Generación de linfocítica micropartículas y detección de su efecto proapoptótico sobre las células epiteliales de la vía aérea

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

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Summary

Micropartículas membrana arrojar celulares (MPs) son vesículas biológicas activas que pueden ser aislados y sus efectos fisiopatológicos investigados en varios modelos. Aquí se describe un método para generar MPs derivadas de los linfocitos T (LMP) y para demostrar su efecto proapoptótico en células epiteliales de las vías respiratorias.

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Yang, C., Xiong, W., Qiu, Q., Tahiri, H., Gagnon, C., Liu, G., Hardy, P. Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (96), e52651, doi:10.3791/52651 (2015).

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Abstract

El interés en las funciones biológicas de las vesículas de membrana derivadas de células en la comunicación celular se ha incrementado en los últimos años. Las micropartículas (MP) son un tal tipo de vesículas, que varían en diámetro desde 0,1 m a 1 m, y normalmente se desprenden de la membrana plasmática de las células eucariotas se someten a la activación o la apoptosis. Aquí se describe la generación de linfocitos T derivados de micropartículas (LMP) a partir de células CEM T apoptóticas estimulados con actinomicina D. LMP están aisladas a través de un proceso de centrifugación diferencial de varios pasos y que se caracteriza por citometría de flujo. Este protocolo también presenta un método de detección in situ la muerte celular para demostrar el efecto proapoptótico de LMP en las células epiteliales bronquiales derivados de ratón explantes de tejidos bronquiales respiratorias primarias. Los métodos descritos en este documento proporcionan un procedimiento reproducible para el aislamiento de cantidades abundantes de LMP a partir de linfocitos apoptóticos in vitro. LMP derivade esta manera se puede utilizar para evaluar las características de varios modelos de enfermedad, y para la farmacología y pruebas de toxicología. Dado que el epitelio de la vía aérea ofrece una barrera física y funcional de protección entre el ambiente externo y el tejido subyacente, el uso de explantes de tejidos bronquiales en lugar de líneas de células epiteliales inmortalizadas ofrece un modelo eficaz para investigaciones que requieran tejido del tracto de las vías respiratorias.

Protocol

NOTA: Hombre C57BL / 6 ratones (5-7 semanas de edad) son de Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Canadá.) Y manipulados de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de Sainte-Justine CHU. Alfombrillas de explantes de tejidos bronquiales son una buena fuente de células epiteliales bronquiales primarias para la investigación de los efectos pro-apoptóticos de LMP en las células epiteliales. Este protocolo describe la generación in vitro de LMP, así como un método para detectar células epiteliales apoptóticas en explantes de tejidos bronquiales tratados con LMP. Este protocolo consiste en 3 secciones.

1. LMP producción y caracterización

NOTA: Para evitar la contaminación, asegurar que todos los materiales utilizados en este experimento son estériles o en autoclave. Realice todos los pasos a TA en una cabina de seguridad biológica en condiciones estériles, a menos que se indique lo contrario.

1.1) La estimulación y percepción de los diputados9

  1. Descongelar una alícuota de 10 millones de células T CEM en un baño a 37 ° C. Diluir en 10 ml pre-calentado medio libre de suero hematopoyético tales como X-Vivo, en un tubo estéril de 15 ml y centrifugar a 200 gx 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de medio de pre-calentado.
  2. La transferencia de células en un matraz de cultivo de tejido T75 (para células en suspensión) con 15 ml de medio hematopoyético precalentado como X-VIVO e incubar durante 4 días en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO 2.
  3. Después de 4 días, transferir todo el medio de cultivo y las células en un matraz de cultivo de tejidos T175 que contiene 100 ml de medio fresco. Continuar la incubación de las células durante aproximadamente 72 horas bajo las mismas condiciones hasta que han crecido hasta una densidad de 2 millones de células / ml.
  4. Células uniformemente dividido entre cuatro matraces T175 cada 150 ml de medio fresco que contiene y continuar el cultivo de células hasta que las células han crecido (aproximadamente 48 h de incubación) a una densidad de 2 millones / ml.
  5. 6 células en un nuevo frasco T175 que contiene 150 ml de medio fresco, para mantener los 2 millones / ml densidad celular.
  6. Añadir actinomicina D (disuelto en DMSO a 2 mg / ml) al medio a una concentración final de 0,5 mg / ml y se incuba durante 24 hr.
  7. Transferir todo el medio de cultivo en tubos de 50 ml cónicos y centrifugar las células a 750 xg durante 5 min. Transferir el sobrenadante a 50 ml tubos cónicos y se centrifuga a 1500 xg durante 15 min para eliminar los fragmentos de células grandes.
  8. Transferir el sobrenadante en una botella de 250 ml y ultracentrífuga a 12.000 xg durante 50 min. Descartar el sobrenadante y recoger pellets.
  9. Gránulos Wash LMPs enriquecido con PBS 40 ml estéril en un tubo de 50 ml por centrifugación a 12.000 xg durante 50 min. Repita este paso dos veces.
  10. Recoger el último sobrenadante de lavado; que se utilizará como control del vehículo. Suspender los pellets LMPS en 1ml de PBS y transferir en un 1,5 ml microtubo estéril. Alícuotas y almacenar LMP aisladas a -80 ° C (para evitar múltiples ciclos de libre deshielo).

1.2) Caracterización de los diputados mediante análisis FACS 4

  1. Preparar 2 muestras de tampón de anexina, 1 con y otro sin CaCl 2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, más o menos 5 mM CaCl 2.
  2. Filtra búfer anexina y FACS fluido envolvente de flujo usando un filtro de 0,22 micras para eliminar las partículas.
  3. Diluir 1 l de LMP en 44 l de tampón de anexina con 5 mM CaCl 2 en un tubo de FACS. Preparar otro tubo con 1 l de LMP en 44 l de tampón de anexina sin CaCl 2 (control negativo).
  4. Añadir 5 l de AnnexinV-Cy5 en cada tubo y mezclar bien. Incubar durante 15 min a TA en la oscuridad. Detener la reacción mediante la dilución de la mezcla con 400 l de FACS de fluido de funda flujo en cada tubo.
  5. Añadir 10 l (200.000 cuentas) de 7 micras conteo beasuspensión ds como estándar interno en cada tubo para obtener un recuento absoluto.
  6. Establecer puertas de tamaño relativo (FSC-H, PMT E00, escala logarítmica) y granularidad relativa (SSC-H, PMT 325, escala logarítmica) gráfico de puntos en el citómetro de flujo usando perlas fluorescentes de tamaño calibrado de 1 m (puerta 1) y que cuenta granos puerta a las 7 micras (puerta 2).
  7. Analizar la muestra LMP en FSC-H / SSC-H parcela usando las puertas establecidas y FL-4 canales para anexina (PMT 765, escala logarítmica) gráfico de puntos, mediante la adquisición de una señal de hasta 20.000 contar bolas se alcanzan en la puerta 2.
  8. Determinar los eventos AnnexinV positivos de LMP en tampón anexina contiene CaCl2, y luego restar los acontecimientos de LMP en tampón anexina sin CaCl2 (control negativo).
  9. Calcular el número absoluto de MPs en base a la siguiente ecuación:
    Ecuación 1

1.3) Determinación de MP Protein Concentración (Bradford ensayo)

  1. Preparar 5 diluciones en serie de un estándar de proteína de 1,25 a 20 mg / ml. Pipetear 800 l de cada solución patrón y la muestra en un tubo de ensayo limpio por duplicado. Añadir 200 l de reactivo de colorante de Bradford a cada tubo. Mezclar bien, a continuación, se incuba a temperatura ambiente durante 5 min.
  2. Medir la absorbancia a 595 nm. Determinar la concentración de proteína de LMP usando la regresión lineal de la curva estándar.

2. Los explantes de tejido bronquial y LMP Tratamiento

NOTA: Preste especial atención al entorno de trabajo estéril y aséptica preparar las soluciones y medio utilizados en los siguientes experimentos. Para preparar la completa curación Medium, añadir 1 ml de tejido cicatricial Mediano suplementos con suero (descongelado en el hielo) a 100 ml de Tejidos Healing mediano y mezclar bien.

2.1) Preparación de explantes de tejidos bronquiales

  1. Antes de cultivo, rayar 6 áreas de 1 cm 2cada uno en el borde de la superficie de cada 100 mm placa de cultivo de tejidos con una hoja de bisturí. Cubra cada rascó 100 mm placa de cultivo de tejidos con 2 ml de la solución de revestimiento placa de cultivo, y se incuba el plato en un incubador de CO2 humidificado O / N a 37 ° C. Vacío aspirar la solución excedente y llenar el recipiente con 15 ml de lavado de tejidos Medio.
  2. La eutanasia a C57BL / 6 ratones (5 a 7 semanas de edad) por inhalación de CO2 de acuerdo con los protocolos aprobados por el comité de ética del cuidado animal.
  3. Asépticamente diseccionar el tejido pulmonar con bisturí, pinzas Dumont super fino, y tijeras quirúrgicas. Retire con cuidado parénquima y los vasos sanguíneos. Coloque el tejido pulmonar en helada Tissue Lavado Medio para el transporte al laboratorio, en su caso.
  4. Además diseccionar bronquio sumergido en el medio de lavado de tejidos y separar el bronquio con un diámetro de 1 a 2,5 mm de tejidos pulmonares periféricos. Slice tejidos bronquiales en ~ 5 mm anillos bronquiales gruesas con un bisturí. Use un movimiento de pala con las pinzas microdissecting curvas estériles para recoger los fragmentos bronquiales y colocarlos en las áreas rayadas de los platos.
  5. Retire el medio de lavado de tejido, e incubar los fragmentos a temperatura ambiente durante ~ 5 min para permitir que se adhieran a los platos.
  6. Añadir 10 ml de la cicatrización completa de medio a cada plato y colocarlos en una cámara incubadora modular atmósfera controlada. Enjuague con la cámara de alta mezcla de gas O 2 (70% O 2, 25% de N 2 y 5% de CO 2,). Coloque la cámara en una incubadora orbital de sobremesa y agitar a 37 ° C. Agitar la cámara durante 24 horas a 10 ciclos por minuto para permitir que el medio fluya intermitentemente a través de los fragmentos.
  7. Después de 24 horas de incubación, observar los explantes de tejido bajo un microscopio óptico de contraste de fase invertida. Seleccione explantes bronquiales con movimiento completo, pelo fino y animado epitelio bronquial para el tratamiento LMP posterior.

2.2) Tratamiento LMP

  1. Preparar medio de crecimiento completo de la siguiente manera: crecimiento deshielo suplementos medianas con inhibidor de suero y fibroblastos en hielo. Añadir 1 ml de los suplementos de medio de crecimiento con suero y 200 inhibidor de fibroblastos l a 100 ml de medio de crecimiento; mezclar bien. Calentar el medio de crecimiento completo a 37 ° C durante 10 min antes de usar.
  2. Diluir LMPs aislados en un nuevo tubo eppendorf estéril con PBS para preparar una acción LMPs a una concentración de 800 mg / ml.
  3. Añadir 0,5 ml de medio completo de crecimiento a cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos.
  4. La transferencia de los explantes bronquiales seleccionados con las pinzas microdissecting curvas del protocolo anterior (sección 2.1) a cada pocillo de la placa de cultivo de tejidos.
  5. Etiqueta de la placa de cultivo apropiado para identificar pozos de tratamiento LMPS y pozos de control. Añadir 25 l de stock LMP en cada tratamiento LMPs bien (para una concentración final de 40 mg / ml) y 25 l vehículo de control (véase LMP producción s) a los pocillos de control.
  6. Continuar la incubación en una cámara incubadora modular atmósfera controlada a 37 ° C con agitación suave.
  7. Después de 24 horas, lavar explantes 3 veces con PBS y se procederá a la (fijación paraformaldehído al 4% [PFA]) siguiente paso.

3. El examen histopatológico

3.1) Preparar las siguientes soluciones antes de proceder a los próximos pasos

  1. Preparar tampón PBS 1x mezclando NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,76 mM KH 2 PO 4, pH 7,4.
  2. Para preparar 4% PFA, se disuelven 20 g de PFA en 400 ml de agua, se calentó a 60 ° C con agitación; añadir unas gotas de NaOH 10 M para borrar la solución. A continuación añadimos tampón PBS 1x y ajustar el volumen a 500 ml y el pH a 7,4. Filtro y alícuota; almacenar a -20 ° C.
  3. Prepare los siguientes reactivos de deshidratación o de rehidratación; 100%, 90%, 70%, 50% de etanol y xileno.
e_step "> 3.2) Explante Fijación y Tejidos Sección desparafinización

  1. Coloque cada explante en un tubo de microcentrífuga marcado con 1,5 ml de PFA al 4% y se incuba O / N a 4 ° C. Enjuague los explantes dos veces con PBS 1x.
  2. Deshidratar explantes a través de una serie de alcohol (etanol 70%: 3 veces 30 minutos cada uno; etanol al 90%: 2 veces 30 minutos cada uno; etanol al 100%: 3 veces 30 min cada uno, y luego xileno: 3 veces 20 min cada uno). Realice todos los pasos a TA en una campana de humos.
  3. Imbed explantes de tejidos en parafina a 58 ° C en un horno. Preparar 5 micras secciones de tejido de espesor usando un micrótomo rotatorio.
  4. Flotador las secciones en un 56 ° C baño de agua, y luego montar las secciones en portaobjetos histológicos etiquetados. Colocar los portaobjetos en bastidores de tinción manuales y seco a 65 ° C durante 1 hora. Permita que las diapositivas se enfríen a temperatura ambiente.
  5. Sumerja los bastidores en 4 platos mancha consecutivas que contienen xileno durante 10 minutos cada uno para eliminar la parafina. Sumergir los bastidores en una serie de etanol para eliminar el xileno: 100%, luego 95%, THes 80%, entonces el 70%, luego etanol al 50% (5 minutos por cada paso). Enjuague los bastidores con agua del grifo durante 5 min para eliminar el etanol.

3.3) hematoxilina y eosina (H & E) tinción

  1. Continuar trabajando con las secciones de tejido fijadas; coloque el estante en una placa de tinción de llenado con hematoxilina de Mayer durante 15 min. Enjuague la rejilla con agua del grifo para eliminar hematoxilina durante 20 min.
  2. Colocar en agua destilada durante 30 sec.Place en etanol al 95% durante 30 seg. Colocar en Eosina Y placa de tinción de solución durante 1 min. Deshidratar a través de 2 cambios de etanol 95%, etanol al 100%, y xileno para 2 min cada uno.
  3. Realice una comprobación rápida con un microscopio para asegurarse de que se elimina el exceso eosina. Coloque 2 a 3 gotas de medio de montaje (Fisher SP15-100) en cada diapositiva, luego cubra con una tapa de vidrio.

3.4) En Detección Muerte Situ Cell: Ensayo de TUNEL

  1. Antes de empezar, preparar la solución de trabajo de proteinasa K: 20 g / ml enTris 10 mM / HCl, pH 7,4.
  2. Repita los pasos 1 a 5 de la sección 3.2 (fijación del explante y la sección de deparaffinization tejido). Enjuagar los portaobjetos con desionizada H 2 O.
  3. Sumergir los portaobjetos con PBS 1x durante 10 min. Escurrir el exceso de PBS. Incubar las secciones de tejido durante 30 min a RT con solución de trabajo de proteinasa K. Enjuague desliza dos veces con PBS 1x.
  4. Lleve a cabo el ensayo de TUNEL como se describe en el manual de instrucciones de kit de detección de muerte celular. Montar utilizando medio de montaje y cubreobjetos manualmente con cubreobjetos de vidrio.
  5. Analizar las muestras en un microscopio de luz. Utilice Image Pro 4.5 para analizar las células apoptóticas en el color marrón.

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Representative Results

LMP se caracterizaron con la tinción de anexina V 10 por fluorescencia de células activadas por la clasificación análisis (FACS) y cerrada usando 1 micras cuentas en las que el 97% de los diputados (≤1 m) fueron anexina-V-Cy5 positivo (Figura 1A y 1B). Por lo general, se obtuvieron alrededor de 2,5 mg de LMP siguiendo este protocolo. Explantes de tejidos bronquiales de C57BL / 6 ratones fueron sometidos a vehículo y el tratamiento LMP. El análisis histopatológico de las secciones bronquiales reveló el efecto de LMP en la integridad estructural del epitelio bronquial. En explantes de control, el epitelio bronquial era en gran parte intacto (Figura 2A); Sin embargo, en explantes tratados con LMP, la capa de células epiteliales superficiales se daña o se pierde, y no hubo una disminución significativa en la altura de las células epiteliales y la densidad (Figura 2B). Tinción TUNEL-positivas (un marcador de la apoptosis) fue más pronunciado en el epitelio bronquial tratados con LMP en comparación con el control (

Figura 1
Figura 1. Flujo análisis de citometría de diputados derivados de línea celular CEM T. (A) Determinación del frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC) características con 1 m granos utilizados para diputados de la puerta. (B) Eventos en la puerta de los diputados se evaluaron más de marcaje con anexina V-Cy5 distinguir verdaderos eventos de ruido electrónico , lo que aumenta la especificidad de la detección diputados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. LMP-indujeron daños capa epitelial bronquial. Histopatológicos imágenes representativas de epitheli bronquialum de los explantes tratados con control (A) o (B) LMP (40 mg / ml para 24 hr). Secciones de explantes fueron teñidas con hematoxilina y eosina. Las flechas negras apuntan a la capa epitelial. Áreas dispersadas de pérdida de las capas de células superficiales y basal es evidente en secciones de explantes bronquiales tratados con LMP (B). 400 aumentos, bar = 20 M. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. LMP-indujeron apoptosis de las células del epitelio bronquial Las células apoptóticas en la capa epitelial de los bronquios segmentarios se detectaron mediante el ensayo de TUNEL.; positivamente células teñidas se representan en color marrón. Imágenes representativas de las células epiteliales bronquiales en el control (A) (B) se muestran. Las flechas negras apuntan a la capa epitelial. 200X aumentos (panel superior) y 400X (panel inferior), bar = 20 M. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los diputados son mediadores activos de diafonía intercelular y su estudio es la promesa en muchas áreas de la ciencia. 11 Este estudio presenta un protocolo detallado para la generación a gran escala in vitro de LMP derivado de una línea de células T apoptóticas. Estas MPs expresan un gran repertorio de moléculas de linfocitos y están biológicamente implicados en la regulación de la homeostasis celular y tisular. Sin embargo, LMPs procedente de diferentes fuentes puede ser biológicamente diferente. 4,9,12,13

LMP mostrar propiedades variadas dependiendo de los estímulos utilizados para generarlos in vitro y la célula de la que se derivan. Como tal, la extrapolación de los datos obtenidos in vitro utilizando LMP derivados de líneas celulares inmortalizadas a los datos de LMP generados in vivo se debe realizar con precaución.

Este protocolo describe varias etapas de centrifugación requeridas para el aislamiento de MPs; Por lo tanto, cse necesita manipulación areful para minimizar la pérdida de MPs durante este proceso. Se recomienda Snap congelación de LMP aisladas a -70 ° C; hemos observado que las bioactividades de LMP en estas condiciones pueden conservarse durante un máximo de 2 años (datos no publicados).

Hasta la fecha, la citometría de flujo es considerado el "estándar de oro" para el análisis de los diputados. Análisis de citometría de flujo policromática se utiliza para determinar las subpoblaciones de MPs de diferentes orígenes celulares. Sin embargo, los citómetros de flujo comercialmente disponibles actuales están limitados en su capacidad para analizar de menor tamaño poblaciones MPS (menos de 300 nm) y para distinguir entre restos celulares y MPS. Además, el análisis FACS (análisis citofluorimétrico) puede ser un método alternativo para ensayo de TUNEL para contar las células apoptóticas para el análisis estadístico.

Aquí, mostramos que explantes bronquiales cultivadas ex vivo puede proporcionar una buena fuente de células epiteliales de la vía aérea fo la farmacología y la investigación de la toxicología. Debido a que estos explantes bronquiales parecen a sus entornos fisiológicos originales, pueden ser útiles para determinar las vías de señalización de ciertas enfermedades bronquiales o pulmonares. Sin embargo, utilizar sólo explantes bronquiales no será capaz de confirmar el efecto apoptótico de LMP en las células epiteliales se el resultado de directo y / o de la secundaria a la activación de las células inmunes residentes. Para investigar el efecto directo de la LMP, las células epiteliales de la vía aérea principal serán apropiados para este fin.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo es apoyado por becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (178,918), Fonds de recherche en santé du Québec - Visión Red de Investigación de la Salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LMPs production and characterization
CEM T cells  ATCC  CCL-119
X-VIVO 15 medium  Cambrex, Walkersville 04-744Q
Flask T75 Sarstedt 83.1813.502
Flask T175 Sarstedt 83.1812.502
Actinomycin D  Sigma Chemical Co. A9415-2mg
PBS Lifetechnologies 14190-144
0.22 µm filter Sarstedt 83.1826.001
Annexin-VCy5 BD Pharmagen  559933
FACS flow solution BD Bio-sciences 342003
Fluorescent microbeads (1 µm) Molecular Probes  T8880
Polysterene counting beads (7 µm) Bangs laboratories PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes Falcon 352058
1 ml pipet Fisher 13-678-11B
5 ml pipet Falcon 357543
25 ml pipet Ultident DL-357551
1.5 ml conical polypropylene micro tube Sarstedt 72.690
15 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.554.205
50 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube Nalgene 3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle Beckman 356011
Protein assay (Bradford assay) Bio-Rad Laboratories 500-0006
Protein assay standard II Bio-Rad Laboratories 500-0007
Test tube 16 x 100 VWR 47729-576
Test tube 12 x 75 Ultident 170-14100005B
Cell incubator  Mandel Heracell 150
Low speed centrifuge IEC Centra8R
High speed centrifuge Beckman Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle Beckman JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube Beckman JA30.50
Fow cytometry  BD Bio-sciences FACS Calibur
Spectrophotometer Beckman Series 600
Bronchial tissue explants and sections 
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)   Charles River Laboratories, Inc. 
Mouse Airway PrimaCell™ System: CHI Scientific, Inc. 2-82001
 Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades Becton Dickinson AcuteCare 371310 #10
Scalpel Handle Fine Science Tools Inc.  10003-12 #7
phase-contrast inverted microscope Olympus Optical CO., LTD.    CK2
high O2 gas mixture  VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber Billups-Rothenberg Inc. MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker Barnstead Lab-Line,  SHKA4000-7
12-well tissue culture plate Becton Dickinson and Company 353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm) Sarstedt, Inc. 83.1802
Surgical scissors Fine Science Tools Inc.  14060-09 Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps Fine Science Tools Inc.  11052-10
humidified CO2 incubator Mandel Scientific Company Inc.  SVH-51023421
 Histopathological examination 
formalin formaldehyde Sigma-Aldrich, Inc.  HT5011
paraffin Fisher scientific  International, Inc. T555
ethyl alcohol Merck KGaA, Darmstadt EX0278-1
 glutaraldehyde  Sigma-Aldrich, Inc.  G6403
Cacodylate Sigma-Aldrich, Inc.  31533
microscope slides VWR Scientific Inc.  48300-025 25x75 mm
Xylene Fisher scientific  International, Inc. X5-4
Mayer's hematoxylin Sigma-Aldrich, Inc.  MHS16 Funnel with filter paper  
HCl  Fisher scientific  International, Inc.   A144s-500
eosin  Sigma-Aldrich, Inc.  HT110116 Funnel with filter paper  
Permount™ Mounting Medium Thermo Fisher Scientific Inc.  SP15-100
glass coverslip surgipath medical industries, Inc. 84503 24×24 #1 
TUNEL detection kit In Situ Cell Death Detection, POD 11 684 817 910
oven Despatch Industries Inc. LEB-1-20
rotary Microtome Leica Microsystems Inc. RM2145
filter paper Whatman International Ltd. 1003150 #3
Microscope Nikon Imaging Japan Inc. E800
staining dish complete Wheaton Industries, Inc. 900200 including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube Sarstedt Inc.  72.69 39x10 mm
Orbital and Reciprocating Water Bath ExpotechUSA ORS200
phosphate buffered saline   GIBCO 14190-144
fume hood Nicram RD Service 3707E

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References

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