Een eenvoudige en goedkope methode voor het bepalen Koude Gevoeligheid en aanpassing in Muizen

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Gereau IV, R. W. A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52640, doi:10.3791/52640 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Meten koude responsiviteit bij knaagdieren is van belang voor een beter begrip van de mogelijke mechanismen van koude gevoeligheid bij mensen zowel onder normale en pathologische omstandigheden. De Koude Plantaire Assay (CPA), oorspronkelijk ontwikkeld enkele jaren geleden 1, is ontworpen om reproduceerbare, eenduidige muizen gedragsreacties op een koude stimulus afgeleverd bij RT genereren. Meer recente verbeteringen van deze assay kon de reproduceerbare meting koude gevoeligheid uiteenlopende temperaturen 2. Beide versies zijn ook ontworpen om relatief hoge doorvoer, en goedkoop te gebruiken.

Een groot deel van de vooruitgang is geboekt in het begrijpen van de mechanismen van koude gevoeligheid gebruik van andere gedragsproblemen methoden. Een methode is de aceton verdampen test, wat inhoudt deppen of sproeien aceton op de muis poot en het meten van de hoeveelheid tijd dat de muis besteedt aantikt poot 3,4. Helaas,de reacties op aceton verdamping verstoord door het nat gevoel en de geur van de aceton. Ook kan de koude stimulus die wordt toegepast in de aceton verdampen proef is afhankelijk van de hoeveelheid aceton toegepast en is moeilijk te kwantificeren. Tenslotte verwonde muizen minimale reactie op aceton bij basislijn, waardoor het onmogelijk analgesie gemeten in afwezigheid van overgevoeligheid deze methode.

Een andere klassieke test voor koude reacties is de staart flick test, waar de latentie tot de intrekking wordt gemeten na de staart wordt ondergedompeld in koud water 5,6. Terwijl de gedragsreacties in deze test eenduidig ​​en meet het onderzoek antwoorden op een bepaalde temperatuur worden de dieren worden tegengehouden tijdens de test, die koud flexibiliteit door welomschreven stress geïnduceerde analgetische mechanismen 7 kan veranderen.

Een andere veel gebruikte tool is de koude plaat test, die de gedragsmaatregelenresponsen van muizen na een Peltier-gekoelde plaat 8-10 geplaatst. Hoewel deze tool geeft informatie over het dier de reacties bij een bepaalde temperatuur, het is ook niet consequent toegepast; verschillende groepen verschillende reacties waaronder het aantal sprongen 8,11, de latentie eerste reactie 8,11- 13 gemeten en het aantal poot liften 11,13,14 met zeer verschillende resultaten. De koude plaat test is ook relatief lage omzet als alleen een dier kunnen worden getest in een tijd, en het een dure en kwetsbare peltier-apparaat vereist.

De 2-plaat temperatuur voorkeur test is een veelgebruikte afgeleide van de koude plaat test die de relatieve hoeveelheid tijd dat de dieren doorbrengen op 2 verbonden platen van verschillende temperaturen 9,15- 17 meet. Een ander soortgelijk gebruikte assay is de temperatuurgradiënt assay, waarbij de hoeveelheid tijd die muizen brengen in verschillende temperatuurzonestussen 5 ° C en 45 ° C op een lange metalen plaat gemeten 16. Hoewel deze testen laten vergelijking van temperaturen, is het onduidelijk of het gedrag vertegenwoordigt temperatuur afkeer of om de temperatuur voorkeur.

Ten slotte heeft de dynamische koud bord test is gebruikt om te meten hoe muizen reageren op veranderende omgevingstemperatuur 18. Deze werkwijze omvat het plaatsen van muizen op een RT Peltier apparaat en ramping minimumtemperatuur 1 ° C terwijl meten hoeveel de muizen springen of likken hun poten bij verschillende temperaturen plaat. Hoewel deze proef waar muizen aanpassen aan een koelomgeving, verschaft het niet een manier om te testen hoe muizen reageren op een koude stimulus in de setting van een koeler omgevingstemperatuur. Bovendien vereist dure apparatuur te voeren en biedt geen manier aan muizen tot de testapparatuur acclimatiseren voordat meten de koude gevoeligheid.

Als aanvulling op deze testen, de CPA test de acclimated responsies op een welbepaalde koude stimulus op verschillende temperatuurbereiken, of tijdens het proces van aanpassing aan koude omgevingstemperaturen. Het kan testen 14 muizen tegelijk met de huidige inrichting, met de potentie om goedkoop worden opgeschaald voor high-throughput testing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle muis protocollen waren in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen en werden goedgekeurd door de Animal Studies Committee van de Washington University School of Medicine (St. Louis, MO).

1. Voorbereiding van de testplaat en behuizingen

  1. Reinig het glasoppervlak.
  2. Zet het T-type filament thermokoppel aan de oppervlakte in het midden van de glasplaat met laboratorium tape.
  3. Plaats de dierenverblijven op de glasplaat in één lijn langs het midden van de plaat.
  4. Rijg de thermokoppelsonde door het centrum dierenverblijf en steek de stekker in de datalogger. Draai de datalogger op terwijl deactiveren van de functie voor automatisch uitschakelen, en bevestig de datalogger aan op de computer met de meegeleverde kabel.
    1. Als het opnemen van de plaat temperatuur tijdens het experiment, opent u de data logger software om de opname van de plaat temperaturen beginnen.
    2. Pas indien nodig de software opnieuw tekoord de plaat temperatuur één keer per seconde.
    3. Beginnen met het opnemen van de temperatuur met behulp van de software geleverd met de thermische datalogger.
  5. Scheid de behuizing met zwarte inzetstukken aan visuele interactie tussen muizen te voorkomen.
  6. Plaats spiegels onder het glas, zodat de onderkant van de behuizingen zichtbaar vanuit een comfortabele zitpositie.

2. Warming / Koeling van de Plaat van het Glas

  1. Vul aluminium dozen met verwarmd water, nat ijs of droog ijs en plaats ze adequaat op de glasplaat (aluminiumfolie pakketten gevuld met droogijs kan ook worden gebruikt om het glas te koelen Figuur 1) 2.
    1. Voor het testen bij 30 ° C, de positie van de aluminium dozen ongeveer 0,25 '' weg van de dierenverblijven (Figuur 2B) 2.
      1. Stel een verwarmde circulatiepomp aan weerszijden van de glasplaat. Stel de circulatiepomp om 45 - 60 ° C en onse aan de aluminium dozen vullen met een gestage stroom van warm water (figuur 1C) 2.
      2. Plaats de circulatiepompen zodat het hete water uit de aluminium kisten afvoert direct terug in het reservoir van de circulatiepomp aan elke kant (figuur 1C) 2.
    2. Voor het testen bij RT, laat u de vakken leeg (figuur 2) 2.
    3. Voor het testen bij 17 ° C, de positie van de boxen ongeveer 0,25 '' weg van de dierenverblijven aan beide zijden en vullen met nat ijs (Figuur 2) 2.
    4. Voor het testen bij 12 ° C, de positie van de boxen ongeveer 1.25 '' weg van de behuizingen aan beide zijden en vullen met droog ijs (Figuur 2) 2.
    5. Voor het testen bij 5 ° C, plaats de boxen ongeveer 0,25 '' weg van de behuizingen aan beide zijden en vullen met droog ijs (Figuur 2) 2.
      1. Bij koeling het glas met droog ijs, zorg ervoor dat er voldoende ventilatie om de CO 2 opbouw in de ruimte te voorkomen.
  2. Wacht tot het glas naar de gewenste temperatuurbereik bereikt.
  3. Voeg de muizen om de behuizingen op de plaat.
    OPMERKING: Een witte ruis generator kan worden gebruikt om geluidsoverlast te verminderen.
  4. Wacht tot de muizen om te acclimatiseren.
    LET OP: In onze faciliteit neemt dit ongeveer 2,5 uur, maar dit kan sterk variëren op basis van dierlijke huisvesting en behandeling voorwaarden.
  5. Handhaaf het glas bij het gewenste temperatuurbereik te zorgen dat de dozen met verwarmd water, nat ijs of droog ijs worden bewaard.
    OPMERKING: Met onze apparaten moeten de vakken worden bijgevuld met ijs ongeveer elke 90 min.
    OPMERKING: Voor de 17 ° C staat, is het nuttig om het grootste deel van het water uit de aluminium kisten door de afvoer gaten te legen voordat het navullen met ijs. Dit zal de temperatuur beter, en pr te stabiliserengebeurtenis overflow
    OPMERKING: De exacte hoeveelheid van het droogijs wordt seizoensinvloeden variëren, maar over het algemeen houden de vakken meer dan ¼ volledig over de gehele lengte van het vat zal de temperatuur constant te houden.

3. Testen van de Muizen op een vaste temperatuur

  1. Buiten de gedrags kamer, vult een ijsemmer ongeveer de helft vol met droogijs.
  2. Met behulp van een hamer of een hamer, verpletteren de droogijs tot een fijn poeder.
    OPMERKING: Bij een te volle bak zal het moeilijk maken om volledig te verpletteren het droogijs tot poeder.
  3. Met behulp van een straight scheermesje of een schaar, knip de bovenkant van een spuit van 3 ml.
  4. Met behulp van een 21 G naald, poke 3 gaten aan tegenoverliggende zijden van de spuit (totaal 6 holes).
    LET OP: Deze gaten zal de druk wordt gegenereerd door sublimatie verminderen, terwijl het comprimeren van het droogijs. De cut-off spuit kan worden hergebruikt voor meerdere experimenten.
  5. Neem de spuit, droog ijs poeder, en een hand-held stopwatch in de gedrags-kamer.
  6. Vul de spuit kamer half vol droge poeder ijs. Houd het afgesneden uiteinde van de spuit tegen een plat voorwerp, en aandrukken van de poeder met de plunjer. Wees voorzichtig; de plastic plunjer verbuigen of breken van de druk. Als dit gebeurt, vervang dan de zuiger van een nieuwe spuit.
  7. Verleng de punt van het gecomprimeerde droog ijs pellet langs de rand van de injectiespuit.
  8. Test muizen die volledig in rust zijn.
    1. Bij 30 ° C, 23 ° C en 17 ° C, proefmuizen alle 4 poten op het glas en niet beweegt, maar niet volledig slaap 19.
    2. Bij 12 ° C en 5 ° C, testen muizen die op 2 poten of 4 poten en stil of springen.
  9. Met behulp van de spiegels voor targeting, voorzichtig maar stevig op de vlakke pellet vlak tegen het glazen oppervlak onder de muis achterpoot (Figuur 1A) 2. Start de kant-timer.
  10. Stop de timer en verwijder de pellet wanneer de muis beweegt weg van de gekoelde glazen.
    OPMERKING: De terugtrekking beweging kan verticaal of horizontaal zijn.
    1. Als de muis heel kort beweegt de poot en dan stuurt het terug naar het koeloppervlak, blijven de timing en het stimuleren totdat de muis maakt een permanente beweging weg.
      OPMERKING: Ons laboratorium gebruikt maximaal stimulus van 20 seconden voor muizen in de meeste gevallen.
  11. Herhaal deze testprocedure tot ten minste 3 waarden op elke poot van elk dier worden verzameld. Afzonderlijke proeven testen tegenover poten op dezelfde muis met tenminste 7 min en afzonderlijke opeenvolgende proeven met een enkele poot met ten minste 15 min.
  12. Gebruik indien nodig verschillende diktes van glas verschillende tarieven van koeling (figuur 3) 1 genereren.
    OPMERKING: De koelsnelheid is omgekeerd gecorreleerd met de dikte van het glas.

4. Het testen van de Muizen Tijdens Koude Adaptation

LET OP: Dit is een alternatieve protocol dat het testen toestaat als het glas plate koelt, plaats nadat de plaat is gestabiliseerd en de muizen volledig aan de koude omgeving.

  1. Volg de in deel 1 voor het opzetten van het apparaat vermelde instructies.
  2. Volg de in rubriek 3 van de uitgangswaarde van metingen bij kamertemperatuur (Figuur 7A) 2 instructies.
  3. Pre-koelen aluminium dozen met droogijs.
  4. Zodra basislijn terugtrekking latencies zijn gemeten, plaatst u de voorgekoeld dozen op de plaat ongeveer 1.25 '' weg van de behuizingen aan weerszijden (Figuur 7A, pijl met het label "Dry ice toegevoegd") 2.
  5. Volg de in hoofdstuk 3 genoemde om metingen te nemen als de glazen plaat koelt, het nemen van metingen zo vaak mogelijk instructies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De gedragsreacties ontlokt muizen beginnend bij 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C en 12 ° C zijn zeer reproduceerbaar (figuur 4A) 20. Om de koude stimulus onder de achterpoot wordt gegenereerd meten, werden muizen geanesthetiseerd met ketamine / xylazine / acepromazine cocktail en de poten zijn bevestigd aan het glas op een T-type thermokoppel filament (figuur 4B) 20. Het glas werd gekoeld of verwarmd tot de gewenste testbereik. Hoewel de plaat gelijkmatig gekoeld langs de lengte van de plaat (figuur 5A) 2, moet worden opgemerkt dat een koude gradiënt gegenereerd over het gedrag behuizingen (Figuur 5B) 2. De delen van de behuizing die dichter bij het ​​droogijs aan weerszijden van de behuizingen zijn koeler, terwijl de centrale delen iets warmer (Figuur 5B) 2. In de koudste temperaturen used, de muizen spenderen het grootste deel van hun tijd in de centrale delen van de behuizing. Zodra de glasplaat temperatuur gestabiliseerd was, werd een brandpunt droog ijs stimulus op het glas onder de poot / thermode geplaatst. Op basis van de temperatuur sporen opgenomen van deze opstelling is het duidelijk dat de koude stimuli gegenereerd met de CPA zijn zeer reproduceerbaar bij elk temperatuurbereik (figuur 4C) 20.

De koude stimulus opgewekt in de CPA werd ook gemeten met drie verschillende dikten van glas om de intensiteit van de koeling (figuur 3) variëren. De koelsnelheid is omgekeerd evenredig met de dikte van het glas, en geven deze dikten kunnen worden gebruikt om koude gevoeligheid meten als nodig (figuur 3).

Eerder werk heeft aangetoond dat het CPA analgesie en overgevoeligheid bij muizen kan detecteren. 30 minuten na subcutane injectie van 1,5 mg / kg morfine, muizen significant ik hebonger latency intrekking dan muizen die subcutane injecties van een zoutoplossing (Figuur 6A: 2-way ANOVA belangrijkste effect * p <0,05 met Bonferroni post-hoc-test; 30 min ** p <0,01; n = 12 per groep) 1. 60 min na morfine / zout, is er geen verschil tussen de saline- en morfine geïnjecteerde groepen, die overeenkomt met de snelheid van morfine metabolisme in muizen.

Compleet Freund's adjuvans (CFA) is eerder aangetoond dat ontsteking en overgevoeligheid na injectie achterpoot 21. Na CFA injecties, de CPA terugtrekking latency verlagen 2 en 3 uur na de injectie (Figuur 6B: 2-way ANOVA belangrijkste effect p <0,001 met Bonferroni post-hoc-test; 2 uur * p <0,05, 3 uur ** p <0,01 n = 12 per groep). 4 uur na CFA injectie werden de muizen die subcutane injectie van 1,5 mg / kg morfine. 30 min na morfine injectie, zowel CFA- en zoutoplossing ingespoten muizen was toegenomen withdrawal latencies ten opzichte van hun latency op 3 uur (Figuur 6B: 1-way ANOVA met Dunnett post-hoc-test; CFA 3 uur versus CFA 4,5 hr $$$ p <0,001, zoutoplossing 3 uur versus zoutoplossing 4,5 uur $$$ p <0,001). Een uur later, nadat de morfine werd gemetaboliseerd, de CFA-geïnjecteerde muizen hadden wederom lagere latentie dan de saline geïnjecteerde controlemuizen (Figuur 6B: 2-weg ANOVA met Bonferroni post-hoc-test; ** p <0,01) 1.

De meeste zoogdieren hebben de mogelijkheid om hun temperatuurgevoeligheid aanpassing aan de omgeving passen. In vitro studies hebben gesuggereerd dat dit aanpassingsproces is afhankelijk PIP2 hydrolyse 22- 24, maar eerdere gedragsinstrumenten konden deze hypothese in vivo valideren. De CPA kan kwantificeren aanpassing op twee verschillende manieren. Door het testen van de terugtrekking latency van muizen als het glas afkoelt ( 2. Onder normale omstandigheden is de terugtrekking latency is ongewijzigd als de plaat koelt, wat suggereert dat koude aanpassing gebeurt sneller dan kunnen worden gekwantificeerd met de CPA (Figuur 7B: 0 min = 12,13 ± 0,8 sec, 30 min = 12,1 ± 1,6 sec, 60 min = 13,2 ± 1,1 sec, 90 min = 10,8 ± 1,2 sec 1-way ANOVA met Bonferroni post hoc-test p> 0.05, n = 6) 2. Echter, wanneer de muizen worden gegeven intraplantaire injecties van de fosfolipase-C-remmer U73122 25 voordat de plaat wordt afgekoeld (figuur 7C) hun terugtrekking latenties worden verminderd, wat suggereert dat de aanpassing wordt aangetast (Figuur 7D: basislijn = 11,29 ± 0,53 sec, 30 min = 8.09 ± 1.17 sec, 1-way ANOVA met Dunnett's post-hoc test hoofdeffect p = 0.02, individuele basislijn versus 30 min p = 0,02, n = 9).

De CPA kan ook het meten van de abverwerking tot aanpassing aan koude temperaturen gedurende langere tijdsperioden. Wanneer wildtype muizen getest met CPA na geacclimatiseerd gedurende 3 uur bij 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C of 12 ° C de terugtrekkingslatentie gelijk helemaal starttemperatuur, suggereert dat het wildtype muizen aangepast aan de koudere omgevingstemperatuur (Figuur 2A: WT 30 ° C = 13,23 ± 0,5 sec, 23 ° C = 12,8 ± 0,7 sec, 17 ° C = 12,3 ± 0,9 sec, 12 ° C = 12,8 ± 0,5 sec, 1- ANOVA met Bonferroni post-hoc test, p> 0.05 n = 6 30 ° C, n = 15 tot 23 ° C, 17 ° C en 12 ° C) 20. In tegenstelling tot de wild-type muizen, als uitgangspunt temperatuur daalt de terugtrekking latencies van TRPM8-KO muizen afnemen, wat erop wijst dat zij niet in staat zijn om hun reactie drempel aan te passen aan hun omgeving passen (Figuur 8: 1-weg herhaalde metingen ANOVA met Bonferroni post- hoc-test; mannetjes belangrijkste effect p = 1,5 x 10-5, 12 ° C vs. 23 ° C p = 6 x 10 -5, 17 ° C versus 23 ° C p = 0,004; vrouwtjes hoofdeffect p = 3,6 x 10 -5, 12 ° C versus 23 ° C p = 9,25 x 10 -5, 17 ° C versus 23 ° C p = 0,0005; df = 1, n = 11 mannen en 11 vrouwen) 20.

Figuur 1
Figuur 1. De Koude plantaris Assay (CPA) inrichting 2. (A) Schematische voor het uitvoeren van de CPA. Muizen worden geacclimatiseerd op een glasplaat plastic gedragsmatige behuizingen tot ze rusten. Een droog ijs pellet wordt aangebracht op de onderzijde van het glas onder de achterpoot en de latentie om uit de koeling glas gemeten. (B) Afbeelding van de CPA inrichting in de configuratie afkoelen van de plaat tot 5 ° C. De thermische data logger is in het midden van de behuizingenEn de aluminium dozen flankeren de behuizing aan beide zijden. (C) Afbeelding van de CPA inrichting in de configuratie voor verwarming van de plaat tot 30 ° C. De watercirculatie stroomt heet water in de aluminium behuizing, die stroomt uit de afvoer aan de zijkant terug in het reservoir van de circulator. Met toestemming gebruikt van Brenner et al. 2014 2. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. De temperatuur van de glasplaat tijdens de CPA. 2 (A) gemiddeld temperatuur traces van de glasplaat tijdens gedragsexperimenten in de CPA. 30 ° C n = 1, 23 ° C N = 5, 17 ° C N = 7, 12 ° C N = 7, 4 ° C n = 5 (B) Schematische diagrammen demonstrating hoe de verschillende temperaturen in de CPA te genereren. Met toestemming gebruikt van Brenner et al. 2014 2. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. De dikte van het glas is omgekeerd gecorreleerd met de mate van afkoeling 1. (A) Schematische diagrammen de proefopzet (BD). De temperatuur tijdens koude plantaire stimulus onder de poot werd gemeten op drie glazen dikten onder normale omstandigheden, en die Styrofoam afstandhouders stutten de poot van het glasoppervlak. In alle gevallen stutten de poot van het glas veroorzaakte een dramatische daling van de koude stimulus gemeten op de poot (n = 6 per glasdikte). ( et al. 2012 1 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. CPA latentie stroken 20. (A) Gemiddeld terugtrekkingslatentie muizen vanaf 23 ° C, 17 ° C of 12 ° C. (B) Configuratie voor het meten CPA koude stimulus. De poot van een verdoofde muis is bevestigd op de glazen plaat met laboratorium tape op de topvan een T-type thermokoppel filament. De CPA stimulus wordt op de onderzijde van het glas onder zowel poot en thermokoppel. (C) temperaturen die in de CPA vanaf 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C of 12 ° C. De zwarte pijlen geven de gemiddelde terugtrekking latency voor wakker muizen in elke conditie. Met toestemming gebruikt van Brenner et al. 2014 2. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. Glasplaat temperaturen zijn consistent in de CPA. 2 (A) Thermokoppel t1 (zwart) werd geplaatst in het midden van de plaat. Thermokoppel t2 (rood) is in de gedrags behuizing dichtst geplaatst naar de rechterkant van de plaat. De temperatuur tracings en de grafiek aan de rechterkant (t1-t2) vertonen bijna identieke temperaturen t1 en t2 in de loop van het experiment. (B) Thermokoppel t1 (zwart) werd geplaatst in het midden van de plaat. Thermokoppel t2 (rood) werd geplaatst in het centrale gedrags behuizing aan de wand dichter bij de droog-ijs gevulde aluminium dozen. De temperatuur traces en de grafiek aan de rechterkant (t1-t2) blijkt dat er een ongeveer 3 ° C verschil tussen t1 en t2 wanneer de plaat een stabiele temperatuur heeft bereikt. Met toestemming gebruikt van Brenner et al. 2014 2. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6. De CPA kan analgesie en overgevoeligheid 1 te meten. (A) Subcutaneous injectie van 1,5 mg / kg morfine verhoogt de terugtrekkingslatentie muizen 30 min na injectie (2-weg ANOVA met Bonferroni post-hoc-test; 30 min na injectie ** p <0,01). 60 min na injectie, er geen significant verschil tussen morfine ingespoten met zoutoplossing geïnjecteerde muizen. (B) intraplantaire injectie van 10 ul compleet Freund's adjuvans (CFA) vermindert de terugtrekkingslatentie muizen 2 en 3 uur na injectie (2-weg ANOVA met Bonferroni post-hoc-test, * p <0,05, ** p <0,01). Alle muizen kregen subcutane injecties van morfine bij 4 uur en alle terugtrekking latenties op 4,5 uur waren significant hoger in vergelijking met 3 uur (1-way ANOVA met post hoc-test van Dunnet; $$$ p <0,001). 5.5 uur na injectie van CFA (1,5 uur na morfine injectie), CFA-geïnjecteerde muizen hadden nog steeds lager latentie dan zoutoplossing geïnjecteerde muizen (2-weg ANOVA met Bonferroni post-hoc-test; ** p <0,01). Hergebruikt met toestemming vanBrenner et al. 2012 1. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7
Figuur 7. Meten koude aanpassing als de glasplaat dynamisch koelt 20. (A) Schematische voor het uitvoeren van de CPA als de glasplaat wordt de koeling. Baseline temperaturen worden gemeten bij kamertemperatuur, het droogijs containers worden toegevoegd aan de plaat, en de intrekking latentie wordt gemeten als de glasplaat afkoelt. (B) Wild-type muizen hebben dezelfde terugtrekkingslatentie de glasplaat koelt suggereert dat ze passen bij koeltemperaturen sneller kunnen worden gemeten met de CPA (Baseline = 12,8 ± 0,3 sec, 30 min = 13,67 ± 0,9 sec, 60 min = 11,03 ± 1,0 sec, 90 min = 11,31 ± 0,6 sec, n = 3 muizen; 1-way ANOVA met Bonferroni post-hoc test geen significante verschillen tussen een groep). (C) Schematische voor het uitvoeren van de CPA als de glasplaat wordt koeling, na intraplantaire injecties van de PLC-remmer U73122 of de controle verbinding U73343. (D) muizen significant lagere latentie terwijl de plaat afkoelt na injectie U73122, U73122 suggereert dat interfereert met het vermogen tot aanpassing aan koeling omgevingstemperaturen. Met toestemming gebruikt van Brenner et al. 2014 20. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van de Internationale Vereniging voor de Studie van Pain (IASP). Het cijfer kan niet worden gereproduceerd voor andere doeleinden zonder toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

"Figuur Figuur 8. TRPM8-KO muizen zich niet aanpassen aan het milieu koeling 20 TRPM8-KO muizen hebben een hogere terugtrekking latency dan wild-type nestgenoten te allen beginnend temperaturen gemeten (2-way ANOVA met Bonferroni post-hoc-test;. *** P < 0.001). De trillatentie van TRPM8-KO muizen vermindert ook de begintemperatuur afneemt (1-way ANOVA met Bonferroni post-hoc-test; ## p <0,01, ### p <0,001), terwijl er geen significante verandering in de intrekking latentie van wildtype nestgenoten als de starttemperatuur daalt. Met toestemming gebruikt van Brenner et al. 2014 20. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van de Internationale Vereniging voor de Studie van Pain (IASP). Het cijfer kan niet worden gereproduceerd voor andere doeleinden zonder toestemming. Gelieve click hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T-type thermocouple probe Physitemp IT-24p Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger Extech EA15 Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml Syringe BD 309657 The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer If using Extech logger, any Pcwill work
Aluminum boxes Washington University in St. Louis machine shop boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator VWR Any water circulator model with a pump will work
21 G needle BD 305165 The exact needle size is not important
Hand timer Any hand timer will work
Mirror Any flat mirror will work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, D. S., Golden, J. P., Gereau, R. W. A Novel Behavioral Assay for Measuring Cold Sensation in Mice. Plos ONE. 7, (6), 8 (2012).
  2. Brenner, D. S., Vogt, S. K., Gereau, R. W. A technique to measure cold adaptation in freely behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. (2014).
  3. Choi, Y., Yoon, T. W., Na, H. S., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral signs of ongoing pain and cold allodynia in a rat model of neuropathic pain. Pain. 59, (3), 369-376 (1994).
  4. Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neuroscience letters. 458, (2), 93-95 (2009).
  5. Carlton, S. M., Lekan, H. A., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral manifestations of an experimental model for peripheral neuropathy produced by spinal nerve ligation in the primate. Pain. 56, (2), 155-166 (1994).
  6. Pizziketti, R. J., Pressman, N. S., Geller, E. B., Cowan, A., Adler, M. W. Rat cold water tail-flick: A novel analgesic test that distinguishes opioid agonists from mixed agonist-antagonists. European Journal of Pharmacology. 119, (1-2), 23-29 (1985).
  7. Pinto-Ribeiro, F., Almeida, A., Pego, J. M., Cerqueira, J., Sousa, N. Chronic unpredictable stress inhibits nociception in male rats. Neuroscience letters. 359, (1-2), 73-76 (2004).
  8. Karashima, Y., et al. TRPA1 acts as a cold sensor in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (4), 1273-1278 (2009).
  9. Knowlton, W. M., Bifolck-Fisher, A., Bautista, D. M., McKemy, D. D. TRPM8, but not TRPA1, is required for neural and behavioral responses to acute noxious cold temperatures and cold-mimetics in vivo. Pain. 150, (2), 340-350 (2010).
  10. Allchorne, A. J., Broom, D. C., Woolf, C. J. Detection of cold pain, cold allodynia and cold hyperalgesia in freely behaving rats. Molecular pain. 1, 36 (2005).
  11. Colburn, R. W., et al. Attenuated cold sensitivity in TRPM8 null mice. Neuron. 54, (3), 379-386 (2007).
  12. Dhaka, A., Murray, A. N., Mathur, J., Earley, T. J., Petrus, M. J., Patapoutian, A. TRPM8 is required for cold sensation in mice. Neuron. 54, (3), 371-378 (2007).
  13. Bautista, D. M., et al. The menthol receptor TRPM8 is the principal detector of environmental cold. Nature. 448, (7150), 204-208 (2007).
  14. Obata, K., et al. TrpA1 induced in sensory neurons contributes to cold hyperalgesia after inflammation and nerve injury. The Journal of Clinical Investigation. 115, (9), 2393-2401 (2005).
  15. Tang, Z., et al. Pirt functions as an endogenous regulator of TRPM8. Nature communications. 4, 2179 (2013).
  16. Lee, H., Iida, T., Mizuno, A., Suzuki, M., Caterina, M. J. Altered thermal selection behavior in mice lacking transient receptor potential vanilloid 4. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25, (5), 1304-1310 (2005).
  17. Pogorzala, L. A., Mishra, S. K., Hoon, M. A. The cellular code for Mammalian thermosensation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 33, (13), 5533-5541 (2013).
  18. Yalcin, I., Charlet, A., Freund-Mercier, M. -J., Barrot, M., Poisbeau, P. Differentiating thermal allodynia and hyperalgesia using dynamic hot and cold plate in rodents. The journal of pain official journal of the American Pain Society. 10, (7), 767-773 (2009).
  19. Callahan, B. L., Gil, A. S., Levesque, A., Mogil, J. S. Modulation of mechanical and thermal nociceptive sensitivity in the laboratory mouse by behavioral state. The journal of pain: official journal of the American Pain Society. 9, (2), 174-184 (2008).
  20. Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Dhaka, A., Story, G. M., Gereau, R. W. A dynamic set point for thermal adaptation requires phospholipase C-mediated regulation of TRPM8 in vivo. Pain. (2014).
  21. Patwardhan, A. M., Scotland, P. E., Akopian, A. N., Hargreaves, K. M. Activation of TRPV1 in the spinal cord by oxidized linoleic acid metabolites contributes to inflammatory hyperalgesia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (44), 18820-18824 (2009).
  22. Fujita, F., Uchida, K., Takaishi, M., Sokabe, T., Tominaga, M. Ambient Temperature Affects the Temperature Threshold for TRPM8 Activation through Interaction of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate. Journal of Neuroscience. 33, (14), 6154-6159 (2013).
  23. Rohacs, T., Lopes, C. M., Michailidis, I., Logothetis, D. E. PI(4,5)P2 regulates the activation and desensitization of TRPM8 channels through the TRP domain. Nature neuroscience. 8, (5), 626-634 (2005).
  24. Daniels, R. L., Takashima, Y., McKemy, D. D. Activity of the neuronal cold sensor TRPM8 is regulated by phospholipase C via the phospholipid phosphoinositol 4,5-bisphosphate. The Journal of biological chemistry. 284, (3), 1570-1582 (2009).
  25. Zhang, H., et al. Neurokinin-1 receptor enhances TRPV1 activity in primary sensory neurons via PKCepsilon: a novel pathway for heat hyperalgesia. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27, (44), 12067-12077 (2007).
  26. Wang, H., Zylka, M. J. Mrgprd-expressing polymodal nociceptive neurons innervate most known classes of substantia gelatinosa neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29, (42), 13202-13209 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics