Havayolu Epitel Hücreleri üzerinde Lenfositik mikrotanecikler ve proapoptotik Etkisi Algılama Üretimi

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hücre zarı atkı mikroparçacıklar (MPler), izole edilmiş ve kendi patofizyolojik etkileri, çeşitli modelleri üzerinde araştırılabilir aktif biyolojik veziküllerdir. Burada T lenfositleri (LMPs) türetilen milletvekillerini üretilmesi için ve solunum yolu epitel hücreleri üzerindeki proapoptotik etkilerini kanıtlamak için bir yöntem tarif eder.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yang, C., Xiong, W., Qiu, Q., Tahiri, H., Gagnon, C., Liu, G., Hardy, P. Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (96), e52651, doi:10.3791/52651 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hücre-hücre iletişimine hücre zarı türetilmiş veziküllerin biyolojik rolleri ilgi son yıllarda artmıştır. Mikropartiküller (MP) ile 1 um, 0.1 um çapı kadar, veziküllerin böyle bir tipi olup, tipik olarak aktivasyonu ya da apoptoza ökaryotik hücrelerin plazma zarından döküldü. Burada D LMPs çok aşamalı bir diferansiyel santrifüj işlemi ile izole edilir ve akış sitometrisi kullanılarak, özelliği aktinomisin ile uyarılan apoptotik CEM T hücreleri T lenfosit kaynaklı mikro (LMPs) üretimini tarif eder. Bu protokol, aynı zamanda, fare primer solunum bronş doku eksplantlarında türetilen bronş epitel hücrelerinde LMPs proapoptotik etkilerini kanıtlamak için in situ hücre ölümü algılama yöntemi sunulur. Burada tarif edilen yöntemler, in vitro apoptotik lenfositlerden LMPs, çok miktarda izole etmek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlamaktır. LMPs türetilmişBu şekilde, çeşitli hastalık modellerinde özelliklerini değerlendirmek için kullanılır ve farmakoloji ve toksikoloji testleri için edilebilir. Solunum yolu epitel dış çevre ve altta uzanan doku arasındaki bir koruyucu fiziksel ve fonksiyonel bariyer sunar göz önüne alındığında, bronşiyal doku eksplantlarında yerine ölümsüz epitel hücre çizgilerinin kullanımı yolu sistemi doku gerektiren araştırmalar için etkili bir model sağlar.

Protocol

Not: Erkek C57BL / 6 fareleri (5-7 haftalık), Charles River Laboratories International, Inc. (. St-Constant, Quebec, Kanada) ve MUB Sainte-Justine Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı protokollere göre manipüle edilebilir. Fare bronş doku eksplantlarında epitelial hücreler üzerinde LMPs proapoptotik etkilerinin araştırılması için primer bronşiyal epitel hücreleri için iyi bir kaynak sağlamaktadır. Bu protokol LMPs in vitro üretimi ve aynı zamanda LMPs ile muamele edilmiş bronş doku eksplantlarında apoptotik epitel hücrelerinin bulgulanması için bir yöntem tarif eder. Bu protokol 3 bölümden oluşmaktadır.

1. LMPs üretimi ve karakterizasyonu

NOT: bulaşmayı önlemek, bu deneyde kullanılan tüm malzemeler steril ya da otoklava olduğundan emin olmak için. Aksi belirtilmediği sürece, steril koşullar altında, bir biyolojik güvenlik kabini içinde oda sıcaklığında her adımları.

1.1) uyarılması ve milletvekillerinin Koleksiyon9

  1. Bir 37 ° C su banyosu içinde 10000000 CEM T hücreleri bir kısım çözülme. 10 ml seyreltik önceden ısıtılmış serum barındırmayan 200 gx 5 dakika bir 15 ml'lik steril bir tüpe ve santrifüj, X-VIVO hematopoietik ortam. Önceden ısıtılmış orta 5 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire.
  2. 15 ml önceden ısıtılmış hematopoietik X-VIVO gibi orta ve% 5 CO2 ile 37 ° C de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, 4 gün boyunca inkübe ile (süspansiyon hücreleri için), T75 doku kültür şişesi içine aktarın hücreleri.
  3. 4 gün sonra, 100 ml taze ortam içeren bir T175 doku kültürü şişesi içine, tüm kültür ortamı ve hücre aktarın. Bunlar 2.000.000 hücre / ml'lik bir yoğunluğa kadar büyütüldü kadar aynı koşullar altında yaklaşık 72 saat boyunca hücrelerin kuluçkaya devam edin.
  4. Eşit dört T175 şişelerinden her biri 150 mi taze ortam ve hücreler, 2.000.000 / ml'lik bir yoğunluğa kadar (yaklaşık 48 saat enkübasyon) büyüyünceye kadar hücre kültürü devam arasında hücreleri ayrıldı.
  5. 6 hücre yeniden süspanse edin.
  6. 0.5 ug / ml bir son konsantrasyonda ortama (2 mg / ml'de DMSO içinde çözülmüştür), aktinomisin D edin ve 24 saat boyunca inkübe edilir.
  7. 50 ml konik tüpler içine tüm kültür ortamı aktarın ve 5 dakika boyunca 750 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün. 15 dakika büyük hücre parçaları kaldırmak için 1.500 xg'de 50 ml konik tüpler ve santrifüj içine süpernatant aktarın.
  8. 50 dakika boyunca 12.000 xg'de 250 ml şişe ve ultrasantrifüjdeki içine süpernatant aktarın. Süpernatantı atın ve pelet toplamak.
  9. Yıkama 50 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüj ile 50 ml'lik bir tüp içinde 40 ml steril PBS ile pelet LMPs zenginleştirilmiş. Iki kez bu adımı tekrarlayın.
  10. Son yıkama süpernatant toplayın; Bu araç kontrolü olarak kullanılır. 1 LMPs pelet Askıyaml PBS ve 1.5 ml steril bir mikrotüp içine aktarın. Kısım ve mağaza izole LMPs -80 ° C 'de (birden fazla serbest-erime döngülerinden kaçınmak için).

FACS Analizi 4 üzerinden milletvekillerinin 1.2) Karakterizasyonu

  1. CaCI2 olmadan anneksin tamponu 2 örnekleri, 1 ve başka bir hazırlayın: HEPES 10 mM NaCl 140 mM, artı ya da eksi 5 mM CaCl2.
  2. Parçacıkları kaldırmak için 0.22 mikron filtre kullanılarak anneksin tampon ve FACS akış kılıf sıvısı Filtre.
  3. FACS tüpüne 5 mM CaCl2 ile anneksin tampon 44 ul LMPs 1 ul sulandırmak. CaCI2 (negatif kontrol) olmadan anneksin tamponu 44 ul LMPs 1 ul bir tüp hazırlanır.
  4. Her bir tüp içinde annexinV-Cy5 5 ul ilave edin ve iyice karıştırın. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Her bir tüp içinde, FACS akış kılıf sıvısı 400 ul karışım seyrelterek reaksiyonu durdurun.
  5. 7 mikron sayma bea 10 ul (200.000 boncuk) EkleHer bir tüp bir iç standart olarak DS süspansiyon mutlak sayısı elde edildi.
  6. Göreli büyüklüğü kapılarını (FSC-H, PMT E00, ölçek log) ve bağıl granülarite (SSC-H, PMT 325, log ölçek) büyüklüğü kalibre floresan boncuklar kullanılarak sitometrede akış nokta arsa kurulması 1 mikron (kapı 1) ve 7 mikron (kapı 2) hapların kapısı sayma.
  7. 20.000 sayma boncuk kapısı 2 ulaşılana kadar bir sinyal alarak, nokta arsa (ölçek log, PMT 765) anneksin kurulmuş kapıları ve FL-4 kanal kullanarak FSC-H / SSC-H arsa üzerinde LMPs örnek analiz.
  8. CaCl2 ihtiva eden tampon maddesi içinde anneksin LMPs pozitif annexinV olaylarını belirlemek ve CaCI2 (negatif kontrol) olmadan anneksin tamponunda LMPs olaylarını çıkarın.
  9. Aşağıdaki denkleme göre MP'lerin mutlak sayısı hesaplanır:
    Denklem 1

MP P 1.3) Belirlenmesirotein Konsantrasyon (Bradford tahlili)

  1. 1.25 ila 20 ug / ml bir protein standardı 5 seri dilüsyonları hazırlayın. Pipet iki kez temiz bir test tüpüne her bir standart ve örnek 800 ul. Her tüpe Bradford boya reaktif 200 ul ekle. İyice karıştırın, daha sonra 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
  2. 595 nm'de absorbansı ölçülür. Standart eğrinin lineer regresyon kullanılarak LMPs protein konsantrasyonunu belirleyin.

2. Bronş Doku Eksplantlarındaki ve LMPs Tedavisi

NOT: Steril bir çalışma ortamı özel dikkat ve aseptik deneyler aşağıdaki kullanılan çözümler ve orta hazırlamak. Komple Şifa Orta hazırlamak 100 ml Doku Şifa Orta (buz üzerinde çözülmüş) Serum ile Doku Şifa Orta Takviyeler 1 ml ekleyin ve iyice karıştırın.

Bronş Doku Eksplantlarından 2.1) hazırlanması

  1. Kültür işleminden önce, 1 cm 2 6 alanlarını çizilmeyebir neşter ile her biri 100 mm doku kültürü çanağı yüzeyinin kenarında her. Kat her bir kültür çanağı kaplama çözeltisinin 2 ml'si ile 100 mm doku kültürü çanağı çizilmiş ve 37 ° C'de / nemlendirilmiş bir CO2 kuluçka makinesi içinde O, N çanak inkübe edin. Vakum fazlası çözüm aspire ve Doku Yıkama Orta 15 ml çanak doldurun.
  2. Hayvan bakım etik komitesi tarafından onaylanmış protokollere göre CO 2 solumaktan (5 ila 7 haftalık) C57BL / 6 fareler Euthanize.
  3. Aseptik neşter, Dumont süper ince cımbız, ve cerrahi makas ile akciğer dokusunun teşrih. Dikkatle parankim ve kan damarları çıkarın. Uygunsa, laboratuara taşınması için buz soğukluğunda Doku, yıkama ortamı içine akciğer dokusu yerleştirin.
  4. Bundan başka doku Yıkama Ortamı içinde batık bronş incelemek ve periferik akciğer dokulardan 1-2,5 mm bir çapı olan bronş ayırın. Bir neşter ile ~ 5 mm kalınlığında bronş halkalar halinde Dilim bronşiyal dokular. Bronşiyal parçaları pick up ve yemekleri çizik alanlar üzerine yerleştirmek için steril kavisli Microdissecting forseps ile bir çekiş hareketi kullanın.
  5. Doku Yıkama Ortamı çıkarın ve bunları tabaklarına yapışmasının sağlanması için ~ 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe fragmanları.
  6. Her yemeğin Komple Şifa Orta 10 ml ekleyin ve kontrollü bir atmosfer modüler inkübatör odasına koyun. Yüksek O2 gaz karışımı (% 70 O2,% 25 N2 ve% 5 CO2), odasını yıkayın. Bir tezgah üstü yörünge inkübatör odasına yerleştirin ve 37 ° C'de sallayın. Orta parçaları üzerinde aralıklı olarak akmasına izin verecek şekilde, dakikada 10 çevrim, 24 saat boyunca çalkalayın.
  7. 24 saat inkübasyondan sonra, bir faz-kontrast ters ışık mikroskobu altında doku eksplantlar dikkate alınmalıdır. Sonraki LMPs tedavisi için tam, ince saç hareketi ve canlı bronş epitel ile bronş eksplantlar seçin.

2.2) LMPs Tedavi

  1. Aşağıdaki gibi tam büyüme ortamı hazırlayın: çözülme büyüme ortamı takviyeleri buz serum ve fibroblast inhibitörü ile. Serum ve büyüme ortamı, 100 ml 200 ul fibroblast inhibitörü ile büyüme ortamı takviyesi 1 ml ilave et; iyice karıştırın. Kullanımdan önce, 10 dakika boyunca 37 ° C'de tam büyüme ortamı ısıtın.
  2. 800 ug / ml bir konsantrasyonda bir LMPs stok hazırlamak için PBS ile yeni bir steril bir Eppendorf tüpü içinde izole LMPs seyreltin.
  3. 12-çukurlu bir doku kültür plakasının her bir oyuğuna, tam büyüme ortamında 0.5 ml ilave edilir.
  4. Doku kültürü plakasının her bir kuyunun önceki protokol (bölüm 2.1) den kavisli Microdissecting forseps ile seçilen bronşiyal eksplantlar aktarın.
  5. LMPs tedavi kuyuları ve kontrol kuyuları tespit etmek uygun kültür plaka etiketleyin. Ve 25 ul kontrol aracı (40 ug / ml bir son konsantrasyon için) her LMPs tedaviye 25 ul LMPs stok ekleyin (bkz LMP Kontrol kuyuları s üretimi).
  6. Hafifçe çalkalanarak 37 ° C sıcaklıkta kontrollü bir atmosfer modüler inkübatör içinde inkübasyona devam edin.
  7. 24 saat sonra, PBS ile eksplantlar 3 kez yıkayın ve bir sonraki aşama (% 4 paraformaldehit [PFA] katılaştırma) geçin.

3. Histopatolojik Sınav

3.1) Sonraki Adımlar Devam Etmeden Önce ardından Çözümler hazırlayın

  1. 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na-2 HPO 4, 1.76 mM KH 2 PO 4, pH 7.4 karıştırılarak 1x PBS tamponu hazırlayın.
  2. % 4 PFA, karıştırılarak 60 ° C'de ısıtıldı, 400 ml su içinde PFA 20 g çözülmesi hazırlamak; çözeltinin-berraklaştırılması için 10 M NaOH ve bir kaç damla ekleyin. Sonraki 1x PBS tampon ekleyin ve 7.4 500 ml hacim ve pH ayarlamak. Filtre ve kısım; -20 ° C'de saklayın.
  3. Aşağıdaki dehidrasyon veya rehidrasyon reaktifler hazırlayın; % 100,% 90,% 70,% 50 etanol ve ksilen.
e_step "> 3.2) Eksplantın Fiksasyon ve Doku Bölüm parafinden arındırma

  1. % 4 PFA 1.5 ml ile etiketlenmiş bir mikrosantrifüj tüpü içinde, her eksplant yerleştirin ve 4 ° C 'de O / N inkübe edin. 1x PBS ile iki kez eksplantlar durulayın.
  2. Bir alkol serisi ile eksplantlar kurutmak (% 70 etanol: Her 3 kez 30 dakika% 90 etanol: Her 2 kez 30 dakika,% 100 etanol: 3 kez 30 dakika her biri, daha sonra, ksilen, 3 kere 20 dakika) ekstrakte edildi. Bir çeker ocak içinde, oda sıcaklığında bütün adımları.
  3. Bir fırın içinde 58 ° C 'de parafin doku eksplantlar imbed. Bir döner mikrotom kullanılarak 5 mikron kalınlığında doku bölümleri hazırlayın.
  4. 56 ° C su banyosunda bölümleri Şamandıra ve sonra etiketli histolojik slaytlar üzerine bölümleri monte edin. 1 saat 65 ° C'de manuel boyama rafları ve kuru slaytlar yerleştirin. Slaytlar oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
  5. Parafin çıkarmak için 10 dakika her ksilen içeren 4 ardışık leke yemekler rafları batırın. Inci, sonra% 100,% 95: iksilenin çıkması için bir etanol seri rafları Dipdaha sonra% 80,% 70, sonra% 50 etanol (her adım için 5 dakika) tr. Etanolü ortadan kaldırmak için 5 dakika boyunca musluk suyu ile rafları durulayın.

3.3) Hematoksilen Eozin ve (H & E) Boyama

  1. Sabit doku bölümleri ile çalışmaya devam; 15 dakika için Mayer'in Hematoksilen ile dolu bir boyama çanak içine raf yerleştirin. 20 dakika için hematoksilin kaldırmak için musluk suyu ile raf durulayın.
  2. 30 saniye için% 95 etanol içinde 30 sec.Place için damıtılmış su içinde yerleştirin. 1 dakika Eosin Y çözüm boyama çanak yerleştirin. 2 dakika her biri için,% 95 etanol,% 100 etanol ve ksilen 2 değişikliklere dihidrat.
  3. Fazla eozin çıkarıldığından emin olmak için bir mikroskop altında hızlı bir kontrol yapınız. Bir kapak camı ile kapak daha sonra, her bir slayt üzerine montaj ortamı (Fisher SP15-100) olarak 2-3 damla yerleştirin.

3.4) in situ hücre ölümü algılama içinde: TÜNEL tahlili

  1. Başlamadan önce, proteinaz K çalışma çözeltisi hazırlayın: 20 ug / ml10 mM Tris / HCI, pH 7.4 ile yıkanır.
  2. Bölüm 3.2 (Eksplantın tespit ve doku bölüm Parafinden arındırmadan) 5'e kadar olan adımları tekrarlayın 1. Deiyonize H 2 O ile slaytlar durulayın
  3. 10 dakika boyunca 1x PBS ile slaytlar daldırın. Aşırı PBS boşaltın. Proteinaz K kullanmaya hazır çözelti ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca doku bölümleri inkübe edin. Durulayın 1x PBS ile iki kez kayar.
  4. Hücre ölümü algılama kiti Öğretim Kılavuzunda açıklandığı gibi TÜNEL tahlili yapın. Montaj orta kullanarak monte, ve cam lamelleri ile manuel lamel.
  5. Bir ışık mikroskobu altında örnekleri analiz edin. Kahverengi renk apoptotik hücreleri analiz Pro Image 4.5 kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LMPs floresan-aktive edilmiş hücre (FACS) analizi, sıralama ve MP'lerin (≤1 um)% 97 anneksin-V-Cy5 pozitif olan 1 um boncuklar kullanılarak bir kapı ile anneksin V boyama 10 ile karakterize edilmiştir (Şekil 1A ve 1B). Tipik haliyle, LMPs yaklaşık 2.5 mg ile bu protokol izlenerek elde edilmiştir. C57BL bronş doku eksplantlarında / 6 fareleri araç ve LMPs işlemine tabi tutulmuştur. Bronşiyal bölümlerin histopatolojik analizi bronşiyal epitel yapısal bütünlüğü ile LMPs etkisini ortaya çıkarmıştır. Kontrol eksplantlarda, bronşiyal epitel (Şekil 2A) büyük ölçüde hasar görmemiş idi; Ancak, LMPs-tedavi eksplantlarda, yüzeyel epitel hücre tabakası hasarlı veya kayıp, ve epitel hücre yüksekliği ve yoğunluğu (Şekil 2B) önemli düşüşler vardı oldu. TÜNEL pozitif boyama (apoptoz markeri) karşı daha fazla kontrol ile karşılaştırıldığında LMPs ile muamele edilmiş bronş epitel belirgindir (

Şekil 1,
CEM T hücre soyu elde MP'lerin sitometri analizi Şekil 1. Akış. (A) ileri (FSC) ve yan dağılım (SSC) kapı milletvekilleri için kullanılan 1 mikron boncuk özellikleri belirlenmesi. Milletvekilleri kapısı Olaylar daha da elektronik gürültü gerçek olayları ayırt etmek anneksin V-Cy5 ile etiketleme açısından değerlendirildi (B) böylece milletvekilleri algılama özgünlüğünü artırılması. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. bronşiyal epitel tabakası hasarı LMPs kaynaklı. Bronş epitheli Temsilcisi histopatolojik görüntüleri(A), kumanda ya da (B) LMPs (24 saat boyunca 40 ug / ml) ile muamele eksplantların um arasındadır. Eksplant bölümleri hematoksilin ve eosin ile boyandı. Siyah oklar epitel tabakası işaret. Yüzeysel ve bazal hücre tabakası yamalı kaybı LMPs ile muamele edilmiş bronş eksplantlar (B) bölümleri de görülmektedir. Büyütme 400X, bar = 20 uM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. bronşiyal epitel hücre apoptozisi LMPs kaynaklı segmental bronşların epitel tabakasında apoptotik hücreler TUNEL testi ile tespit edilmiştir.; pozitif olarak lekeli hücreler, kahverengi olarak gösterilmiştir. Kontrol bronş epitel hücre Örnek görüntüsü (A) (B) gösterilmektedir. Siyah oklar epitel tabakası işaret. Büyütme 200X (üst panel) ve 400X (alt panel), çubuk = 20 uM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Milletvekilleri hücrelerarası çapraz konuşma aktif arabulucular ve onların çalışma bilimin birçok alanda umut vericidir. 11 Bu çalışma bir apoptotik T hücre soyu elde LMPs in vitro büyük ölçekli üretimi için ayrıntılı bir protokol sundu. Bu MPler lenfosit moleküllerinin büyük bir repertuarı ifade eder ve biyolojik hücre ve doku homeostazının düzenlenmesinde rol oynar. Bununla birlikte, farklı kaynaklardan elde edilen LMPs biyolojik olarak farklı olabilir. 4,9,12,13

LMPs vitro bunları üretmek için kullanılan uyaranlara ve türetildikleri hücreye bağlı olarak çeşitli özellikleri gösterir. Bu nedenle, in vivo olarak oluşan LMPs verilerine ölümsüzleştirilmiş hücre çizgilerinden türetilen LMPs kullanılarak in vitro elde edilen verilerin ekstrapolasyon dikkatli yapılmalıdır.

Bu protokol milletvekilleri izolasyonu için gerekli birkaç santrifüj adımları açıklar; Bu nedenle, Careful manipülasyon, bu işlem sırasında MP'lerin kaybını en aza indirmek için gereklidir. -70 ° C 'de izole edilmiş LMPs Snap dondurma tavsiye edilir; bu koşullar altında LMPs biyoaktiviteleri 2 yıla kadar (yayınlanmamış veriler) muhafaza edilebilir olduğunu gözlemledik.

Bugüne kadar, akım sitometri milletvekilleri analizi için "altın standart" olarak kabul edilir. Çok renkli akım sitometri analizi farklı hücresel kökenlerden gelen milletvekillerinin subpopülasyonunun belirlemek için kullanılır. Bununla birlikte, mevcut piyasada mevcut akış sitometrelerinde küçük ölçekli milletvekilleri popülasyonları (en az 300 nm) analiz etmek ve hücresel enkaz ve milletvekilleri arasında ayrım yeteneği sınırlıdır. Buna ek olarak, FACS analizi (sitoflüorimetrik analizi) İstatistiksel analiz için, apoptotik hücrelerin sayısı için TÜNEL tahlili için alternatif bir yöntem olabilir.

Burada, ex vivo olarak, bronşiyal eksplantlar kültürlenmiş f havayolu epitel hücrelerinde iyi bir kaynak sağlamak olduğunu göstermektedirveya farmakoloji ve toksikoloji tarama. Bu bronşiyal eksplantlar orijinal fizyolojik ortamlara benzer olduğundan, belirli bir bronş veya akciğer hastalıklarının sinyal yollarını belirlemek için yararlı olabilir. Ancak, mümkün değil epitel hücreleri üzerinde LMPs apoptotik etkisini onaylamak için tek bronşiyal eksplantlar kullanabilir ve / veya sekonder yerleşik bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu doğrudan kaynaklanmaktadır. LMPs doğrudan etkisini araştırmak için, birinci hava yolu epitel hücreleri, bu amaç için uygun olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Vizyon Sağlık Araştırma Ağı - Bu çalışma Sağlık Araştırması (178.918), Fonds de recherche en santé du Québec, Kanada Enstitüleri hibe ile desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LMPs production and characterization
CEM T cells  ATCC  CCL-119
X-VIVO 15 medium  Cambrex, Walkersville 04-744Q
Flask T75 Sarstedt 83.1813.502
Flask T175 Sarstedt 83.1812.502
Actinomycin D  Sigma Chemical Co. A9415-2mg
PBS Lifetechnologies 14190-144
0.22 µm filter Sarstedt 83.1826.001
Annexin-VCy5 BD Pharmagen  559933
FACS flow solution BD Bio-sciences 342003
Fluorescent microbeads (1 µm) Molecular Probes  T8880
Polysterene counting beads (7 µm) Bangs laboratories PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes Falcon 352058
1 ml pipet Fisher 13-678-11B
5 ml pipet Falcon 357543
25 ml pipet Ultident DL-357551
1.5 ml conical polypropylene micro tube Sarstedt 72.690
15 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.554.205
50 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube Nalgene 3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle Beckman 356011
Protein assay (Bradford assay) Bio-Rad Laboratories 500-0006
Protein assay standard II Bio-Rad Laboratories 500-0007
Test tube 16 x 100 VWR 47729-576
Test tube 12 x 75 Ultident 170-14100005B
Cell incubator  Mandel Heracell 150
Low speed centrifuge IEC Centra8R
High speed centrifuge Beckman Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle Beckman JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube Beckman JA30.50
Fow cytometry  BD Bio-sciences FACS Calibur
Spectrophotometer Beckman Series 600
Bronchial tissue explants and sections 
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)   Charles River Laboratories, Inc. 
Mouse Airway PrimaCell™ System: CHI Scientific, Inc. 2-82001
 Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades Becton Dickinson AcuteCare 371310 #10
Scalpel Handle Fine Science Tools Inc.  10003-12 #7
phase-contrast inverted microscope Olympus Optical CO., LTD.    CK2
high O2 gas mixture  VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber Billups-Rothenberg Inc. MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker Barnstead Lab-Line,  SHKA4000-7
12-well tissue culture plate Becton Dickinson and Company 353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm) Sarstedt, Inc. 83.1802
Surgical scissors Fine Science Tools Inc.  14060-09 Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps Fine Science Tools Inc.  11052-10
humidified CO2 incubator Mandel Scientific Company Inc.  SVH-51023421
 Histopathological examination 
formalin formaldehyde Sigma-Aldrich, Inc.  HT5011
paraffin Fisher scientific  International, Inc. T555
ethyl alcohol Merck KGaA, Darmstadt EX0278-1
 glutaraldehyde  Sigma-Aldrich, Inc.  G6403
Cacodylate Sigma-Aldrich, Inc.  31533
microscope slides VWR Scientific Inc.  48300-025 25x75 mm
Xylene Fisher scientific  International, Inc. X5-4
Mayer's hematoxylin Sigma-Aldrich, Inc.  MHS16 Funnel with filter paper  
HCl  Fisher scientific  International, Inc.   A144s-500
eosin  Sigma-Aldrich, Inc.  HT110116 Funnel with filter paper  
Permount™ Mounting Medium Thermo Fisher Scientific Inc.  SP15-100
glass coverslip surgipath medical industries, Inc. 84503 24×24 #1 
TUNEL detection kit In Situ Cell Death Detection, POD 11 684 817 910
oven Despatch Industries Inc. LEB-1-20
rotary Microtome Leica Microsystems Inc. RM2145
filter paper Whatman International Ltd. 1003150 #3
Microscope Nikon Imaging Japan Inc. E800
staining dish complete Wheaton Industries, Inc. 900200 including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube Sarstedt Inc.  72.69 39x10 mm
Orbital and Reciprocating Water Bath ExpotechUSA ORS200
phosphate buffered saline   GIBCO 14190-144
fume hood Nicram RD Service 3707E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, (1), 4-9 (2011).
  2. Martinez, M. C., Tual-Chalot, S., Leonetti, D., Andriantsitohaina, R. Microparticles: targets and tools in cardiovascular disease. Trends Pharmacol Sci. 32, (11), 659-665 (2011).
  3. Benameur, T., Andriantsitohaina, R., Martinez, M. C. Therapeutic potential of plasma membrane-derived microparticles. Pharmacol Rep. 61, (1), 49-57 (2009).
  4. Yang, C., et al. Lymphocytic microparticles inhibit angiogenesis by stimulating oxidative stress and negatively regulating VEGF-induced pathways. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 294, (2), 467-476 (2008).
  5. Yang, C., Gagnon, C., Hou, X., Hardy, P. Low density lipoprotein receptor mediates anti-VEGF effect of lymphocyte T-derived microparticles in Lewis lung carcinoma cells. Cancer Biol Ther. 10, (5), 448-456 (2010).
  6. Angelillo-Scherrer, A. Leukocyte-derived microparticles in vascular homeostasis. Circ Res. 110, (2), 356-369 (2012).
  7. Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. J Immunol. 178, (12), 8090-8096 (2007).
  8. Qiu, Q., Xiong, W., Yang, C., Gagnon, C., Hardy, P. Lymphocyte-derived microparticles induce bronchial epithelial cells' pro-inflammatory cytokine production and apoptosis. Mol Immunol. 55, (3-4), 220-230 (2013).
  9. Martin, S., et al. Shed membrane particles from T lymphocytes impair endothelial function and regulate endothelial protein expression. Circulation. 109, (13), 1653-1659 (2004).
  10. Shet, A. S., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102, (7), 2678-2683 (2003).
  11. Mause, S. F., Weber, C. Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange. Circ Res. 107, (9), 1047-1057 (2010).
  12. Yang, C., et al. Anti-proliferative and anti-tumour effects of lymphocyte-derived microparticles are neither species- nor tumour-type specific. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  13. Soleti, R., et al. Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors. Carcinogenesis. 30, (4), 580-588 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics