Un procedimiento de craneotomía lateral grande para el campo amplio de mesoescala imágenes ópticas de la actividad cerebral

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Neuroscience

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Summary

Este protocolo presenta un método para crear una gran craneotomía unilateral sobre las regiones temporal y parietal de la corteza cerebral de ratón. Esto es especialmente útil para la formación de imágenes en tiempo real sobre un área expansiva de un hemisferio cortical.

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Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity. J. Vis. Exp. (123), e52642, doi:10.3791/52642 (2017).

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Abstract

La craneotomía es un procedimiento comúnmente realizado para exponer el cerebro para experimentos in vivo. En la investigación de ratón, la mayoría de los laboratorios utilizan un pequeño craneotomía, típicamente 3 mm x 3 mm. Este protocolo presenta un método para crear una ventana craneal sustancialmente mayor 7 mm x 6 mm exponiendo más de un hemisferio cerebral sobre las cortezas temporal y parietal de ratón (por ejemplo, bregma 2.5 a 4.5 mm, lateral 0 - 6 mm). Para realizar esta cirugía, la cabeza debe ser inclinado aproximadamente 30 ° y gran parte del músculo temporal debe ser retraído. Debido a la gran cantidad de eliminación de hueso, este procedimiento es sólo para experimentos agudos con el animal anestesiado durante toda la cirugía y el experimento.

La principal ventaja de esta gran ventana craneal lateral innovador es proporcionar acceso simultáneo a las dos áreas medial y lateral de la corteza. Esta gran ventana craneal unilateral puede ser utilizado para estudiar la dinámica de los nervios entre las células,así como entre diferentes áreas corticales mediante la combinación de registros electrofisiológicos de múltiples electrodos, de formación de imágenes de la actividad neuronal (por ejemplo, formación de imágenes, intrínseca o extrínseca), y la estimulación optogenética. Además, este gran craneotomía también expone una gran superficie de los vasos sanguíneos corticales, lo que permite la manipulación directa de la vasculatura cortical lateral.

Introduction

La craneotomía es un procedimiento estándar utilizado por los neurólogos para revelar una porción del cerebro. Desde los albores de la electrofisiología, la craneotomía ha permitido avances sin precedentes en el campo de la neurociencia. mapeo densa de la corteza cerebral con electrodos ha llevado a probar hipótesis experimentos y teorías basadas en estos mapas. Hemos entrado recientemente una nueva era en la que se está utilizando la craneotomía para formación de imágenes in vivo de cortical flujo de sangre 1, 2, 3 y la arquitectura neurovascular 4, lo que permite la visualización en tiempo real de la actividad cortical dentro de las áreas expuestas 5, 6, 7. Aunque muchos estudios utilizan craneotomías combinados con técnicas de formación de imágenes ópticas en vivo para estudiar la estructura y función de las neuronas corticales, células gliales, y corvasculatura tical 8, 9, más investigaciones están limitados por pequeñas áreas de corteza expuesta (pero ver 10).

El propósito de este protocolo es proporcionar un método para crear una gran craneotomía lateral, la exposición de la corteza cerebral de la línea media en el hueso escamoso, y que se extiende más allá de bregma y lambda. Esta gran craneotomía permite la visualización simultánea de las cortezas de asociación (retroesplenial, cingulada y parietal), el motor primario y secundario, somatosensorial, visual, y la corteza auditiva. Este método se ha acoplado previamente con imágenes de colorante sensible al voltaje (VSDI) para investigar cómo múltiples áreas corticales interactúan entre sí durante la actividad espontánea y estímulos inducidos cortical 5, 11, 12. Los aspectos más desafiantes de este procedimiento incluyen el posicionamiento de la cabezadel animal, la fijación de la placa de cabeza, y evitar la hemorragia mientras se separa el músculo temporal desde el hueso parietal. También se debe tomar durante los procesos de perforación y de eliminación de cráneo como las curvas de cráneo en un ángulo oblicuo.

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Protocol

El siguiente protocolo sigue la Universidad de Lethbridge Cuidado de Animales (ACC) directrices, y se lleva a cabo de acuerdo con las normas del Consejo Canadiense de los Animales (CCAC).

1. Preparación

  1. Para los períodos de estudio prolongados, autoclave todos los suministros quirúrgicos abiertos y asegurar que se mantiene la esterilidad durante toda la cirugía. Si se requieren múltiples cirugías, autoclave entre cirugías.
  2. Asegúrese de que hay un montón de tampón de cerebro en la mano (por lo menos 50 ml). La solución está compuesta de cloruro de 134 mM de sodio, de potasio 5,4 mM, 1 mM cloruro de magnesio hexahidratado, 1,8 mM de dihidrato de cloruro de calcio, y 5 mM de HEPES de sodio, pH equilibrado a 7,4 con cloruro de 5 M de hidrógeno.
  3. Coloque el ratón en una cámara de inducción y anestesiar con 3 - 4% de isoflurano. Siga con 1,0 - 2,0% de isoflurano para el mantenimiento durante la cirugía. Además de reducir hasta un mínimo de 0,4 a 0,8% durante la exploracións = "xref"> 5, 13, 14, 15, proporcionado anestesia adecuada se mantiene. Estos bajos niveles de anestesia requieren la supervisión vigilante y frecuente del ratón (aproximadamente cada 5 min) para asegurar que permanece arrefléxica a los estímulos dolorosos.
    NOTA: La deshidratación puede llegar a ser problemática debido a la alta proporción de superficie a volumen del ratón y agravada por el uso prolongado de isoflurano.
    1. Utilice inyecciones subcutáneas de solución salina, 0,1 ml por 10 g de peso corporal, cada 1 - 2 h. Cuando adecuadamente hidratado, el ratón orinar una vez cada 1 - 2 h.
  4. Vigilar de cerca el ratón para asegurar la anestesia consistentes a lo largo de la cirugía y de imagen. No deje desatendido el ratón y cuidar de que nunca recupere la conciencia.
  5. Transferir el ratón anestesiado a la cabeza porta-configuración y el lugar en una almohadilla de calefacción termo-regulación ajustado a 37 ° C. Asegurar los teet superioresh en un soporte de los dientes.
  6. Girar la cabeza del ratón hacia la izquierda aproximadamente 30 ° para exponer el lado lateral derecho de la cabeza y asegure la cabeza del ratón con el extremo romo de barras del oído (Figura 1A).
  7. Aplicar pomada oftálmica para evitar el secado de la córnea.
  8. Para reducir el edema cerebral, inyectar dexametasona (4 mg / kg) por vía intramuscular.
  9. Limpiar la piel sobre el área quirúrgica con hisopos de algodón humedecido en 4% de clorhexidina (3 veces) y 70% de etanol (3 veces). Use cada hisopo de algodón sólo una vez.
  10. Don guantes quirúrgicos y cubrir el animal con una envoltura de plástico adhesivo. Proporcionar anestésico local mediante la inyección de lidocaína (8 - 10 mg / kg; 2% epinefrina) por vía subcutánea sobre el sitio de la craneotomía. Espere entre 3 - 5 min para que el fármaco sea absorbido en el tejido.

2. Extracción de la piel y retraer el músculo del cráneo

  1. Realizar casi todos estos procedimientos mientras se visualiza el cráneo bajo unamicroscopio de disección (por ejemplo, 0,7 - 4.5X de potencia, dependiendo de la situación).
  2. Levante la piel de 1 mm a la izquierda de la línea media (justo detrás de la oreja) con unas pinzas y hacer una pequeña incisión horizontal con tijeras quirúrgicas.
  3. Hacer un 5 - corte lateral 6 mm hacia la oreja derecha, y luego se corta hacia el extremo rostral de la cabeza.
  4. En el punto de incisión inicial, insertar las tijeras y cortar 10 mm rostral.
  5. Cortar la piel alrededor de la oreja derecha y cerca del ojo derecho para exponer el lado derecho del cráneo y el músculo temporal. Asegúrese de que la parte más ancha de la zona expuesta es al menos 7 mm. Recorte la piel aún más si el área quirúrgica tiene que ampliarse.
  6. Fijar la piel alrededor de la incisión poniendo unas gotas de pegamento de cianoacrilato de butilo entre el cráneo y la piel. Asegúrese de que el tejido ha sido previamente secado con aplicadores con punta de algodón o tejidos laminados para aumentar la eficacia del adhesivo.
  7. El uso de un hisopo de algodón, frotar la superficiedel cráneo en un movimiento circular para eliminar el periostio del cráneo. Asegúrese de que no quede ninguno por secado del cráneo por completo.
  8. Usando tijeras de primavera y fórceps, separar el músculo temporal del cráneo; cortar y retraer el músculo lateralmente hasta alcanzar el hueso escamoso (Figura 1C). Tenga mucho cuidado de no dañar la vena temporal superficial que corre a lo largo del nivel del hueso escamoso cerca del ojo, de lo contrario podría ocurrir una hemorragia.
  9. Control de sangrado con espuma de gel pre-empapado en tampón cerebro. Para una hemorragia seria utilizar un cauterizador de calor. Caída de butil cianoacrilato pegamento en los puntos de hemorragia después del tratamiento con el cauterizador calor. Asegúrese de que la zona se seca previamente mediante el uso de aplicadores con punta de algodón o tejidos laminados para aumentar la eficacia del adhesivo.

3. La craneotomía

NOTA: El cirujano debe seguir siendo diligente durante la extracción del cráneo yDura para evitar complicaciones innecesarias. pasos para solucionar problemas se incluyen si se presenta complicaciones.

  1. Marcar la ubicación de bregma ya sea con un marcador de punta fina o cortar una cinta pequeña pieza triangular y señalar una esquina en bregma (Figura 2A) para orientar las regiones cerebrales subyacentes.
  2. Antes de la colocación de la placa de cabeza asegurar el cráneo esté completamente seco. El cráneo se transmitirá rápidamente seca después de la aplicación de la espuma de gel empapada en tampón cerebro, si se necesita más de secado, utilice hisopos con punta de algodón. Este paso es crucial para la fijación placa de cabeza (Figura 1B).
    NOTA: Si hay periostio izquierda en el cráneo, o si el cráneo no está seca antes de pegar en la placa de cabeza, es probable que se desprenda. Si esto ocurre, retire con cuidado la placa de cabeza y empezar de nuevo. El sangrado puede ocurrir durante este proceso; permitir que unos pocos minutos para que se coagule, y luego eliminar suavemente. No se recomienda que este proceso se repitió dos veces más.
  3. <li> Aplicar pegamento de cianoacrilato de etilo alrededor del borde inferior de la placa de cabeza 16, y la cola de la placa de cabeza por encima del área de craneotomía (Figura 1D y figura 2A).
  4. Llenar el espacio de abertura entre la placa y la cabeza del cráneo con cemento dental dejando sólo el área expuesta craneotomía. Esperar a que el cemento dental para secar y endurecer, típicamente de 5 - 10 min (Figura 2B).
    1. Una vez ajustado el cemento, llenar brevemente el bien con tampón de cerebro y permitir a remojo durante 3 - 5 min. Utilice un tejido laminado para eliminar el tampón de cerebro antes de perforar (Figura 2C).
  5. Esquema de la zona quirúrgica mediante la ligera anotando la superficie del cráneo con un taladro dental. Use un taladro neumático (ajustado al máximo de 20 PSI), con un FG ¼ rebabas, y controlado con un pedal de velocidad variable.
  6. trazar suavemente la perforación a lo largo de la puntuación original de profundizar en ella, esegurar el taladro no penetra a través del cráneo en el cerebro (Figura 2D). Por turnos cada pocos minutos entre la perforación y frotando la superficie del cráneo con los tejidos laminados humedecidos. Esto reducirá calentamiento y secado del cráneo de la fricción mecánica y la exposición prolongada.
    NOTA: El cráneo se transmitirá rápidamente seca después de la aplicación de la espuma de gel húmedo. Si se necesita más de secado, utilice hisopos con punta de algodón.
    Precaución: El cráneo es irregular en espesor. Por ejemplo, la cresta parietal-temporal es el área más gruesa, mientras que las regiones del cráneo cerca de la línea media y monumentos escamoso son relativamente delgadas.
  7. Durante la perforación, comprobar periódicamente si el pandeo del cráneo presionando suavemente sobre ella con fórceps o la broca de perforación que no se mueve. Cuando el hueso comienza a ceder, dejar de perforación y sumerja toda la ventana en tampón cerebro.
    NOTA: Si la sangre se precipita fuera de un área, se puede sugerir que la duramadre se ha dañado. Si este es el caso, colocar una semi-húmedo de espuma de gel sobre el área y trato de absorber la sangre mientras se aplica una presión suave a la espuma de gel con un hisopo de punta de algodón.
  8. Espere por lo menos 5 min antes de la retirada del cráneo para ablandar el hueso y para reducir la posibilidad de la duramadre que se pega al hueso, haciendo que el proceso de eliminación de cráneo más fácil.
  9. Realizar el proceso de eliminación del cráneo, mientras que el cráneo se sumerge en tampón cerebro.
    NOTA: Si una porción del cráneo permanece obstinadamente unido, una hoja de bisturí # 11 se puede utilizar para marcar suavemente el cráneo. Tenga mucho cuidado para no romper la hoja a través del cráneo y en el cerebro.
  10. Comenzando desde el borde anterior, palanca suavemente el cráneo flojo de la duramadre el uso de fórceps.
    NOTA: Si una pequeña cantidad de sangrado se produce durante el proceso de eliminación cráneo, eliminar el tampón con una pipeta de transferencia o una jeringa, y luego vuelva a colocar con tampón nuevo.
  11. Una vez que el hueso está suelto y "flotantes" en la duramadre, sujete firmemente el hueso con unas pinzas y levantar el hueso dela duramadre. Asegúrese de que el hueso no penetra en el cerebro.
  12. Para controlar el sangrado, el rollo de esquina de un tejido en un punto y eliminar la mayor parte de la memoria intermedia del pozo craneal. Aplicar rápidamente espuma de gel, pre-empapados en tampón, a la zona de sangrado mientras que la adición de una presión muy ligera con un hisopo de punta de algodón.
    NOTA: El sangrado por lo general viene desde el borde del hueso o la superficie de la duramadre; ambos casos son normales y el sangrado se detendrá rápidamente si no hay vasos sanguíneos principales están dañados. Si el sangrado continúa, la sangre puede llenar toda la ventana, formando una hoja de coágulo sobre la superficie de imágenes.
    1. Para quitar la hoja de coágulo, cuidadosamente recoger piezas de sangre coagulada de la zona de formación de imágenes mientras se deja el coágulo de sangre intacta alrededor de la fuente del vaso sanguíneo roto. Tenga cuidado de no eliminar el coágulo de sangre procedente de la fuente de sangrado ya que esto puede causar aún más la pérdida de sangre. Irrigar la superficie del cerebro con tampón de cerebro para eliminar cualquier sangre.
    2. Tenga cuidado de no tocar ladelicado tejido cerebral o la adición de material extraño al cerebro; repetir hasta que el sangrado se ha detenido, durante aproximadamente 2 - 5 min (Figura 2E).
      NOTA: En este punto, la craneotomía está listo para la preparación de la ventana craneal (ver paso 5). Si es necesario, retire la duramadre antes de implantar la ventana craneal (ver paso 4).

4. Eliminación Dura

NOTA: la eliminación Dura requiere extremo cuidado y puede tomar más de 15 minutos.

  1. Dibuje el exceso de tampón de la craneotomía. Mientras se mantiene una superficie húmeda, agarra un pequeño trozo de duramadre con fórceps y rasgar suavemente la duramadre.
  2. El uso de fórceps y tijeras de primavera de rasgar y cortar la duramadre con suavidad.
  3. Caer más memoria intermedia del cerebro en la superficie del cerebro para flotar la duramadre y evitarlo separado del cerebro. Continúe hasta que todos duramadre se retira del sitio ventana del cráneo. Cuando se realiza correctamente el cerebro parece ser muy limpio, con distinta blvasos OOD y sin manchas (comparar Figura 2E con 2F).
    Precaución: Algunas áreas de la duramadre están asociadas a las pequeñas arteriolas en la superficie del cerebro (por ejemplo, cerca de la línea media proximal a la zona de asociación parietal), y la eliminación de tales pueden romperse la arteriola. En tales casos, puede ser mejor dejar un pequeño trozo de duramadre intacta sobre la parte superior de la arteriola. El variador de velocidad no puede penetrar esa zona pequeña, pero esto se prefiere tener hemorragia mayor.
  4. Fix la superficie del cerebro en agarosa tan pronto como sea posible para minimizar el movimiento de pulsación y para prevenir una mayor hinchazón (ver paso 5).

5. Preparar craneal ventana

  1. Pulverizar la cubierta de vidrio con 70% de etanol y el uso de un bote de aire para secar suavemente. Asegúrese de que el cristal está completamente limpio, sin manchas o polvo presente.
  2. Preparar 1,3% de agarosa por calentamiento de 200 mg de polvo de agarosa disueltos en 15 ml de tampón de cerebro. Ajuste el microwAVE a alta y el calor durante 10 - 15 s a la vez, se agita suavemente en el medio, hasta que se disuelve todo el agar.
    Nota: Asegúrese de que no burbujas o partículas están presentes, ya que estos interfieren con formación de imágenes.
  3. Coloque un termómetro en la agarosa caliente y enfriar la agarosa hasta justo encima de la temperatura de solidificación (~ 40 ° C).
    NOTA: correr agua fría sobre el exterior del recipiente de agarosa puede acelerar el proceso de enfriamiento. Remover suavemente de forma continua para asegurar que no burbujas o partículas están presentes.
  4. Inmediatamente antes de aplicar el agar, eliminar el tampón cerebro del pozo craneal. Elaborar la agarosa con una pipeta de transferencia y soltar la agarosa directamente sobre el cerebro. colocar rápidamente la hoja de la cubierta sobre la superficie y fijación de la hoja de la cubierta con agarosa gotas en las esquinas.

6. La eutanasia

NOTA: los cirujanos En nuestra experiencia, este procedimiento toma experimentado al menos 3 - 4 cirugías de práctica para alcanzar más de un 90%tasa de éxito. Menos cirujanos experimentados pueden requerir aún más práctica. Durante la craneotomía o durotomía, el cerebro puede sufrir daños, tales como si los punzones de perforación a través del hueso en el cerebro. Algunos daños menores en el borde de la craneotomía puede ser permisible. Sin embargo, si el cerebro no se ve "limpia" con los vasos sanguíneos no dañados de color rojo brillante y la corteza blanca, puede necesitar ser terminado el experimento. Los ejemplos de preparaciones pobres son aquellos con los vasos sanguíneos muertos, o cuando la corteza está marcado con vasos sanguíneos rotos o dañados. Si alguno de estos síntomas están presentes, el experimento improbable dió datos de alta calidad. Si la cirugía / experimento tuvo éxito o no, con humanidad sacrificar al ratón en la realización del experimento.

  1. Profundamente anestesiar con al menos 3,5% de isoflurano. A continuación, dar una inyección intraperitoneal de pentobarbital de sodio a 300 mg / kg. Idealmente, si la aguja se inserta en el hígado, la muerte será muy rápida (<1 min).
  2. Si se requiere perfusión, verificar que el animal está profundamente anestesiados antes de proceder (véase el paso 1.3).
  3. Alternativamente, si no se requiere la perfusión, espere un mínimo de 5 minutos y compruebe que el ratón está muerto. Confirmar la ausencia de la respiración, los latidos del corazón, así como una falta de retirada del dolor y los reflejos corneales. También, observar por pálida coloración azul / blanco de las extremidades y el oscurecimiento de los vasos sanguíneos más de la corteza.

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Representative Results

Para el estudio de las interacciones entre áreas corticales dentro de un solo hemisferio, se utilizó una gran craneotomía extiende a través del seno sagital y 5 - 6 En mm lateral. Esta ventana craneal incluido cortezas de los hemisferios del cerebro derecho (figura 3A) primaria (motor, somatosensorial, visual, auditiva), secundaria (motor, visual), y de asociación (retroesplenial, cingulada, asociación parietal). Para este trabajo se utilizó de formación de imágenes sensibles al voltaje colorante (VSD), que refleja los cambios en el potencial de membrana 3. Este protocolo también sería útil para la otra extrínseca (por ejemplo, calcio 17 y glutamato 18 de formación de imágenes) o experimentos de imagen intrínsecos. Cuando la estimulación de la extremidad posterior, la extremidad anterior, barbas, visual, o sistema auditivo de ratones ligeramente anestesiados utilizando 0,5% de isoflurano, se observó patrones de consenso de despolarización cortical (> Figura 3B). De acuerdo con los estudios anteriores 5 , 19 , 20 , 21 , 22 , encontramos que la breve estimulación táctil de C2 barril corteza llevó a la activación primaria somatosensory áreas, así como "islas" de las respuestas dentro de las áreas relacionadas funcionalmente. Por ejemplo, la corteza motora primaria (M1) o secundaria de la corteza somatosensorial (S2, Figura 3Bi ). Una sola estimulación de pico de tono de 1 ms (25 kHz) condujo a la activación de la corteza auditiva primaria (A1) aproximadamente 20 ms después de la estimulación auditiva ( Figura 3Bii ). Durante los siguientes milisegundos, la despolarización se extendió a través de la corteza auditiva y pasó a la corteza somatosensorial secundaria vecina. Aproximadamente 25 ms después del inicio del tono, emergería una despolarización cortical secundaria, localizada a 1,07; 0,2 mm medial y 1,9 ± 0,1 mm posterior con respecto al bregma (n = 9 ratones). Esto es aproximadamente la ubicación de la zona de asociación parietal (PTA). La señal VSD entonces propaga a la zona de la línea media donde se encuentran otras áreas de asociación cortical incluyendo retrosplenial (RS) y la corteza cingulada (CG). Por lo tanto, la estimulación auditiva dio lugar a la activación de dos áreas focales separados, de la que viajan las ondas de despolarización VSD se extendió a un área más grande dentro de la corteza de la línea media. Estimulación focal del ojo contralateral con un verde 1 ms de pulso LED, a la activación de la corteza visual primaria dentro de los 40 ms (Figura 3Bv). Esta activación primaria de la corteza visual fue seguido por: (1) la expansión espacial del VSD despolarización en las áreas vecinas situadas medial, lateral, anterior y a la zona activada inicial; (2) La despolarización de una segunda región cortical medial aproximadamente 50 ms después de la estimulación (n = 8 experimentos) situado a lo largo de sa sutura gittal. Esto era similar a estímulos sensoriales de la extremidad anterior (Figura 3Biii), las extremidades posteriores (Figura 3Biv), whisker C2, o audición. respuestas VSDI evocados de estimulación sensorial de la extremidad anterior, las extremidades posteriores o audición inicialmente activados los respectivos cortezas sensoriales primarias, seguido de una difusión anisotrópica de la actividad, así como la activación de la línea media de la corteza alrededor de 20 - 40 ms después de la estimulación. Este resultado fue similar a las respuestas de estimulación visual y bigote. La propagación de la actividad sensorial evocado a lo largo de las rutas de la línea media y la activación frecuente de mismas regiones por la actividad espontánea 6 puede sugerir que estas regiones son el eje central del núcleo de conexión de la corteza del ratón, en el que la información sensorial puede integrar con la actividad cortical espontánea.

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Figura 1. Configuración quirúrgico y preparación. La cabeza (A) de ratón se afeita, limpiado, girado aproximadamente 30 ° para la exposición lateral, y se fija con el extremo romo de barras del oído. anestésico isoflurano se entrega a través de una pieza de la nariz y el soporte de los dientes. El ratón se cubre con auto-adhesivo envoltura de plástico para aumentar la esterilidad y el calor. (B) Primer plano muestra la piel y el periostio retirado de la placa de cráneo parietal, el músculo temporal es sin tocar. (C) El músculo temporal se elimina la exposición de la placa temporal y hueso escamoso, tenga en cuenta la vena superficial no está dañado. (D) antes de la fijación, la placa de cabeza se coloca en la ubicación correcta con cera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


La Figura 2. Paso a paso procedimiento quirúrgico. (A) La cabeza de la placa está fijado al cráneo con pegamento de cianoacrilato de etilo en las posiciones anterior y posterior. Tenga en cuenta la ubicación del bregma (pieza negro de la cinta triangular). (B) La ventana craneal se prepara mediante la aplicación de cemento dental engrosada entre la cabeza de la placa y el cráneo. Tenga en cuenta que el bregma y los puntos de referencia escamoso permanecen visibles. (C) Después del secado de cemento, se añadió tampón de cerebro para suavizar el cráneo y para evitar la adhesión de la duramadre. Un tejido laminado ayudará a la eliminación de tampón cerebro antes de la perforación. (D) Los bordes de la craneotomía se han anotado. Tenga en cuenta la vasculatura se ve más fácilmente a través del hueso adelgazada cerca de los bordes de cemento dental. (E) Las placas parietales y cráneo temporal han sido Removed y la duramadre es visible. Nota manchas de sangre en la duramadre del sangrado menor, lo cual es normal. Un examen cuidadoso bajo 2 - ampliación 4X revelará dos capas de los vasos sanguíneos, uno en la duramadre y el otro en la pia. (F) La duramadre se retira revelando una corteza prístina. Pial vasculatura es de color rojo brillante con manchas no presentes. Tenga en cuenta los trozos sueltos de duramadre color blanco en los bordes de la ventana craneal. En este ejemplo, se produjo una hemorragia dural menor en la parte posterior de la ventana del cráneo, que rápidamente se coagula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Los patrones únicos y Consenso de activación durante múltiples formas de estimulación sensorial. < / strong> (A) Representación esquemática de la craneotomía unilateral que muestra las regiones corticales de imágenes. (B) Fotomicrografía de la amplia craneotomía unilateral con bregma indicado por un círculo blanco en cada imagen. Los patrones de activación cortical se muestran en un ratón anestesiado con isoflurano (0,5%) después de (i) la estimulación (Stim) de la barba C2 contralateral, (ii) la estimulación auditiva, (iii) la estimulación de la extremidad anterior contralateral, (iv) estimulación miembro posterior contralateral y (v) la estimulación visual del ojo contralateral con un diodo (LED) emisores de luz. No había activación de la línea media después de todas las formas de estimulación sensorial (flechas blancas) en 10 - 25 ms después de la activación corteza sensorial primaria. Las respuestas son la media de 20 ensayos. La imagen segunda desde la izquierda en la segunda fila (II) indica el anterior (A), posterior (P), medial (M) y lateral (L). Modificado con permiso de Mohajerani, et al., 2013.p_upload / 52642 / 52642fig3large.jpg" target = '_ blank'> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo innovador para una gran ventana craneal permite imágenes simultáneas sobre las áreas temporal y parietal de la corteza cerebral. Combinado con formación de imágenes ópticas, se puede ayudar a revelar la dinámica neurales dentro de las áreas corticales durante la actividad espontánea y estímulo-inducida. Este craneotomía expansiva también expone una gran extensión de la red vasculatura cortical, incluyendo el extremo proximal de la arteria cerebral media (MCA), permitiendo de imágenes in vivo del flujo sanguíneo y la manipulación directa de los vasos laterales para modelos isquémicos. Esta técnica será de gran utilidad para las líneas desarrolladas recientemente de ratones que expresan proteínas indicador de calcio de tensión y 23. Estos ratones ofrecen la ventaja práctica de pasar por alto la necesidad de una incubación de tintes sensibles al voltaje en la corteza. Estos colorantes extrínsecos toman tiempo para penetrar adecuadamente el tejido cerebral (~ 60 - 90 min) y están limitados por su toxicidad leve. También tienen grandes craneotomíasPreviamente utilizado para estudiar el cerebro de rata en desarrollo con VSDI [ 11] . Ratas recién nacidas tienen una cabeza mucho más grande y es comparable en tamaño con ratones adultos. Esto ofrece a los investigadores una oportunidad única para estudiar los problemas de desarrollo en neurociencia, aunque no con ratones transgénicos.

Las principales limitaciones de este método son la incapacidad para experimentos crónicos. La curvatura del cráneo hace que el proceso de perforación sea más difícil y más lento que las craneotomías más pequeñas. Para esta gran craneotomía, es vital posicionar la cabeza con los puntos centrales de sutura y squamosal para que sean paralelos al plano de enfoque de la lente. Mientras que se espera una cierta distorsión del cerebro de la curvatura del cerebro, éstos se superan centrándose en las capas superficiales de la corteza. Este problema se alivia adicionalmente obteniendo numerosas repeticiones de estimulación y promediado. En resumen, nuestra gran técnica de craneotomía es ampliamente aplicadalicable para el estudio de los problemas actuales en neurobiología.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por una Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) Descubrimiento de Grant # 40352, Campus de Alberta por Presidente del Programa Innovación, Programa de Investigación de Alzheimer Alberta a MHM, y CRSNG crear en BIF beca de doctorado y AIHS beca de postgrado en MK. Agradecemos a Pu Min Wang para el desarrollo de este protocolo y para el entrenamiento quirúrgico y Behroo Mirza Agha y Di Shao para la cría.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heating Pad FHC 40-90-2
Fine Scissors Fine Science Tools 14058-09
Forceps  Fine Science Tools 11251-35 2 or more pairs are recommended
Spring scissors Fine Science Tools 15000-00, 15000-10 1 pair should be designated for dura removal 
Jet tooth shade powder LANG Dental Jet Tooth Shade Powder to be mixed with the Jet Liquid
Jet tooth shade liquid LANG Dental Jet Tooth Shade Liquid to be mixed wihth the Jet Powder 
Drill Heads - Carbide Burs FG 1/4 389 Midwest Dental 385201
Agarose Powder Sigma-Aldrich A9793
Gelfoam Sinclair Dental Canada Pfizer Gelfoam
Isoflurane Western Drug Distribution Centre Ltd 124125
Lidocaine 2% Epinephrine Western Drug Distribution Centre Ltd 125299
Dexamethazone 5 mg/mL Western Drug Distribution Centre Ltd 125231
Butyl cyanoacrylate glue (VetBond) Western Drug Distribution Centre Ltd 12612

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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