Une méthode simple et peu coûteuse pour déterminer Sensibilité au froid et adaptation chez la souris

Neuroscience

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Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Gereau IV, R. W. A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52640, doi:10.3791/52640 (2015).

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Abstract

Introduction

Mesure de la réactivité à froid chez les rongeurs est important pour améliorer la compréhension des mécanismes potentiels de sensibilité au froid chez les humains dans des conditions normales et pathologiques. The Cold plantaire Assay (CPA), développé à l'origine il ya plusieurs années une, est conçu pour générer des réponses claires murins comportement reproductibles à un stimulus froid amené à RT. Améliorations plus récentes de cet essai ont permis la mesure reproductible de sensibilité au froid à une large gamme de températures 2. Les deux versions sont également conçus pour être relativement à haut débit, et peu coûteux à utiliser.

A beaucoup de progrès ont été réalisés dans la compréhension des mécanismes de sensibilité au froid en utilisant d'autres méthodes comportementales. Un procédé est le test de l'évaporation de l'acétone, ce qui implique tamponnant ou en pulvérisant de l'acétone sur la patte de la souris et en mesurant la quantité de temps que la souris consacre effleurant la patte de 3,4. Malheureusement,les réponses à l'acétone évaporation sont confondus par la sensation d'humidité et l'odeur de l'acétone. En outre, le stimulus froid qui est appliquée dans le test d'évaporation de l'acétone peuvent varier en fonction de la quantité d'acétone appliqué, et est difficile à quantifier. Enfin, les souris non lésés ont des réponses minimales au niveau de référence à l'acétone, ce qui rend impossible la mesure de l'analgésie en l'absence d'une hypersensibilité à la présente méthode.

Un autre essai classique pour les réponses à froid est le test du Tail Flick, où la latence de retrait est mesuré après la queue est immergée dans 5,6 d'eau froide. Alors que les réponses comportementales dans cet essai sont sans ambiguïté et l'essai mesure les réponses à une température spécifique, les animaux doivent être retenus pendant les essais, qui peut altérer la réactivité à froid grâce à des mécanismes analgésiques induits par le stress bien décrits 7.

Un autre outil couramment utilisé est le test de la plaque froide, qui mesure le comportementles réponses des souris après leur mise sur une plaque refroidie par effet Peltier 10/08. Bien que cet outil fournit des informations sur les réponses des animaux à des températures spécifiques, il a également été utilisé d'une manière incompatible; différents groupes ont mesuré différents types de réponses, y compris nombre de sauts 8,11, la latence de la première réponse 8,11- 13, et le nombre de patte ascenseurs 11,13,14 avec des résultats très différents. Le dosage de la plaque froide est également relativement faible débit comme un seul animal peut être testée à la fois, et il nécessite un dispositif de Peltier coûteux et fragile.

Le test de préférence de la température de 2 plaques est un dérivé communément utilisé pour le test de la plaque froide qui mesure la quantité relative de temps que les animaux passent sur ​​deux plaques reliées à des températures différentes 9,15- 17. Un autre test couramment utilisé est le même dosage de gradient thermique, où la quantité de temps que les souris passent en différentes zones de températurecomprise entre 5 ° C et 45 ° C sur une plaque longue métallique 16 est mesurée. Bien que ces tests permettent de comparer les températures, il est difficile de savoir si le comportement représente l'aversion de la température ou à la préférence de température.

Enfin, l'analyse dynamique de plaque froide a été utilisé pour mesurer la souris répondent à l'évolution des températures ambiantes 18. Cette méthode consiste à placer des souris sur un dispositif à effet Peltier et RT rampe vers le bas à 1 ° C tout en mesurant combien les souris sautent ou lèchent les pattes de la plaque à des températures différentes. Bien que cette façon teste les souris se adapter à un environnement de refroidissement, il ne fournit pas un moyen pour tester la souris réagissent à un stimulus froid dans le cadre d'une température ambiante froide. En outre, il nécessite un équipement coûteux à réaliser et ne offre pas un moyen de souris se acclimater à l'équipement de test avant de mesurer leur sensibilité au froid.

Pour compléter ces essais, le CPA teste la ACCLIMATED réponses à un stimulus froid bien défini à une variété de gammes de température, ou pendant le processus d'adaptation à des températures ambiantes froides. Il peut tester jusqu'à 14 souris à la fois avec notre appareil actuel, avec le potentiel d'être économiquement plus grande échelle pour les tests à haut débit.

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Protocol

Tous les protocoles de souris étaient conformes aux Instituts nationaux de la Santé et des lignes directrices ont été approuvées par le Comité des études animales de l'École de médecine de l'Université de Washington (St. Louis, MO).

1. Préparation de la plaque d'essais et boîtiers

  1. Nettoyer la surface du verre.
  2. Fixez la sonde filament thermocouple de type T à la surface dans le milieu de la plaque de verre avec du ruban de laboratoire.
  3. Placez les enclos des animaux sur la plaque de verre en une seule ligne le long du milieu de la plaque.
  4. Enfilez la sonde de thermocouple dans l'enceinte des animaux de centre et se brancher sur l'enregistreur de données. Mettez l'enregistreur de données sur tout en désactivant la fonction d'arrêt automatique, et joindre l'enregistreur de données à l'ordinateur avec le câble fourni.
    1. Si l'enregistrement de la température de la plaque lors de l'expérience, ouvrez le logiciel de l'enregistreur de données pour commencer l'enregistrement des températures de la plaque.
    2. Si nécessaire, ajuster le logiciel à nouveauCordon la température de la plaque une fois par seconde.
    3. Commencez températures en utilisant le logiciel fourni avec l'enregistreur de données thermique enregistrement.
  5. Séparer l'enceinte avec des inserts noirs pour empêcher l'interaction visuelle entre les souris.
  6. Reflète la position sous le verre de telle sorte que la face inférieure des enceintes est visible à partir d'une position assise confortable.

2. réchauffement / refroidissement de la plaque de verre

  1. Remplissez les boîtes en aluminium avec de l'eau chauffée, de la glace mouillée, ou de la glace sèche et les positionner de façon appropriée sur la plaque de verre (paquets de papier d'aluminium remplis de glace sèche peuvent également être utilisés pour refroidir le verre; Figure 1) 2.
    1. Pour les tests à 30 ° C, positionner les boîtes d'aluminium d'environ 0,25 '' loin des enclos des animaux (figure 2B) 2.
      1. Fixer un circulateur d'eau chauffée des deux côtés de la plaque de verre. Réglez le thermostat à 45 - 60 ° C, et nouse pour remplir les boîtes en aluminium avec un flux régulier de l'eau chaude (figure 1C) 2.
      2. Placez les circulateurs de telle sorte que l'eau chaude dans les boîtes en aluminium draine directement dans le réservoir du circulateur de chaque côté (figure 1C) 2.
    2. Pour les tests à température ambiante, laissez les cases vides (Figure 2) 2.
    3. Pour les tests à 17 ° C, positionner les boîtes d'environ 0,25 '' loin des enclos des animaux de chaque côté et remplir avec de la glace humide (Figure 2) 2.
    4. Pour les tests à 12 ° C, positionner les boîtes environ 1,25 '' loin des enceintes de chaque côté et remplir avec de la glace sèche (Figure 2) 2.
    5. Pour les tests à 5 ° C, positionner les boîtes d'environ 0,25 '' loin des enceintes de chaque côté et remplir avec de la glace sèche (Figure 2) 2.
      1. Lorsque le refroidissement du verre avec de la glace sèche, assurez-vous que la ventilation est suffisante pour empêcher l'accumulation de CO 2 dans la salle.
  2. Attendre que le verre pour atteindre la plage de température souhaitée.
  3. Ajouter les souris aux enceintes sur la plaque.
    NOTE: Un générateur de bruit blanc peut être utilisé pour diminuer les nuisances sonores.
  4. Attendez que la souris se acclimater.
    NOTE: Dans notre installation cela prend environ 2,5 heures, mais cela peut varier considérablement en fonction de logement des animaux et les conditions de manutention.
  5. Maintenir le verre à la plage de température souhaitée en se assurant que les boîtes sont toujours pleines d'eau chauffée, de la glace mouillée, ou de la glace sèche.
    NOTE: Avec notre appareil, les boîtes doivent être rempli avec de la glace à peu près toutes les 90 min.
    REMARQUE: Pour le C 17 ° état, il est utile de vider plupart de l'eau dans les boîtes en aluminium à travers les trous de drainage avant de le remplir avec de la glace. Ce sera de stabiliser la température mieux, et prdébordement de l'événement
    NOTE: Le montant exact de la glace sèche varie de façon saisonnière, mais en général, en gardant les boîtes plus de ¼ complètes sur toute la longueur de la boîte va garder la température constante.

3. Test de la souris à des températures fixes

  1. En dehors de la salle de comportement, remplissez un seau à glace à moitié plein de glace sèche.
  2. L'utilisation d'un marteau ou un maillet, écraser la glace sèche en une poudre fine.
    REMARQUE: Une surcharge du seau, il sera difficile d'écraser complètement la glace sèche en poudre.
  3. En utilisant une lame de rasoir ou des ciseaux, découpez le dessus une seringue de 3 ml.
  4. En utilisant une aiguille 21 G, percez trois trous sur les côtés opposés de la seringue (total de six trous).
    NOTE: Ces trous vont diminuer la pression générée par sublimation tout en comprimant la glace sèche. La seringue de coupure peut être réutilisée pour de multiples expériences.
  5. Prenez la seringue, la poudre de glace sèche, et un chronomètre portatif dans la salle de comportement.
  6. Remplir la chambre à moitié plein de poudre de glace sèche de la seringue. Maintenez l'extrémité de la seringue contre un objet plat de coupe, et de comprimer fermement la poudre en utilisant le piston. Faites attention; le piston de plastique peut tordre ou de casser de la pression. Si cela se produit, remplacer le piston d'une nouvelle seringue.
  7. Elargir la pointe de la pastille de glace carbonique comprimé delà du bord de la seringue.
  8. souris d'essai qui sont entièrement au repos.
    1. A 30 ° C, 23 ° C et 17 ° C, les souris d'essai qui ont tous les quatre pattes sur la vitre et ne bouge pas, mais pas complètement endormie 19.
    2. A 12 ° C et 5 ° C, les souris de test qui sont sur deux pattes ou quatre pattes et ne se déplaçant pas ou sauter.
  9. En utilisant les miroirs pour le ciblage, doucement mais appuyez fermement sur ​​le culot affleurant à plat contre la surface de verre sous la patte arrière de la souris (figure 1A) 2. Lancer la main-minuterie.
  10. Arrêter le chronomètre et enlever le culot lorsque la souris se éloigne du verre refroidi.
    NOTE: Le mouvement de retrait peut être verticale ou horizontale.
    1. Si la souris se déplace très brièvement la patte, puis il revient à la surface de refroidissement, continuera jusqu'à ce moment et en stimulant la souris fait un mouvement permanent de suite.
      NOTE: Notre laboratoire utilise un temps de relance maximum de 20 secondes pour les souris dans la majorité des cas.
  11. Répétez cette procédure de test jusqu'à ce qu'au moins trois valeurs sur chaque patte de chaque animal sont collectées. Des essais distincts essai pattes opposées sur la même souris par au moins 7 min et essais consécutifs séparés sur toute la patte unique d'au moins 15 min.
  12. Si nécessaire, utiliser différentes épaisseurs de verre pour générer différents taux de refroidissement (Figure 3) 1.
    REMARQUE: La vitesse de refroidissement est inversement corrélée à l'épaisseur du verre.

4. Test de la souris Pendant froide adaptation

NOTE: Ce est un autre protocole qui permet de tester le plat de verree refroidit, plutôt qu'une fois la plaque se est stabilisée et les souris ont totalement adaptée à l'environnement froid.

  1. Suivez les instructions figurant à la section 1 de mettre en place l'appareil.
  2. Suivez les instructions figurant à la section 3 de prendre les mesures de base à la température ambiante (figure 7A) 2.
  3. Pré-refroidir les boîtes en aluminium avec de la glace sèche.
  4. Une fois latences de retrait de base ont été mesurées, positionner les boîtes prérefroidis sur la plaque d'environ 1,25 '' loin des enceintes de chaque côté (figure 7A, flèche étiqueté «glace sèche ajouté") 2.
  5. Suivez les instructions figurant à la section 3 de prendre des mesures comme la plaque de verre refroidit, prendre des mesures aussi souvent que possible.

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Representative Results

Les réponses comportementales induites chez des souris à partir de 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C et 12 ° C sont très reproductible (figure 4A) 20. Afin de mesurer le stimulus froid étant généré sous la patte arrière, les souris ont été anesthésiés avec un kétamine / xylazine / acépromazine cocktails et leurs pattes ont été fixés sur le verre sur le dessus d'un thermocouple de type T filament (figure 4B) 20. Le verre est refroidi ou réchauffé à l'intervalle de test souhaitée. Bien que la plaque est refroidie de manière uniforme le long de la longueur de la plaque (figure 5A) 2, il convient de noter qu'un gradient froid est généré à travers les boîtiers de comportement (figure 5B) 2. Les parties de l'enceinte qui sont plus près de la glace sèche de chaque côté des enceintes sont plus fraîches, tandis que les parties centrales sont légèrement plus chaud (figure 5B) 2. Dans les températures les plus froides used, les souris passent la majorité de leur temps dans les parties centrales de l'enceinte. Une fois que la température de la plaque de verre se était stabilisée, un stimulus de la glace sèche focale a été placée sur le verre sous la patte / thermode. Basé sur les traces de température enregistrées à partir de cette configuration, il est clair que les stimuli froids générés en utilisant le CPA sont hautement reproductibles à chaque plage de température (figure 4C) 20.

Le stimulus froid généré dans l'ACP a également été mesurée en utilisant trois différentes épaisseurs de verre pour faire varier l'intensité du refroidissement (figure 3). La vitesse de refroidissement est inversement proportionnelle à l'épaisseur du verre, et l'autre de ces épaisseurs peuvent être utilisées pour mesurer la sensibilité au froid selon les besoins (figure 3).

Des travaux antérieurs ont montré que la CPA peut détecter l'analgésie et l'hypersensibilité chez la souris. 30 min après l'injection sous-cutanée de 1,5 mg / kg de morphine, les souris ont significativement longer latence au retrait de souris ayant reçu des injections sous-cutanées de solution saline (figure 6A: 2 ANOVA principal effet * p <0,05 avec post-hoc test de Bonferroni; 30 min ** p <0,01; n = 12 par groupe) 1. En 60 min après morphine / solution saline, il n'y a pas de différence entre les groupes Saline- et la morphine injectée, ce qui est cohérent avec le taux de métabolisme de la morphine chez les souris.

Adjuvant complet de Freund (CFA) a été montré précédemment pour causer l'inflammation et d'hypersensibilité après injection 21 patte arrière. Après injections CFA, les latences de retrait de l'ACP diminuent post-injection 2 et 3 heures (figure 6B: 2 ANOVA principal effet p <0,001 avec Bonferroni post-hoc essai; 2 h * p <0,05, 3 h ** p <0,01 n = 12 par groupe). 4 h après l'injection de CFA, les souris ont reçu des injections sous-cutanées de 1,5 mg / kg de morphine. 30 minutes après l'injection de morphine, à la fois CFA-souris et de solution saline injectée avaient augmenté DébroAwal latences par rapport à leurs latences à 3 h (figure 6B: une analyse de la variance avec le test post-hoc de Dunnett; CFA 3 heures contre 4,5 heures CFA $$$ p <0,001, une solution saline 3 heures contre 4,5 heures une solution saline $$$ p <0,001). Une heure plus tard, une fois que la morphine avait été métabolisé, les souris CFA injectés ont une fois de plus latences de retrait plus faibles que les souris témoins de solution saline injectée (figure 6B: 2-way ANOVA avec test de Bonferroni post-hoc; ** p <0,01) 1.

La plupart des espèces de mammifères ont la capacité d'adapter leur sensibilité à la température pour correspondre à leur environnement. In vitro, des études ont suggéré que ce processus d'adaptation dépend de PIP 2 hydrolyse 22- 24, mais les outils de comportement précédents ne ont pas pu valider cette hypothèse in vivo. La CPA est capable de quantifier cette adaptation de deux manières différentes. En testant la latence de retrait de souris que le verre refroidit ( deux. Dans des conditions normales, le temps de latence de retrait est inchangée que la plaque se refroidit, ce qui suggère que l'adaptation au froid arrive plus vite que peut être quantifié avec le CPA (Figure 7B: 0 min = 12,13 ± 0,8 sec, 30 min = 12,1 ± 1,6 sec, 60 min = 13,2 ± 1,1 sec, 90 min = 10,8 ± 1,2 sec 1 ANOVA avec Bonferroni post hoc essai p> 0,05, n = 6) 2. Cependant, lorsque les souris sont donnés intraplantaire injections de la phospholipase C inhibiteur U73122 25 avant que la plaque est refroidie (Figure 7C) leurs latences de retrait sont diminuées, ce qui suggère que l'adaptation est altérée (Figure 7D: base = 11,29 ± 0,53 sec, 30 min = 8,09 ± 1,17 sec; une ANOVA avec post-hoc du test de Dunnett, principal effet p = 0,02, niveau de base individuel vs 30 min p = 0,02, n = 9).

Le CPA peut également mesurer l'abilité de se adapter à des températures ambiantes froides sur de longues périodes de temps. Lorsque les souris de type sauvage sont testées en utilisant le CPA après avoir été acclimatés pendant 3 heures à 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C ou 12 ° C, le temps de latence de retrait sont les mêmes températures du tout à partir, ce qui suggère que le type sauvage souris adaptée à la température ambiante froide (Figure 2A: WT 30 ° C = 13,23 ± 0,5 s, 23 ° C = 12,8 ± 0,7 s, 17 ° C = 12,3 ± 0,9 s, 12 ° C = 12,8 ± 0,5 s, la 1- ANOVA avec un test post-hoc de Bonferroni, p> 0,05 pour n = 6 à 30 ° C, n = 15 à 23 ° C, 17 ° C et 12 ° C) 20. Contrairement aux souris de type sauvage, que la température de départ diminue les latences de retrait de souris TRPM8-KO diminuer, ce qui suggère qu'ils sont incapables de se adapter à leur seuil de réponse en fonction de leur environnement (Figure 8: 1-way ANOVA à mesures répétées avec Bonferroni post- Test hoc; mâles principal effet p = 1,5 x 10-5, 12 ° C vs. 23 ° C p = 6 x 10 -5, 17 ° C contre 23 ° C p = 0,004; femelles principal effet p = 3,6 x 10 -5, 12 ° C contre 23 ° C p = 9,25 x 10 -5, 17 ° C contre 23 ° C p = 0,0005; df = 1, n = 11 hommes et 11 femmes) 20.

Figure 1
Figure 1. Le froid plantaire Assay (CPA) appareil 2. (A) Schéma pour effectuer l'ACP. Les souris sont acclimatés sur une plaque de verre dans des enclos de comportement plastique jusqu'à ce qu'ils sont au repos. Pastille de la glace sèche est appliqué sur la face inférieure de la vitre en dessous de la patte arrière, et la latence de retrait de la vitre de refroidissement est mesurée. (B) de l'appareil photo de l'ACP, dans la configuration de refroidir la plaque à 5 ° C. L'enregistreur de données thermique est au centre des enceintesEt les boîtes en aluminium flanquent l'enceinte de chaque côté. (C) de l'appareil photo de l'ACP, dans la configuration pour réchauffer la plaque à 30 ° C. Le circulateur d'eau l'eau chaude coule dans la boîte d'aluminium, qui se écoule ensuite sur le drain sur le côté dans le réservoir du circulateur. Réutilisées avec l'autorisation de Brenner et al. 2014 2. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Température de la plaque de verre au cours de la CPA 2. (A) en moyenne tracés de température de la plaque de verre au cours d'expériences comportementales dans le CPA. 30 ° C n = 1, 23 ° C n = 5, 17 ° C n = 7, 12 ° C n = 7, 4 ° C n = 5. (B) Schémas demonstrating comment générer les différentes conditions de température dans le CPA. Réutilisées avec l'autorisation de Brenner et al. 2014 2. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. L'épaisseur du verre est inversement corrélée avec la vitesse de refroidissement 1. (A) Représentation schématique du plan expérimental de diagrammes (BD). La température au cours de stimulus froid sous plantaire de la patte a été mesurée sur les trois épaisseurs de verre dans des conditions normales, et des espaceurs en polystyrène qui étayage la patte loin de la surface du verre. Dans tous les cas, l'étayage la patte loin du verre a entraîné une diminution spectaculaire de la relance à froid mesurée à la patte (n = 6 par l'épaisseur du verre). ( et al. 2012 1 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. latences de retrait de CCP sont cohérentes 20. (A) la latence de retrait moyen pour les souris à partir de 23 ° C, 17 ° C ou 12 ° C. (B) Configuration de mesurer CPA stimulus froid. La patte d'une souris anesthésiée est fixé sur la plaque de verre avec du ruban de laboratoire sur le dessusd'un filament T-thermocouple de type. Le stimulus de CPA est placé sur la face inférieure du verre sous la fois la patte et le thermocouple. (C) Les températures générées dans l'ACP à partir de 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C ou 12 ° C. Les flèches noires représentent les latences de retrait moyenne pour les souris éveillé dans chaque condition. Réutilisées avec l'autorisation de Brenner et al. 2014 2. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. températures de la plaque de verre sont conformes au CPA 2. (A) thermocouple t1 (noir) a été placé au centre de la plaque. Thermocouple t2 (rouge) a été placé dans l'enceinte de comportement plus proche du bord droit de la plaque. Les tra de températurecings et le graphique à l'extrême droite (T1-T2) montrent des températures presque identiques à t1 et t2 tout au long de l'expérience. (B) t1 thermocouple (noir) a été placée au centre de la plaque. Thermocouple t2 (rouge) a été placée dans l'enceinte comportementale central, sur le mur près des boîtes en aluminium remplis de glace sèche. Les tracés de température et le graphique à l'extrême droite (T1-T2) montrent qu'il ya une différence C environ 3 ° entre t1 et t2 fois la plaque a atteint une température stable. Réutilisées avec l'autorisation de Brenner et al. 2014 2. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Le CPA peut mesurer l'analgésie et une hypersensibilité. (A) Subcutaneous injection de 1,5 mg / kg de morphine augmente la latence de retrait de souris 30 minutes après l'injection (2-way ANOVA avec post-hoc test de Bonferroni; après l'injection de 30 min ** p <0,01). 60 min après l'injection, il n'y a pas de différence significative entre la morphine et les souris injectées de solution saline injectée. (B) d'injection intraplantaire de 10 ul adjuvant complet de Freund (CFA) diminue la latence de retrait de souris 2 et après l'injection de 3 heures (2-way ANOVA avec Bonferroni post-hoc essai; * p <0,05, ** p <0,01). Toutes les souris ont reçu des injections sous-cutanées de morphine à 4 h, et tous les latences de retrait à 4,5 heures étaient significativement plus élevés comparativement à 3 h (une ANOVA avec post-hoc test Dunnet; $$$ p <0,001). 5,5 heures après l'injection de CFA (1,5 heures après l'injection de morphine), les souris CFA injectés avait encore latences de retrait plus faibles que les souris de solution saline injectée (2-way ANOVA avec Bonferroni post-hoc essai; ** p <0,01). Réutilisées avec l'autorisation deBrenner et al. 2012 1. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7. Mesurer adaptation au froid que la plaque de verre refroidit dynamiquement 20. (A) Schéma pour effectuer l'ACP comme la plaque de verre se refroidit. Températures de référence sont évalués à la RT, les conteneurs de glace sèche sont ajoutés à la plaque, et la latence de retrait est mesurée comme la plaque de verre refroidit. (B) souris de type sauvage ont la même latence de retrait de la plaque de verre se refroidit, ce qui suggère qu'ils se adaptent à des températures de refroidissement plus rapide que peut être mesurée avec le CPA (Baseline = 12,8 ± 0,3 sec, 30 min = 13,67 ± 0,9 sec, 60 min = 11,03 ± 1,0 sec, 90 min = 11,31 ± 0,6 s, n = 3 souris; Une ANOVA avec test post-hoc de Bonferroni, aucune différence significative entre tous les groupes). (C) Schéma de l'exécution du CPA comme la plaque de verre se refroidit, après intraplantaires injections du U73122 inhibiteur de la PLC ou U73343 de composé témoin. (D) Les souris ont latences de retrait nettement plus faibles tandis que la plaque est de refroidissement après injection de U73122, U73122 suggérant que interfère avec la capacité de se adapter à des températures ambiantes de refroidissement. Réutilisées avec l'autorisation de Brenner et al. 2014 20. Cette figure a été reproduite avec la permission de l'Association internationale pour l'étude de la douleur (IASP). Le chiffre ne peut être reproduite à d'autres fins sans autorisation. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

"Figure Figure 8. souris TRPM8-KO ne se adapte pas à l'environnement de refroidissement 20 souris TRPM8-KO ont latences de retrait plus élevé que la même portée de type sauvage à toutes les températures mesurées à partir (2-way ANOVA avec Bonferroni post-hoc essai;. *** P < 0,001). La latence de retrait de souris TRPM8-KO diminue également que les baisses de température de départ (1-way ANOVA avec Bonferroni post-hoc essai; ## p <0,01, ### p <0,001), alors qu'il n'y a aucun changement important dans le retrait latence de congénères de type sauvage que la température de départ diminue. Réutilisées avec l'autorisation de Brenner et al. 2014 20. Cette figure a été reproduite avec la permission de l'Association internationale pour l'étude de la douleur (IASP). Le chiffre ne peut être reproduite à d'autres fins sans autorisation. Se il vous plaît click ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
T-type thermocouple probe Physitemp IT-24p Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger Extech EA15 Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml Syringe BD 309657 The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer If using Extech logger, any Pcwill work
Aluminum boxes Washington University in St. Louis machine shop boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator VWR Any water circulator model with a pump will work
21 G needle BD 305165 The exact needle size is not important
Hand timer Any hand timer will work
Mirror Any flat mirror will work

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References

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