דור של Lymphocytic microparticles וזיהוי של Proapoptotic השפיעו על תאי אפיתל Airway

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

microparticles Cell-לשפוך קרום (חברי פרלמנט) הוא שלפוחית ​​ביולוגית פעילה שיכול להיות מבודדת ואפקטי pathophysiological נחקרו בדגמים שונים. כאן אנו מתארים שיטה ליצירת חברי פרלמנט הנגזרים מלימפוציטים מסוג T (LMPs) ועבור הוכחת השפעת proapoptotic בתאי האפיתל בדרכי נשימה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yang, C., Xiong, W., Qiu, Q., Tahiri, H., Gagnon, C., Liu, G., Hardy, P. Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (96), e52651, doi:10.3791/52651 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

העניין בתפקידים הביולוגיים של שלפוחית-נגזר קרום תא בתקשורת תאי תאים גדל בשנים האחרונות. Microparticles (חברי פרלמנט) הוא סוג אחד כזה של שלפוחית, הנע בקוטר מ 0.1 מיקרומטר עד 1 מיקרומטר, ולשפוך בדרך כלל מקרום הפלזמה של תאים האיקריוטים עוברים הפעלה או אפופטוזיס. כאן אנו מתארים את הדור של microparticles-נגזרים הלימפוציטים T (LMPs) מתאי T CEM אפופטוטיים מגורה עם actinomycin LMPs ד מבודד באמצעות תהליך רב שלבי צנטריפוגה ההפרש ומאופיין באמצעות cytometry זרימה. פרוטוקול זה גם מציג שיטת זיהוי מוות של תאים באתר עבור הוכחת השפעת proapoptotic של LMPs על תאי האפיתל הסימפונות נגזרים מexplants העכבר עיקרי הנשימה הסימפונות רקמה. שיטות שתוארו במסמך זה מספקים הליך שחזור לבידוד כמויות שופעות של LMPs לימפוציטים אפופטוטיים במבחנה. LMPs נגזרבאופן זה ניתן להשתמש כדי להעריך את המאפיינים של דגמי מחלה שונים, ולפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה בדיקות. בהתחשב בכך שאפיתל דרכי הנשימה מציע מכשול פיזי ופונקציונלי הגנה בין הסביבה החיצונית והרקמה בסיסית, שימוש בexplants רקמת הסימפונות ולא שורות תאי אפיתל הונצחו מספק מודל אפקטיבי לחקירות הדורשות רקמות בדרכי נשימה.

Protocol

הערה: זכר C57BL / 6 עכברים (5-7 שבועות) הם מצ'ארלס ריבר מעבדות International, Inc (St-קבוע, קוויבק, קנדה.) ומניפולציות על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת בעלי החיים Sainte-ג'סטין CHU Care. explants רקמת הסימפונות העכבר מספק מקור טוב לתאי האפיתל הסימפונות ראשיים לחקירת השפעות proapoptotic של LMPs על תאי האפיתל. פרוטוקול זה מתאר את הדור במבחנה של LMPs, כמו גם שיטה לגילוי תאי האפיתל אפופטוטיים בexplants רקמת הסימפונות טופל LMPs. פרוטוקול זה כולל 3 חלקים.

1. LMPs ייצור ואפיון

הערה: כדי למנוע זיהום, לוודא שכל החומרים המשמשים בניסוי זה הם סטרילי או autoclaved. לבצע את כל השלבים בRT בארון בטיחות ביולוגי בתנאי סטרילי, אלא אם צוין אחרת.

1.1) גירוי ואוסף של חברי פרלמנט9

  1. להפשיר aliquot של 10 מיליון תאי CEM T באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לדלל ב 10 מיליליטר מראש חימם בינוני hematopoietic כגון X-VIVO, בשפופרת 15 מיליליטר סטרילי וצנטריפוגות ב 200 GX 5 דקות סרום ללא. לשאוב את תאי supernatant ו resuspend ב 5 מיליליטר בינוני מחומם מראש.
  2. העברת תאים לתוך בקבוק רקמות T75 תרבות (לתאי השעיה) עם 15 מיליליטר בינוני מחוממת מראש hematopoietic כגון X-VIVO ודגירה של 4 ימים בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  3. לאחר 4 ימים, להעביר את כל מדיום התרבות ותאים לתוך בקבוק תרבית רקמת T175 המכיל 100 מיליליטר בינוני טרי. להמשיך דוגרים התאים לכ -72 שעות באותם תנאים עד שהם גדלו לצפיפות של 2 מיליון תאים / מיליליטר.
  4. באופן שווה לפצל תאים בין ארבע צלוחיות T175 כל מדיום המכיל 150 מיליליטר טרי ולהמשיך תרבית תאים עד תאים גדלו (כ 48 דגירה hr) לצפיפות של 2 מ'/ מיליליטר.
  5. 6 תאים לתוך בקבוק T175 חדש המכיל 150 מיליליטר בינוני טרי, כדי לשמור על 2 מ'/ צפיפות תאי מיליליטר.
  6. להוסיף actinomycin D (מומס DMSO ב2 מ"ג / מיליליטר) למדיום בריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ו דגירה של 24 שעות.
  7. להעביר את כל התרבות הבינוני לתוך צינורות חרוטי 50 מיליליטר ולסובב את התאים ב 750 XG במשך 5 דקות. מעביר את supernatant לצינורות 50 מיליליטר ו צנטריפוגות חרוטי ב 1500 XG במשך 15 דקות כדי להסיר שברי תאים גדולים.
  8. מעביר את supernatant לתוך בקבוק 250 מיליליטר וultracentrifuge ב XG 12,000 למשך 50 דקות. בטל supernatant ולאסוף כדורים.
  9. לשטוף LMPs מועשר כדורים עם PBS 40 מיליליטר סטרילי בשפופרת 50 מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב XG 12,000 למשך 50 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים.
  10. לאסוף את supernatant לשטוף האחרון; הוא ישמש כשליטה ברכב. להשעות את כדורי LMPs ב 1מיליליטר של PBS ולהעביר לתוך microtube סטרילי 1.5 מיליליטר. LMPs המבודד Aliquot ולאחסן ב -80 ° C (כדי למנוע מחזורים חופשי הפשרה מרובות).

1.2) אפיון של חברי פרלמנט באמצעות ניתוח FACS 4

  1. הכן 2 דגימות של חיץ Annexin, 1 ובמשנו ללא CaCl 2: Hepes 10 מ"מ, 140 מ"מ NaCl, פלוס או מינוס 5 מ"מ CaCl 2.
  2. סנן חיץ Annexin ונוזל זרימת נדן FACS באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים.
  3. לדלל 1 μl של LMPs ב -44 μl של חיץ Annexin עם 5 מ"מ CaCl 2 לתוך צינור FACS. הכן צינור אחר עם 1 μl של LMPs ב -44 μl של חיץ Annexin ללא CaCl 2 (שליטה שלילית).
  4. הוסף 5 μl של annexinV-Cy5 בצינור אחד ומערבבים היטב. דגירה במשך 15 דקות ב RT בחושך. לעצור את התגובה על ידי דילול התערובת עם 400 μl של נוזל זרימת נדן FACS בצינור אחד.
  5. הוסף 10 μl (200,000 חרוזים) של bea הספירה 7 מיקרומטרהשעיה ds כסטנדרט פנימי בצינור אחד כדי להשיג ספירה מוחלטת.
  6. הקמת שערים של גודל יחסי (FSC-H, PMT E00, להיכנס בקנה מידה) וגרעיניות היחסית (SSC-H, PMT 325, להיכנס בקנה מידה) עלילת נקודה על cytometer הזרימה באמצעות חרוזי ניאון-מכויל גודל של 1 מיקרומטר (שער 1) ו ספירת שער חרוזים בשעה 7 מיקרומטר (שער 2).
  7. לנתח את מדגם LMPs על עלילה / SSC-H FSC-H באמצעות השערים שהוקמו וFL-4 ערוצים לAnnexin (PMT 765, להיכנס בקנה מידה) עלילת נקודה, על ידי רכישת אות עד 20,000 חרוזים ספירה הם הגיעו בשער 2.
  8. לקבוע את אירועי annexinV החיוביים של LMPs במאגר Annexin מכיל CaCl 2, וכך להפחית את האירועים של LMPs במאגר Annexin ללא CaCl 2 (שליטה שלילית).
  9. לחשב את מספרם המוחלט של חברי פרלמנט המבוססים על המשוואה הבאה:
    משוואת 1

1.3) קביעת MP Pריכוז rotein (רדפורד Assay)

  1. הכן 5 דילולים סידוריים של תקן 1.25-20 מיקרוגרם / מיליליטר חלבון. פיפטה 800 μl של כל פתרון סטנדרטי ומדגם לתוך מבחנה נקייה בשני עותקים. הוסף 200 μl של מגיב ברדפורד צבע לכל צינור. מערבבים היטב, ולאחר מכן לדגור על RT במשך 5 דקות.
  2. למדוד הספיגה ב 595 ננומטר. קבע את ריכוז החלבון של LMPs באמצעות רגרסיה ליניארית של עקומה סטנדרטית.

2. Explants רקמות הסימפונות וLMPs טיפול

הערה: שים לב מיוחד לסביבת העבודה סטרילית, וסביבה נקיה מחיידקים להכין את הפתרונות ובינוניים המשמשים בניסויים הבאים. כדי להכין את Complete הריפוי בינוני, להוסיף 1 מיליליטר של רקמות תוספי בינוניים ריפוי עם סרום (מופשר על קרח) 100 מיליליטר רקמות ריפוי בינוני ומערבבים היטב.

2.1) הכנת Explants רקמות הסימפונות

  1. לפני culturing, לגרד 6 אזורים של 1 סנטימטר 2כל אחד בקצה של פני השטח של כל מנה תרבית רקמת 100 מ"מ עם להב סכין מנתחים. מעיל כל גרד 100 צלחת תרבית רקמת מ"מ עם 2 מיליליטר של פתרון ציפוי המנה התרבות, ודגירת הצלחת בO חממת humidified CO 2 / N על 37 מעלות צלזיוס. אבק לשאוב את הפתרון העודף ולמלא את הצלחת עם 15 מיליליטר של כביסה רקמות בינונית.
  2. להרדים C57BL / 6 עכברים (5-7 שבועות) משאיפת CO 2 על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת האתיקה טיפול בבעלי החיים.
  3. הסביבה נקיה מחיידקים לנתח רקמת ריאה עם אזמל, פינצטה סופר בסדר דומון, ומספריים כירורגיות. מוציא בזהירות כלי parenchyma ודם. הנח רקמת ריאה לכביסה בינוני רקמות קרות כקרח להובלה למעבדה, אם ישים.
  4. בהמשך לנתח הסמפונות שקועות בכביסת רקמות בינונית ולהפריד את הסמפונות בקוטר של 1 עד 2.5 מ"מ מרקמות ריאה היקפית. רקמות הסימפונות Slice לטבעות ~ 5 מ"מ עובי הסימפונות עם אזמל. השתמש בתנועה גורף עם המלקחיים המעוקלים microdissecting סטרילי כדי להרים את שברי הסימפונות ולמקם אותם על האזורים השרוט של המנות.
  5. הסר את כביסה רקמות בינונית, ודגירה שברים בRT ל~ 5 דקות, כדי לאפשר להם לדבוק במנות.
  6. הוסף 10 מיליליטר של שלם ריפוי בינוני לכל מנה ולמקם אותם בתא חממת מודולרי אווירה מבוקרת. רוקן את החדר עם תערובת גבוהה O 2 גז (70% O 2, 25% N 2, 5% CO 2,). מניחים את החדר בחממה מסלולית benchtop ולנער אותו על 37 מעלות צלזיוס. לנער את התא למשך 24 שעות ב 10 מחזורים לדקה על מנת לאפשר למדיום לזרום לסירוגין על שברים.
  7. אחרי 24 שעות דגירה, להתבונן explants הרקמה תחת מיקרוסקופ אור שלב בניגוד הפוכה. בחר explants הסימפונות עם, תנועה שלמה קנס שיער ואפיתל הסימפונות התוסס לטיפול LMPs שלאחר מכן.

2.2) LMPs טיפול

  1. הכן מדיום גידול מוחלט כדלקמן: תוספי מדיום גידול הפשרה עם מעכב סרום ופיברובלסטים על קרח. הוסף 1 מיליליטר של תוספי מדיום גידול עם סרום ו -200 מעכב פיברובלסטים μl לשל מדיום גידול של 100 מיליליטר; מערבב היטב. לחמם את מדיום גידול המוחלט על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני השימוש.
  2. לדלל LMPs המבודד בצינור Eppendorf סטרילי חדש עם PBS להכין מניית LMPs בריכוז של 800 מיקרוגרם / מיליליטר.
  3. הוסף 0.5 מיליליטר של צמיחה בינונית מלאה היטב בכל צלחת תרבית רקמת 12 גם.
  4. העבר את explants הסימפונות נבחר עם המלקחיים microdissecting המעוקלים מהפרוטוקול הקודם (סעיף 2.1) היטב בכל הצלחת בתרבית הרקמה.
  5. תווית צלחת התרבות כראוי לזהות בארות טיפול LMPs ובארות שליטה. הוסף 25 מניות LMPs μl לכל טיפול LMPs היטב (לריכוז סופי של 40 מיקרוגרם / מיליליטר) ו -25 כלי רכב שליטת μl (ראה LMP של ייצור) לבארות שליטה.
  6. המשך הדגירה בתא חממת מודולרי אווירה מבוקרת על 37 מעלות צלזיוס עם רעד עדין.
  7. לאחר 24 שעות, לשטוף explants 3 פעמים עם PBS ולהמשיך ל( קיבעון 4 paraformaldehyde% [PFA]) השלב הבא.

3. Histopathological בחינה

3.1) הכן את הפתרונות הבאים לפני שתמשיכו לשלבים הבא

  1. הכן חיץ PBS 1x ידי ערבוב 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na 2 4 HPO, 1.76 מ"מ KH 2 PO 4, pH 7.4.
  2. כדי להכין 4% PFA, לפזר 20 גרם של PFA ב400 מיליליטר של מים, מחומם על 60 ° C עם ערבוב; להוסיף כמה טיפות של 10 M NaOH כדי לנקות את הפתרון. הבא להוסיף למאגר PBS 1x ולהתאים את עוצמת הקול עד 500 מיליליטר ו- pH 7.4. מסנן וaliquot; לאחסן ב -20 ° C.
  3. הכן את חומרים כימיים התייבשות או התייבשות הבאה; 100%, 90%, 70%, 50% אתנול ו קסילן.
e_step "> 3.2) explant קיבוע ורקמות סעיף Deparaffinization

  1. מניחים כל explant בצינור microcentrifuge שכותרתו עם 1.5 מיליליטר של PFA 4% ו דגירה O / N ב 4 מעלות צלזיוס. יש לשטוף את explants פעמיים עם PBS 1x.
  2. ליבש explants באמצעות סדרת אלכוהול (אתנול 70%: 3 פעמים 30 דקות כל אחד, 90% אתנול: 2 פעמים 30 דקות כל אחד, 100% אתנול: 3 פעמים 30 דקות כל אחד, ואז קסילן: 3 פעמים 20 דקות כל אחד). לבצע את כל השלבים בRT במנדף.
  3. להשתיל explants הרקמה בפרפין על 58 מעלות צלזיוס בתנור. הכן 5 מיקרומטר סעיפי רקמות עבים באמצעות microtome סיבובי.
  4. לצוף החלקים באמבט המים C ° 56, ולאחר מכן להתקין את החלקים על גבי שקופיות היסטולוגית שכותרת. מניחים את השקופיות במדפי צביעה ידניות ויבש על 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. אפשר השקופיות כדי לקרר בRT.
  5. טובלים את המדפים ב 4 מנות כתם רצופות המכילות קסילן במשך 10 דקות כל אחד כדי להסיר פרפין. טובלים את המדפים בסדרת אתנול להסיר קסילן: 100%, אז 95%, הen 80%, אז 70%, אז 50% אתנול (5 דקות לכל שלב). יש לשטוף את המדפים במים ברז למשך 5 דקות כדי להסיר אתנול.

3.3) Hematoxylin ו Eosin (H & E) מכתים

  1. להמשיך לעבוד עם קטעי רקמה הקבועים; הנח את המדף לתוך צלחת מלאה בכתמים Hematoxylin מאיר במשך 15 דקות. יש לשטוף את המדף במים ברז כדי להסיר Hematoxylin עבור 20 דקות.
  2. מניחים במים מזוקקים למשך 30 sec.Place באתנול 95% למשך 30 שניות. מניחים בצלחת מכתים פתרון Eosin Y דקות 1. ליבש באמצעות 2 שינויים של 95% אתנול, 100% אתנול, וקסילן עבור 2 דקות כל אחד.
  3. לבצע בדיקה מהירה תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שeosin העודף מוסר. מניחים 2-3 טיפות של מדיום הרכבה (פישר SP15-100) על כל שקופית, ואז לכסות עם מכסה זכוכית.

3.4) בתא Situ מוות איתור: Assay TUNEL

  1. לפני שיתחיל, להכין פתרון K proteinase עבודה: 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב10 מ"מ טריס / HCl, pH 7.4.
  2. חזור על שלבי 1 עד 5 מתוך סעיף 3.2 (קיבעון explant וdeparaffinization סעיף רקמות). יש לשטוף את השקופיות עם deionized H 2 O.
  3. לטבול את השקופיות עם 1x PBS במשך 10 דקות. מסננים את PBS העודף. דגירה סעיפי רקמות למשך 30 דקות ב RT עם פתרון עובד proteinase K. יש לשטוף את שקופיות פעמיים עם 1x PBS.
  4. בצע את assay TUNEL כפי שמתואר בחוברת הוראות ההפעלה של ערכה לגילוי מוות של תאים. הר באמצעות הרכבה בינונית, וcoverslip ידני עם coverslips זכוכית.
  5. ניתוח דגימות תחת מיקרוסקופ אור. השתמש בתמונת Pro 4.5 לנתח את התאים אפופטוטיים בצבע חום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LMPs אופיינו עם Annexin V צביעה 10 על ידי תא הקרינה המופעל מיון ניתוח (FACS) ונשלטים באמצעות 1 מיקרומטר חרוזים שבי 97% מחברי הפרלמנט (≤1 מיקרומטר) היו חיובי Annexin-V-Cy5 (איור 1 א ו -1 B). בדרך כלל, כ -2.5 מ"ג של LMPs התקבל בעקבות פרוטוקול זה. explants רקמת הסימפונות מעכברי C57BL / 6 היו נתונים לרכב וטיפול LMPs. ניתוח Histopathological סעיפים הסימפונות חשף את ההשפעה של LMPs על השלמות המבנית של האפיתל הסימפונות. בexplants שליטה, אפיתל הסימפונות היה במידה רבה ניזוק (איור 2 א); עם זאת, בexplants טופל LMPs, שכבת תאי אפיתל השטחית נפגעה או איבדה, והיו ירידה משמעותית בגובה תאי אפיתל וצפיפות (איור 2). מכתים TUNEL-חיובי (סמן של אפופטוזיס) היה בולט יותר באפיתל הסימפונות טופל LMPs בהשוואה לקבוצת ביקורת (

איור 1
איור 1. זרימה cytometry הניתוח של חברי פרלמנט הנגזרים משורת תאי CEM T. (א) קביעת קדימה (FSC) וצד הפיזור (SSC) מאפיינים עם 1 מיקרומטר חרוזים המשמשים לחברי פרלמנט שער. (ב) לאירועים בשער חברי הפרלמנט הוערכו נוספים לתיוג עם Annexin V-Cy5 להבחין אירועים אמיתיים מרעש אלקטרוני , ובכך להגדיל את הספציפיות של זיהוי חברי פרלמנט. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
2. איור LMPs-induced נזק שכבת האפיתל הסימפונות. תמונות histopathological נציג epitheli הסימפונותאממ של explants טופל בשליטה (א) או (ב) LMPs (40 מיקרוגרם / מיליליטר במשך 24 שעות). חלקי explant הוכתמו Hematoxylin ו Eosin. חיצים שחורים מצביעים על שכבת האפיתל. אובדן בלתי סדיר של שכבות תאים השטחיות ובסיסיות בא לידי ביטוי בסעיפים של explants טופל LMPs הסימפונות (B). ההגדלה 400X, בר = 20 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
3. איור LMPs-induced אפופטוזיס תא אפיתל הסימפונות התאים אפופטוטיים בשכבת האפיתל של הסמפונות מגזרית היו מזוהים על ידי assay TUNEL.; חיובי תאים מוכתמים מתוארים בחום. נציג תמונות של תאי האפיתל הסימפונות בשליטה () (B) מוצגות. חיצים שחורים מצביעים על שכבת האפיתל. ההגדלה 200X (פנל עליון) ו400X (פנל תחתון), בר = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חברי פרלמנט הם מתווכים פעילים דיבורים צלב אינטר והמחקר שלהם הוא מבטיח בתחומים רבים של מדע. 11 מחקר זה הוצג פרוטוקול מפורט לדור בקנה מידה גדול במבחנה של LMPs נגזר משורת תאי T אפופטוטיים. חברי פרלמנט אלה מבטאים רפרטואר גדול של מולקולות הלימפוציטים והם מעורבים מבחינה ביולוגית בוויסות של הומאוסטזיס הסלולר ורקמות. עם זאת, LMPs המופק ממקורות שונים עשוי להיות שונה מבחינה ביולוגית. 4,9,12,13

LMPs להציג מאפיינים מגוונים בהתאם לגירויים המשמשים לייצורם במבחנה והתא שממנו הם נובעים. ככזה, אקסטרפולציה של נתונים המתקבלים במבחנה באמצעות LMPs נגזר משורות תאים הונצחו נתוני LMPs נוצרו in vivo צריכה להתבצע בזהירות.

פרוטוקול זה מתאר כמה צעדי צנטריפוגה הנדרשים לבידוד של חברי פרלמנט; לכן, גיש צורך במניפולציה areful כדי למזער את האובדן של חברי פרלמנט בתהליך זה. הקפאת Snap של LMPs המבודד ב -70 ° C מומלצת; יש לנו ציינו כי bioactivities של LMPs בתנאים אלה יכולים להישמר לתקופה של עד 2 שנים (נתונים שלא פורסמו).

עד כה, cytometry זרימה נחשב "תקן הזהב" לניתוח חברי פרלמנט. ניתוח התזרים cytometric צבעוני משמש לקביעה תת-אוכלוסיות של חברי פרלמנט ממקורות סלולריים שונים. עם זאת, זרימת cytometers זמין מסחרי הנוכחי מוגבלים ביכולתם לנתח אוכלוסיות חברי פרלמנט קטנות יותר בגודל (פחות מ -300 ננומטר) ולהבחין בין הפסולת הסלולרית וחברי הפרלמנט. בנוסף, ניתוח FACS (ניתוח cytofluorimetric) עשוי להיות שיטה חלופית לassay TUNEL לספור תאים אפופטוטיים לניתוח סטטיסטי.

כאן, אנו מראים כי explants הסימפונות תרבותיים לשעבר vivo יכול לספק מקור טוב של תאי האפיתל בדרכי הנשימה fאו פרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה הקרנה. בגלל explants הסימפונות אלה דומים הסביבות הפיזיולוגיות המקוריות שלהם, הם עשויים להיות שימושיים לקביעת מסלולי איתות של מחלות הסימפונות או ריאות מסוימות. עם זאת, להשתמש explants הסימפונות רק לא הצליח לאשר את ההשפעה של אפופטוטיים LMPs על תאי האפיתל הוא נובע מישיר ו / או משני להפעלה של תאים חיסוניים תושב. כדי לחקור את ההשפעה הישירה של LMPs, תאי האפיתל בדרכי הנשימה העיקריות יהיו מתאימים למטרה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לי המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהמוסד הקנדי לבריאות מחקר (178,918), Fonds דה המשוכלל והנדיר en סנטה du קוויבק - רשת מחקר בריאות חזון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LMPs production and characterization
CEM T cells  ATCC  CCL-119
X-VIVO 15 medium  Cambrex, Walkersville 04-744Q
Flask T75 Sarstedt 83.1813.502
Flask T175 Sarstedt 83.1812.502
Actinomycin D  Sigma Chemical Co. A9415-2mg
PBS Lifetechnologies 14190-144
0.22 µm filter Sarstedt 83.1826.001
Annexin-VCy5 BD Pharmagen  559933
FACS flow solution BD Bio-sciences 342003
Fluorescent microbeads (1 µm) Molecular Probes  T8880
Polysterene counting beads (7 µm) Bangs laboratories PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes Falcon 352058
1 ml pipet Fisher 13-678-11B
5 ml pipet Falcon 357543
25 ml pipet Ultident DL-357551
1.5 ml conical polypropylene micro tube Sarstedt 72.690
15 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.554.205
50 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube Nalgene 3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle Beckman 356011
Protein assay (Bradford assay) Bio-Rad Laboratories 500-0006
Protein assay standard II Bio-Rad Laboratories 500-0007
Test tube 16 x 100 VWR 47729-576
Test tube 12 x 75 Ultident 170-14100005B
Cell incubator  Mandel Heracell 150
Low speed centrifuge IEC Centra8R
High speed centrifuge Beckman Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle Beckman JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube Beckman JA30.50
Fow cytometry  BD Bio-sciences FACS Calibur
Spectrophotometer Beckman Series 600
Bronchial tissue explants and sections 
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)   Charles River Laboratories, Inc. 
Mouse Airway PrimaCell™ System: CHI Scientific, Inc. 2-82001
 Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades Becton Dickinson AcuteCare 371310 #10
Scalpel Handle Fine Science Tools Inc.  10003-12 #7
phase-contrast inverted microscope Olympus Optical CO., LTD.    CK2
high O2 gas mixture  VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber Billups-Rothenberg Inc. MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker Barnstead Lab-Line,  SHKA4000-7
12-well tissue culture plate Becton Dickinson and Company 353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm) Sarstedt, Inc. 83.1802
Surgical scissors Fine Science Tools Inc.  14060-09 Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps Fine Science Tools Inc.  11052-10
humidified CO2 incubator Mandel Scientific Company Inc.  SVH-51023421
 Histopathological examination 
formalin formaldehyde Sigma-Aldrich, Inc.  HT5011
paraffin Fisher scientific  International, Inc. T555
ethyl alcohol Merck KGaA, Darmstadt EX0278-1
 glutaraldehyde  Sigma-Aldrich, Inc.  G6403
Cacodylate Sigma-Aldrich, Inc.  31533
microscope slides VWR Scientific Inc.  48300-025 25x75 mm
Xylene Fisher scientific  International, Inc. X5-4
Mayer's hematoxylin Sigma-Aldrich, Inc.  MHS16 Funnel with filter paper  
HCl  Fisher scientific  International, Inc.   A144s-500
eosin  Sigma-Aldrich, Inc.  HT110116 Funnel with filter paper  
Permount™ Mounting Medium Thermo Fisher Scientific Inc.  SP15-100
glass coverslip surgipath medical industries, Inc. 84503 24×24 #1 
TUNEL detection kit In Situ Cell Death Detection, POD 11 684 817 910
oven Despatch Industries Inc. LEB-1-20
rotary Microtome Leica Microsystems Inc. RM2145
filter paper Whatman International Ltd. 1003150 #3
Microscope Nikon Imaging Japan Inc. E800
staining dish complete Wheaton Industries, Inc. 900200 including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube Sarstedt Inc.  72.69 39x10 mm
Orbital and Reciprocating Water Bath ExpotechUSA ORS200
phosphate buffered saline   GIBCO 14190-144
fume hood Nicram RD Service 3707E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, (1), 4-9 (2011).
  2. Martinez, M. C., Tual-Chalot, S., Leonetti, D., Andriantsitohaina, R. Microparticles: targets and tools in cardiovascular disease. Trends Pharmacol Sci. 32, (11), 659-665 (2011).
  3. Benameur, T., Andriantsitohaina, R., Martinez, M. C. Therapeutic potential of plasma membrane-derived microparticles. Pharmacol Rep. 61, (1), 49-57 (2009).
  4. Yang, C., et al. Lymphocytic microparticles inhibit angiogenesis by stimulating oxidative stress and negatively regulating VEGF-induced pathways. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 294, (2), 467-476 (2008).
  5. Yang, C., Gagnon, C., Hou, X., Hardy, P. Low density lipoprotein receptor mediates anti-VEGF effect of lymphocyte T-derived microparticles in Lewis lung carcinoma cells. Cancer Biol Ther. 10, (5), 448-456 (2010).
  6. Angelillo-Scherrer, A. Leukocyte-derived microparticles in vascular homeostasis. Circ Res. 110, (2), 356-369 (2012).
  7. Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. J Immunol. 178, (12), 8090-8096 (2007).
  8. Qiu, Q., Xiong, W., Yang, C., Gagnon, C., Hardy, P. Lymphocyte-derived microparticles induce bronchial epithelial cells' pro-inflammatory cytokine production and apoptosis. Mol Immunol. 55, (3-4), 220-230 (2013).
  9. Martin, S., et al. Shed membrane particles from T lymphocytes impair endothelial function and regulate endothelial protein expression. Circulation. 109, (13), 1653-1659 (2004).
  10. Shet, A. S., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102, (7), 2678-2683 (2003).
  11. Mause, S. F., Weber, C. Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange. Circ Res. 107, (9), 1047-1057 (2010).
  12. Yang, C., et al. Anti-proliferative and anti-tumour effects of lymphocyte-derived microparticles are neither species- nor tumour-type specific. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  13. Soleti, R., et al. Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors. Carcinogenesis. 30, (4), 580-588 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics