Eine einfache und kostengünstige Methode zur Bestimmung der Überempfindlichkeit auf Kälte und Anpassung an der Maus

Neuroscience

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Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Gereau IV, R. W. A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52640, doi:10.3791/52640 (2015).

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Abstract

Introduction

Mess kalten Reaktionsfähigkeit bei Nagern ist wichtig für ein besseres Verständnis der möglichen Mechanismen der kalten Empfindlichkeit beim Menschen unter normalen und pathologischen Bedingungen. Der Kalte Plantar Assay (CPA), ursprünglich entwickelt, einige Jahre vor 1, wurde entwickelt, um reproduzierbare und eindeutig murine Verhaltensreaktionen auf einen Kältereiz bei RT ausgeliefert zu generieren. Neuere Verbesserungen dieses Tests wurden auf einem großen Temperaturbereich 2 die reproduzierbare Messung der kalten Empfindlichkeit erlaubt. Beide Varianten sind auch entworfen, um mit relativ hohem Durchsatz und kostengünstig zu handhaben sein.

Ein Großteil der Fortschritte im Verständnis der Mechanismen der kalten Empfindlichkeit mit anderen Verhaltensmethoden vorgenommen. Eine Methode ist die Acetonverdampfungstest, der Tupfen beinhaltet oder Sprühen Aceton auf der Maus Pfote und Messung der Menge an Zeit, die der Maus verbringt schnippte die Pfote 3,4. Leiderdie Antworten auf die Acetonverdampfung werden durch den nassen Gefühl und den Geruch des Aceton verwechselt. Auch kann die Kältereiz, die in der Acetonverdampfungstest angewendet wird auf die Menge an Aceton aufgetragen variieren, und ist schwierig zu quantifizieren. Schließlich müssen unverletzten Mäusen minimal antwortet Aceton als Ausgangswert, so dass es unmöglich ist, Analgesie in Abwesenheit von Überempfindlichkeit bei dieser Methode zu messen.

Eine weitere klassische Test für Kälte Reaktionen ist die Tail-Flick-Test, in dem die Latenz zum Rücktritt wird gemessen, nachdem der Schwanz ist in kaltem Wasser 5,6 eingetaucht. Während die Verhaltensreaktionen in diesem Test eindeutig sind, und der Assay misst Antworten auf eine bestimmte Temperatur, müssen die Tiere während der Prüfung zurückgehalten werden, die kalte Reaktionsfähigkeit durch gut beschriebene spannungsinduzierte analgetische Mechanismen 7 verändern kann.

Ein weiteres häufig verwendetes Werkzeug ist die kalte Platte Test, der die VerhaltensmaßeReaktionen von Mäusen, nachdem sie auf einem Peltier-Kühlplatte 8-10 platziert werden. Während dieses Tool liefert Informationen über Tier Reaktionen bei bestimmten Temperaturen, wurde auch uneinheitlich verwendet; verschiedenen Gruppen haben verschiedene Arten von Reaktionen einschließlich Anzahl der Sprünge 8,11, die Latenz bis zum ersten Ansprechen 8,11- 13 gemessen wird, und die Anzahl der Pfote hebt 11,13,14 mit sehr unterschiedlichen Ergebnissen. Die Kaltplattentest ist auch relativ geringen Durchsatz, da nur ein Tier zu einem Zeitpunkt getestet werden, und es ist eine teure und zerbrechliche Peltier-Vorrichtung erfordert.

Das 2-Plattentemperatur Präferenztest ist eine häufig verwendete Derivat der Kaltplattentest, das die relative Zeitdauer, die Tiere ausgeben 2 verbundenen Platten mit unterschiedlichen Temperaturen 9,15- 17 misst. Ein weiteres ähnliches häufig verwendete Test ist der Wärmegradient Assay, in dem die Zeitdauer, die Mäuse zu verbringen in unterschiedlichen Temperaturzonenim Bereich zwischen 5 ° C und 45 ° C auf einer langen Metallplatte gemessen 16. Obwohl diese Assays erlauben den Vergleich von Temperaturen, ist es unklar, ob das Verhalten darstellt Temperatur Abneigung oder Temperatur bevorzugt.

Schließlich ist die dynamische Kaltplattenassay wurde verwendet, um zu messen, wie Mäusen, auf sich ändernde Umgebungstemperatur 18 reagieren. Diese Methode geht darum, Mäuse auf einem RT Peltier-Vorrichtung und Rampen es bis zu 1 ° C während der Messung, wie viel die Mäuse springen oder lecken ihre Pfoten auf verschiedenen Plattentemperaturen. Während dieses Tests, wie Mäusen Anpassung an eine Kühlumgebung, es keine Möglichkeit zu testen, wie Mäusen, die Kältereiz zu reagieren in der Einstellung eines kühleren Umgebungstemperatur. Zusätzlich erfordert es eine teure Ausrüstung durchzuführen und bietet keine Möglichkeit, Mäuse zu Prüfeinrichtungen vor der Messung ihrer kalten Empfindlichkeit akklimatisieren.

Um diese Tests zu ergänzen, überprüft der CPA die ACCLIMAted Antworten auf eine gut definierte Kältereiz bei einer Vielzahl von Temperaturbereichen, oder während des Prozesses der Anpassung an kalten Umgebungstemperaturen. Es kann bis zu 14 Mäuse in einer Zeit mit unseren aktuellen Gerät zu testen, mit dem Potenzial, für High-Throughput-Tests kostengünstig skaliert werden.

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Protocol

Alle Mausprotokolle wurden in Übereinstimmung mit National Institutes of Health Leitlinien und wurden von der Tierstudien Ausschuss der Washington University School of Medicine (St. Louis, MO) zugelassen.

1. Vorbereitung der Testplatte und Gehäuse

  1. Reinigen Sie die Glasoberfläche.
  2. Fixierung des T-Typ Faser Thermoelementsonde an der Oberfläche in der Mitte der Glasplatte mit Labor Band.
  3. Legen Sie die Tiergehege auf der Glasplatte in einer Linie entlang der Mitte der Platte.
  4. Schrauben Sie die Thermoelementsonde durch das Zentrum Tiergehege und stecken Sie in den Datenlogger. Drehen Sie den Datenlogger an, während Deaktivierung des Auto-Shutdown-Funktion, und befestigen Sie den Datenlogger an den Computer mit dem mitgelieferten Kabel.
    1. Wenn die Aufzeichnung der Plattentemperatur während des Experiments, öffnen Sie die Datenlogger-Software Aufnahme Plattentemperaturen zu beginnen.
    2. Falls erforderlich, stellen Sie die Software neuKabel die Plattentemperatur einmal pro Sekunde.
    3. Starten Sie die Aufnahme Temperaturen mit Hilfe der Software mit dem Thermodatenlogger verpackt.
  5. Trennen Sie das Gehäuse mit schwarzen Einsätzen, um visuelle Interaktion zwischen Mäusen verhindern.
  6. Position unterhalb des Glasspiegel, so dass die Unterseite der Gehäuse aus einer bequemen Sitzposition sichtbar ist.

2. Erwärmung / Abkühlung der Glasplatte

  1. Füllen Aluboxen mit erwärmtem Wasser, nassem Eis oder Trockeneis und positionieren Sie sie angemessen auf die Glasplatte (Aluminiumfolie Pakete mit Trockeneis gefüllt können auch, um das Glas zu kühlen verwendet werden; Abbildung 1) 2.
    1. Für die Prüfung bei 30 ° C, positionieren Sie die Aluboxen etwa 0,25 '' von den Tiergehegen (2B) 2.
      1. Legen Sie einen beheizten Wasser Zirkulator auf beiden Seiten der Glasplatte. Stellen Sie den Thermostat auf 45 - 60 ° C, und unsE ist die Alu-Boxen mit einem stetigen Strom von heißem Wasser (1C) 2 zu füllen.
      2. Positionieren Sie die Umwälzpumpen, dass das heiße Wasser aus den Aluboxen entwässert direkt zurück in das Reservoir des Thermostaten auf jeder Seite (Abbildung 1 C) 2.
    2. Für die Prüfung bei RT, lassen Sie die Felder leer (Abbildung 2) 2.
    3. Für die Prüfung bei 17 ° C, stellen Sie die Boxen etwa 0,25 '' von den Tiergehegen auf beiden Seiten füllen und mit nassem Eis (Abbildung 2) 2.
    4. Für die Prüfung bei 12 ° C, stellen Sie die Boxen etwa 1,25 '' von den Gehäusen zu beiden Seiten und füllen mit Trockeneis (Abbildung 2) 2.
    5. Für die Prüfung bei 5 ° C, stellen Sie die Boxen etwa 0,25 '' von den Gehäusen zu beiden Seiten und füllen mit Trockeneis (Abbildung 2) 2.
      1. Beim Abkühlen des Glases mit Trockeneis, stellen Sie sicher, für eine ausreichende Belüftung, um CO 2 Aufbau im Raum zu verhindern.
  2. Warten Sie, bis das Glas, um den gewünschten Temperaturbereich zu erreichen.
  3. Fügen Sie die Maus, um die Gehäuse auf der Platte.
    ANMERKUNG: Eine Rauschgenerator verwendet werden, um Lärmbelästigungen zu verringern.
  4. Warten Sie, bis die Mäuse zu akklimatisieren.
    HINWEIS: In unserer Einrichtung das dauert etwa 2,5 Stunden, aber das kann deutlich auf Basis von Tierhaltung und Umgangsbedingungen variieren.
  5. Halten Sie das Glas auf dem gewünschten Temperaturbereich, indem sichergestellt wird, dass die Boxen voll von erwärmtem Wasser, nassem Eis oder Trockeneis gehalten.
    HINWEIS: Mit unserem Gerät müssen die Kisten mit Eis etwa jede 90 Minuten wieder aufgefüllt werden.
    HINWEIS: Für die 17 ° C Bedingung, ist es hilfreich, das meiste Wasser aus den Aluminium-Boxen durch die Ablauflöcher vor dem Nachfüllen mit Eis zu leeren. Dadurch wird die Temperatur besser, und pr stabilisierenVeranstaltungsüberlauf
    HINWEIS: Die genaue Höhe der Trockeneis wird saisonal variieren, aber in der Regel halten die Boxen mehr als ¼ voll über die gesamte Länge der Box wird die Temperatur konstant zu halten.

3. Prüfung der Mäuse bei Fest Temperaturen

  1. Außerhalb des Verhaltensraum, füllen einen Eiskübel etwa zur Hälfte mit Trockeneis.
  2. Mit einem Hammer oder Gummihammer, quetschen Sie das Trockeneis zu einem feinen Pulver.
    HINWEIS: Durch Überladen des Eimer wird es schwierig, vollständig das Trockeneis zu Pulver zermalmen.
  3. Mit einem geraden Rasierklinge oder einer Schere, schneiden Sie die Spitze einer 3-ml-Spritze.
  4. Unter Verwendung einer 21 G Nadel, stoßen 3 Löcher auf gegenüberliegenden Seiten der Spritze (insgesamt 6 Löcher).
    HINWEIS: Diese Löcher werden den Druck durch Sublimation erzeugt verringern, während Zusammendrücken des Trockeneis. Der Cut-off-Spritze für mehrere Versuche wieder verwendet werden.
  5. Nehmen Sie die Spritze, Trockeneis-Pulver und ein Hand Stoppuhr in die Verhaltensraum.
  6. Füllen Sie die Spritze Kammer zur Hälfte mit Trockeneispulver. Halten Sie das Schnittende der Spritze vor einem flachen Gegenstand, und fest komprimieren das Pulver mit dem Kolben. Achtung; die Kunststoff-Kolben kann sich verbiegen oder brechen aus dem Druck. Wenn dies geschieht, ersetzen Sie den Kolben aus einer neuen Spritze.
  7. Verlängern Sie die Spitze des Druck Trockeneis-Pellets über den Rand der Spritze.
  8. Versuchsmäuse, die vollständig in Ruhe.
    1. Bei 30 ° C, 23 ° C und 17 ° C, Testmäuse, die alle 4 Pfoten auf dem Glas und nicht bewegen, aber nicht vollständig eingeschlafen 19.
    2. Bei 12 ° C und 5 ° C, Testmäuse, die auf 2 oder 4 Pfoten Pfoten und nicht bewegen oder springen werden.
  9. Mit den Spiegel für Targeting, vorsichtig, aber fest drücken Sie die Flach Pellet bündig an der Glasoberfläche unter dem Maushinterpfote (1A) 2. Starten Sie den Handauslöser.
  10. Stoppen Sie den Timer und nehmen Sie die Tablette, wenn die Maus bewegt sich weg von der gekühlten Glas.
    HINWEIS: Diese Rücklaufbewegung kann vertikal oder horizontal sein.
    1. Wenn die Maus bewegt sich nur kurz die Pfote und dann gibt es an der Kühlfläche, weiterhin Timing und anregend, bis die Maus macht eine dauerhafte Abkehr.
      Hinweis: Unser Labor verwendet eine maximale Anregung Zeit von 20 sec für Mäuse in der Mehrzahl der Fälle.
  11. Wiederholen Sie diesen Testverfahren bis mindestens 3 Werte auf jeder Pfote jedes Tieres gesammelt werden. Separate Studien testen gegen Pfoten auf der gleichen Maus um mindestens 7 min, und einen separaten aufeinanderfolgenden Studien auf eine einzelne Pfote um mindestens 15 min.
  12. Falls erforderlich, mit verschiedenen Dicken von Glas an verschiedene Abkühlungsgeschwindigkeiten (Figur 3) 1 zu erzeugen.
    HINWEIS: Die Kühlrate ist umgekehrt proportional mit der Dicke des Glases korreliert.

4. Prüfung der Mäuse während der kalten Anpassung

Hinweis: Dies ist ein alternatives Protokoll, das Testen als Glas plat erlaubtE abkühlt, anstatt einmal die Platte stabilisiert hat und die Mäuse wurden vollständig an die kalte Umgebung angepasst.

  1. Folgen Sie den in Abschnitt 1 Einrichten des Geräts aufgeführten Hinweise.
  2. Folgen Sie den in Kapitel 3 werden auf Baseline-Messungen bei Raumtemperatur (7A) 2 nehmen Anweisungen.
  3. Pre-Kühlung der Aluminiumboxen mit Trockeneis.
  4. Sobald Ausgangsrückzugslatenzen gemessen wurden, positionieren Sie die vorgekühlte Boxen auf der Platte etwa 1,25 '' von den Gehäusen zu beiden Seiten (7A, Pfeil mit der Aufschrift "Trockeneis hinzugefügt") 2.
  5. Befolgen Sie die in Abschnitt 3, Maß zu nehmen, wie die Glasplatte abkühlt, die Messungen so oft wie möglich Anweisungen.

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Representative Results

Die Verhaltens-Antworten von Mäusen ausgelöst beginnend bei 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C und 12 ° C sind in hohem Maße reproduzierbar (4A) 20. Um die Kältereiz unter der Hinterpfote erzeugt messen, wurden Mäuse mit einer Ketamin / Xylazin / Acepromazin anästhesiert Cocktail und die Pfoten wurden auf dem Glas auf einem T-Typ-Thermoelement Filament (4B) 20 befestigt. Das Glas gekühlt, erwärmt, um die gewünschte Testbereich wurde. Obwohl die Platte gleichmäßig entlang der Länge der Platte (5A) 2 abgekühlt ist anzumerken, dass ein Kalt Gradient über die Verhalten Gehäuse (5B) 2 erzeugt werden. Die Teile des Gehäuses, die näher an dem Trockeneis auf beiden Seiten der Gehäuse sind Kühler, während die zentralen Teile sind etwas wärmer (5B) 2. In den kältesten Temperaturen uSED, die Mäuse verbringen die meiste Zeit in den zentralen Teilen des Gehäuses. Nachdem die Glasplatte Temperatur stabilisiert hatte, wurde ein Schwerpunkt Trockeneis Reiz auf das Glas unter der Pfote / Thermode platziert. Basierend auf den Temperaturspuren aus dieser Konfiguration aufgezeichnet werden, ist es klar, dass die Kältereize generiert unter Verwendung des CPA sind hoch reproduzierbar jeden Temperaturbereich (4C) 20.

Der Kältereiz im CPA erzeugt wurde ebenfalls unter Verwendung von drei unterschiedlichen Glasdicken, die Intensität der Kühlung (Figur 3) unterschiedlich gemessen. Die Kühlrate ist umgekehrt proportional zur Dicke des Glases bezogen, und jedes dieser Dicken können verwendet werden, um kalte Empfindlichkeit zu messen, wie erforderlich (3) werden.

Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die CPA können Analgesie und Überempfindlichkeit bei Mäusen nachzuweisen. 30 min nach der subkutanen Injektion von 1,5 mg / kg Morphin, haben Mäuse signifikant longer Latenz zum Rücktritt als Mäuse, die subkutane Injektionen von Kochsalzlösung (6A: 2-Wege ANOVA Haupteffekt * p <0.05 mit Bonferroni post-hoc-Test, 30 min ** p <0,01; n = 12 pro Gruppe) ein. 60 min nach Morphin / Kochsalzlösung, gibt es keinen Unterschied zwischen der saline- und Morphin-injizierten Gruppen, die in Übereinstimmung mit der Rate der Morphin Stoffwechsel bei Mäusen ist.

Komplettes Freundsches Adjuvans (CFA) wurde bereits gezeigt, um Entzündung und Überempfindlichkeit nach Pfote Einspritzung 21 verursachen. Nach dem CFA-Injektionen, die CPA Rückzugslatenzen zu verringern 2 und 3 Stunden nach der Injektion (6B: 2-Wege ANOVA Haupteffekt p <0,001 mit Bonferroni post-hoc-Test; 2 h * p <0,05, 3 h ** p <0,01 n = 12 pro Gruppe). 4 h nach der CFA-Injektion wurden die Mäuse subkutane Injektionen von 1,5 mg / kg Morphium. 30 Minuten nach der Morphiumspritze, sowohl CFA und mit Kochsalzlösung injizierten Mäusen erhöht war withdrawal Latenzzeiten im Verhältnis zu ihrer Latenzzeiten bei 3 h (6B: 1-ANOVA mit Dunnett Post-hoc-Test, CFA 3 Stunden gegen CFA 4,5 h $$$ p <0,001, Kochsalzlösung 3 Stunden gegen Kochsalzlösung 4,5 Stunden $$$ p <0,001). Eine Stunde später, nachdem die Morphin metabolisiert worden war, mussten die CFA-injizierten Mäusen wieder unteren Rückzugslatenzen als die Kochsalzlösung injiziert Kontrollmäusen (6B: 2-Wege-ANOVA mit Bonferroni post-hoc-Test; ** p <0,01) 1.

Die meisten Säugetierarten haben die Fähigkeit, ihre Temperaturempfindlichkeit Anpassung an ihre Umgebung anzupassen. In vitro Studien haben darauf hingewiesen, dass dieser Anpassungsprozess ist abhängig von PIP 2 Hydrolyse 22- 24, aber vorherige Verhaltens Tools konnten diese Hypothese in vivo zu bestätigen. Die CPA in der Lage ist die Quantifizierung dieser Anpassung auf zwei verschiedene Arten. Durch Testen der Wegziehlatenz von Mäusen, da das Glas abkühlt ( 2. Unter normalen Bedingungen wird die Wegziehlatenz unverändert ist, wenn die Platte abkühlt, was darauf hindeutet, dass Kälteanpassung geschieht schneller als mit dem CPA (7B quantifizieren: 0 min = 12.13 ± 0.8 sec, 30 min = 12,1 ± 1,6 sec, 60 min = 13,2 ± 1,1 s, 90 min = 10,8 ± 1,2 sec 1-ANOVA mit Bonferroni post hoc Test p> 0,05, n = 6) 2. Allerdings, wenn die Mäuse intraplantare Injektionen des Phospholipase-C-Inhibitor U73122 25 vor dem Schild gekühlt wird (7C) ihre Rückzugslatenzen verringert werden, was darauf hindeutet, dass die Anpassung beeinträchtigt (7D: baseline = 11,29 ± 0,53 s, 30 min = 8,09 ± 1,17 sec; 1-ANOVA mit Dunnett Post-hoc-Test, Haupteffekt p = 0,02, einzelne Baseline vs. 30 min p = 0,02, n = 9).

Die CPA kann auch messen die ability auf kalte Umgebungstemperaturen über lange Zeiträume hinweg anzupassen. Wenn Wildtyp-Mäusen werden mit dem CPA, nachdem er 3 h bei 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C oder 12 ° C akklimatisiert getestet das Wegziehlatenz ist das gleiche auf allen Starttemperaturen, was darauf hindeutet, dass die Wildtyp- Mäuse angepasst an die kältere Umgebungstemperatur (2A: WT 30 ° C = 13,23 ± 0,5 sec, 23 ° C = 12,8 ± 0,7 sec, 17 ° C = 12,3 ± 0,9 sec, 12 ° C = 12,8 ± 0,5 sec, 1- ANOVA mit Bonferroni Post-Hoc-Test, p <0,05 n = 6 für 30 ° C, n = 15 für 23 ° C, 17 ° C und 12 ° C) 20. Im Gegensatz zu den Wildtyp-Mäusen, wie die Ausgangstemperatur verringert die Rückzugslatenzen von TRPM8-KO-Mäusen zu verringern, was darauf hindeutet, dass sie nicht in der Lage, ihre Ansprechschwelle Anpassung an ihre Umgebung angepasst sind (Abbildung 8: 1-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen mit Bonferroni Post- hoc-Test; Männchen Haupteffekt p = 1,5 x 10 &-5, 12 ° C vs. 23 ° C p = 6 x 10 -5, 17 ° C gegenüber 23 ° C p = 0,004; Frauen Haupteffekt p = 3,6 × 10 -5, 12 ° C gegenüber 23 ° C p = 9,25 × 10 -5, 17 ° C gegenüber 23 ° C p = 0,0005; df = 1, n = 11 männliche und 11 weibliche) 20.

Figur 1
Abbildung 1. Der Kalte Plantar Assay (CPA) Vorrichtung 2. (A) Schematische für die Durchführung der CPA. Die Mäuse werden auf einer Glasplatte in Kunststoff Verhaltens Gehäuse akklimatisiert, bis sie in Ruhe sind. Ein Trockeneis-Pellets ist mit der Unterseite des Glases unterhalb der Hinterpfote angewandt, und die Latenz, um aus dem Kühlglas zurückzuziehen gemessen. (B) Bild der CPA Vorrichtung in der Konfiguration der Platte wird auf 5 ° C abkühlen. Die thermische Datenlogger ist in der Mitte der GehäuseUnd die Aluminiumkästen flankieren das Gehäuse auf beiden Seiten. (C) Abbildung des CPA Vorrichtung in der Konfiguration der Platte zum Aufwärmen auf 30 ° C. Das Wasser Zirkulator heißes Wasser fließt in die Alu-Box, die dann fließt aus den Bach auf die Seite zurück in das Reservoir des Thermostaten. Mit freundlicher Genehmigung von Brenner et al. 2014 2 wiederverwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Die Temperatur der Glasplatte während des CPA 2. (A) Gemittelte Temperatur Kurven der Glasplatte während der Verhaltensexperimente in der CPA. 30 ° C mit n = 1, 23 ° C n = 5, 17 ° C n = 7, 12 ° C n = 7, 4 ° C n = 5. (B) Schematische Diagramme DEMonstrating wie die unterschiedlichen Temperaturverhältnisse in der CPA erzeugen. Mit freundlicher Genehmigung von Brenner et al. 2014 2 wiederverwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3. Die Glasstärke umgekehrt proportional mit der Geschwindigkeit der Kühl 1 korreliert. (A) Schemadiagramm des Versuchsaufbaus (BD). Die Temperatur während der kalten plantar Stimulus unter der Pfote wurde auf allen drei Glasstärken unter normalen Bedingungen gemessen und die Styropor-Abstandshalter stützen die Pfote weg von der Glasoberfläche. In allen Fällen stützte die Pfote von der Glas verursacht eine dramatische Abnahme der Kältereiz gemessen an der Pfote (n = 6 pro Glasdicke). ( et al. 2012 1 wiederverwendet Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

4
Abbildung 4. CPA Rückzugslatenzen konsistent. 20 (A) Durchschnittliche Wegziehlatenz für Mäuse ab 23 ° C, 17 ° C oder 12 ° C. (B) Konfiguration nach Maß CPA Kältereiz. Die Pfote eines betäubten Maus auf der Glasplatte mit Labor Band an der Spitze gesicherteines Filaments Thermoelement vom T-Typ. Die CPA Stimulus ist an der Unterseite des Glases unterhalb sowohl Pfote und Thermoelement plaziert. (C) Temperaturen in der CPA erzeugt ausgehend von 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C oder 12 ° C. Die schwarzen Pfeile repräsentieren die durchschnittliche Rückzugslatenzen für wach Mäuse in jeder Bedingung. Mit freundlicher Genehmigung von Brenner et al wiederverwendet. 2014 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Glasplattentemperaturen entsprechen im CPA. 2 (A) Thermo t1 (schwarz) wurde in der Mitte der Platte angeordnet. Thermoelement T2 (rot) wurde in der Verhaltens Gehäuse am nächsten zum rechten Rand der Platte angeordnet. Die Temperatur tracings und der Graph auf der rechten (t1-t2) zeigen nahezu identische Temperaturen t1 und t2 während der Dauer des Experiments. (B) Thermo t1 (schwarz) wurde in der Mitte der Platte angeordnet. Thermoelement T2 (rot) wurde in den zentralen Verhaltens Gehäuse eingeschlossen, an der Wand näher an den Trockeneis gefüllten Aluminium-Boxen. Die Temperatur-Kurven und der Graph auf der rechten (t1-t2) zeigen, dass es etwa 3 ° C Differenz zwischen t1 und t2, wenn die Platte eine stabile Temperatur erreicht hat. Mit freundlicher Genehmigung von Brenner et al wiederverwendet. 2014 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 6
Abbildung 6. Die CPA kann Analgesie und Überempfindlichkeit 1 zu messen. (A) Subcutaneous Injektion von 1,5 mg / kg Morphin erhöht die Wegziehlatenz von Mäusen 30 Minuten nach der Injektion (2-Wege-ANOVA mit Bonferroni post-hoc-Test, 30 Minuten nach der Injektion ** p <0,01). 60 min nach der Injektion, gibt es keinen signifikanten Unterschied zwischen Morphin-injiziert und mit Salzlösung injizierten Mäusen. (B) intraplantare Injektion von 10 ul komplettem Freund-Adjuvans (CFA) verringert die Wegziehlatenz von Mäusen 2 und 3 Stunden nach der Injektion (2-Wege-ANOVA mit Bonferroni Post-Hoc-Test; * p <0,05, ** p <0,01). Alle Mäuse wurden subkutane Injektionen von Morphin bei 4 Stunden gegeben, und im Vergleich zu 3 Stunden alle Rückzugslatenzen bei 4,5 h waren signifikant höher (1-ANOVA mit Dunnet post-hoc-Test; $$$ p <0,001). 5,5 Stunden nach der Injektion von CFA (1,5 h nach der Morphiuminjektion) hatte CFA-injizierten Mäusen noch niedrigeren Rückzugslatenzen als Kochsalzlösung injizierten Mäusen (2-Wege-ANOVA mit Bonferroni post-hoc-Test, ** p <0,01). Mit freundlicher Genehmigung von wiederverwendetBrenner et al. 2012 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

7
Abbildung 7. Messung Kälteanpassung, wie die Glasplatte dynamisch kühlt 20. (A) Schematische für die Durchführung der CPA als der Glasplatte ist die Kühlung. Grundlinientemperaturen werden bei RT gemessen, die Trockeneisbehälter werden zu der Platte gegeben, und die Wegziehlatenz wird gemessen als die Glasplatte abkühlt. (B) Wildtyp-Mäusen die gleiche Wegziehlatenz als die Glasplatte abkühlt, was darauf hindeutet, dass sie in den Kühltemperaturausgleich schneller als mit der CPA (Baseline gemessen werden = 12,8 ± 0,3 s, 30 min = 13,67 ± 0,9 sec, 60 min = 11,03 ± 1,0 sec, 90 min = 11,31 ± 0,6 s, n = 3 Mäusen; 1-ANOVA mit Bonferroni post-hoc-Test, keine signifikanten Unterschiede zwischen einer Gruppe). (C) Schematische zur Durchführung des CPA, wenn die Glasplatte abkühlt, nachdem intraplantar Injektionen des PLC-Inhibitors U73122 oder U73343 Kontrollverbindung. (D) Mäuse eine signifikant geringere Rückzugslatenzen, während die Platte nach U73122 Einspritzkühlung, was darauf hindeutet, dass U73122 stört die Fähigkeit, sich an Kühlraumtemperatur anpassen. Mit freundlicher Genehmigung von Brenner et al. 2014 20 wiederverwendet. Diese Figur wurde mit Genehmigung der Internationalen Gesellschaft zum Studium des Schmerzes (IASP) reproduziert worden. Der Betrag darf zu keinem anderen Zweck ohne Erlaubnis reproduziert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

"8" Abbildung 8. TRPM8-KO-Mäusen nicht auf Umweltkühl 20 anzupassen TRPM8-KO-Mäuse haben höhere Rückzugslatenzen als Wildtyp-Wurfgeschwistern auf allen Starttemperaturen gemessen (2-Wege-ANOVA mit Bonferroni post-hoc-Test;. *** P < 0,001). Die Wegziehlatenz des TRPM8-KO-Mäusen vermindert auch als die Ausgangstemperatur verringert (1-Weg-ANOVA mit Bonferroni Post-Hoc-Test; ## p <0,01, ### p <0,001), während es keine signifikante Änderung in der Entnahme Latenz von Wildtyp-Wurfgeschwistern als Ausgangstemperatur ab. Mit freundlicher Genehmigung von Brenner et al. 2014 20 wiederverwendet. Diese Figur wurde mit Genehmigung der Internationalen Gesellschaft zum Studium des Schmerzes (IASP) reproduziert worden. Der Betrag darf zu keinem anderen Zweck ohne Erlaubnis reproduziert werden. Bitte click Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
T-type thermocouple probe Physitemp IT-24p Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger Extech EA15 Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml Syringe BD 309657 The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer If using Extech logger, any Pcwill work
Aluminum boxes Washington University in St. Louis machine shop boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator VWR Any water circulator model with a pump will work
21 G needle BD 305165 The exact needle size is not important
Hand timer Any hand timer will work
Mirror Any flat mirror will work

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References

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