Author Produced

Optagelse Tissue Repair i zebrafisk Larver med Time-lapse Lysfelt stereomikroskopi

Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy. J. Vis. Exp. (95), e52654, doi:10.3791/52654 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Zebrafisk (Nacre stamme) blev avlet og opvokset ifølge etablerede protokoller. Blev gjort alt for at minimere lidelse, ved hjælp af 0,4 mM tricaine til anæstesi og 1 mM tricaine for eutanasi. Zebrafisk embryoner og larver blev håndteret i nøje overensstemmelse med god dyr praksis som godkendt af det kompetente udvalg (MDI Biological Laboratory dyr kerne IACUC nummer 13-20). Denne undersøgelse blev godkendt af den nationale menneskelige genom Research Institute Animal Care og brug Udvalg, MDIBL Institutionelle Assurance # A-3562-01 under protokol # 14-09.

Bemærk: Billeddannelsen der fanger fin regenerering i larvernes zebrafisk er sammenfattet i de følgende trin:

1. Optagelse af zebrafisk til larvestadier

  1. Saml æggene og sted ca. 50 æg i en 100 x 25 mm petriskål indeholdende 0,03% Instant Ocean salt i deioniseret vand suppleret med 0,00004% methylenblåt. Inkuber O / N i en 28,5 ° C inkubator.
  2. <li> Den næste morgen fjerne de døde fostre med et glas pipette og skyl æggene i en si med 0,03% Instant Ocean salt i demineraliseret vand (betegnet embryo medium).
    Bemærk: medium, såsom Ringers 18 Hanks 18, E2 19 E3 20 og Danieau 21 kan foretrækkes.
  3. sup> Tilføj frisk embryo medium til fadet. Hvis der anvendes pigmenterede stammer, eventuelt tilføje 0,2 mM 1-phenyl-2-thiourinstof (PTU), som PTU vil forhindre melanogenese og dermed pigmentering af larver. Lad embryoner videreudvikle i inkubatoren indtil 2 dage efter befrugtning eller enhver anden ønsket larvestadiet.

2. Udarbejdelse af Imaging Afdeling

  1. Metode 1: Imaging kamre lavet af PVC eller Teflon slange (figur 1)
    Bemærk: Denne metode ligner Concha og Adams (1998) 22.
    1. Anskaf drikkevand grade plastic eller Teflon slange fra en isenkræmmer med en 25 mm udvendig enda 20 mm indvendig diameter. Skær slangen til at ringe på ca. 10 mm tykkelse med en jævn overflade på hver side. Brug> 200 sandpapir korn at udjævne kanterne.
    2. Rengør ringe med varmt vand og 70% ethanol og lad dem lufttørre.
    3. Med en pipettespids, anvende silikonefedt til halvdelen af ​​en ring og fastgøre ringen til en 75 mm x 25 mm dækglas. Alternativt kan du bruge en 3 ml sprøjte fyldt med silikone fedt i stedet for en pipettespids.
      Bemærk: Da det er vanskeligt at indsætte silikonefedt i 3 ml sprøjte, tilsæt silikonefedt til en 30 ml sprøjte først og bruge denne til fyldning af 3 ml sprøjte.
  2. Metode 2: Fremstilling af en petriskål som et billeddannende kammer.
    1. Erhverve 35 eller 60 mm diameter petriskåle med et dækglas fastgjort til låget (figur 2A). Alternativt, som vist i figur 3 i Distel & Koester (2007) 23, bore en åbning lille nok til Hgamle et dækglas i låget af en lille petriskål og anvende silikonefedt på ydersiden med en 3 ml sprøjte. Ved hjælp af en ren pipette tip, omhyggeligt vedhæfte en rund eller kvadratisk dækglas med ønsket tykkelse til ydersiden (figur 2B).
  3. For at sikre at agarose anvendes til montering ophold solidt fastgjort under imaging procedure, vedhæfte et fint plastnet inde i ringen. Først sender mesh fremstillet af vindue skærmen opnået fra en isenkræmmer, i størrelsen af ​​den indre ring diameter ved hjælp af fine sakse med en vinkel. Derefter skæres en lille rektangel> to gange størrelsen af larve i midten af masken (figur 1, 2).
  4. Påfør fire små prikker af ugiftige silikonefedt til grænsefladen mellem dækglasset og kammeret ring (figur 1A).
  5. Brug pincet til at fastgøre masken fast til bunden af ​​dækglas.

3. Montering og Imaging af Pre-injmåles Larver (dette trin er valgfrit)

Bemærk: Dette trin er velegnet til sammenligninger mellem amputerede og regenereret fin længde, som amputation flyet efter fin regenerering ikke genkendes i zebrafisk larver.

  1. Forbered en 0,5-1,2% lav-melt agaroseopløsning i embryo medium for immobilisering af prøven.
  2. Varm agarose i en mikrobølgeovn og overføres væsken agarose i 1,5 ml rør, der er præ-opvarmet til 42 ° C i en varmeblok.
  3. Lad hot agarose køle ned til 42 ° C, der kan opretholdes over flere uger ved denne temperatur. Prøv at undgå pipettering larverne i agarose over 42 ° C, da dette vil være til skade for dyrene.
  4. Bedøver flere larver anvendes 10 ml 0,4 mM tricaine (pH 7) i embryo medium i en 60 mm diameter petriskål. Forbered tricaine efter zebrafisk Book Opskrifter 18.
    1. Alternativt kan du bruge 10 ml af en 1: 1000 fortynding af 99% 2-phenoxyethanol i en 60 mm diameter petriskål. Poke larverne med et udjævnet microloader pipettespids at vurdere deres anslagsfølsomhed, før du fortsætter. Brug kun ikke-responsiv larver.
  5. Overfør en larve i 42 ° C agaroseopløsning ved anvendelse af en glas Pasteur-pipette. Overfør ikke overdreven væske i agarose, ellers agarose vil blive alt for udvandet og ikke størkne.
  6. Kassér den resterende væske fra pipetten og overføre larve med en dråbe agarose i en lille petriskål (35 eller 60 mm i diameter). Placer larve på sin side til billeddannelse af halefinnen.
  7. Lad agarose at størkne. Vurdere agarose med en plastik pipette spids; vil spidsen nedsænkes i agarose hvis det er for væske. Når agarosen er størknet, vil en lille fordybning være synlig ved berøring med en pipettespids. Efter størkning, tilsæt tricaine løsning og gå videre til stereomikroskop, der skal bruges senere til time-lapse billeddannelse.
  8. Brug et stereomikroskop med tidsforskudt software. Vælg et passende mål og forstørrelse, som vil blive brugt senere til time-lapse billeddannelse. Her skal du bruge en 3,5 x, 16 mm arbejder afstand objektiv på et stereomikroskop. Som ønsket, anvende alternative mikroskoper og objektive linser men vælger en ordentlig forstørrelse at tage højde for potentielle xy-drift og vækst af finnen under billedbehandling procedure.
  9. Vælg kameraet detekteringstilstand på mikroskopet.
  10. I softwaren, skal du vælge 'live' tilstand for at få vist larve på skærmen.
  11. Åbn vinduet 'Egenskaber' til automatisk at registrere lysstyrken.
  12. Manuelt justere kontrasten på mikroskopet trans-illumination base.
  13. Flyt larve ud af synsfeltet og vælg Shading Korrektion funktionen til at minimere baggrund nejise.
  14. Placer larve tilbage i synsfeltet og tage et snapshot. Gem billedet.
  15. Fjern agarose fra larve ved først at skrabe agarose fra hovedet. På denne måde larven kan gled ud af agarose ved forsigtigt at trække hovedet væk fra den resterende agarose med et udjævnet microloader pipettespids eller et insekt stift.
  16. Med en glas Pasteur-pipette overføre larve i frisk tricaine opløsning.

4. Amputation Assay

  1. Forbered en 1,5% agarose løsning ved hjælp af embryo medium og hæld et tyndt lag i en petriskål. Lad agarose størkne.
  2. Under et stereomikroskop placere larve sideværts på den størknede agarose og amputere halefinnen med en 23 G kanyle med et let tryk (figur 3A).

5. Montering af Larva for Time-lapse Imaging

  1. Fortsæt som beskrevet i trin fra 3,1 til 3,5 (figur 3B).
  2. For at muliggøre en ordentlig sårheling eller vævsregenerering at forekomme, forsigtigt skrabe agarose omgiver distale halefinnen ved hjælp af en udjævnet microloader pipettespids eller et insekt stift. Prøv ikke at skade finnen gentagne gange (figur 3C).
  3. Dekanteres tricaine opløsning indeholdende fjernet agarose og fylde kammeret ring med frisk tricaine opløsning.
  4. Påfør silicium fedt på toppen af ​​kammeret ringen og vedhæfte et 75 mm x 25 mm glasplade. Prøv at undgå luftlommer i kammeret, da de vil forstyrre brightfield billedbehandling og tørre ud larve over tid.
  5. Hvis du bruger en petriskål somen afbildningskammeret anvende silicium fedt på topranden af ​​den nederste kammer og fylde bundkammeret med tricaine opløsning. Dekanteres forsigtigt tricaine løsning i låget og drej låget over til nedsænke larve i tricaine opløsning af den nederste kammer i en lille vinkel for at undgå luftlommer. Kammeret bliver forseglet på grund af silikonefedt.

6. Time-lapse Imaging

  1. Saml en opvarmet rugekammeret som beskrevet i 23,24 (figur 4) .Sæt inkubationskammeret omkring mikroskop og slå varmen. Temperaturen holdes på 28 ° C i ca. 10 - 20 min, eller indtil temperaturen er stabiliseret.
  2. Åbn foran den opvarmede rugekammeret og placere afbildningskammeret på mikroskopet stativ med dækglasset opad mod mål.
  3. Placer larver finne på en måde, at 2/3 af synsfeltet forbliver ubesatte. Dette sikrer opsamling afvækst og regenerering af finnen i løbet af den billeddannende procedure uden at skulle flytte larve.
    1. Juster monterede larve til 28 ° C i ~ 30 min før start af tidsforskudt optagelse for at undgå ændringer i brightfield intensitet eller potentielle skift af agarose. Alternativt udnytter forvarmet buffer at starte billeddannelse efter kortere justering tid.
  4. For at opsætte tidsforskudt optagelse, skal du åbne 6D Multidimensional Acquisition vinduet i Axiovision softwaren og vælg z-stak og time-lapse mulighed.
  5. Valgfrit) under fanen z-stak og Slice tilstand, skal du vælge skive tykkelse og vælg derefter Start / stop-indstilling.
  6. Definer øvre og nedre position i stakken.
  7. På fanen time-lapse, skal du vælge intervallet og varigheden af ​​filmen og derefter starte filmen ved at trykke på startknappen. Vi fandt, at 30 min intervaller er tilstrækkelige, og dette interval ikke genererer overdreven data; dog shorter intervaller kan anvendes.
  8. Kontroller placeringen og z-stack dimensioner under den første time, hvis larven ikke var pre-justeret. Hvis det er nødvendigt, flytte larve igen efter en dag, da larven måske flyttet.
  9. Gem filen i slutningen af tidsforskudt optagelse og fortsætte med efterbehandling og kvantificeringer hjælp af tilgængelig billedanalyse software, såsom Imaris 25 eller open source software-pakker Billede J 26 og Fiji 27.

7. Dataanalyse

  1. Bestemmelse af fin længde.
    1. Åbn time-lapse film i imaging software og gemme filerne i den proprietære filformat at øge software ydeevne.
    2. Vælg den retvinklede at vise enkelte afsnit som forventet stakke. For drift korrektion, under menuen Fiji, vælg Plugins, så registrering, og "Korrekt 3D drift«. Dette vil åbne et Fiji vindue og udføre drivgarn korrektioner. Korrektroterende drift i Imaris Steder funktion. Alternativt installere StackReg og TurboReg plugins i Image J og importere til Fiji. Vælg den ønskede transformation algoritme i StackReg plugin.
    3. For at måle afstande (f.eks sår diameter eller fin længde), skal du vælge "Tilføj ny målepunkter 'i øverste venstre værktøjslinjen.
      1. Under "Sæt liste af synlige Statistik Værdier" i nederste venstre menu, vælg de statistiske værdier, der skal vises.
      2. I 'Line Mode' under fanebladet indstillinger Vælg Pairs (AB, CD ...) «.
      3. I »Etiketter Egenskaber 'vælg' Navn 'og' afstand ', for at vise afstanden mellem punkt A og B ved siden af ​​målingen linje.
      4. Skift til "Rediger" mode og holde shift-knappen for at vælge det første punkt i slutningen af ​​rygstrengen. Brug derefter den samme konfiguration til at vælge det andet punkt ved den distale fin margen.
      5. Under fanen statistik Vælg den disk knappen (Export All) nederst til højre for at få vist og eksportere afstanden i billedet.
      6. Gentag målinger på udvalgte tidspunkter ved at flytte skyderen under billedet til højre. I stedet for at skabe nye målepunkter, kan de tidligere omplaceres ved først at vælge punktet med venstre museknap, så samtidigt at trykke på Skift og venstre museknap på den nye position.
    4. Alternativt til målepunkter mulighed, udnytte skive seeren til at måle afstande. I skive view-tilstand, rul til den ønskede position og klik på den første og anden position med venstre museknap. Afstanden vises. Denne mulighed dog ikke giver mulighed for eksport af data.
  2. Bestemmelse fin længde og areal i ImageJ.
    1. Åbn time-lapse film i ImageJ ved hjælp af et plugin, der anerkender .zvi filformat. Alternativt indlæse i en QuickTime fil eller tiff-sekvens.
      Bemærk: Hvis du bruger et ukomprimeret TIFF-filformat, behøver billedets dimensioner ikke at blive angivet.
    2. Hvis du åbner et andet filformat uden filen, skal du vælge 'Set Scale "under" Analyser "menu til først definere billedet distance og enhed. I 'Set Scale menu ", indtast" Afstand i pixels «, under type i" kendt afstand "for pixel værdi (dette kan opnås ved at måle antallet af pixels på en skala bar, der blev føjet til billedet , og klik derefter på Mål for at opnå det resultat), og den "enhed med en længde (typisk" um "). Klik derefter på OK.
    3. For fin arealet vælge 'Freehand Selection' værktøj på værktøjslinjen og beskriver fin område ved at holde venstre museknap nede mens du tegner langs omridset af finnen. For fin længde målinger, skal du vælge "Straight" linje værktøj og trække en linje mellem de ønskede punkter for at væremålt.
    4. Klik på 'Mål' under 'Analyze' for at vise området og længden af ​​finnen. Gentag dette trin så ofte som nødvendigt for forskellige tidspunkter af filmen.
  3. Brug statistik software data kan vises grafisk.

Representative Results

De præsenterede teknik er egnet til at belyse vævsreparation dynamik som reaktion på amputation. Filmen viser, at amputation af finnen først udløser en pung-streng virkning, kendetegnet ved, sammentrækninger via actin-myosin kabler, der er til stede i FIN-fold 28 (figur 5 A, B). Sideløbende celler ekstruderes fra såret (se filmen). Nedgangen kan således være et middel til at udvise celler, der sandsynligvis er bestemt til at undergå celledød. Vores resultater viser endvidere, at den udviklingsmæssige vækst larve sker uafhængigt af regenerering (film), mens fin regenerering ikke indleder indtil omkring 14 timer efter amputation målt ved fin længde og området over tidsforløbet på 36 timer efter amputation (figur 5C , D). Den samlede regenerativ fin vækst efter 1,5 dage var omkring 60% af den oprindelige fin længde (figur 5E). Tilsammen viser disse resultater, at amputation tr iggers fin sammentrækning, ekstrudering af celler fra såret, og en tidsmæssigt forsinket regenerativt respons. Mens ekstruderede celler sandsynligvis er bestemt til at undergå celledød, bør præciseres yderligere arten af ​​disse celler.

Figur 1
Figur 1. Imaging kammer ringsamling

(A) vist en plastring, der er knyttet til et dækglas med silikonefedt. Et plastnet er fastgjort til indersiden af ​​kammeret med fire små prikker af silikonefedt. (B) Det kammer, der indeholder den monterede larve er fyldt med tricaine opløsning og et objektglas er fastgjort til toppen. (C) A monteret to dage gamle larver (pil) er vist ved højere forstørrelse at skildre sin størrelse i forhold til masken."_blank"> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Imaging kammer forsamling fra petriskåle. (A) Vist er en kommerciel glasplade glasbund petriskål med en plastik mesh knyttet til dækglas. (B) Vist er en selvstændig konstrueret petriskål kammer med et hul boret i låget og et dækglas fastgjort udefra med silikonefedt. Nettet og larve er monteret inde i kammeret indeholdende tricaine opløsning. For at forsegle kammeret, er silicium fedt påføres den øverste, yderste rand af nederste kammer og den øverste låg påsat. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

"Figur Figur 3. Arrangement med amputation og montering af en larve til billeddannelse. (A) For amputation, placere en bedøvet larve på en agarose-coatet petriskål og amputere halefinnen med en kanyle. (B) til montering, overføre larve med en overførsel pipette til et 1,5 ml rør fyldt med 42 ° C flydende agarose og pipette en dråbe indeholder larve i imaging kammer, orientere fisk og dækker størknede agarose med embryo medium. (C) Skrab agarose fra halefinnen ved hjælp af en udjævnet microloader pipettespids eller lignende værktøj og erstatte embryo medium med frisk medium. (D) Billede halefinnen under et stereomikroskop. Klik her for at se en større udgave af dette tal.


Figur 4. egenfremstillede opvarmede inkubation kammer. (AC) Vist er en opvarmet inkubation kammer lavet af pap, bobleplast og velcro. En kabelforbundet kuppel varmelegeme (oprindeligt udviklet til kylling Rugning) er fastgjort til kammeret ved hjælp af aluminium tape. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Fin restitution dynamik. (A) Ordning af det udnyttede halefinnen amputation assay og kvantificering metode til at bestemme den fin længde (rød pil) og areal (rød omrids af den fin). (B) halefinnen amputation oprindeligt udløser sammentrækning af fin, efterfulgt af Regenerative væv udvækst. Finnen undergår også udviklingsmæssige vækst, som det fremgår af den laterale størrelse stigning. (C) Vist er fin længde som en funktion af tiden, afslører en lineær regenerativ vækst starter ved ~ 14 HPA. (D) Kvantificering af finnen område afslører en indledningsvis falde i størrelse, hvilket kan henføres til sammentrækning af finnen. Efter ~ 14 timer, de fin størrelse øges ved en lineær hastighed. (E) Sammenligning af fin længde før amputation og efter 36 timer viser ~ 60% genvækst. Scale bar: 100 um Forkortelser: pre-amp, pre-amputation; timer efter amputation, HPA; regen, regenerering; amp, amputation Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Movie . Fin regenerering over tidsforløbet af 36HR. Vist er en halefinne af en 2,5 dage gamle larver i løbet af regeneration. Fra 30 minutter efter amputation regenerativ vækst afbildes i 30 minutters intervaller på et stereomikroskop ved hjælp af en 3,5x objektiv.

Discussion

I denne procedure giver mulighed for at observere sårheling og vævsregenerering i levende zebrafisk larver med in vivo time-lapse billeddannelse på en brightfield stereomikroskop ved hjælp af en forholdsvis simpel opsætning. Denne procedure kræver, at visse vigtige aspekter, som vi har testet, som optimerer resultatet: 1) Lave agarose koncentrationer (~ 0,5%) vil minimere væksten hindringer i stadigt stigende larve zebrafisk, 2) Fjernelse af agarose omkring finnen er vigtigt ikke at tilsløre helingsprocessen, 3) at fange agarose i et plastnet bevarer agarose og dyr i en stabil position under hele proceduren, og 4) en passende temperatur-kontrolleret miljø, som er afgørende for larvernes levedygtighed. Vi har tilpasset en opvarmet inkubation kammer 23,24, som udnytter bobleplast, der er tapede på pap, og et kabelbaseret kuppel varmelegeme til at styre temperaturen og god luftcirkulation med minimale udsving i løbet afimaging procedure. Denne enkle og omkostningseffektive kammer kan fremstilles til at passe enhver mikroskop. En lignende opvarmet inkubation kammer er også brugt til billedbehandling mus og chick udvikling 24,29.

Vi foreslår, at pre-amputeret larver er monteret til en pre-amputation billede, demonteres for amputation, og genmonteres for time-lapse billeddannelse. Selv om det er muligt at udføre disse trin i et enkelt trin i den endelige afbildningskammeret vores erfaring fandt vi, at amputere halefinnen på et dækglas er ikke optimal, da det river vævet og ikke resulterer i et rent snit. Den agarose-baserede amputation under anvendelse af en sprøjte nål blev oprindeligt beskrevet af Kawakami og kolleger (2004) 16 og er også vores erfaring, ideel til at udføre amputationer. Således temmelig kompliceret række trin, som vi præsenterede er velbegrundet og sikrer en optimal regenerering resultat.

Vi viste, at Larval zebrafisk ved 2 dpf kan afbildes op til 1,5 dage i agarose og tricaine opløsning. Vi brugte pH-optimeret tricaine (pH 7) opløsning fremstillet med Instant Ocean salt, som ikke forstyrrer den model sundhed for præsenterede imaging periode. Vi har tidligere dog også vist, at ved hjælp af tricaine i Danieau medium tillader time-lapse billeddannelse på 2,5 dpf larver zebrafisk på et konfokalt mikroskop i mindst 2 dage 30. Således kan optimale pufferbetingelser udvide larver sundhed og længden af ​​billeddannelse. Alternativt kan lavere tricaine koncentrationer anvendes til anæstesi eller 2-phenoxyethanol, som vi fandt er veltolereret i larver og voksne stadier ved 28 ° C i mindst 60 timer.

For at undgå fejl i fin regenerering fjernede vi agarose fra halefinnen før billeddannelse. Vores data viser, at inden for 1,5 dage fin har regenereres til ca. 60%. Denne regenerering sats er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse definerer 3 dages en gennemsnitlig tid for halefinnen regenerering i zebrafisk larver op til 6 dpf 16. Alternative metoder til agarose kan imidlertid anvendes til at montere fisk til billeddannelse. For eksempel tynd plasmaclots 31 eller fluoreret ethylenpropylen (FEP) rør overtrukket med methylcellulose og fyldt med meget lave koncentrationer agarose (0,1%) er blevet anbefalet til lyspladen mikroskopi 32 og kan være egnet til vores foreliggende fremgangsmåde. Men vi anbefaler ikke methylcellulose og 0,1% agarose, da de kræver, at prøven er monteret på bunden af ​​kammeret som følge af mangel på størkning af disse medier. Meget høje koncentrationer af methylcellulose vil desuden generere luftlommer baseret på vores erfaringer, og disse kan forstyrre billeddannelse procedure. Hvis disse medier foretrækkes med anvendelse bundkammeret, er det vigtigt, at en passende bearbejdning afstanden mellem objektivlinsen og prøven er til stede. Det skal bemærkes, at methylcellulose som et monterings medium anbefales kun i op til 1 dag, da det kan forstyrre larver sundhed 32.

Montering modellen i låget kan medføre en langsom gravitationel nedadgående tendens. Det anbefales derfor at billedet flere sektioner på hvert tidspunkt, som enten kan projiceres i et enkelt plan eller kun billeder i brændplanet kan ekstraheres til samling den endelige film. Imaging prøven nederst kammer kunne være et alternativ metode til at undgå potentiel nedadgående tendens. Plasma blodpropper kan være nyttigt for at undgå afdrift, da plasma vil holde sig til det ydre omsluttende lag (EVL, periderm) 31, og derfor kan stabilisere prøven. Dette skal dog testes, samt hvor længe larve zebrafisk kan opretholdes i plasma blodpropper uden at forstyrre larver sundhed eller fin regenerering.

Vores film blev samlet under anvendelse enkelte sektioner (26 um)af en optaget z-stak, som dækkede den fulde tykkelse af finnen (~ 10 um), og som tegnede sig for potentiel Z-drift af finnen under imaging procedure. For at bevare 3-D information, er det også muligt at projicere z-stakke i enkeltbilleder. Da dette kan medføre sløring af billedet, kan brightfield deconvolution ønske. Software, såsom Deconvolve eller Autoquant X3 kan anvendes til dette formål. Alternativt kan anvendes matematiske algoritmer (beskrevet i Tadrous 33) til opnåelse af en point-spread funktion højt signal-til-støj-forhold (SNR). Erhvervelse af en høj SNR er en af ​​de største forhindringer i brightfield deconvolution. Selv om denne metode kræver høj kontrast og tynd prøve tykkelse, ville det være hensigtsmæssigt for billeddannelse af halefinnen grund af sin reduceret bredde.

En klar fordel ved den præsenterede imaging metode er, at det hurtigt kan tilpasses enhver stereomikroskop udstyret med et CCD-kamera end time-lapse-software og tilbyder en billigt alternativ til dyrere konfokal billeddannelse. Selv om denne fremgangsmåde ikke udnytter fluorescens til detektering celle, kan det udvides til sådanne programmer ved at udnytte et automatiseret system til lukkeren kontrol og post-imaging deconvolution software 34. Dette vil gøre det muligt for brugerne at yderligere observere såret reparation og regenerering processer med enkelt celle eller subcellulær opløsning over længere perioder.

Den optiske klarhed og lethed, hvormed embryonale og larver zebrafisk kan håndteres, og tilpasningsevne denne metode til enhver stereomikroskop gør den velegnet til at undervise grundlæggende hvirveldyr biologi i et klasseværelse indstilling. Denne metode kan give de studerende en bedre forståelse af de grundlæggende biologiske processer underliggende væv reparation og regenerering. Andre biologiske processer, der er blevet taget med en lignende metode er zebrafisk fosterudvikling 23,34 og hjerte-funktion (ikke offentliggjort). Denne fremgangsmåde giver også mulighed for overvågning sårheling og regenerering i larver, der er blevet genetisk og farmakologisk manipuleret.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bullseye Agarose MidSci BE-GCA500
Low-melt agarose Fisher BioReagents BP1360-100
1-phenyl-2-thiourea Alfa Aesar L06690
Instant Ocean Aquarium Salt Pet store
Methylene Blue (0.1% solution) Sigma M9140
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich E10505
2-Phenoxyethanol Sigma-Aldrich 77699
Petri Dish 35 x 15 mm BD Falcon 351008
Petri Dish 60 x 15 mm BD Falcon 351007
Petri Dish 100 x 25 mm BD Falcon 351013
5.75 inch boroschillate glass pipets Fisher
35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (Glass: 0.085-0.115mm) MatTek Corporation D35-20-0-TOP
Superfrost/Plus microscope slides Fisherbrand 12-550-15
Glass coverslips Electron Microscopy Services 72191-75
Glass coverslips Warner Instruments CS-18R15
Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal - 48" Home Depot
High vacuum grease Dow Corning
Microloader pipette tips 20 µl Eppendorf 930001007
Fine Scissors - Sharply Angled Up Fine Science Tools 14037-10
3 ml Luer-Lok™ disposable syringe  BD 309657
60 ml Luer-Lok™ disposable syringe BD 309653
23 G syringe needles BD 305145
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11295-00
Equipment
LabDoctor Mini Dry Bath MidSci
Discovery.V12 compound microscope  Zeiss
Plan Apo S 3.5X objective Zeiss
AxioCam MRm  Zeiss
Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011) Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. San Miguel-Ruiz, J. E., García-Arrarás, J. E. Common cellular events occur during wound healing and organ regeneration in the sea cucumber Holothuria glaberrima. BMC Dev Biol. 7, 115 (2007).
  2. Poss, K. D., Keating, M. T., Nechiporuk, A. Tales of regeneration in zebrafish. Dev Dyn. 226, 202-210 (2003).
  3. Akimenko, M. A., Marí-Beffa, M., Becerra, J., Old Géraudie, J. Old questions, new tools, and some answers to the mystery of fin regeneration. Dev Dyn. 226, 190-201 (2003).
  4. Slack, J. M. Regeneration research today. Dev Dyn. 226, 162-166 (2003).
  5. Seifert, A. W., et al. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561-565 (2012).
  6. Goss, R. J., Grimes, L. N. Epidermal downgrowths in regenerating rabbit ear holes. J Morphol. 146, 533-542 (1975).
  7. Williams-Boyce, P. K., Daniel, J. C. Comparison of ear tissue regeneration in mammals. J Anat. 149, 55-63 (1986).
  8. Allan, C. H., et al. Tissue response and Msx1 expression after human fetal digit tip amputation in vitro. Wound Repair Regen. 14, 398-404 (2006).
  9. Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
  10. Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Dev Biol. 315, 125-135 (2008).
  11. Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. Mammalian regeneration and regenerative medicine. Birth Defects Res C Embryo Today. 84, 265-280 (2008).
  12. Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
  13. Akimenko, M. A., Johnson, S. L., Westerfield, M., Ekker, M. Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish. Development. 121, 347-357 (1995).
  14. Reginelli, A. D., Wang, Y. Q., Sassoon, D., Muneoka, K. Digit tip regeneration correlates with regions of Msx1 (Hox 7) expression in fetal and newborn mice. Development. 121, 1065-1076 (1995).
  15. Brien, G. S., et al. Coordinate development of skin cells and cutaneous sensory axons in zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 520, 816-831 (2012).
  16. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev Dyn. 231, 693-699 (2004).
  17. Yoshinari, N., Ishida, T., Kudo, A., Kawakami, A. Gene expression and functional analysis of zebrafish larval fin fold regeneration. Dev Biol. 325, 71-81 (2009).
  18. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th, Univ of Oregon Press. Eugene. (2000).
  19. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, part A. Preface. Methods Cell Biol. 100, (13), (2010).
  20. Dahm, N. -V. a Zebrafish: A Practical Approach, Issue 975. reprint, Oxford University Press. 303 (2002).
  21. The Zebrafish: 2nd Edition Genetics, Genomics and Informatics. Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. 2nd, (2005).
  22. Concha, M. L., Adams, R. J. Oriented cell divisions and cellular morphogenesis in the zebrafish gastrula and neurula: a time-lapse analysis. Development. 125, 983-994 (1998).
  23. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. CSH Protoc. 2007, (2007).
  24. Kulesa, P. M., Kasemeier-Kulesa, J. C. Construction of a Heated Incubation Chamber around a Microscope Stage for Time-Lapse Imaging. CSH Protoc. 2007, (2007).
  25. Bitplane. Imaris V 6.1.0 Reference Manual. (2008).
  26. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 36-42 (2004).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  28. Mateus, R., et al. In vivo cell and tissue dynamics underlying zebrafish fin fold regeneration. PLoS One. 7, e51766 (2012).
  29. Jones, E. A., et al. et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
  30. Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., Köster, R. W. Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons. PLoS Biol. 7, e1000240 (2009).
  31. Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Dev Dyn. 228, 464-474 (2003).
  32. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
  33. Tadrous, P. J. A method of PSF generation for 3D brightfield deconvolution. J Microsc. 237, 192-199 (2010).
  34. Distel, M., Babaryka, A., Köster, R. W. Multicolor in vivo time-lapse imaging at cellular resolution by stereomicroscopy. Dev Dyn. 235, 1100-1106 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics