Простой и недорогой метод для определения холодную чувствительность и адаптация в мышах

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Gereau IV, R. W. A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52640, doi:10.3791/52640 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Измерение холодной реагирования на грызунах важно для улучшения понимания потенциальных механизмов холодного чувствительности у человека в нормальных и патологических условиях. Холодная подошвенный анализа (CPA), изначально разработанная несколько лет назад 1, предназначен для генерации воспроизводимые и однозначные мышиные поведенческих реакций на холодную стимул поставки при комнатной температуре. Более поздние усовершенствования этого анализа позволили воспроизводимое измерение холодной чувствительности в широком диапазоне температур 2. Обе версии также разработан, чтобы быть относительно высокую пропускную способность и недорогой в использовании.

Значительный прогресс был достигнут в понимании механизмов холодной чувствительности с использованием других поведенческих методов. Один метод испытания испарения ацетона, который включает в себя вытирать или распылением ацетона на лапы мыши и измерения количества времени, которое тратит мыши щелкая лапу 3,4. К сожалению,ответы на испарения ацетона посрамлены мокрым ощущения и запах ацетона. Кроме того, холодный стимул, который применяется в тесте испарения ацетона может изменяться в зависимости от количества ацетона прикладной, и трудно определить количественно. Наконец, неповрежденной мыши имеют минимальные ответов на ацетона в основании, что делает невозможным измерить обезболивание при отсутствии чувствительности с помощью этого метода.

Другой классический тест для холодных ответов есть хвост щелчок анализа, где задержки к выходу измеряется после того, как хвост погружали в холодную воду 5,6. В то время как поведенческие реакции в этом тесте являются однозначными и анализ измеряет ответов на определенной температуре, животные должен удерживаться во время тестирования, которое может изменять холодной отклика с помощью хорошо описанных индуцированных стрессом обезболивающих механизмов 7.

Другой часто используемый инструмент является тест холодная плита, которая измеряет поведенческиеОтветы мышей после их помещают на тарелку Пельтье охлаждением 8-10. В то время как этот инструмент предоставляет информацию о реакции животных на конкретных температурах, было также противоречиво используются; различные группы измерили различные типы реакций, включая числа скачков 8,11, задержки в первой реакции 8,11- 13, а количество лапы поднимает 11,13,14 с очень разными результатами. Холодная плита анализ также относительно низкая пропускная способность, как только у одного животного могут быть проверены одновременно, и это требует дорогих и хрупких Пельтье устройство.

Тест предпочтения Температура 2-пластина обычно используется производное теста холодной пластины, который измеряет относительное количество времени, которое животные проводят на 2 соединенных пластин различных температурах 9,15- 17. Другой подобный тест широко используется в термический градиент анализа, где количество времени, которое мышей проводят в различных температурных зонв диапазоне от 5 ° С до 45 ° С на длительный металлической пластины измеряется 16. Хотя эти анализы позволяют сравнивать температуры, неясно, является ли поведение температуры отвращение или предпочтениями температуры.

Наконец, динамический холодной пластины анализа была использована, чтобы оценить, насколько мышей реагировать на изменение температуры окружающей среды 18. Этот метод включает в себя размещение мышей на Пельтье устройства RT и наращивает его до 1 ° С при измерении, сколько мышей прыгать или лизать лапы при различных температурах пластины. Хотя это тесты, как мыши, адаптироваться к охлаждающей среде, не обеспечивают способ, чтобы проверить, насколько мышей реагируют на холодную стимула в установлении более низкой температуре окружающей среды. Кроме того, он требует дорогостоящего оборудования для выполнения и не дает возможность акклиматизироваться мышей испытательного оборудования перед измерением их холодной чувствительность.

В дополнение к этим анализы, CPA проверяет ACCLIMAответы Тед четко определенной холодной стимула в различных температурных интервалах, или в процессе адаптации к низким температурам окружающей среды. Она может испытать до 14 мышей в то время, с нашей нынешней аппарата, с потенциалом, чтобы быть недорого расширены для высокой пропускной испытаний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все протоколы мыши были в соответствии с национальными институтами принципов здравоохранения и были утверждены Комитетом по исследованиях на животных из Вашингтонского университета медицины (Сент-Луис, штат Миссури) на.

1. Подготовка плиты и корпуса тестирования

  1. Очистите поверхность стекла.
  2. Безопасный Т-типа, термопарой нити на поверхность в середине стеклянной пластины с лабораторной ленты.
  3. Поместите корпуса животного на стеклянную пластину в одну линию вдоль середины пластины.
  4. Автор термопары через зонд животных корпуса центральной и вставьте в регистратор данных. Включите регистратор данных на при деактивации функции автоматического выключения и прикрепите регистратор данных к компьютеру с помощью входящего в комплект кабеля.
    1. Если запись температуры пластины в процессе эксперимента, откройте программное обеспечение регистратора данных для записи температуры пластины.
    2. Если необходимо, отрегулируйте программное обеспечение зановошнур температура пластины один раз в секунду.
    3. Начните записи температуры с помощью программного обеспечения, поставляемого с тепловым регистратора данных.
  5. Отделите корпус с черными вставками для предотвращения визуального взаимодействия между мышами.
  6. Положение зеркала под стекла таким образом, что нижняя сторона корпусов видно из удобной сидячем положении.

2. Потепление / охлаждения стеклянной пластины

  1. Заполните алюминиевые коробки с подогретой водой, мокрого льда или сухого льда и расположить их соответствующим образом на стеклянную пластину (пакеты из алюминиевой фольги, заполненные сухим льдом также могут быть использованы для охлаждения стекла; Рисунок 1) 2.
    1. Для испытаний при 30 ° С, положение алюминиевых окон примерно 0,25 '' от корпусов животных (фиг.2В) 2.
      1. Набор с подогревом воды циркуляционного насоса по обе стороны от стеклянной пластины. Установите циркуляционный насос в 45 - 60 ° С, и насе его для заполнения алюминиевые ящики с постоянным потоком горячей воды (рис 1в) 2.
      2. Расположите циркуляционные таким образом, что горячая вода из алюминиевых коробок стоков непосредственно в резервуар циркулятора с каждой стороны (рис 1в) 2.
    2. Для тестирования при комнатной температуре, оставьте поля пустыми (рис 2) 2.
    3. Для тестирования в 17 ° C, установите флажки около 0,25 '' от корпусов животных по обе стороны и залейте льду (рис 2) 2.
    4. Для тестирования в 12 ° C, установите флажки около 1,25 '' от корпусов по обе стороны и заполнить с помощью сухого льда (рис 2) 2.
    5. Для испытаний на 5 ° С, положение коробки примерно 0,25 '' в сторону от корпуса по обе стороны и заполнить сухим льдом (рисунок 2) 2.
      1. При охлаждении стекла с сухим льдом, убедитесь, что вентиляция для предотвращения CO 2 накопления в комнате.
  2. Подождите, пока стекло, чтобы достичь требуемого температурного диапазона.
  3. Добавить мышей корпусов на тарелку.
    Примечание: Генератор белого шума может быть использован, чтобы уменьшить помехи шума.
  4. Подождите мыши, чтобы акклиматизироваться.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем учреждении это происходит примерно 2,5 ч, но это может значительно меняться в зависимости от содержания животных и условий обращения.
  5. Поддержание стекла в желаемом диапазоне температур, гарантируя, что блоки хранятся полна подогретой водой, мокрого льда или сухого льда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С нашей аппарата коробки должны быть пополнен со льдом примерно каждые 90 мин.
    Примечание: Для C 17 ° условии, что это полезно, чтобы очистить большую часть воды из алюминиевых коробок через дренажные отверстия перед заправкой его со льдом. Это стабилизирует температуру лучше, и прПереполнение событие
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точное количество сухого льда сезонным колебаниям, но в целом сохранности урн больше, чем ¼ полные по всей длине коробки будет поддерживать постоянную температуру.

3. Тестирование Мыши при фиксированных температурах

  1. Вне поведения комнату, заполнить ведро льда примерно половину полной сухого льда.
  2. Используя молоток или молоток, раздавить сухой лед в мелкий порошок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Переполнение ведро будет трудно в полной мере подавить сухой лед в порошок.
  3. Использование прямой лезвия бритвы или ножницы, вырезать довершение 3 мл шприц.
  4. С помощью иглы 21 G, совать 3 отверстия на противоположных сторонах шприца (всего 6 отверстий).
    Примечание: Эти отверстия уменьшает давление, создаваемое путем сублимации при сжатии сухой лед. Отсечения шприц можно повторно использовать для нескольких экспериментов.
  5. Возьмите шприц, сухой порошок лед, и ручной секундомер в поведенческой комнате.
  6. Заполните шприц камеру наполовину полон сухого порошка льда. Удерживая отрезанного конца шприца против плоского объекта, и плотно сжимают порошок с помощью плунжера. Будь осторожен; пластик поршень может погнуться или сломаться от давления или. Если это произошло, замените поршень с новой шприц.
  7. Расширение кончик сжатого сухого льда гранулы за край шприца.
  8. Тестовые мышей, которые полностью в покое.
    1. При 30 ° С, 23 ° С и 17 ° С, тест мышей, которые имеют все четыре лапы на стекле и не движется, но не в полной мере спит 19.
    2. В 12 ° С и 5 ° С, тест мышей, которые находятся на 2 лапах или 4 лапы, не двигаясь и прыжки.
  9. Использование зеркал для прицеливания, мягко, но твердо нажать плоскую гранул вплотную к поверхности стекла под мышью задней лапы (1А) 2. Начните ручной таймер.
  10. Остановить таймер и удалить осадок, когда мышь перемещается от охлажденного стекла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: движение изъятие может быть вертикальным или горизонтальным.
    1. Если очень коротко мыши перемещает лапу, а затем возвращает его на охлаждаемой поверхности, по-прежнему времени и стимулирование, пока мышь не имеет постоянный отход.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наша лаборатория использует максимальное время Стимул 20 сек для мышей в большинстве случаев.
  11. Повторите эту процедуру тестирования по крайней мере до 3 значения на каждой лапе каждого животного не собираются. Отдельные пробы тестирования противоположные лапы на одной и той же мыши, по крайней мере, 7 мин и отдельных последовательных испытаний на какой-либо одной лапкой по крайней мере 15 мин.
  12. Если необходимо, используйте различную толщину стекла для создания различных скорости охлаждения (рис 3) 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: скорость охлаждения обратно коррелирует с толщиной стекла.

4. Тестирование мышей в холодное время адаптации

ПРИМЕЧАНИЕ: Это альтернативный протокол, который позволяет тестировать как стекло Плате охлаждает, а не после того, как пластина стабилизированного и мышей полностью адаптирована к холодной окружающей среде.

  1. Следуйте инструкциям, приведенным в разделе 1 для настройки аппарата.
  2. Следуйте инструкциям, приведенным в разделе 3, чтобы принять базовые измерения при комнатной температуре (7А) 2.
  3. Предварительного охлаждения алюминиевые ящики с сухим льдом.
  4. После того, как исходные задержки вывода были измерены, поместите предварительно охлажденный коробки на пластине примерно 1,25 '' от корпусов по обе стороны (7А, стрелка с надписью "Сухой лед добавил, что") 2.
  5. Следуйте инструкциям, приведенным в разделе 3 для измерений как стеклянная пластина охлаждается, замеры как можно чаще.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Поведенческие реакции, индуцированные у мышей, начиная с 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, и 12 ° C высокой воспроизводимостью (4А) 20. Для того чтобы измерить холодной стимул быть создан под задней лапы мышей анестезировали смесью кетамина / ксилазина / ацепромазина коктейль и их лапы были закреплены на стекло в верхней части Т-типа нитей термопары (фиг.4В) 20. Стекло охлаждают или нагревают до желаемой полигоне. Хотя пластина охлаждается равномерно по длине пластины (фиг 5А) 2, следует отметить, что холодный градиент генерируется по поведению корпуса (фиг.5В) 2. Части корпуса, которые ближе к сухой лед по обе стороны от корпуса холоднее, в то время как центральные части немного теплее (фиг.5В) 2. В холодных температурах уSed, мыши проводят большую часть своего времени в центральных частях корпуса. После того, как температура стеклянной пластины стабилизировалась, фокусное сухой лед стимул был помещен на стекло под лапы / термодатчика. На основе температуры следов записанных в этой установке, ясно, что холодные раздражители, полученные с помощью CPA высокой воспроизводимостью при каждом интервале температур (фиг.4С) 20.

Холодно стимул генерируется в CPA также измеряли с использованием трех различных толщин стекла варьировать интенсивность охлаждения (рисунок 3). Скорость охлаждения находится в обратной зависимости от толщины стекла, и любой из этих толщин может быть использовано для измерения холодной чувствительность при необходимости (рисунок 3).

Предыдущие исследования показали, что ЦПУ может обнаружить аналгезию и гиперчувствительность у мышей. Через 30 мин после подкожной инъекции 1,5 мг / кг морфина, мыши имеют значительно лonger Задержка с выводом чем мышей, получавших подкожные инъекции физиологического раствора (рис 6A: 2-полосная ANOVA Основной эффект * р <0,05 с Bonferroni ретроспективном тесте; 30 мин ** р <0,01; N = 12 в каждой группе) 1. К 60 мин после морфина / солевом растворе, не существует никакой разницы между saline- и морфина вводили групп, что соответствует скорости метаболизма морфина у мышей.

Фрейнда адъювант (CFA) ранее было показано, вызывают воспаление и гиперчувствительность после задней лапы инъекцией 21. После инъекций КФА, что задержки CPA отмены уменьшить 2 и 3 ч после инъекции (рис 6В: 2-полосная ANOVA Основной эффект р <0,001 с Бонферрони после специальной испытания; 2 ч * р <0,05, 3 ч ** р <0,01 N = 12 в каждой группе). 4 ч после инъекции CFA, что мышам подкожные инъекции 1,5 мг / кг морфина. 30 мин после инъекции морфина, как CFA- и солевым вводили мышам было повышенным выкатнAwal задержки по сравнению с их задержками на 3 часа (6В: 1-полосная ANOVA с тестом после специальной Даннетта; CFA 3 ч против CFA 4,5 ч $$$ р <0,001, физиологический 3 ч против физиологического раствора 4,5 ч $$$ р <0,001). Спустя час после того, как морфин был усвоен, КФА-вводили мышам снова имели более низкие задержки вывода, чем у контрольных мышей засоленных впрыском (рис 6b: 2-полосная ANOVA с тестом Бонферрони после специальной **; р <0,01) 1.

Большинство видов млекопитающих имеют возможность адаптировать свои температурную чувствительность, чтобы соответствовать их среде. В пробирке исследования показали, что этот процесс адаптации, зависит от PIP 2 гидролиза 22- 24, но предыдущие инструменты поведенческие были не в состоянии обосновать эту гипотезу в естественных условиях. ЦПУ способен количественного эту адаптацию двумя различными способами. С помощью тестирования задержки вывода мышей, стекло остывает ( два. При нормальных условиях задержка вывода остается неизменной, как пластина охлаждается, предполагая, что адаптация к холоду происходит быстрее, чем может быть определена количественно с CPA (рис 7В: 0 мин = 12,13 ± 0,8 сек, 30 мин = 12,1 ± 1,6 сек, 60 мин = 13,2 ± 1,1 сек, 90 мин = 10,8 ± 1,2 сек 1-дисперсионного анализа с Bonferroni после специальной испытательной р> 0,05, N = 6) 2. Однако, когда мышей приведены внутриподошвенная инъекций фосфолипазы-С ингибитора U73122 25 до пластины охлаждается (7С) их задержки на снятие средств снизилась, что свидетельствует, что адаптация нарушается (рис 7D: базовый = 11,29 ± 0,53 сек, 30 мин = 8.09 ± 1.17 сек; 1-полосная ANOVA с пост-специальной тест Даннетта, основной эффект р = 0,02, индивидуальный базовый против 30 мин р = 0,02, п = 9).

CPA может также измерять АВility адаптироваться к низким температурам окружающей среды в течение длительных периодов времени. При мышей дикого типа испытаны с помощью CPA после акклиматизации в течение 3 ч при 30 ° С, 23 ° С, 17 ° С, или 12 ° C Задержка вывода является одинаковым во всех, начиная температура, предполагая, что дикого типа мышей адаптировались к более холодному температуре окружающей среды (рис 2а: WT 30 ° C = 13,23 ± 0,5 сек, 23 ° C = 12,8 ± 0,7 сек, 17 ° C = 12,3 ± 0,9 сек, 12 ° C = 12,8 ± 0,5 сек, 1- дисперсионного анализа с Bonferroni после специальной тест, р> 0,05 N = 6 для 30 ° C, N = 15 для 23 ° C, 17 ° C, и 12 ° C) 20. В отличие от мышей дикого типа, а начальная температура уменьшает отмены задержки мышей TRPM8-KO уменьшаться, предполагая, что они не в состоянии адаптировать свою порога срабатывания в соответствии с их среду (Рисунок 8: 1-полосная повторных измерений ANOVA с Bonferroni пост- Специальная тест, самцы Основной эффект р = 1,5 х 10-5, 12 ° C по сравнению. 23 ° С р = 6 х 10 -5, 17 ° С против 23 ° С р = 0,004; женщины основной эффект р = 3,6 х 10 -5, 12 ° C по сравнению с 23 ° C р = 9,25 х 10 -5, 17 ° C по сравнению с 23 ° C р = 0,0005; DF = 1, N = 11 мужчин и 11 женщин) 20.

Рисунок 1
Рисунок 1. Холодный подошвенный анализа (CPA) устройство 2. () Схематическое для выполнения CPA. Мыши акклиматизировались на стеклянную пластину в пластиковых корпусах поведения, пока они не находятся в состоянии покоя. Сухим льдом осадок наносят на нижней стороне стекла на нижней стороне задней лапы, и задержка на выход из охлаждающей стекла измеряется. (Б) Изображение ЦПУ устройства, в конфигурации, чтобы охладить пластины до 5 ° С. Тепловой регистратор данных в центре корпусаИ алюминиевые окна обрамляют корпус с обеих сторон. (С) Изображение ЦПУ устройства, в конфигурации, чтобы нагреть пластину 30 ° С. Вода течет циркулятор горячей воды в поле алюминия, который затем вытекает из слив на стороне обратно в резервуар циркул. Подержанные с разрешения Бреннер и др. 2014 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2. Температура стеклянной пластине в течение CPA 2. (А) Средняя температура прорисовки стеклянной пластине в течение поведенческих экспериментов в CPA. 30 ° С п = 1, 23 ° C N = 5, 17 ° C N = 7, 12 ° C N = 7, 4 ° C N = 5. (В) Принципиальные схемы DEMonstrating, как генерировать различные температурные условия в CPA. Подержанные с разрешения Бреннер и др. 2014 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Толщина стекла обратно коррелирует со скоростью охлаждения 1. () Схематическое диаграмм экспериментальный дизайн (BD). Температура во время холодной подошвенной стимула под лапы измер ли на всех трех толщины стекла при нормальных условиях, и которые пенополистирола прокладки подпирать лапу от поверхности стекла. Во всех случаях, подпирая лапу от стекла вызвало резкое снижение холодной стимул измеренного на лапе (N = 6 на толщине стекла). ( и др. 2012 1 Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенный вариант этой цифры.

Рисунок 4
Рисунок 4. ЦПУ отмены задержки соответствуют 20. (А) Среднее время ожидания вывода для мышей, начиная с 23 ° C, 17 ° C, или 12 ° C. (B) Конфигурация для измерения CPA холодной стимул. Лапа под наркозом мыши закреплена на стеклянную пластину с лабораторной ленты на верхнейиз синтетических нитей термопарой Т-типа. ЦПУ стимул находится на нижней стороне стекла под лапой как и термопарой. (C) Температура генерируется в CPA, начиная с 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, или 12 ° C. Черные стрелки представляют собой средние задержки вывода для активных мышей в каждой состоянии. Используется с ее разрешения от Бреннера и др. 2014 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5
Рисунок 5. температура стеклянной пластины последовательны в ВМС 2. () Термопары T1 (черный) помещают в центре пластины. Термопара T2 (красный) помещают в ближайший поведенческой корпуса к правому краю пластины. Температурные траcings и график в крайней правой (T1-T2) показывают практически идентичные температуры при T1 и T2 на протяжении всего эксперимента. (В) термопары T1 (черный) помещают в центре пластины. Термопара T2 (красный) был помещен в центральной поведенческой корпуса, на стенке ближе к сухим льдом заполнены алюминиевых коробок. Температурные обводка и график в крайней правой (T1-T2) показывают, что существует различие примерно на 3 ° C между T1 и T2, как только пластина достигает стабильной температуры. Используется с ее разрешения от Бреннера и др. 2014 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6
Рисунок 6. CPA можно измерить обезболивания и гиперчувствительность 1. (A) Subcutaneous инъекции 1,5 мг / кг морфина увеличивает задержку вывода мышей через 30 мин после инъекции (2-полосная ANOVA с Bonferroni ретроспективном тесте; после инъекции 30 мин ** р <0,01). 60 мин после инъекции, нет существенной разницы между морфином впрыском и солевым раствором, вводили мышам. (B) внутриподошвенная инъекция 10 мкл полного адъюванта Фрейнда (CFA) уменьшает задержку вывода мышей 2 и 3 ч после инъекции (2-полосная ANOVA с Бонферрони ретроспективном тесте; * р <0,05, ** р <0,01). Все мыши были подкожные инъекции морфина на 4 часа, и все задержки вывода на 4,5 часа были значительно выше по сравнению с 3 ч (1-полосная ANOVA с ретроспективном тесте Dunnet в; $$$ р <0,001). 5,5 ч после инъекции CFA (1,5 ч после инъекции морфина), CFA-вводили мышам еще более низкие задержки вывода, чем физиологический раствор вводят мышам (2-полосная ANOVA с Бонферрони ретроспективном тесте; ** р <0,01). Подержанные с разрешенияБреннер и др. 2012 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7
Рисунок 7. Измерение адаптация к холоду, как стеклянная пластина динамически охлаждает 20. () Схематическое для выполнения CPA как стеклянной пластинки охлаждения. Исходные температуры измерены при комнатной температуре, сухие контейнеры льда добавляли в планшет, и задержки вывода определяется как стеклянная пластина охлаждается. (B) мышей дикого типа имеют одинаковую задержку вывода, как стеклянная пластина охлаждается, предполагая, что они адаптироваться к температуре охлаждающей быстрее, чем может быть измерена с CPA (базовый = 12,8 ± 0,3 сек, 30 мин = 13,67 ± 0,9 сек, 60 мин = 11,03 ± 1,0 сек, 90 мин = 11,31 ± 0,6 сек, п = 3 мышей; 1-полосная ANOVA с Bonferroni после специальной теста, без существенных различий между любыми группами). (С) Схема для выполнения CPA в стеклянной пластины охлаждения, после внутриподошвенная инъекций ингибитора PLC U73122 или U73343 управления соединением. (D) Мыши имеют значительно более низкие задержки вывода в то время как пластина охлаждения после инъекции U73122, U73122 предполагая, что мешает способности адаптироваться к охлаждающей температуре окружающей среды. Подержанные с разрешения Бреннер и др. 2014 20. Этот рисунок был воспроизведен с разрешения Международной ассоциации по изучению боли (IASP). Цифра может быть не воспроизводится в любых других целях без разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

"Рисунок Мыши Рисунок 8. TRPM8-KO не адаптироваться к окружающей охлаждения 20 мышей TRPM8-KO имеют более высокие задержки вывода, чем помета дикого типа на всех, начиная измеряемых температур (2-ANOVA с Бонферрони ретроспективном тесте;. *** Р < 0,001). Задержка вывода мышей TRPM8-KO также уменьшается с уменьшением начальной температуры (1-полосная ANOVA с Бонферрони после специальной испытания; ## р <0,01, ### р <0,001), в то время как нет никаких существенных изменений в выводе Латентность дикого типа помета в качестве исходного понижении температуры. Подержанные с разрешения Бреннер и др. 2014 20. Этот рисунок был воспроизведен с разрешения Международной ассоциации по изучению боли (IASP). Цифра может быть не воспроизводится в любых других целях без разрешения. Пожалуйста, сделайте кликК здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T-type thermocouple probe Physitemp IT-24p Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger Extech EA15 Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml Syringe BD 309657 The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer If using Extech logger, any Pcwill work
Aluminum boxes Washington University in St. Louis machine shop boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator VWR Any water circulator model with a pump will work
21 G needle BD 305165 The exact needle size is not important
Hand timer Any hand timer will work
Mirror Any flat mirror will work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, D. S., Golden, J. P., Gereau, R. W. A Novel Behavioral Assay for Measuring Cold Sensation in Mice. Plos ONE. 7, (6), 8 (2012).
  2. Brenner, D. S., Vogt, S. K., Gereau, R. W. A technique to measure cold adaptation in freely behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. (2014).
  3. Choi, Y., Yoon, T. W., Na, H. S., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral signs of ongoing pain and cold allodynia in a rat model of neuropathic pain. Pain. 59, (3), 369-376 (1994).
  4. Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neuroscience letters. 458, (2), 93-95 (2009).
  5. Carlton, S. M., Lekan, H. A., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral manifestations of an experimental model for peripheral neuropathy produced by spinal nerve ligation in the primate. Pain. 56, (2), 155-166 (1994).
  6. Pizziketti, R. J., Pressman, N. S., Geller, E. B., Cowan, A., Adler, M. W. Rat cold water tail-flick: A novel analgesic test that distinguishes opioid agonists from mixed agonist-antagonists. European Journal of Pharmacology. 119, (1-2), 23-29 (1985).
  7. Pinto-Ribeiro, F., Almeida, A., Pego, J. M., Cerqueira, J., Sousa, N. Chronic unpredictable stress inhibits nociception in male rats. Neuroscience letters. 359, (1-2), 73-76 (2004).
  8. Karashima, Y., et al. TRPA1 acts as a cold sensor in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (4), 1273-1278 (2009).
  9. Knowlton, W. M., Bifolck-Fisher, A., Bautista, D. M., McKemy, D. D. TRPM8, but not TRPA1, is required for neural and behavioral responses to acute noxious cold temperatures and cold-mimetics in vivo. Pain. 150, (2), 340-350 (2010).
  10. Allchorne, A. J., Broom, D. C., Woolf, C. J. Detection of cold pain, cold allodynia and cold hyperalgesia in freely behaving rats. Molecular pain. 1, 36 (2005).
  11. Colburn, R. W., et al. Attenuated cold sensitivity in TRPM8 null mice. Neuron. 54, (3), 379-386 (2007).
  12. Dhaka, A., Murray, A. N., Mathur, J., Earley, T. J., Petrus, M. J., Patapoutian, A. TRPM8 is required for cold sensation in mice. Neuron. 54, (3), 371-378 (2007).
  13. Bautista, D. M., et al. The menthol receptor TRPM8 is the principal detector of environmental cold. Nature. 448, (7150), 204-208 (2007).
  14. Obata, K., et al. TrpA1 induced in sensory neurons contributes to cold hyperalgesia after inflammation and nerve injury. The Journal of Clinical Investigation. 115, (9), 2393-2401 (2005).
  15. Tang, Z., et al. Pirt functions as an endogenous regulator of TRPM8. Nature communications. 4, 2179 (2013).
  16. Lee, H., Iida, T., Mizuno, A., Suzuki, M., Caterina, M. J. Altered thermal selection behavior in mice lacking transient receptor potential vanilloid 4. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25, (5), 1304-1310 (2005).
  17. Pogorzala, L. A., Mishra, S. K., Hoon, M. A. The cellular code for Mammalian thermosensation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 33, (13), 5533-5541 (2013).
  18. Yalcin, I., Charlet, A., Freund-Mercier, M. -J., Barrot, M., Poisbeau, P. Differentiating thermal allodynia and hyperalgesia using dynamic hot and cold plate in rodents. The journal of pain official journal of the American Pain Society. 10, (7), 767-773 (2009).
  19. Callahan, B. L., Gil, A. S., Levesque, A., Mogil, J. S. Modulation of mechanical and thermal nociceptive sensitivity in the laboratory mouse by behavioral state. The journal of pain: official journal of the American Pain Society. 9, (2), 174-184 (2008).
  20. Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Dhaka, A., Story, G. M., Gereau, R. W. A dynamic set point for thermal adaptation requires phospholipase C-mediated regulation of TRPM8 in vivo. Pain. (2014).
  21. Patwardhan, A. M., Scotland, P. E., Akopian, A. N., Hargreaves, K. M. Activation of TRPV1 in the spinal cord by oxidized linoleic acid metabolites contributes to inflammatory hyperalgesia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (44), 18820-18824 (2009).
  22. Fujita, F., Uchida, K., Takaishi, M., Sokabe, T., Tominaga, M. Ambient Temperature Affects the Temperature Threshold for TRPM8 Activation through Interaction of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate. Journal of Neuroscience. 33, (14), 6154-6159 (2013).
  23. Rohacs, T., Lopes, C. M., Michailidis, I., Logothetis, D. E. PI(4,5)P2 regulates the activation and desensitization of TRPM8 channels through the TRP domain. Nature neuroscience. 8, (5), 626-634 (2005).
  24. Daniels, R. L., Takashima, Y., McKemy, D. D. Activity of the neuronal cold sensor TRPM8 is regulated by phospholipase C via the phospholipid phosphoinositol 4,5-bisphosphate. The Journal of biological chemistry. 284, (3), 1570-1582 (2009).
  25. Zhang, H., et al. Neurokinin-1 receptor enhances TRPV1 activity in primary sensory neurons via PKCepsilon: a novel pathway for heat hyperalgesia. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27, (44), 12067-12077 (2007).
  26. Wang, H., Zylka, M. J. Mrgprd-expressing polymodal nociceptive neurons innervate most known classes of substantia gelatinosa neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29, (42), 13202-13209 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics