気道上皮細胞上でのアポトーシス促進効果のリンパ球微粒子および検出の生成

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Immunology and Infection

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Summary

細胞膜小屋微粒子(MPS)を単離し、それらの病態生理学的効果は、様々なモデルで研究することができるアクティブな生物学的な小胞である。ここでは、Tリンパ球(のLMP)由来のMPを生成する気道上皮細胞に対するアポトーシス促進効果を実証するための方法を記載する。

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Yang, C., Xiong, W., Qiu, Q., Tahiri, H., Gagnon, C., Liu, G., Hardy, P. Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (96), e52651, doi:10.3791/52651 (2015).

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Abstract

細胞間コミュニケーションにおける細胞膜由来の小胞の生物学的役割への関心が近年増加している。微粒子(MPは)は0.1μm〜1μmの直径の範囲の、小胞のような一種類であり、そして典型的に活性化またはアポトーシスを起こして、真核細胞の細胞膜から脱落。ここでは、D.のLMPアクチノマイシンで刺激しアポトーシスCEM T細胞からTリンパ球由来の微粒子(のLMP)の生成が多段階分画遠心法によって単離し、フローサイトメトリーを使用して特徴づけられる記述する。このプロトコルはまた、マウス初代呼吸気管支組織外植片から派生気管支上皮細胞上のLMPのアポトーシス促進効果を実証するための、その場で細胞死検出法を提案する。本明細書に記載の方法は、in vitroでのアポトーシスリンパ球からのLMPの豊富な量を単離するための再現可能な手順を提供する。のLMPは、導出このように様々な疾患モデルの特性を評価するために使用され、薬理学および毒性試験のためにすることができる。気道上皮は、外部環境と下層組織との間に保護物理的および機能的なバリアを提供することを考慮すると、気管支組織外植片ではなく、不死化上皮細胞系の使用は、気道管組織を必要とする研究のための有効なモデルを提供する。

Protocol

注:男性C57BL / 6マウス(5-7週齢)をチャールズ·リバー·ラボラトリーズインターナショナル社(セント·コンスタント、ケベック州、カナダ)からのものであり、CHUサントジャスティン動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って操作。マウス気管支組織外植片は、上皮細胞上のLMPのアポトーシス促進効果を調査するための主要な気管支上皮細胞の良い情報源を提供する。このプロトコルは、のLMP のインビトロ発生、ならびにLMPで処理した気管支組織外植片におけるアポトーシス上皮細胞を検出するための方法を記載する。このプロトコルは、3つのセクションで構成されています。

1.のLMP産生および特徴

注:汚染を防止するために、この実験で使用されるすべての材料は滅菌されているか、オートクレーブしていることを確認してください。特に断りのない限り、無菌状態の下で生物学的安全キャビネット内で室温ですべての手順を実行します。

1.1)刺激とMPのコレクション9

  1. 37℃の水浴1000万CEM T細胞のアリコートを解凍する。 10ミリリットルで希釈し、予め温めた無血清200 GX 5分で15ミリリットル滅菌チューブと遠心分離機で、例えばX-VIVOのような造血中。予め温め培地5mlの上清と再懸濁細胞を吸引除去する。
  2. このようなX-VIVOとして予め温め造血媒体15 mlの(懸濁細胞)T75組織培養フラスコに細胞を移し、5%CO 2で37℃で加湿インキュベーター中で4日間インキュベートする。
  3. 4日後、100mlの新鮮な培地を含有するT175組織培養フラスコ中にすべての培地および細胞を移す。彼ら200万細胞/ mlの密度に成長するまで、同じ条件下で約72時間細胞をインキュベートし続ける。
  4. 均等に4 T175フラスコをそれぞれ含む150ミリリットルの新鮮な培地と細胞を2万個/ mlの密度まで(約48時間のインキュベーション)に成長するまで、細胞培養を継続する間にセルを分割する。
  5. 6個の細胞を懸濁します。
  6. を0.5μg/ mlの最終濃度で培地に(2 mg / mlのでDMSOに溶解)アクチノマイシンDを添加し、24時間インキュベートする。
  7. 50ミリリットルコニカルチューブにすべての培養液を移し、5分間750×gで細胞をスピンダウン。大細胞断片を除去するために15分間1500×gで50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に上清を移し。
  8. 50分間12000×gで250ミリリットルボトルと超遠心機に上清を移し。上清を捨て、ペレットを収集します。
  9. 洗浄50分間12000×gで遠心分離によって50mlチューブ中で40 mlの滅菌PBSにペレットのLMPが富化。二回、この手順を繰り返します。
  10. 最後の洗浄上清を収集。車両の制御に使用される。 1でのLMPペレットを一時停止mlのPBSと1.5 mlの滅菌マイクロチューブに移す。アリコートとストア(複数の空き融解サイクルを避けるために)-80℃でのLMPを単離した。

FACS分析4を介してMPの1.2)キャラクタリゼーション

  1. のCaCl 2なしで2アネキシンバッファのサンプル、1とし、別のを準備します。ヘペスが10mM、NaClが140 mMの、プラスマイナス5のCaCl 2。
  2. 粒子を除去するために0.22μmのフィルターを用いてアネキシンバッファおよびFACSフローシース流体をフィルタ。
  3. FACSチューブに5 mMのCaCl 2をアネキシンバッファー44μlの中のLMPの1μLに希釈する。のCaCl 2なしアネキシンバッファの44μL(陰性対照)でのLMPの1μlの別のチューブを準備します。
  4. 各チューブにアネキシンV-Cy5での5μlを加え、よく混ぜる。暗所でRTで15分間インキュベートする。各チューブ内FACSフローシース液の400μlのミックスを希釈することにより反応を停止します。
  5. BEAを数える7μmの10μlの(20万ビーズ)を追加各管中の内部標準としてのds懸濁液は絶対数を取得する。
  6. 相対的な大きさのゲート(FSC-H、PMT E00、スケールログ)と相対粒度(SSC-H、PMT 325、ログスケール)のサイズ·キャリブレーション蛍光ビーズを使用して、フローサイトメーター上のドットプロットを確立さ1μm(ゲート1)と7ミクロン(ゲート2)でビーズゲートを数える。
  7. 2万カウンティングビーズがゲート2に到達するまでの信号を取得することにより、ドットプロット(ログスケール、PMT 765)アネキシンのための確立されたゲートとFL-4チャネルを使用してFSC-H / SSC-Hプロット上のLMPサンプルを分析します。
  8. のCaCl 2を含有アネキシンバッファ内のLMPのアネキシンV陽性の事象を決定し、その後のCaCl 2(ネガティブコントロール)することなく、アネキシンバッファ内のLMPのイベントを引く。
  9. 次式に基づいてMPの絶対数を計算する。
    式1

MP Pの1.3)の決定rotein濃度(ブラッドフォードアッセイ)

  1. 1.25〜20 / mlのからのタンパク質標準の5連続希釈を準備します。ピペット連で清潔な試験管に各標準と試料液を800μL。各チューブにブラッドフォード色素試薬を200μlを追加します。室温で5分間インキュベートその後、よく混ぜる。
  2. 595 nmの吸光度を測定します。標準曲線の線形回帰を使用してのLMPのタンパク質濃度を決定します。

2.気管支組織外植とのLMPトリートメント

注:無菌の作業環境には特に注意してください、そして無菌的に以下の実験に使用される溶液及び培地を調製。 、完全な治癒培地を調製100ミリリットル組織ヒーリング中に(氷上で解凍)血清を用いて組織ヒーリングミディアムサプリメントの1ミリリットルを加え、よく混ぜます。

気管支組織外植片の2.1)の準備

  1. 培養前に、1cm 2の6領域を傷つけるメスの刃で各100mmの組織培養皿の表面のエッジにそれぞれ。コートはそれぞれの培養皿のコーティング溶液2mlと100mmの組織培養皿に傷、37℃の加湿CO 2インキュベータO / Nで皿をインキュベートする。真空が余剰液を吸引し、組織洗浄​​媒体15mlで料理を埋める。
  2. 動物のケア倫理委員会によって承認されたプロトコルに従ってCO 2吸入により(5〜7週齢)C57BL / 6マウスを安楽死させる。
  3. 無菌的には、メス、デュモンスーパーファインピンセット、および外科はさみで肺組織を解剖。慎重に実質および血管を取り除く。該当する場合は、研究室への輸送のための氷冷組織洗浄媒体に肺組織を置きます。
  4. さらに組織洗浄培地中に沈め気管支を解剖し、末梢肺組織から1〜2.5ミリメートルの直径を有する気管支の分離。メスで〜5ミリメ​​ートルの厚さの気管支リングにスライス気管支組織。 気管支断片をピックアップし、料理の傷領域上に配置する無菌の湾曲したmicrodissecting鉗子ですくい運動を使用してください。
  5. 組織洗浄媒体を取り外し、それらを皿に付着させ〜室温で5分間の断片をインキュベート。
  6. 各ディッシュに完全な治癒中の10ミリリットルを追加し、制御された雰囲気モジュラーインキュベーターチャンバーに配置します。高いO 2混合ガス(70%O 2、25%N 2及び5%CO 2)を有するチャンバを洗い流す。ベンチトップ軌道インキュベーター内室を置き、37℃でそれを振る。培地フラグメント上に断続的に流れることができるように、毎分10サイクルで24時間チャンバーを振る。
  7. 24時間インキュベートした後、位相差倒立光学顕微鏡で組織外植片を観察します。完全な、細い髪の動きとその後のLMPの治療のために活発な気管支上皮と気管支植片を選択します。

2.2)のLMPトリートメント

  1. 解凍成長培地サプリメントを氷上で血清および線維芽細胞阻害剤と次のように完全増殖培地を準備します。血清及び増殖培地100mlに200μlの線維芽細胞阻害剤による成長培地サプリメントを1ml加える。完全に混合する。使用前に10分間37℃で、完全増殖培地を温める。
  2. を800μg/ mlの濃度でのLMPストックを調製するためにPBSで新しい無菌のエッペンドルフチュー​​ブに孤立のLMPを希釈する。
  3. 12ウェル組織培養プレートの各ウェルに完全な増殖培地を0.5mlを加える。
  4. 組織培養プレートの各ウェルに、前のプロトコル(2.1節)から湾曲したmicrodissecting鉗子と、選択した気管支植片を転送します。
  5. のLMP処理ウェルと対照ウェルを識別するために、適切に培養プレートにラベルを付けます。そして25μlの制御車両(40 / mlの最終濃度)を各ウェルのLMPの治療に25μLのLMPの株式を追加します(LMP S対照ウェルへの生産)。
  6. 穏やかに振盪しながら37℃で制御された雰囲気モジュラーインキュベーターチャンバー内のインキュベーションを続けます。
  7. 24時間後、PBSで外植3回洗浄し、次のステップ(4%パラホルムアルデヒド[PFA]固定)に進みます。

3.病理組織学的検査

3.1)次のステップに進む前に、次のソリューションを準備

  1. 137のNaCl、2.7のKCl、10のNa 2 HPO 4、1.76 mMのKH 2 PO 4、pHが7.4を混合して1×PBS緩衝液を準備します。
  2. 、4%PFAを調製400mlの水に20gのPFAを溶解、攪拌しながら60℃で加熱すること。解決策をクリアする10 M NaOHを数滴を追加します。次に1×PBS緩衝液を追加し、7.4に500ミリリットルとpHに音量を調整します。フィルタとアリコート。 -20℃で保存する。
  3. 以下の脱水や水分補給の試薬を準備します。 100%、90%、70%、50%エタノール及びキシレン。
e_step "> 3.2)植固定および組織節脱パラフィン

  1. 4%PFAの1.5ミリリットルで標識されたマイクロ遠心チューブ内の各植片を置き、4℃でO / Nインキュベートする。 1×PBSで2回植片をすすぐ。
  2. アルコール系を通して外植片を脱水し(70%エタノール:各3回、30分間、90%エタノール:各2回​​30分間、100%エタノール:3回30分ずつ、次にキシレン:3回20分ずつ)。ドラフト内で室温ですべての手順を実行します。
  3. オーブンで58℃のパラフィンに組織外植を埋め込む。ロータリーミクロトームを用いて5μm厚の組織切片を準備します。
  4. 56℃の水浴中で切片をフロートし、次いで標識された組織スライド上に切片をマウントする。 1時間65℃で手動染色ラックと乾燥でスライドを置きます。スライドを室温で冷却する。
  5. パラフィンを除去するために10分間、キシレンをそれぞれ含む4個の連続染色ディッシュ内のラックを浸し。目、その後、100%、95%のキシレンを除去し、エタノール系列でラックを浸し次に、80%、70%、次いで50%エタノール(各ステップで5分間)エン。エタノールを除去し、5分間水道水でラックをすすぐ。

3.3)ヘマトキシリン​​およびエオシン(H&E)染色

  1. 固定組織切片で作業を続ける。 15分間マイヤーのヘマトキシリン​​で満たされた染色皿にラックを配置。 20分間ヘマトキシリン​​を除去するために水道水でラックをすすぐ。
  2. 30秒間の95%エタノール中で30 sec.Place蒸留水に置く。 1分間のエオシンYソリューション染色皿に置きます。 2分ごとに、95%エタノール、100%エタノール、キシレン2変化を通して脱水する。
  3. 過剰エオシンが除去されることを保証するために、顕微鏡下でクイックチェックを実行します。カバーガラスでカバーした後、各スライド上に封入剤(フィッシャーSP15-100)の2から3滴を置きます。

3.4)In Situ細胞死検出の場合 :TUNELアッセイ

  1. 開始する前に、プロテイナーゼKワーキング溶液を調製:20μg/ mlの中で10mMトリス/塩酸、pHは7.4。
  2. セクション3.2(外植固定および組織切片の脱パラフィン)の5〜ステップ1を繰り返します。脱イオンH 2 Oでスライドをすすぐ
  3. 10分間1X PBSでスライドを浸し。過剰のPBSを排出します。プロテイナーゼK希釈標準溶液をRTで30分間、組織切片をインキュベートする。リンスは、1×PBSで2回スライドする。
  4. 細胞死検出キットの取扱説明書に記載されているようにTUNELアッセイを実行します。封入剤を使用してマウントし、カバーガラスを使用して手動でカバースリップ。
  5. 光学顕微鏡下でサンプルを分析します。茶色のアポトーシス細胞を分析するために4.5 Proの画像を使用してください。

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Representative Results

のLMPは(FACS)分析およびMPの97%(≤1μm)をアネキシンV-Cy5での陽性( 図1Aおよび1B)であった1μmのビーズを使用してゲート制御を蛍光活性化細胞ソーティングによって、アネキシンV染色10で特徴付けた。典型的には、のLMPの約2.5mgが、このプロトコルに従って得た。 C57BL / 6マウスからの気管支組織外植片は、車両とのLMP処理を行った。気管支セクションの組織病理学的分析は、気管支上皮の構造的完全性に対するのLMPの効果を明らかにした。対照外植では、気管支上皮は( 図2A)、主に損傷を受けていないでした。しかし、のLMP処理した外植で、表在上皮細胞層が損傷や紛失、および上皮細胞の高さと密度( 図2B)の大幅な減少があったした。 TUNEL陽性染色(アポトーシスのマーカー)(対照と比較してのLMP処理した気管支上皮でより顕著であった

図1
CEM T細胞株から派生MPのサイトメトリー分析図1.フロー。 (A)前方(FSC)および側方散乱(SSC)は、ゲートのMPに使用さ1μmのビーズとの特性の決定を。議員ゲートのイベントは、さらに電子ノイズから真のイベントを区別するために、アネキシンV-Cy5を用いた標識のために評価した(B) 、それによって議員検出の特異性を向上させることができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2.のLMP誘発性気管支上皮層の損傷。気管支epitheliの代表的な病理組織学的画像(A)対照または(B)のLMP(24時間、40μg/ mlの)で処理した外植片のウム。外植片切片を、ヘマトキシリン​​およびエオシンで染色した。黒矢印は、上皮層を指す。表在性および基底細胞層の斑状損失のLMP処理気管支植片(B)の節において明らかである。倍率400X、バー= 20μMが。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3のLMP誘発性気管支上皮細胞アポトーシス区気管支の上皮層におけるアポトーシス細胞をTUNELアッセイによって検出した陽性に染色された細胞は、茶色に示されている。コントロールの気管支上皮細胞(A)の代表的な画像(B)が示されている。黒矢印は、上皮層を指す。倍率200X(上のパネル)と400X(下のパネル)、バー= 20μM。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

MPは、細胞間のクロストークのアクティブなメディエーターであり、それらの研究は、科学の多くの分野において有望である。11本研究は、アポトーシスT細胞株由来のLMP のインビトロでの大規模生成のための詳細なプロトコルを提示した。これらのMPは、リンパ球分子の大きなレパートリーを発現し、生物学的細胞および組織の恒常性の調節に関与している。しかし、異なる供給源に由来のLMPは、生物学的に異なっていてもよい。4,9,12,13

のLMPは、in vitroでそれらを生成するために使用される刺激は、それらが由来する細胞によって異なる特性を示す。このように、 生体内で生成されたのLMPからのデータの不死化細胞株由来のLMPを使用して、in vitroで得られたデータの外 ​​挿は、慎重に行われるべきである。

このプロトコルは、国会議員の単離のために必要ないくつかの遠心分離工程を説明する。したがって、Careful操作は、このプロセス中のMPの損失を最小限にするために必要とされる。 -70℃で孤立のLMPのスナップ凍結することをお勧めします。我々は、これらの条件下でのLMPの生物活性は、最大2年(未発表データ)のために保存することができることを観察した。

現在までに、フローサイトメトリーは、MPの分析のための「ゴールドスタンダード」とみなされる。多色フローサイトメトリー分析は、異なる細胞起源からのMPの亜集団を決定するために使用される。それにもかかわらず、現在の市販のフローサイトメーターは、小さいサイズのMP集団(300nm未満)を分析し、細胞残屑およびMPの間を区別する能力に限界がある。また、FACS分析(蛍光分析)は、統計分析のために、アポトーシス細胞をカウントするためのTUNELアッセイの代替方法であり得る。

ここでは、ex vivoで培養された気管支の外植片が気道上皮細胞のfの良好な供給源を提供することができることを示してまたは薬理学および毒物学スクリーニング。これらの気管支植片が元の生理学的環境に似ているため、それらは特定の気管支または肺疾患のシグナル伝達経路を決定するのに有用であり得る。しかし、できない上皮細胞のLMPのアポトーシス効果を確認するためにだけ気管支外植片を使用するか、または/及び第二の居住者の免疫細胞の活性化に直接起因している。のLMPの直接の効果を調査するために、一次気道上皮細胞は、この目的のために適切である。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もない。

Acknowledgments

ビジョン保健研究ネットワーク - この作品は、ヘルスリサーチ(178918)、フォン·ド·RECHERCHEエンサンテケベックのカナダの研究所からの助成金によってサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LMPs production and characterization
CEM T cells  ATCC  CCL-119
X-VIVO 15 medium  Cambrex, Walkersville 04-744Q
Flask T75 Sarstedt 83.1813.502
Flask T175 Sarstedt 83.1812.502
Actinomycin D  Sigma Chemical Co. A9415-2mg
PBS Lifetechnologies 14190-144
0.22 µm filter Sarstedt 83.1826.001
Annexin-VCy5 BD Pharmagen  559933
FACS flow solution BD Bio-sciences 342003
Fluorescent microbeads (1 µm) Molecular Probes  T8880
Polysterene counting beads (7 µm) Bangs laboratories PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes Falcon 352058
1 ml pipet Fisher 13-678-11B
5 ml pipet Falcon 357543
25 ml pipet Ultident DL-357551
1.5 ml conical polypropylene micro tube Sarstedt 72.690
15 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.554.205
50 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube Nalgene 3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle Beckman 356011
Protein assay (Bradford assay) Bio-Rad Laboratories 500-0006
Protein assay standard II Bio-Rad Laboratories 500-0007
Test tube 16 x 100 VWR 47729-576
Test tube 12 x 75 Ultident 170-14100005B
Cell incubator  Mandel Heracell 150
Low speed centrifuge IEC Centra8R
High speed centrifuge Beckman Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle Beckman JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube Beckman JA30.50
Fow cytometry  BD Bio-sciences FACS Calibur
Spectrophotometer Beckman Series 600
Bronchial tissue explants and sections 
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)   Charles River Laboratories, Inc. 
Mouse Airway PrimaCell™ System: CHI Scientific, Inc. 2-82001
 Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades Becton Dickinson AcuteCare 371310 #10
Scalpel Handle Fine Science Tools Inc.  10003-12 #7
phase-contrast inverted microscope Olympus Optical CO., LTD.    CK2
high O2 gas mixture  VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber Billups-Rothenberg Inc. MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker Barnstead Lab-Line,  SHKA4000-7
12-well tissue culture plate Becton Dickinson and Company 353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm) Sarstedt, Inc. 83.1802
Surgical scissors Fine Science Tools Inc.  14060-09 Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps Fine Science Tools Inc.  11052-10
humidified CO2 incubator Mandel Scientific Company Inc.  SVH-51023421
 Histopathological examination 
formalin formaldehyde Sigma-Aldrich, Inc.  HT5011
paraffin Fisher scientific  International, Inc. T555
ethyl alcohol Merck KGaA, Darmstadt EX0278-1
 glutaraldehyde  Sigma-Aldrich, Inc.  G6403
Cacodylate Sigma-Aldrich, Inc.  31533
microscope slides VWR Scientific Inc.  48300-025 25x75 mm
Xylene Fisher scientific  International, Inc. X5-4
Mayer's hematoxylin Sigma-Aldrich, Inc.  MHS16 Funnel with filter paper  
HCl  Fisher scientific  International, Inc.   A144s-500
eosin  Sigma-Aldrich, Inc.  HT110116 Funnel with filter paper  
Permount™ Mounting Medium Thermo Fisher Scientific Inc.  SP15-100
glass coverslip surgipath medical industries, Inc. 84503 24×24 #1 
TUNEL detection kit In Situ Cell Death Detection, POD 11 684 817 910
oven Despatch Industries Inc. LEB-1-20
rotary Microtome Leica Microsystems Inc. RM2145
filter paper Whatman International Ltd. 1003150 #3
Microscope Nikon Imaging Japan Inc. E800
staining dish complete Wheaton Industries, Inc. 900200 including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube Sarstedt Inc.  72.69 39x10 mm
Orbital and Reciprocating Water Bath ExpotechUSA ORS200
phosphate buffered saline   GIBCO 14190-144
fume hood Nicram RD Service 3707E

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References

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