורי הניקוז לפני המילוי אותו עם קרח. זה יתייצב, ויחסי ציבור הטמפרטורה טובים יותרהצפת אירוע
    הערה: כמות הקרח היבש המדויקת משתנות עונתית, אבל באופן כללי שמירה על קופסות יותר מ ¼ מלאים לאורך כל אורכו של התיבה ישמור טמפרטורה קבועה.

3. בדיקת העכברים בטמפרטורות קבועות

  1. מחוץ לחדר התנהגותיות, למלא דלי קרח כמחצית מלאה של קרח יבש.
  2. שימוש בפטיש או פטיש, לרסק את הקרח היבש לאבקה דקה.
    הערה: מילוי יתר של הדלי יקשה לרסק את הקרח היבש באופן מלא באבקה.
  3. באמצעות סכין גילוח ישר או מספריים, לחתוך את החלק העליון את מזרק 3 מיליליטר.
  4. באמצעות מחט 21 G, לתקוע 3 חורים בצדדים מנוגדים של המזרק (הכולל של 6 חורים).
    הערה: חורים אלה יקטינו את הלחץ שנוצר על ידי סובלימציה תוך דחיסת הקרח היבש. המזרק החתוך ניתן לעשות שימוש חוזר בניסויים מרובים.
  5. קח את המזרק, אבקת קרח יבשה, ושעון עצר שנערך ביד לחדר התנהגותיות.
  6. למלא את תא מזרק חצי מלא של אבקת קרח יבשה. החזק את הקצוות של המזרק נגד אובייקט שטוח, ובתקיפות לדחוס את האבקה באמצעות הבוכנה. היזהר; בוכנת הפלסטיק עלולה לכופף או לשבור מהלחץ. אם זה יקרה, להחליף את הבוכנה של מזרק חדש.
  7. להאריך את הקצה של גלולה הקרח היבשה הדחוסה עבר הקצה של המזרק.
  8. עכברי מבחן כי הם מלא במנוחה.
    1. על 30 מעלות צלזיוס, 23 ° C ו -17 ° C, עכברי מבחן שכל 4 כפות על הזכוכית ולא זזו, אבל לא ישן 19 באופן מלא.
    2. בגיל 12 מעלות צלזיוס, 5 מעלות צלזיוס, עכברי מבחן, כי הם על 2 כפות או 4 כפות ולא זזו או לקפוץ.
  9. השימוש במראות למיקוד, בעדינות אך בתקיפות לחצו על סומק גלולה השטוח על משטח הזכוכית מתחת לhindpaw העכבר (איור 1 א) 2. התחל היד-טיימר.
  10. לעצור את שעון העצר ולהסיר את הכדור כאשר העכבר מתרחק מהזכוכית מקוררת.
    הערה: תנועת הנסיגה יכולה להיות אנכית או אופקית.
    1. אם העכבר נע לזמן קצר מאוד כפה ולאחר מכן מחזיר אותו אל פני השטח הקירור, תמשיך עיתוי וגירוי עד העכבר עושה צעד קבוע משם.
      הערה: המעבדה שלנו משתמשת בזמן גירוי מקסימאלי של 20 שניות לעכברים ברוב המכריע של המקרים.
  11. חזור על הליך בדיקה זו לפחות עד 3 ערכים על כל כף רגל של כל בעלי חיים שנאספו. ניסויים נפרדים בדיקת כפות הפוכות באותו העכבר על ידי לפחות 7 דקות, ומשפטים רצופים נפרדים על כל כף רגל אחת על ידי לפחות 15 דקות.
  12. במידת הצורך, להשתמש בעוביים שונים של זכוכית כדי ליצור שיעורים שונים של קירור (איור 3) 1.
    הערה: שיעור הקירור קשור ביחס הפוך עם העובי של הזכוכית.

4. בדיקת העכברים במהלך קרה הסתגלות

שימו לב: זה פרוטוקול חלופי המאפשר בדיקה כplat הזכוכיתדואר מתקרר, ולא פעם אחת הצלחת התייצבה והעכברים יש להתאים באופן מלא לסביבה הקרה.

  1. בצע את ההוראות המופיעות בסעיף 1 להקמת המנגנון.
  2. בצע את ההוראות המופיעות בסעיף 3 לקחת מידות בסיס בRT (איור 7 א) 2.
  3. טרום לקרר את תיבות אלומיניום עם קרח יבש.
  4. ברגע ששיהוי נסיגת בסיס נמדד, למקם את תיבות precooled על הצלחת כ -1.25 '' מהמארזים משני הצדדים (איור 7 א, חץ שכותרתו "קרח יבש הוסיף") 2.
  5. בצע את ההוראות המופיעות בסעיף 3 כדי לבצע מדידות כצלחת הזכוכית מתקררת, במדידות לעתים קרובות ככל האפשר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התגובות התנהגותיות שהושרו מעכברים מתחילים ב 30 מעלות צלזיוס, 23 ° C, 17 ° C, ו- 12 ° C הן (איור 4 א) 20 לשחזור מאוד. על מנת למדוד את הגירוי הקר המופק תחת hindpaw, עכברים מורדמים עם קטמין / xylazine / קוקטייל acepromazine וכפותיהם הובטחו על הזכוכית על גבי תרמי נימה T-הסוג (איור 4) 20. הזכוכית מקוררת או מחומם למגוון בדיקות הרצוי. למרות הצלחת מקוררת באופן אחיד לאורכו של הצלחת (איור 5 א ') 2, יש לציין כי שיפוע קר מופק על פני מארזי ההתנהגות (איור 5) 2. החלקים של המתחם שקרובים יותר לקרח היבש בכל צד של המארזים הם קרירים, ואילו החלקים המרכזיים הם מעט חמים יותר (איור 5) 2. בטמפרטורות הקרות ביותר uSED, העכברים מבלים את רוב זמנם בחלקים של המתחם המרכזיים. ברגע שטמפרטורת צלחת הזכוכית התייצבה, גירוי קרח יבש מוקד הונח על הזכוכית מתחת לכפה / thermode. בהתבסס על עקבות הטמפרטורה שנרשמו מהגדרה זו, ברור שהגירויים הקרים נוצרו באמצעות רו"ח הם מאוד לשחזור בכל טווח טמפרטורה (איור 4C) 20.

הגירוי הקר שנוצר ברו"ח נמדד גם באמצעות שלושה עוביים שונים של זכוכית לגוון את עוצמת הקירור (איור 3). שיעור הקירור הוא ביחס הפוך לעובי הזכוכית, וכל עוביים אלה יכולים לשמש למדידת רגישות קרה לפי צורך (איור 3).

מחקרים קודמים הראו כי רו"ח יכול לזהות שיכוך כאבים ורגישים יתר בעכברים. 30 דקות לאחר זריקות תת עורית של 1.5 מ"ג / קילוגרם של מורפיום, עכברים יש באופן משמעותי lחביון onger לנסיגה מעכברים שקבלו זריקות תת עורית של תמיסת מלח (איור 6 א: 2-way p ANOVA העיקרי * השפעה <0.05 במבחן הפוסט-הוק Bonferroni; 30 דקות ** p <0.01; n = 12 לכל קבוצה) 1. ב -60 דקות לאחר מורפיום / מלוח, אין הבדל בין saline- והקבוצות-הזריק מורפיום, אשר עולה בקנה אחד עם קצב חילוף החומרים מורפיום בעכברים.

Adjuvant של פרוינד המלא (CFA) יש בעבר הוכח לגרום לדלקת ורגישות יתר לאחר הזרקת hindpaw 21. לאחר זריקות CFA, שיהוי נסיגת רו"ח להקטין לאחר הזרקת 2 ו -3 שעות (איור 6: 2-way p ANOVA העיקרי אפקט <0.001 עם Bonferroni פוסט הוק-בדיקה; שעה 2 p * <0.05, 3 שעות ** p <0.01 n = 12 לכל קבוצה). 4 שעות לאחר הזרקת CFA, העכברים קבלו זריקות תת עורית של 1.5 מ"ג / קילוגרם מורפין. 30 דקות לאחר הזרקת מורפיום withdr, שני CFA- ועכברים מוזרקים מלוחים עלואוואל שיהוי ביחס לשיהוי שלהם ב -3 שעות (איור 6: 1-הדרך ANOVA עם הבדיקה לאחר מעשה-של Dunnett; CFA 3 שעות לעומת p CFA 4.5 שעות $$$ <0.001, מלוח 3 שעות לעומת 4.5 שעות מלוחים $$$ p <0.001). שעה לאחר מכן, פעם אחת מורפיום היה חילוף חומרים, העכברים שהוזרקו-CFA היו שוב שיהוי נסיגה נמוך יותר מאשר העכברים מוזרקים המלוחים בקרה (איור 6: 2-way ANOVA עם מבחן Bonferroni פוסט-הוק; ** p <0.01) 1.

רוב מיני היונקים היכולת להתאים את רגישות הטמפרטורה שלהם כדי להתאים את הסביבה שלהם. במבחנה, המחקרים הראו כי תהליך הסתגלות זה תלוי בPIP 2 הידרוליזה 22- 24, אבל הכלים התנהגותיים קודמים לא הצליחו לאמת השערה זו in vivo. רו"ח מסוגל לכמת הסתגלות זאת בשתי דרכים שונות. על ידי בדיקת חביון הנסיגה של עכברים כזכוכית מתקררת ( 2. בתנאים רגילים חביון הנסיגה הוא ללא שינוי כצלחת מתקררת, המצביעה על כך הסתגלות קרה קורה מהר יותר מאשר ניתן לכמת עם רו"ח (איור 7: 0 דקות = 12.13 ± 0.8 שניות, 30 דקות = 12.1 ± 1.6 שניות, 60 דקות = 13.2 ± 1.1 שניות, 90 דקות = 10.8 ± 1.2 שניות 1-הדרך ANOVA עם Bonferroni ההודעה p מבחן הוק> 0.05, n = 6) 2. עם זאת, כאשר ניתנים עכברי intraplantar זריקות של U73122 מעכב פוספוליפאז-C 25 לפני הצלחת מקוררת (איור 7 ג) שיהוי נסיגתם ירדו, מה שמרמז הסתגלות שהנו פגום (איור 7D: בסיס = 11.29 ± 0.53 שניות, 30 דקות = 8.09 ± 1.17 שניות; 1-הדרך ANOVA עם פוסט-הוק המבחן של Dunnett, p = 0.02 השפעה העיקרית, לעומת תחילת המחקר בודד 30 דקות p = 0.02, n = 9).

רו"ח יכול גם למדוד את ability להסתגל לטמפרטורות סביבה קרות על פני תקופות זמן ארוכות. כאשר עכברי wild-type נבדקים באמצעות רו"ח לאחר שהתאקלם במשך 3 שעות על 30 מעלות צלזיוס, 23 ° C, 17 ° C, או 12 ° C חביון הנסיגה הוא אותו הטמפרטורות בכל מתחילות, המצביע על כך wild-type עכברים מותאמים לטמפרטורת הסביבה הקר יותר (איור 2 א: 30 WT ° C = 13.23 ± 0.5 שניות, 23 ° C = 12.8 ± 0.7 שניות, 17 ° C = 12.3 ± 0.9 שניות, 12 ° C = 12.8 ± 0.5 שניות, 1 דרך ANOVA עם מבחן Bonferroni פוסט-הוק, p> 0.05 n = 6 ל -30 מעלות צלזיוס, n = 15 במשך 23 ° C, 17 ° C, ו- 12 ° C) 20. בניגוד לעכברי wild-type, כמו טמפרטורת ההתחלה מקטינה את זמני שיהוי נסיגה של עכברי TRPM8-KO להקטין, המצביע על כך שהם לא מסוגלים להתאים את סף התגובה שלהם כדי שיתאים לסביבתם (איור 8: צעדי 1-הדרך חוזרים ונשנים ANOVA עם פוסט Bonferroni הוק בדיקה; זכרי p השפעה העיקרי = 1.5 x 10-5, C ° 12 vs. 23 ° C p = 6 x 10 -5, 17 ° C לעומת p C ° 23 = 0.004; p השפעה העיקרי נקבות = 3.6 x 10 -5, 12 ° C לעומת p C ° 23 = 9.25 x 10 -5, 17 ° C לעומת 23 ° C p = 0.0005; df = 1, n = 11 זכרים ונקבות 11) 20.

איור 1
איור 1. קר Plantar Assay (רו"ח) מנגנון 2. (א) סכמטי לביצוע רו"ח. עכברים התאקלמו על צלחת זכוכית במארזי פלסטיק התנהגות עד שהם במנוחה. גלולה קרח יבשה מוחלת על החלק התחתון של הכוס מתחת לhindpaw, וההשהיה לסגת מזכוכית הקירור נמדדת. תמונה (B) של מנגנון רו"ח, בתצורה כדי לקרר את הצלחת עד 5 מעלות צלזיוס. אוגר נתונים התרמי הוא במרכז המארזים, ואת תיבות האלומיניום לאגף את המתחם משני הצדדים. תמונה (C) של מנגנון רו"ח, בתצורה כדי לחמם את הצלחת עד 30 ° C. Circulator המים זורם מים חמים לתוך תיבת האלומיניום, אשר לאחר מכן זורמת החוצה לטמיון בצד חזרה למאגר של circulator. שימוש חוזר באישור ברנר et al. 2,014 2. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. טמפרטורה של צלחת הזכוכית במהלך רו"ח 2. () בממוצע העתקי טמפרטורה של צלחת הזכוכית במהלך ניסויים התנהגותיים ברו"ח. dem 30 ° C n = 1, 23 ° C n = 5, 17 ° C n = 7, 12 ° C n = 7, 4 ° C n = 5. (B) דיאגרמות סכמטיonstrating איך ליצור את תנאי טמפרטורה השונים ברו"ח. שימוש חוזר באישור ברנר et al. 2,014 2. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. עובי הזכוכית קשור ביחס הפוך לקצב קירור 1. (א) סכמטי דיאגרמות עיצוב ניסיוני (BD). הטמפרטורה במהלך גירוי plantar קר מתחת לכפה נמדדה בכל שלושת עוביים הזכוכית בתנאים רגילים, ומפרידים שהקלקר תמכו הכפה ממשטח הזכוכית. בכל המקרים, ותמך הכפה מהזכוכית גרם לירידה דרמטית בגירוי הקר הנמדד בכפה (n = 6 לעובי זכוכית). ( et al. 2012 1 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
4. שיהוי נסיגת רו"ח איור עולה בקנה אחד 20. (א) חביון הנסיגה הממוצע לעכברים החל מ -23 מעלות צלזיוס, 17 מעלות צלזיוס, או 12 מעלות צלזיוס. (ב) תצורה למדוד רו"ח גירוי קר. הכפה של עכבר הרדים מאובטחת על צלחת הזכוכית עם קלטת מעבדה על גבישל צמד תרמי נימה T-סוג. גירוי רו"ח ממוקם בחלק התחתון של הכוס מתחת שני כפות ותרמיות. טמפרטורות (C) שנוצרו ברו"ח החל מ 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, או 12 מעלות צלזיוס. החיצים השחורים מייצגים את שיהוי הנסיגה הממוצע של עכבר ער בכל מצב. שימוש חוזר באישור ברנר et al. 2,014 2. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
5. טמפרטורות צלחת זכוכית איור עולות בקנה אחד ברו"ח 2. (א) t1 צמד התרמי (שחור) הוצב במרכז הצלחת. T2 התרמי (אדום) הוצב במתחם ההתנהגות הקרוב ביותר לקצה הימני של הצלחת. Tra הטמפרטורהcings והגרף ב( T1-T2) ימין הקיצוני מראים טמפרטורות כמעט זהות בT1 ו- T2 בכל מהלך הניסוי. (ב) t1 צמד התרמי (שחור) הוצב במרכז הצלחת. T2 התרמי (אדום) הוצב במתחם ההתנהגותי המרכזי, בקיר הקרוב יותר לתיבות האלומיניום מלאת הקרח היבש. העתקי הטמפרטורה והגרף ב( T1-T2) ימין הקיצוני מראים שיש הבדל C 3 ° בערך בין T1 ו- T2 פעם הגיעה לצלחת טמפרטורה יציבה. שימוש חוזר באישור ברנר et al. 2,014 2. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. רו"ח יכול למדוד שיכוך כאבים ורגישות יתר 1. () Sהזרקת ubcutaneous של 1.5 מ"ג / קילוגרם מורפין מגדיל את זמן אחזור הנסיגה של עכברים 30 דקות לאחר ההזרקה (2-way ANOVA עם מבחן פוסט-הוק Bonferroni; לאחר הזרקת 30 דקות ** p <0.01). 60 דקות לאחר ההזרקה, אין הבדל משמעותי בין-הזריק מורפיום ועכברים הוזרקו תמיסת מלח. הזרקת Intraplantar של 10 ul Adjuvant של פרוינד המלא (CFA) (ב) מקטינה את זמן אחזור הנסיגה של עכברים 2 ולאחר הזרקת 3 שעות (2-way ANOVA עם מבחן Bonferroni פוסט-הוק; * p <0.05, ** p <0.01). כל העכברים קבלו זריקות תת עוריות של מורפיום על 4 שעות, וכל שיהוי הנסיגה ברמה של 4.5 שעות היו גבוה יותר באופן משמעותי בהשוואה ל -3 שעות (1-הדרך ANOVA עם המבחן פוסט-הוק של Dunnet; p $$$ <0.001). 5.5 שעות לאחר הזרקה של CFA (1.5 שעות לאחר הזרקת מורפיום), עכברים שהוזרקו-CFA עדיין היו שיהוי נסיגה נמוך יותר מאשר עכברים הוזרק תמיסת מלח (2-way ANOVA עם מבחן Bonferroni פוסט-הוק; ** p <0.01). שימוש חוזר באישורברנר et al. 2012 1. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7. מדידת הסתגלות קרה כמו צלחת הזכוכית דינמית מתקררת 20. סכמטי (א ') לביצוע רו"ח כצלחת הזכוכית מתקרר. טמפרטורות Baseline נמדדות לפי RT, מכולות הקרח יבשות מתווספות לצלחת, והשהית הנסיגה נמדדת כצלחת הזכוכית מתקררת. יש עכברים (B) Wild-סוג באותו זמן אחזור נסיגה כצלחת הזכוכית מתקררת, מה שמרמז שהם להסתגל לטמפרטורות קירור מהירים יותר מאשר ניתן למדוד עם רו"ח (Baseline = 12.8 ± 0.3 שניות, 30 דקות = 13.67 ± 0.9 שניות, 60 דקות = 11.03 ± 1.0 שניות, 90 דקות = 11.31 ± 0.6 שניות, n = 3 עכברים; 1-הדרך ANOVA עם מבחן Bonferroni פוסט-הוק, לא נמצא הבדלים משמעותיים בין קבוצות בכל). (ג) סכמטי לביצוע רו"ח כצלחת הזכוכית מתקרר, לאחר זריקות intraplantar של U73122 מעכב PLC או U73343 מתחם שליטה. יש עכברים (D) שיהוי נסיגה נמוך באופן משמעותי תוך צלחת קירור לאחר הזרקת U73122, המצביע על כך U73122 מפריע ליכולת להסתגל לקירור טמפרטורת סביבה. שימוש חוזר באישור ברנר et al. 2,014 20. איור זה שוחזר באישור של האגודה הבינלאומית לחקר הכאב (IASP). הדמות אין לשכפל לכל מטרה אחרת ללא רשות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"איור עכברי איור 8. TRPM8-KO לא להסתגל לסביבת קירור 20 עכברי TRPM8-KO latencies נסיגה גבוה מהמלטת wild-type בכל הטמפרטורות מתחילות נמדדו (2-way ANOVA עם מבחן Bonferroni פוסט-הוק;. *** p < 0.001). חביון הנסיגה של עכברי TRPM8-KO גם יורד ככל שיורד טמפרטורת ההתחלה (1-הדרך ANOVA עם Bonferroni פוסט הוק-בדיקה; p ## <0.01, p ### <0.001), בעוד שאין שינוי משמעותי בנסיגה זמן אחזור של המלטת wild-type כמקטין את הטמפרטורה מתחילה. שימוש חוזר באישור ברנר et al. 2,014 20. איור זה שוחזר באישור של האגודה הבינלאומית לחקר הכאב (IASP). הדמות אין לשכפל לכל מטרה אחרת ללא רשות. אנא Click כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T-type thermocouple probe Physitemp IT-24p Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger Extech EA15 Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml Syringe BD 309657 The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer If using Extech logger, any Pcwill work
Aluminum boxes Washington University in St. Louis machine shop boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator VWR Any water circulator model with a pump will work
21 G needle BD 305165 The exact needle size is not important
Hand timer Any hand timer will work
Mirror Any flat mirror will work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, D. S., Golden, J. P., Gereau, R. W. A Novel Behavioral Assay for Measuring Cold Sensation in Mice. Plos ONE. 7, (6), 8 (2012).
  2. Brenner, D. S., Vogt, S. K., Gereau, R. W. A technique to measure cold adaptation in freely behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. (2014).
  3. Choi, Y., Yoon, T. W., Na, H. S., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral signs of ongoing pain and cold allodynia in a rat model of neuropathic pain. Pain. 59, (3), 369-376 (1994).
  4. Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neuroscience letters. 458, (2), 93-95 (2009).
  5. Carlton, S. M., Lekan, H. A., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral manifestations of an experimental model for peripheral neuropathy produced by spinal nerve ligation in the primate. Pain. 56, (2), 155-166 (1994).
  6. Pizziketti, R. J., Pressman, N. S., Geller, E. B., Cowan, A., Adler, M. W. Rat cold water tail-flick: A novel analgesic test that distinguishes opioid agonists from mixed agonist-antagonists. European Journal of Pharmacology. 119, (1-2), 23-29 (1985).
  7. Pinto-Ribeiro, F., Almeida, A., Pego, J. M., Cerqueira, J., Sousa, N. Chronic unpredictable stress inhibits nociception in male rats. Neuroscience letters. 359, (1-2), 73-76 (2004).
  8. Karashima, Y., et al. TRPA1 acts as a cold sensor in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (4), 1273-1278 (2009).
  9. Knowlton, W. M., Bifolck-Fisher, A., Bautista, D. M., McKemy, D. D. TRPM8, but not TRPA1, is required for neural and behavioral responses to acute noxious cold temperatures and cold-mimetics in vivo. Pain. 150, (2), 340-350 (2010).
  10. Allchorne, A. J., Broom, D. C., Woolf, C. J. Detection of cold pain, cold allodynia and cold hyperalgesia in freely behaving rats. Molecular pain. 1, 36 (2005).
  11. Colburn, R. W., et al. Attenuated cold sensitivity in TRPM8 null mice. Neuron. 54, (3), 379-386 (2007).
  12. Dhaka, A., Murray, A. N., Mathur, J., Earley, T. J., Petrus, M. J., Patapoutian, A. TRPM8 is required for cold sensation in mice. Neuron. 54, (3), 371-378 (2007).
  13. Bautista, D. M., et al. The menthol receptor TRPM8 is the principal detector of environmental cold. Nature. 448, (7150), 204-208 (2007).
  14. Obata, K., et al. TrpA1 induced in sensory neurons contributes to cold hyperalgesia after inflammation and nerve injury. The Journal of Clinical Investigation. 115, (9), 2393-2401 (2005).
  15. Tang, Z., et al. Pirt functions as an endogenous regulator of TRPM8. Nature communications. 4, 2179 (2013).
  16. Lee, H., Iida, T., Mizuno, A., Suzuki, M., Caterina, M. J. Altered thermal selection behavior in mice lacking transient receptor potential vanilloid 4. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25, (5), 1304-1310 (2005).
  17. Pogorzala, L. A., Mishra, S. K., Hoon, M. A. The cellular code for Mammalian thermosensation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 33, (13), 5533-5541 (2013).
  18. Yalcin, I., Charlet, A., Freund-Mercier, M. -J., Barrot, M., Poisbeau, P. Differentiating thermal allodynia and hyperalgesia using dynamic hot and cold plate in rodents. The journal of pain official journal of the American Pain Society. 10, (7), 767-773 (2009).
  19. Callahan, B. L., Gil, A. S., Levesque, A., Mogil, J. S. Modulation of mechanical and thermal nociceptive sensitivity in the laboratory mouse by behavioral state. The journal of pain: official journal of the American Pain Society. 9, (2), 174-184 (2008).
  20. Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Dhaka, A., Story, G. M., Gereau, R. W. A dynamic set point for thermal adaptation requires phospholipase C-mediated regulation of TRPM8 in vivo. Pain. (2014).
  21. Patwardhan, A. M., Scotland, P. E., Akopian, A. N., Hargreaves, K. M. Activation of TRPV1 in the spinal cord by oxidized linoleic acid metabolites contributes to inflammatory hyperalgesia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (44), 18820-18824 (2009).
  22. Fujita, F., Uchida, K., Takaishi, M., Sokabe, T., Tominaga, M. Ambient Temperature Affects the Temperature Threshold for TRPM8 Activation through Interaction of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate. Journal of Neuroscience. 33, (14), 6154-6159 (2013).
  23. Rohacs, T., Lopes, C. M., Michailidis, I., Logothetis, D. E. PI(4,5)P2 regulates the activation and desensitization of TRPM8 channels through the TRP domain. Nature neuroscience. 8, (5), 626-634 (2005).
  24. Daniels, R. L., Takashima, Y., McKemy, D. D. Activity of the neuronal cold sensor TRPM8 is regulated by phospholipase C via the phospholipid phosphoinositol 4,5-bisphosphate. The Journal of biological chemistry. 284, (3), 1570-1582 (2009).
  25. Zhang, H., et al. Neurokinin-1 receptor enhances TRPV1 activity in primary sensory neurons via PKCepsilon: a novel pathway for heat hyperalgesia. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27, (44), 12067-12077 (2007).
  26. Wang, H., Zylka, M. J. Mrgprd-expressing polymodal nociceptive neurons innervate most known classes of substantia gelatinosa neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29, (42), 13202-13209 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics