Fareler Soğuk Hassasiyeti ve Uyum belirlenmesi için Basit ve ucuz Yöntem

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Gereau IV, R. W. A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52640, doi:10.3791/52640 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Kemirgenlerde soğuk cevabın ölçülmesi normal ve patolojik koşullar altında, insanlarda soğuk duyarlılık potansiyel mekanizmaları anlaşılmasına yönelik olarak önemlidir. Soğuk Plantar Test (CPA), başlangıçta önce 1 birkaç yıl oda sıcaklığında teslim soğuk uyarana tekrar üretilebilir, açık sıçangil davranışsal tepkileri üretmek için tasarlanan geliştirmiştir. Bu deneyde, bir daha yeni geliştirmeler sıcaklıkta 2 geniş bir soğuk duyarlılık tekrarlanabilir ölçümünü mümkün kılmıştır. Her iki versiyon, nispeten yüksek verimli, ve kullanımı ucuz olması için tasarlanmıştır.

Ilerleme bir hayli diğer davranışsal yöntemler kullanılarak soğuk hassasiyeti mekanizmalarını anlamada yapılmıştır. Bir yöntem dabbing veya fare pençe üzerinde aseton püskürtme ve fare pençe 3,4 Flicking harcadığı süreyi ölçen içerir aseton buharlaşma testidir. Ne yazık ki,aseton buharlaşma tepkiler ıslak duyu ve aseton kokusu tarafından eleştirilmiştir edilir. Ayrıca, aseton buharlaştırma testte uygulanan soğuk uyarıcı uygulanmış aseton miktarına bağlı olarak ve ölçmek zordur değişebilir. Son olarak, zarar görmemiş farelerde, başlangıçta aseton minimum bir yanıt sahip imkansız bu yöntemle aşırı duyarlılık yokluğunda analjezi ölçmek için adrestir.

Soğuk yanıtlar için başka klasik tahlili Kuyruk soğuk su 5,6 batırılır sonra geri çekilmesi için gecikme ölçülür Kuyruk titremesi tahlili vardır. Bu deneyde davranışsal tepkileri kesin ve deney, belirli bir sıcaklığa yanıtları ölçen birlikte, hayvanlar iyi tarif edilen stres kaynaklı analjezik mekanizmaları 7 boyunca soğuk yanıt değiştirebilir ki, test sırasında tespit edilmelidir.

Başka yaygın kullanılan bir araçtır davranışsal ölçen soğuk plaka testi, birfarelerin tepkileri bir Peltier soğutulmuş plaka 8-10 yerleştirilirler. Bu araç, belirli sıcaklıklarda hayvan yanıtları hakkında bilgi sağlarken, aynı zamanda tutarsız kullanılmıştır; farklı gruplar atlar 8,11 sayısı, ilk tepki 8,11- 13 gecikme dahil yanıtların farklı ölçüldü ve pençe sayısı çok farklı sonuçlar 11,13,14 kaldırır. Soğuk plaka deneyi de bir seferde test edilebilir tek bir hayvan gibi nispeten düşük kapasiteli olduğunu ve pahalı ve kırılgan Peltier cihazı gerektirir.

2-plaka sıcaklığı tercih testi hayvanlar farklı sıcaklıklarda 9,15- 17 2 bağlantılı plakalar üzerinde harcama zaman göreceli miktarını ölçen soğuk plaka testi yaygın olarak kullanılan bir türevidir. Bir başka benzer yaygın olarak kullanılan tahlil termal gradyan tahlil, fareler, farklı sıcaklık bölgelerinde geçirmek zaman miktarıdıruzun bir metal plaka ile, 5 ° C ile 45 ° C arasında değişen 16 ölçülür. Bu deneyler sıcaklık karşılaştırılmasına olanak iken, davranış sıcaklığı kaçınma veya sıcaklık tercihine temsil belirsizdir.

Son olarak, dinamik soğuk plaka tahlil fareler ortam sıcaklıkları 18 değişen nasıl tepki ölçmek için kullanılır olmuştur. Bu yöntem, bir RT Peltier cihazda fareler yerleştirerek ve fareler atlamak veya farklı plaka sıcaklıklarda pençeleri yalamak ne kadar ölçüm yaparken 1 ° C aşağı rampa içerir. Bu fareler, bir soğutma ortamına uyum nasıl test ederken, bu fareler bir soğutucu ortam sıcaklığının ortamda soğuk bir uyarana cevap nasıl test etmek için bir yol sağlamaz. Ayrıca, bunu gerçekleştirmek için pahalı ekipman gerektirir ve soğuk hassasiyeti ölçmeden önce test ekipmanları fareler gelmesini için bir yol sağlamaz.

Bu analizleri tamamlamak için, EBM acclima testleriSıcaklık aralıkları çeşitli de iyi tanımlanmış bir soğuk uyarıcıya Ted tepkileri ya da soğuk ortam sıcaklıklarında adapte işlemi esnasında uygulanabilir. Bu ucuz yüksek verimli testi için ölçeklendirilebilir potansiyeline sahip, bizim şimdiki aparatı ile bir seferde 14 farelere kadar test edebilirsiniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm fare protokolleri Sağlık kurallar National Institutes uygun ve Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Çalışmaları Komitesi (St. Louis, MO) tarafından onaylanmıştır.

1. Test Plakası ve Kutuları hazırlanması

  1. Cam yüzeyini temizleyin.
  2. Laboratuvar bant ile cam tabak ortasında yüzeyine T-tipi lif termokupl probu sabitleyin.
  3. Plaka ortasında boyunca tek bir satır cam plaka üzerine hayvan muhafazaları yerleştirin.
  4. Merkez hayvan muhafaza ile termokupl probu Konu ve veri kaydedici takın. Otomatik kapanma özelliği devreden ise veri logger açın ve sağlanan kablo ile bilgisayara veri logger takın.
    1. Deney sırasında plaka sıcaklığı kayıt varsa, plaka sıcaklıkları kaydetmeye başlamak için veri kaydedici yazılımı açın.
    2. Gerekirse, yeniden yazılım ayarlayınkord plaka sıcaklığı kez her saniye.
    3. Termal data logger ile paketlenmiş yazılımı kullanarak sıcaklıkları kayıt başlayın.
  5. Fareler arasındaki görsel etkileşimi önlemek için siyah ekler ile muhafaza ayırın.
  6. Pozisyon muhafazaları alt rahat bir oturma konumundan görünür, öyle ki, cam altında yansıtır.

2. Isıtma / Cam Tabak Soğutma

  1. Isıtılmış su, ıslak buz ya da kuru buz alüminyum kutular doldurun ve cam plaka üzerine uygun bir şekilde konumlandırmak (kuru buz dolu alüminyum folyo paketler aynı zamanda cam soğutmak için de kullanılabilir; Şekil 1) 2.
    1. 30 ° C'de test için, uzak hayvan muhafazaları (Şekil 2B) 2 'yaklaşık 0.25 alüminyum kutuları yerleştirin.
      1. Cam levhasının her iki tarafında bir ısıtılmış su sirkülatör ayarlayın. 45 sirkülatörü ayarlayın - 60 ° C, ve bizeSıcak su (Şekil 1C) 2 sabit bir akım ile alüminyum kutuları doldurmak için e.
      2. Sirkülatör yerleştirin alüminyum kutuları sıcak su doğrudan geri her iki tarafında (Şekil 1C) üzerindeki sirkülatörün rezervuar içine drene olduğu 2.
    2. Oda sıcaklığında test için, kutuları boş (Şekil 2) 2 bırakın.
    3. (Şekil 2) 17 ° C'de test için, uzakta iki tarafında hayvan muhafazaları gelen '' yaklaşık 0.25 kutuları yerleştirin ve ıslak buz ile doldurun 2.
    4. (Şekil 2) 12 ° C'de test edilmesi için, uzak iki tarafında muhafazalar ile ilgili '' yaklaşık olarak 1.25 kutuları pozisyon ve kuru buz ile doldurun 2.
    5. (Şekil 2) 5 ° C'de test için yaklaşık 0,25 '' uzak iki tarafında muhafazaları kutuları yerleştirin ve kuru buz ile doldurun 2.
      1. Kuru buz ile cam soğutma yaparken, odada CO 2 birikmesini önlemek için yeterli havalandırma olduğundan emin olun.
  2. İstenilen sıcaklık aralığı ulaşması cam bekleyin.
  3. Plaka üzerinde muhafazaları fareler ekleyin.
    NOT: Bir beyaz gürültü jeneratör gürültü bozuklukları azaltmak için kullanılabilir.
  4. Fareler gelmesini bekleyin.
    NOT: Tesisimizde bu yaklaşık 2.5 saat sürer, ancak bu hayvan barınağı ve taşıma koşullarına göre önemli ölçüde değişebilir.
  5. Kutular ısındı su, ıslak buz veya kuru buz dolu tutulmasını sağlayarak istenilen sıcaklık aralığında cam koruyun.
    NOT: Bizim aparat ile kutuları buz kabaca her 90 dakika ile doldurulmuş olması gerekir.
    NOT: 17 ° C koşulu için, buz ile doldurmadan önce tahliye deliklerinden alüminyum kutuları su en boşaltmak için yardımcı olur. Bu sıcaklık daha iyi ve pr stabilize edecekOlay taşması
    NOT: Kuru buz kesin miktarı mevsimsel değişiklik, ancak genel olarak sıcaklık sabit tutacak kutusunun tüm uzunluğu boyunca tam daha fazla kutu ¼ tutmak olacaktır.

Sabit Sıcaklıklarda 3. Test Fareler

  1. Davranışsal oda dışında, kuru buz dolu yarısı bir buz kovası doldurun.
  2. Bir çekiç ya da tokmak kullanarak, ince bir toz haline kuru buz ezmek.
    NOT: kova aşırı doldurulması zor tamamen toz haline kuru buz ezmek için yapacaktır.
  3. Düz jilet veya makas kullanarak, 3 ml şırınga üst kesti.
  4. Bir 21 G iğne kullanılarak, şırınga (toplam 6 delik), karşı uçlarında 3 delik karıştırmak.
    NOT: Kuru buz sıkıştırarak ederken bu delikler yüceltme tarafından oluşturulan basınç azalacak. Kesme şırınga çok deneyler için yeniden kullanılabilir.
  5. Şırınga, kuru buz tozu ve davranışsal odasına el kronometre al.
  6. Kuru buz tozu yarısı dolu şırınga odasına doldurun. Düz bir nesneye karşı şırınga kesme ucunu tutun ve sıkıca pistonu kullanarak tozu sıkıştırmak. Dikkatli ol; plastik piston bükmeyin veya basınç kırılabilir. Bu durumda, yeni bir şırınga pistonu değiştirin.
  7. Şırınga kenarına geçmiş sıkıştırılmış kuru buz pelet ucunu uzatın.
  8. Istirahatte tamamen olan test fareler.
    1. 30 ° C, 23 ° C ve 17 ° C sıcaklıkta, 4 camına pençeleri ve sahip deney fareleri hareketli, ama 19 tam uykuya değil.
    2. 12 ° C ve 5 ° C de, hareketli ya da atlama 2 pençeler veya 4 pençe olup Hangi Test fareleri.
  9. Yavaşça, hedefleme için aynalar kullanarak ama sıkıca fare hindpaw (Şekil 1A) 2 altındaki cam yüzeyine karşı düz pelet floş basın. El-Sayacı başlatmak.
  10. Zamanlayıcı durdurun ve fare uzakta soğutmalı cam hareket ettiğinde pelet çıkarın.
    NOT: çekilme hareketi, dikey veya yatay olabilir.
    1. Fare çok kısa bir süre pençe taşır ve daha sonra soğutma yüzeye dönerse fare uzak bir kalıcı hamle yapana kadar, zamanlama ve uyarıcı devam edin.
      NOT: Bizim laboratuvar olguların çoğunda fareler için 20 sn maksimum uyaran saatini kullanır.
  11. Her hayvanın her pençe en az 3 değerleri toplanana kadar bu test prosedürü tekrarlayın. En az 15 dakika herhangi bir pençe üzerinde en az 7 dakika, ve ayrı ardışık denemeler aynı fare zıt pençeleri test Ayrı denemeler.
  12. Gerektiğinde, soğutma (Şekil 3) 1, farklı oranlarını üretmek üzere, çeşitli cam kalınlığı kullanır.
    NOT: soğutma oranı ters cam kalınlığı ile ilişkilidir.

4. Soğuk Uyum sırasında Fare Test

NOT: Bu cam plat olarak test sağlayan bir alternatif protokoldürE ziyade plaka stabilize ve fareler tamamen soğuk ortama adapte kez daha, soğutur.

  1. Aparatı kurmak için Bölüm 1'de listelenen talimatları uygulayın.
  2. RT (Şekil 7A) 2 de temel ölçümleri almak için Bölüm 3'te listelenen talimatları uygulayın.
  3. Kuru buz ile alüminyum kutuları Öncesi serin.
  4. Başlangıç ​​geri çekme gecikmeleri ölçülmüştür sonra, uzak muhafazaları ile ilgili her iki tarafında plaka, yaklaşık 1.25 'ise önceden soğutulmuş kutuları pozisyon (Şekil 7A etiketli ok, "kuru buz ilave") 2'dir.
  5. Cam plaka soğurken mümkün olduğunca sık ölçümleri alarak, ölçümler almak için Bölüm 3'te listelenen talimatları uygulayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

30 ° C, 23 ° C, 17 ° C ve 12 ° C 'de başlayan farelerden ortaya davranışsal tepkileri yüksek oranda tekrarlanabilir (Şekil 4A), 20 bulunmaktadır. Arka ayağın altında elde edilen soğuk uyarıcı ölçmek için, fareler ketamin / ksilazin / asepromazin kokteyli ile anestezi uygulandı ve pençeleri bir T-tipi filaman termokupl (Şekil 4B), 20 üst camın üzerine tespit edilmiştir. Cam soğuduktan veya arzu edilen test aralığına ısıtıldı. Plaka plaka (Şekil 5A) 2 uzunluğu boyunca üniform soğutulmaktadır rağmen, soğuk, gradyan hareketini muhafazaları (Şekil 5B) 2 üzerinde elde edildiği not edilmelidir. Merkezi parça biraz daha sıcak (Şekil 5B) 2 ise muhafazalar her iki yanı üzerinde bir kuru buz yakın olan bazı kısımları, soğuk. Soğuk sıcaklıklarda used, fareler kasanın orta kesimlerinde zamanlarının çoğunu harcamak. Cam plaka sıcaklığı stabilize edildikten sonra, bir odak kuru buz uyaran pençe / Thermode'un altında camına yerleştirildi. Bu kurulum kaydedilen sıcaklık izleri dayanarak, CPA kullanılarak oluşturulan soğuk uyaranlara her sıcaklık aralığında (Şekil 4C) 20 derece tekrarlanabilir olduğu açıktır.

CPA üretilen soğuk uyarıcı da soğutma (Şekil 3) yoğunluğunu değiştirmek için üç cam farklı kalınlıklara kullanılarak ölçülmüştür. soğutma oranı ile ters camın kalınlığına bağlı olduğu ve bu kalınlıkta herhangi bir (Şekil 3) gerektiği gibi soğuk duyarlılığını ölçmek için kullanılabilir.

Önceki çalışmalar EBM farelerde analjezi ve hipersensitiviteye algılayabilir göstermiştir. Morfin, 1.5 mg / kg deri altından enjeksiyondan sonra 30 dakika, fareler önemli ölçüde L bilgisituzlu su deri altından enjeksiyonlar verilmiştir farelere göre geri çekilmesi için onger gecikme (Şekil 6A: Bonferroni post-hoc testi ile ANOVA temel etkisi * p <0.05 2-yollu 30 dakika ** p <0.01; n = grup başına 12), 1. Morfin / tuzlu su daha sonra 60 dakika ile farelerde morfin metabolizma hızı ile tutarlıdır saline- ve morfin enjekte grupları arasında herhangi bir fark yoktur.

Tam Freund katkı maddesi (CFA), daha önce arka pençe enjeksiyon 21. sonra enflamasyon ve aşırı duyarlılık neden olduğu gösterilmiştir. ** P <0.01 2 saat * p <0.05, 3 saat, Bonferroni post-hoc testi ile 2-yönlü ANOVA ana etkisi p <0.001: CFA enjeksiyonları sonrasında, EBM geri çekme potansiyelleri (Şekil 6B 2 ve 3 saat sonrası enjeksiyon azaltmak n = 12 her grup için). 4 saat CFA enjeksiyonundan sonra, fareler 1.5 mg / kg morfin deri altından enjeksiyonlar verilmiştir. Morfin enjeksiyonu, CFA- ve serum fizyolojik enjekte edilen fareler, her iki artmış Withdr 30 dakika sonraawal 3 saat kendi gecikmeleri göre gecikmelerinde (Şekil 6B: Dunnett post-hoc testi ile 1-yönlü ANOVA, CFA 4.5 saat $$$ p <0.001, tuzlu tuzlu 4.5 saat vs 3 saat vs CFA 3 saat $$$ p <0.001). Morfin metabolize edildiğini bir kez bir saat sonra, CFA-enjekte edilen fareler tekrar tuzlu-enjekte kontrol farelere göre daha düşük çekme potansiyelleri vardı (Şekil 6B: 2-yollu Bonferroni post-hoc testi ile ANOVA; ** p <0.01) 1.

Çoğu memeli türler çevrelerini maç onların sıcaklık hassasiyeti uyum sağlama yeteneğine sahip. In vitro çalışmalar, bu uyum süreci PIP 2 hidroliz 22- 24 bağlıdır, ancak önceki davranış araçlar in vivo bu hipotezi doğrulamak mümkün olduğunu ileri sürmüşlerdir. The, EBM iki farklı şekilde bu adaptasyon miktarının yeteneğine sahiptir. Cam soğur farelerin çekilme gecikme test ederek ( 2 olur gibi ng> Şekil 7A, C), EBM soğuk adaptasyon ölçebilirsiniz. 0 dk 12.13 ± 0.8 sn, 30 dk = 12.1 ± 1.6 sn, 60 dk = 13.2 =: levha, soğuk adaptasyon EBM (Şekil 7B ile ölçülebilir daha hızlı olur düşündüren, soğutur gibi normal şartlar altında geri çekilme gecikme değişmez Bonferroni post hoc testi p> 0.05 ile 1.1 sn, 90 dk = 10.8 ± 1.2 sn 1-yönlü ANOVA ± n = 6) 2. Fareler plaka önce fosfolipaz-C inhibitörü U73122 25 enjeksiyonları intraplanar verilmiştir Ancak, engelli olduğu adaptasyon düşündüren, onların geri çekme potansiyelleri azalmış (Şekil 7C) soğutulur (Şekil 7D: bazal = 11.29 ± 0.53 sn, 30 dk = Dunnett post-hoc testi, ana etkisi p = 0.02, bireysel temel vs 30 dk p = 0.02 ile 1-yönlü ANOVA, n = 9); 8.09 ± 1.17 sn.

EBM da ab ölçebilirsinizility uzun süreler boyunca soğuk ortam sıcaklıklarına uygun hale getirir. Vahşi tip fare, 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C ya da 12 ° C 'de 3 saat süre ile çevreye alıştırıldı sonra EBM kullanılarak test edildiğinde çekilme potansiyelindeki işaret aynı hiç başlangıç ​​sıcaklıkları olması vahşi tip WT 30 ° C = 13.23 ± 0.5 sn, 23 ° C = 12.8 ± 0.7 sn, 17 ° C = 12.3 ± 0.9 sn, 12 ° C = 12.8 ± 0.5 sn, 1-: fareler soğuk ortam sıcaklığına (Şekil 2A adapte Bonferroni post-hoc testi, p> 0.05, n = 6, 30 ° C, n = yönlü ANOVA 15, 23 ° C, 17 ° C, 12 ° C) 20 için. Başlangıç ​​sıcaklığı TRPM8-KO farelerin çekme potansiyelleri azaldıkça wild-tip farelerden farklı olarak, (Şekil onların çevreye uygun tepki eşiğini adapte edemiyoruz düşündüren, azaltmak 8: 1-yönlü tekrarlı ölçümler ANOVA Bonferroni Direk- ile hoc testi; temel etkisi p = 1.5 x 10 erkekler-5, Vs 12 ° C. 23 ° C p = 6 x 10 -5, 17 ° C vs. 23 ° C p = 0.004; kadın ana etki p = 3.6 x 10 -5, 12 ° C vs 23 ° C p = 9.25 x 10 -5, 17 ° C vs 23 ° C p = 0.0005; df = 1, n = 11 erkek ve 11 kadın) 20.

Şekil 1,
CPA gerçekleştirmek için Şekil 1. Soğuk Plantar Deneyi (EBM) aparatı 2. (A) şematik. Onlar istirahatte kadar Fareler plastik davranış muhafazaları bir cam plaka üzerine alıştırıldı edilir. Bir kuru buz pelet arka ayağın altında cam alt uygulanır ve gecikme ölçülür soğutma cam çekilme. Yapılandırmada EBM tertibatının (B), Şekil plaka için 5 ° C soğumaya. Termal veri kaydedici muhafazaları merkezindeVe alüminyum kutular iki tarafında muhafaza kanadını. Yapılandırmada EBM tertibatının (C), Şekil 30 ° C plaka ısınmaya. Su sirkülasyon sonra tekrar sirkülatörün rezervuar içine tarafında drenaj dışarı akar alüminyum kutu içine sıcak su akar. Brenner ve ark. 2014 2 izni ile yeniden. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil CPA 2. (A) sırasında cam levha 2. Sıcaklık CPA davranışsal deneyler sırasında cam plakanın sıcaklığı trase Ortalamalı. 30 ° C, n = 1, 23 ° C, n = 5, 17 ° C, n = 7, 12 ° C, n = 7, 4 ° C, n = 5. (B) şematik diyagramı demCPA farklı sıcaklık koşulları oluşturmak için nasıl onstrating. Brenner ve ark. 2014 2 izni ile yeniden. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. cam kalınlığı ters 1 soğutma hızı ile ilişkilidir. (A) şematik deneysel tasarım (BD) diyagram. pençe altındaki soğuk plantar uyaran sırasında sıcaklık normal şartlar altında her üç cam kalınlıkları ölçüldü ve Strafor ayırıcılar uzakta cam yüzeyinden pençe propping. Her durumda, camdan gelen pençe pençe propping ölçülen soğuk uyaran (n = 6 cam kalınlığı başına) dramatik bir düşüşe neden olmuştur. ( ve ark. 2012 1 izni ile yeniden bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. EBM geri çekme gecikmeleri, 23 ° C'de, 17 ° C veya 12 ° C den itibaren fareler için 20 (A). Ortalama çekilme potansiyelindeki tutarlıdır. (B) Yapılandırma EBM soğuk uyaran ölçmek için. anestezi altında farenin pençe üzerine laboratuar bant ile cam levha üzerine sabitlenmektedirT-tipi lif termokupl. EBM uyaran pençe ve termokupl hem altında camın alt kısmında yer almaktadır. (C) sıcaklıklar 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C veya 12 ° C den başlayarak CPA oluşturulur. siyah oklar, her durumda uyanık fareler için ortalama çekme gecikmeleri temsil eder. Brenner ve ark izni ile yeniden. 2014 2. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5. Cam plaka sıcaklıkları plakanın ortasına yerleştirildi CPA 2. (A) Termokupl t1 (siyah) tutarlıdır. Termokupl t2 (kırmızı), plakanın sağ kenarına yakın davranış mahfaza içine yerleştirilmiştir. Sıcaklık tracings ve sağ (T1-T2) ile grafik deney süresince t1 ve t2 de hemen hemen aynı sıcaklıkları göstermektedir. (B) Termokupl t1 (siyah) plaka merkezinde yerleştirildi. Termokupl t2 (kırmızı), kuru buz dolu alüminyum kutular için yakın duvara, merkezi davranış muhafaza içine yerleştirilmiştir. Sıcaklık kopyalamaları ve aşırı sağ (t1-t2) de grafik plakası istikrarlı bir sıcaklığa ulaştıktan sonra t1 ve t2 arasında kabaca 3 ° C fark olduğunu göstermektedir. Brenner ve ark izni ile yeniden. 2014 2. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6. EBM analjezi ve aşırı duyarlılık 1 ölçebilirsiniz. (A) S1.5 mg ubcutaneous enjeksiyon / kg morfin 30 dakika enjeksiyonu ardından farelerin çekilme potansiyelini arttırır (Bonferroni post-hoc testi ile 2 yollu ANOVA, 30 dakika sonra püskürtme ** p <0.01). 60 dakika enjeksiyondan sonra, morfin enjekte ve tuzlu-enjekte edilen farelerin arasında anlamlı bir fark yoktur. (Bonferroni post-hoc testi ile 2 yollu ANOVA; * p <0.05, ** p <0.01), (B), 10 ul intraplantar enjeksiyon Tam Freund Katkı Maddesi (CFA), farelerde 2 ve 3 saat sonra enjeksiyon çekilme potansiyelini azaltır. Tüm fareler 4 saatte morfin derialtı enjeksiyonu verildi ve 4.5 saatte tüm geri çekme potansiyelleri 3 saat ile karşılaştırıldığında anlamlı derecede yüksek bulundu (Dunnet post-hoc testi ile 1-yönlü ANOVA; $$$ p <0.001). (Bonferroni post-hoc testi ile 2 yönlü ANOVA; ** p <0.01) CFA enjeksiyonu (morfin enjeksiyonundan sonra 1.5 saat) sonra 5.5 saat, CFA-enjekte edilen fareler hala tuzlu-enjekte edilen farelerin daha düşük çekme potansiyelleri vardı. Izni ile yenidenBrenner ve ark. 2012 1. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7,
Cam plaka dinamik 20 soğur soğuk adaptasyon Ölçme Şekil 7.. Cam levha olarak EBM gerçekleştirmek için (A) şematik soğutma. Taban sıcaklığı, kuru buz kaplar plakaya ilave edilir, oda sıcaklığında ölçülür ve cam plaka soğudukça çekilme potansiyelindeki ölçülür. Cam plaka soğur (B) Yabani tip fareler onlar CPA (Baseline ile ölçülebilir daha hızlı soğutma sıcaklıklara uyum düşündüren, aynı çekilme gecikme var = 12.8 ± 0.3 sn, 30 dk = 13.67 ± 0.9 sn, 60 dk = 11.03 ± 1.0 sn, 90 dakika = 11.31 ± 0.6 saniye, n = 3 fare; Bonferroni post-hoc testi, herhangi bir grup arasında anlamlı bir fark) 1-yönlü ANOVA. Cam levha olarak CPA gerçekleştirmek için şematik (C) PLC inhibitörü U73122 veya kontrol bileşik U73343 olan intraplantar enjeksiyondan sonra, soğutma. Plaka U73122 enjeksiyonundan sonra soğutma sırasında (D) Fare U73122 ortam sıcaklıkları soğutma uyum yeteneği ile müdahale düşündüren, anlamlı olarak düşük çekme gecikmeleri var. Brenner ve ark. 2014 20 izni ile yeniden. Bu Şekil Ağrı Çalışmaları Uluslararası Birliği (IASP) izni ile yeniden olmuştur. Şekil izni olmadan başka herhangi bir amaçla çoğaltılamaz DEĞİL olabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

"Şekil Şekil 8. TRPM8-KO fareler çevre 20 Soğutma uyum yok TRPM8-KO fareler Bonferroni post-hoc testi ile (2-yönlü ANOVA ölçülen tüm başlangıç ​​sıcaklıklarında yabani tip littermates daha yüksek çekme gecikmeleri var;. *** P < 0.001). TRPM8-KO farelerin çekilme gecikme de başlangıç ​​sıcaklığı azaldıkça azalır (Bonferroni post-hoc testi ile 1-yönlü ANOVA; ## p <0.01, ### p <0.001), çekilmesinde önemli bir değişiklik varken Başlangıç ​​sıcaklığı azaldıkça, vahşi tip littermates gecikmesi. Brenner ve ark. 2014 20 izni ile yeniden. Bu Şekil Ağrı Çalışmaları Uluslararası Birliği (IASP) izni ile yeniden olmuştur. Şekil izni olmadan başka herhangi bir amaçla çoğaltılamaz DEĞİL olabilir. tiklayiniz LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya k.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T-type thermocouple probe Physitemp IT-24p Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger Extech EA15 Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml Syringe BD 309657 The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer If using Extech logger, any Pcwill work
Aluminum boxes Washington University in St. Louis machine shop boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator VWR Any water circulator model with a pump will work
21 G needle BD 305165 The exact needle size is not important
Hand timer Any hand timer will work
Mirror Any flat mirror will work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, D. S., Golden, J. P., Gereau, R. W. A Novel Behavioral Assay for Measuring Cold Sensation in Mice. Plos ONE. 7, (6), 8 (2012).
  2. Brenner, D. S., Vogt, S. K., Gereau, R. W. A technique to measure cold adaptation in freely behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. (2014).
  3. Choi, Y., Yoon, T. W., Na, H. S., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral signs of ongoing pain and cold allodynia in a rat model of neuropathic pain. Pain. 59, (3), 369-376 (1994).
  4. Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neuroscience letters. 458, (2), 93-95 (2009).
  5. Carlton, S. M., Lekan, H. A., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral manifestations of an experimental model for peripheral neuropathy produced by spinal nerve ligation in the primate. Pain. 56, (2), 155-166 (1994).
  6. Pizziketti, R. J., Pressman, N. S., Geller, E. B., Cowan, A., Adler, M. W. Rat cold water tail-flick: A novel analgesic test that distinguishes opioid agonists from mixed agonist-antagonists. European Journal of Pharmacology. 119, (1-2), 23-29 (1985).
  7. Pinto-Ribeiro, F., Almeida, A., Pego, J. M., Cerqueira, J., Sousa, N. Chronic unpredictable stress inhibits nociception in male rats. Neuroscience letters. 359, (1-2), 73-76 (2004).
  8. Karashima, Y., et al. TRPA1 acts as a cold sensor in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (4), 1273-1278 (2009).
  9. Knowlton, W. M., Bifolck-Fisher, A., Bautista, D. M., McKemy, D. D. TRPM8, but not TRPA1, is required for neural and behavioral responses to acute noxious cold temperatures and cold-mimetics in vivo. Pain. 150, (2), 340-350 (2010).
  10. Allchorne, A. J., Broom, D. C., Woolf, C. J. Detection of cold pain, cold allodynia and cold hyperalgesia in freely behaving rats. Molecular pain. 1, 36 (2005).
  11. Colburn, R. W., et al. Attenuated cold sensitivity in TRPM8 null mice. Neuron. 54, (3), 379-386 (2007).
  12. Dhaka, A., Murray, A. N., Mathur, J., Earley, T. J., Petrus, M. J., Patapoutian, A. TRPM8 is required for cold sensation in mice. Neuron. 54, (3), 371-378 (2007).
  13. Bautista, D. M., et al. The menthol receptor TRPM8 is the principal detector of environmental cold. Nature. 448, (7150), 204-208 (2007).
  14. Obata, K., et al. TrpA1 induced in sensory neurons contributes to cold hyperalgesia after inflammation and nerve injury. The Journal of Clinical Investigation. 115, (9), 2393-2401 (2005).
  15. Tang, Z., et al. Pirt functions as an endogenous regulator of TRPM8. Nature communications. 4, 2179 (2013).
  16. Lee, H., Iida, T., Mizuno, A., Suzuki, M., Caterina, M. J. Altered thermal selection behavior in mice lacking transient receptor potential vanilloid 4. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25, (5), 1304-1310 (2005).
  17. Pogorzala, L. A., Mishra, S. K., Hoon, M. A. The cellular code for Mammalian thermosensation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 33, (13), 5533-5541 (2013).
  18. Yalcin, I., Charlet, A., Freund-Mercier, M. -J., Barrot, M., Poisbeau, P. Differentiating thermal allodynia and hyperalgesia using dynamic hot and cold plate in rodents. The journal of pain official journal of the American Pain Society. 10, (7), 767-773 (2009).
  19. Callahan, B. L., Gil, A. S., Levesque, A., Mogil, J. S. Modulation of mechanical and thermal nociceptive sensitivity in the laboratory mouse by behavioral state. The journal of pain: official journal of the American Pain Society. 9, (2), 174-184 (2008).
  20. Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Dhaka, A., Story, G. M., Gereau, R. W. A dynamic set point for thermal adaptation requires phospholipase C-mediated regulation of TRPM8 in vivo. Pain. (2014).
  21. Patwardhan, A. M., Scotland, P. E., Akopian, A. N., Hargreaves, K. M. Activation of TRPV1 in the spinal cord by oxidized linoleic acid metabolites contributes to inflammatory hyperalgesia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (44), 18820-18824 (2009).
  22. Fujita, F., Uchida, K., Takaishi, M., Sokabe, T., Tominaga, M. Ambient Temperature Affects the Temperature Threshold for TRPM8 Activation through Interaction of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate. Journal of Neuroscience. 33, (14), 6154-6159 (2013).
  23. Rohacs, T., Lopes, C. M., Michailidis, I., Logothetis, D. E. PI(4,5)P2 regulates the activation and desensitization of TRPM8 channels through the TRP domain. Nature neuroscience. 8, (5), 626-634 (2005).
  24. Daniels, R. L., Takashima, Y., McKemy, D. D. Activity of the neuronal cold sensor TRPM8 is regulated by phospholipase C via the phospholipid phosphoinositol 4,5-bisphosphate. The Journal of biological chemistry. 284, (3), 1570-1582 (2009).
  25. Zhang, H., et al. Neurokinin-1 receptor enhances TRPV1 activity in primary sensory neurons via PKCepsilon: a novel pathway for heat hyperalgesia. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27, (44), 12067-12077 (2007).
  26. Wang, H., Zylka, M. J. Mrgprd-expressing polymodal nociceptive neurons innervate most known classes of substantia gelatinosa neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29, (42), 13202-13209 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics