쥐 망막 및 원격 사지 허혈 양상의 보호 효과에 기능을 평가하기 위해 전위도를 사용하여

1Discipline of Physiology and Bosch Institute, Sydney Medical School, University of Sydney
Neuroscience

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Brandli, A., Stone, J. Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning. J. Vis. Exp. (100), e52658, doi:10.3791/52658 (2015).

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Abstract

Introduction

ERG는 광에 응답하여 망막에 의해 발생하고, 눈의 각막 표면으로부터 기록 전위이다. 기록 조건을 신중하게 관리하는 경우, ERG 망막 기능을 평가하기 위해 다양한 방법으로 사용될 수있다. 여기서 우리는 '플래시 ERG', 망막 Ganzfeld 배경에 제시된 간단한, 밝은 플래시에 노출되었을 때 발생하는 전위를 기록하는 방법을 설명했다. Ganzfeld는 균일하게 빛을 분산 빛의 플래시가 약 균일하게 전체 망막에 도달한다. 망막을 기록하기 전에 어두운 적응되며, 동물의 기록을 위해 준비 될 때 어두운 적응이 유지되는 경우, ERG 두로드와 콘 감광체에 의해 생성된다 얻어진.

어두운 적응 플래시 에르그는 두 가지 방법으로 분석 된 특성 파형을 가지고 있습니다. 먼저, ERG 파형의 초기와 후기 컴포넌트 구별하고 뉴런의 시퀀스와 관련되어왔다망막 알 활성화. 최초의 구성 요소는 짧은 대기 시간에 음의 가능성, 파 (그림 1)입니다. 이것은 양의 진행 가능성이 뒤에, B 파를했다. B 파의 상승 단계는 별도의 구성 요소 (진동 전위 또는 OPS) 간주되는 진동을 보여줍니다. 파장은 감광체에 의해 생성 된 것으로 간주되며, 무 축삭 세포에 의한 1 층의 내측 핵 세포 및 OPS 의한 B 표면파.

자극 강도에 기초하여, 매우 희미 깜박에 응답 암순응 임계 반응이 가능하다 불린다. 암순응 임계 응답은 망막 신경절 세포 2-4에서 생성하는 것으로 이해된다. 둘째, 플래시 ERG 빛 적응에 의해 분리 될 수 있고, 또는 두 플래시 프로토콜에 의해 일단이 상기 조작 패널과 원뿔 중심 성분으로, 후술. 포토 픽 조건 하에서, 콘 인구가 낮기 때문에, 전파는 쥐에서 검출되지이지만 OPS와 B 파장은5 취소합니다. 그의 망막 높은 콘 인구가 영장류에서, 일단이 상기 조작 패널과 원뿔 경로 모두 검출 파 (6)를 생성합니다.

종종 플래시 ERG로부터 추출 두 유용한 대책 감광체 인구가 위험한 점 밝은에 노출, 예를 들면, 감소도 2에 도시 된 전형적인 플래시 응답.와도 1에서와 같이 측정 A- 및 B- 파의 진폭, 아르 빛, 망막 전위도의 모든 구성 요소가 감소된다. 원격 허혈 (RIP)와 같은 신경 개입, A-와 B 파 (그림 3)의 진폭의 보존에 의해 검증 될 수있다. 요약하면, ERG의 분석은 건강 손상 가볍고 neuroprotected 망막 간의 비교를 가능하게한다.

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Protocol

이 프로토콜은 시드니 대학의 동물 관리 가이드 라인을 따른다.

1. 만들기 전극

  1. 양극 백금 와이어 직경 1-2mm의 짧은 (5cm) 길이에서 (각막 연락을 드릴 것 하나)를 구축합니다. 루프에 직경이 수 mm 그것을 패션. 앰프의 입력단에 도달하도록 충분한 시간, 통상의 리드에 연결이 루프 (도 4 참조).
  2. AG / AgCl을 또한 컨벤션 리드에 연결된 직경 1-2mm를, 펠렛 사용 (동물의 입에 갈 것입니다) 음극를 구축합니다 (그림 4 참조).
  3. (동물의 엉덩이에 들어갈 것) 기준 전극은, 또한 적당한 길이의 리드에 접속 깨끗한 피하 주사 바늘 (23 G)를 사용함에 따라 (도 4 참조).
  4. 이상적으로, (양의 U를 세 개의 전극을 연결, 기기 제조업체가 제공하는 세 개의 핀 케이블을 사용(94); 각막, 부정 → 입, 앰프 엉덩이 → 참조).

가벼운 자극 및 망막 전위도 셋업 2. 연결 및 교정

  1. 어두운 할 수있는 작은 기록 실험실을 작성 (또는 위치). 빨간색 만든 이상 - 더 - 벤치 빛 또는 붉은 머리 램프의 한쪽 또는 양쪽에 착용.
  2. 1 룩스를 초과하지 않도록 설치하는 동안 쥐의 눈에 도달하는 붉은 빛의 조도를 확인하기 위해 럭스 미터를 사용합니다.
    주 : 감광 필터는 램프 밝기를 감소시킬 수 있고, 램프의 광원은 특히 적색광을 방출한다. 광원이 낮은 (가시) 파장을 방출하는 경우 다크 적응이 손상됩니다.
  3. (이 종종 불투명 테이프와 지속성을 필요) 기록 실험실을 입력 모든 미광을 봉쇄 이상 들어갈 정도로 큰, 그래서 희미 감광 필터를 (이이 장에서 구입하실 수 있습니다) 준비, 컴퓨터 화면 당신은에있을 것이다 실험실.
    참고 : 길 잃은 빛과화면의 빛이 쥐 눈의 어두운 적응을 침해하기에 충분하다.
  4. 데이터 수집 하드웨어에 앰프를 연결합니다. 앰프에 긍정적, 부정적 기준 리드를 연결합니다. 컴퓨터 및 LED Ganzfeld 전원부 안전하게 접지 전원에 연결되어 있는지 확인.
    참고 : 일부 연구소는 건물 접지에 연결, 접지 포인트를 전문으로; 배수관은 효율적인 대안이다.
  5. 연구 품질 복사계와 LED 광원을 보정합니다. 동물의 눈은 실험 기간 동안 위치 할 때의 위치에 미터의 센서를 고정합니다.
  6. Ganzfeld LED가 깜박 사이의 플래시 에너지, 플래시 지속 시간, 플래시 반복과 시간에 단계적인 증가와 전체 필드 ERG 프로토콜을 실행하는 프로그램은, interstimuls 간격 (ISI) 설정을라고. 예를 들어 전체 필드 프로토콜은 표 1을 참조하십시오.
    참고 : ERG 깜박 반복 희미 깜박에서 증가 풀 필드 b에단계 현명한 방식으로 오른쪽으로 깜박입니다. 트윈 플래시 프로그램은 전체 필드에서 프로토콜에 다음과로드와 콘의 답변 분리 할 수​​ 있습니다.

망막 전위도 실험에 3 일 이전

  1. 어두운 기록하기 전에 12 시간 동안 흰쥐 적응. 이 미광이 제거 된 후, 기록 실험실에서 이렇게하는 것이 편리하다.

에르그 실험의 4 일

  1. 동물이 기록하면서 부드럽게 가열 될 수 있도록 정렬합니다. 우리는 동물의 머리가 Ganzfeld에 항목에 정확한 지점에서 휴식 할 수 있도록 구축 된 빛 금속 플랫폼을 사용합니다. 이 플랫폼은 우리가 물을 욕조에 40 ℃로 예열 물 펌프 통해 붙박이 튜브를 가지고있다.
    주 : 경험이 37 ° C에서 동물의 코어 온도를 유지 보여준다.
  2. 어두운 조건에서 쥐의 무게를. 기록의 무게와 올바른 케타민 (60 ㎎ / ㎏)과 자일 라진을 구성 (5 ㎎ / ㎏) 투여 량. 쥐 세대를 억제TLY 및 복강 마취제를 주입.
  3. 주입 시간이 있습니다. 동물이 의식이되면 (대개 5 분 이내)을 가볍게 반사 반응이 존재하는지, 한 발 패드를 곤란하게하여 마취의 깊이를 확인합니다. 그것은이 반사가 진행하기 전에, 없거나 약한 때까지 기다리는 것이 좋습니다.
  4. 각막에 proxmethacaine의 단일 아트로핀의 드롭 및 다른를 적용합니다.
  5. 검은 스레드의 10cm 길이를 잘라. 단순한 매듭으로 루프를 확인하고 눈의 적도 위에 루프 슬립. 살짝 조여; 효과는 최소한의 압력으로, 약간 앞으로 안구를 그릴 것입니다. 이 눈꺼풀 분명 각막을 유지합니다.
  6. 적용 카보 머 눈은 각막 표면에 떨어진다. 확인 카보 머 각막 표면에 남아 있고 눈꺼풀이나 얼굴에 유출하지 않습니다.
  7. 가열 플랫폼의 상단에 흡수 침구를 놓습니다.
  8. Ganzfeld의 ​​구멍에 권장되는 장소에 머리를 침대에 위치 쥐.
  9. 삽입 INT직장에 ernal 온도 프로브. 꼬리에 프로브 코드를 테이핑하여 위치에서 안전 온도 프로브.
  10. 피하 뒤쪽 다리에 기준 전극 (23 G 바늘)를 삽입하고, 앰프에 연결합니다.
  11. 안전하게 입에 음극 (AG / AgCl을 펠렛)을 놓습니다. 이 입 밖으로 미끄러지는 것을 방지하기 위해, 안정된 표면에 연결 리드를 부착합니다.
  12. 각막의 중심을 통해 양극을 배치합니다. 미세 조작기를 사용하여 전극이 부드럽게 각막 접촉되도록.
  13. 37.5 ° C - 확인 체온은 37.0이다.
  14. 동물 올바른 위치에 전극이 제자리에되면, 불투명 한 재료로 전체 설치 (Ganzfeld과 동물) 드레이프 (어두운 적응을 유지하기 위해). 우리는 부드러운 검은 천을 사용하십시오.
  15. 미리 수집 샘플링 5 밀리 초와 100-1000 밀리의 수집 시간이 2 kHz 샘플링 레이트로 설정 취득 소프트웨어. 내지 1,000으로 밴드 패스 필터를 설정할Hz에서 그 샘플링을 보장은 플래시 다음 ~ 250 밀리의 기간을 샘플링 트리거됩니다.
  16. 기록 기준선을 확인합니다. 그것은 외부 소음이 없어야하지만, 일부 앰프 소음과 진동 호흡을 보여 주어야한다.
  17. 베이스 라인은 외부 소음을 표시하는 경우, 문제 해결을 시작합니다. 대부분의 문제는 전극의 위치, 또는 접지에 미끄러지 관련이 있습니다. 녹음은 외부 소음의 자유 보장하기 위해 패러데이 케이지를 사용합니다.
  18. 테스트 플래시, 0.4 로그 스코틀랜드 cd.sm -2를 실행합니다. 비슷한 ERG 파형 (2A)가 나타납니다 그림. 0.4 로그 스코틀랜드의 cd.sm -2 플래시 연구실 전형적인 반응에서 (: -474 ± 39 μV와 b 파 : 파 1,512 ± 160 μV, N = 11)입니다.
  19. 어두운 동물 10 분 동안 재 - 적응 허용합니다. 이 기준을 다시 확인이 10 분을 사용하는 것이 편리하다.
  20. 안정적인 신호의 다음과 같은 확인 녹음을 시작합니다.
  21. 기록 세션의 끝에서, 그 본체를 확인 temperatURE 유지 하였다. 전극을 제거합니다. 각막에 카보 머 폴리머를 다시 적용합니다. 이 동물 하우징에 반환하기 전에, 완전히 모바일 및 활성화 될 때까지 동물이 열 패드를 복구 할 수 있습니다.

5. 원격 허혈

  1. 깨어 또는 anesthetised 설치류 중 하나에서 원격 허혈을 수행합니다.
  2. 동물 마취 경우 (위) 가열 플랫폼에 누워 무릎의 명확한 뒷다리의 상단 부분에 혈압계 커프 슬립.
  3. 동물이 처리에 사용되는 경우, 마취없이이 절차를 수행 할 수있다; 이 두 사람이 필요합니다. 한 사람이 부드럽게 동물을 억제하고, 두 번째는 혈압계 커프를 적용하고 혈압계를 운영하고 있습니다.
  4. 깨어 동물, 부드럽게 한 뒷다리 무료로, 동물을 포장 수건의 조각 ~ 15cm X 30-50cm를 사용합니다. 머리가 홀더의 팔과 몸통, 장소 사이에 자리 잡고으로, 왼쪽 팔뚝 (말)에 자사의 뒷면에있는 동물을 놓는다커프는 단지 설명했다.
  5. 커프를 수축 및 공기압 밸브가 폐쇄되어 있는지. anesthetised 동물에서 160 mmHg로에 커프 펌프, 깨어 동물에서 180 mmHg로한다. 이 수축기 혈압 (일반적으로 140 mmHg로 160 mmHg로 각각)를 초과합니다.
  6. 휴대용 펌프를 이용하여, 필요에 따라 이들의 압력을 유지한다.
  7. 허혈 후 예정된 시간 (우리는 5 분 재관류로 구분 5 분의 2주기를 사용), 공기압 밸브를 풀어 커프 압을 수축.
  8. 발바닥에 붙어 피부 온도 프로브 원격 허혈의 효과를 확인한다. 피부 온도는 일반적으로 5 분 이상, 32-30 ° C의에서 떨어지는 재관류에 복구합니다.

6. 가벼운 손상

  1. 쥐가 어두운 적응 하룻밤 전에 가벼운 손상 과정에 있는지 확인하십시오.
  2. (지체없이 우리의 실험에서) 사지 허혈 다음 적절한 시간에, 각 동물은 플렉시 글라스 박스, 위스콘신에 단독으로 배치됩니다바닥 기반의 용기에 번째 물과 음식.
    참고 : 빛에 의한 손상은 흰둥이 동물에서 수행 할 수 있습니다.
  3. 표준 시간 (보통 오전 9시)에서 미리 교정 1,000 룩스 흰색 빛에 전환하고 24 시간 동안이 상태를 유지한다.

7. 망막 전위도 데이터 추출 및 분석

  1. ERG의 평균 웨이브 폼을 획득. 감산하여, 비 - 제로 기준에 대한 정확한 필요한 경우.
  2. 기준선과 제 사이의 전압 차이로서, (높은 자극 강도에 중간에서 발표) 파의 진폭을 측정한다 (<30 밀리 초 지연) 트로프 (도 1).
  3. 일반적으로 80-100 밀리 (도 1)의 지연 시간에 발생하는 파장의 피크 파장은 다음의 양극 사이의 전압 차이와 같은 B 파 진폭을 측정한다.
  4. 90 Hz의 전이 대역으로 60-235 Hz의 데이터를 필터링하는 푸리에 변환을 이용하여 진동을 격리 전위
  5. A-와 B 파 피크의 암시 적 시간 (대기 시간)도 유용한 측정 (그림 1)이 될 수 있습니다. 로드 응답을 분리하는 트윈 깜박을 사용합니다. 혼합 응답 (플래시 1)로드 응답을 분리하기 (그림 2)에서 콘 응답 (플래시 2)를 뺍니다.
  6. 각각의 광 강도에게 파 및 b 파의 진폭 (후 처리 / 후 처리-기준)을 정상화 또는 치료 그룹에 대한 평균. 강도 - 반응 곡선은 플래시 에너지 대 그룹 진폭 및 에러 플롯.

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Representative Results

프로토콜은 생체 내 쥐의 망막 시각 기능을 측정 할 수있다. 전파, 광 수용체의 기능을 측정하고, B-파도 내측 망막 기능의 측정은,도 1에 주석 첨부된다.

도 2a에 도시 된 바와 같이 증가하는 빛 자극과로드 지배 ERG 신호 증가. 파장이 0.4 로그 스코틀랜드의 cd.sm -2 2.5 로그 스코틀랜드의 cd.sm에서 포화 될 때까지 파의 진폭이 증가 -2 (미도시)에서 ~ 명백해진다. 트윈 플래시 패러다임은도 2b에서와 같이, 콘 및로드 단리 응답 혼입 ERG 신호를 분리하는데 사용되어왔다.

이 에르그 기록 기술은 신경 개입을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 기준 기록은 빛 손상 이전에이 그림 3a에 볼 수 있습니다 일주일에 완료했다. 그림에서 보여 파 및 b 파의 진폭을 모두 감소 등의 손상,URE의 3B. 원격 허혈은도 3c에 도시 된 바와 같이, ERG 진폭의 손실을 저감 할 수 있었다. 원격 허혈 기술은 "무릎"위의 지혈대의 올바른 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 그림 3D에서와 같이 지혈대의 잘못된 응용 프로그램은, 망막에 빛의 손상을 방지하지 않습니다.

그림 1
그림 1 :. 시간 표시 T0에서 주어진 빛의 밝은 플래시로 어두운 적응 눈의 각막에서 기록 된 바와 어두운 적응 에르그 추적에서 파 및 b 파의 측정. 파의 진폭은 제 트로프 (적색 화살표)에 대한 기준선을 측정한다. B 파의 진폭은 다음과 같은 긍정적 인 피크 (파란색 화살표)에 파의 저점을 측정한다. 암시 시간 (대기 시간)이 자극으로부터 측정되는추적에 관심 지점에 인공물 (T0), 같은 파 (대괄호)의 저점으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 증가 플래시 강도와로드와 콘의 답변 분리 어두운 적응 에르그의 개발 빛의 섬광의 증가에 어두운 적응 눈의 각막에서 기록 된 바와 흔적.. 파 밝은 강도에 나타납니다. 스콧 cd.sm -2, 피크 B 파가 포화하지만 파장은 성장을 계속했다 1.4에 비해 0.4 로그 (A). (B)에, 쌍둥이 깜박 중첩된다. 두 개의 2.0 로그 스코틀랜드의 cd.sm -2 깜박은 500 밀리 초 ISI에 의해 분리된다. 첫 번째 플래시는 혼합을 생성응답 (블랙), 및 제 플래시 원뿔 만 응답 (점선)를 생성한다. 콘 응답을 빼면하면 고립로드 응답 (회색)를 산출한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
도 3 :. ERG는 주제 파형, RIP에 의해 (C) 망막 컨디셔닝 손상 광에 노출되기 전에 (A) 정상 망막 망막 광 손상, (B)를 위해 여기에 도시되어 망막 기능의 척도를 제공하고, (D) 망막은 비효율적 RIP에 의해 조절하고 손상을 빛에 노출. 동일한 플래시 에너지는 각각의 레코드 (2.0 로그의 cd.sm -2)를 사용 하였다. D의 레코드 압력 커프를 들어뒷다리에 잘못 넣고 허혈이 설정되지 않았습니다. 가벼운 손상이 망막 전위도 (B)의 진폭을 줄이고 RIP는 감소를 완화합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 :. ERG 전극을 닫습니다 전극이 왼쪽에서 오른쪽으로, 도시 건설 될; 양극, 음극은 입 후 옆구리 피하에 삽입되는 바늘에 접속 악어 클립들로 구성되어 상기 기준 전극에 위치하는 각막에 문의한다. 여기를 클릭하세요 큰 버전을 볼 이 그림의.

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Discussion

위에서 설명한 어두운 적응 플래시 에르그 방법은 쥐의 망막 기능을 평가하기위한 신뢰할 수있는 방법이다. 파 및 b 파 모두 빛의 손상에 의해 감소​​되었다. 원격 허혈 양상은 파 및 b 파의 광 손상에 의한 감소를 완화. 망막 기능이 보존 원격 허혈 양상은 저산소증, 허혈 및 운동 8-10으로 보호 전처리의 다른 형태를 닮은 신경을 유도 것을 제안합니다. 녹화 설정, 광 자극의 파라​​미터, 및 동물의 상태 - 기록 ERG 신호는 세 세트의 요인에 의해 결정된다.

녹화 설정

전극이 잘못 배치되는 경우 ERG는 진폭이 감소 또는 제조가 불완전 11 접지된다. 주변 전기 장치의 접지 상태가 기록 노이즈를 줄이기 위해 중요하다; 큰 소음은 패러 드를 계속하는 경우님 케이지를 사용할 필요가 있습니다. 정극 확실 ERG 전체 필드 프로토콜을 시작하기 전에 완료 될 때 체크 및 위치 확인과 각막의 중앙에 위치한다. 그것은이 전극 접촉부 만 각막 중요하다; 눈꺼풀에 문의하거나 심지어 수염은 신호 진폭을 줄일 수 있습니다. 느슨한 면사는 양극에 접촉을 방지하기 위해 눈꺼풀이 프로토콜에서 사용되었다. 일부 연구자는 안정적인 접촉 눈꺼풀 접촉 (12)의 방지를 보장하기 위해 포함 된 양극으로 콘택트 렌즈를 개발했다.

빛의 자극 설정

우리가 사용하고 자극은 LED 광원에서 광범위한 스펙트럼 백색광을 제공한다. 다른 광원은 크세논 스트로브 조명 및 할로겐 조명, 빛의 자극 (11) 사이의 비교에 웨이 머스와 Vingrys를 참조로 빛 자극으로 적합하다. LED 조명의 장점은, 그러나,각각의 플래시 및 에너지의 지속 기간은 쉽게 프로그래밍이 빠르게 광 강도의 넓은 범위에서 다시 설정이야. 우리는 임계 값에서 어두운 적응 설치류 범위에서 포화에 (최대 반응을 생산) (방금 검출 응답을 생산) 등급을 매긴 에너지의 섬광, 세트를 개발했다.

시행 착오를함으로써, 우리는 플래시에 대한 응답의 진폭이 같은 강도의 선행 플래시 독립적인지 확인 간격 (ISIS) interstimulus 설립했다. 플래시 밝게, 더 이상 ISI이 독립을 위해 필요합니다.

또한, 시행 착오에 의해 우리는 깨끗한 신호를 제공하도록 각각의 에너지를 요구 응답의 최소 개수를 확립했다. 평균 이상의 응답은 항상 깨끗한 신호를 제공 할 것입니다. 에너지 시리즈는 (우리의 프로토콜 11 분에) 신속하게 완료 할 수 있도록 우리는 최소값을 사용; 빠른 완성은 동종 때문에 마취 상태의 변화에​​ 변화를 감소필요한 경우 다른 변수에 대한 WS 시간을 공부합니다.

동물의 상태

동물의 생리의 여러 매개 변수를 최적화하고 얻은 에르그 녹음을 표준화하는 것이 중요합니다.

온도

전파 신호는 외부 세그먼트 G 단백질 결합 phototransduction 캐스케이드의 빛 - 유도 활성화로부터 생성되고; 이 폭포의 역학은 모든 효소 반응 등, 온도에 따라 13, 14. 마취 설치류 저체온증하는 경향과 기록 걸쳐 37.5 ℃의 코어 온도를 유지하도록 외부 가열을 필요로한다. 체온보다 1-2 ℃로 떨어지면, 파장 및 B- 파의 진폭은 감소하고 그들의 대기 시간이 15을 증가시킨다.

마취

안정 에르그 녹음 움직임으로 동물을 필요로한다. 신경 근육 차단제와 anaesthetIC 에이전트는 의식과 움직임 상태를 달성하기 위해 망막 전위도 실험에 사용됩니다. 만 쥐 16-20에서 깨어 에르그 녹음의 다섯보고가 있었다. 이러한 연구에서, 전극 수술 두개골에 미리 주입하고, 이러한 연구는 두 ERG 17,20에 마취 효과를 시험 하였다.

에르그 녹음에 사용되는 가장 일반적인 마취가 케타민과 자일 라진의 조합이었다 (우리의 실험에서 케타민과 5 mg을 60 ㎎ / ㎏ / 자일 라진 kg을 사용한다). 이 가스 마취 등의 이소 플루 란과 할로 탄보다 망막 전위도 덜 영향을, 높은 회수율 17,21,22으로, 상대적으로 비 독성 입증했다. 이 접근법은 ~ 40 분 동안 움직이지 동물 유지; 절반 량은 비슷한 기간 동안 기록 조건을 확장하기 위해 사용될 수있다. 장에 의한 연구는 직접적으로와 마취없이 망막 전위를 비교 케타민 - 자일 라진이 잴 A-와 B-의 진폭과 대기 시간을 교란 않는 것으로 나타났다파도 (17). 대부분의 연구자들은 마취 조건을 표준화하고 실험적인 매개 변수를 테스트; 마취제의 일부 효과는 완전히 할인 할 수 없습니다.

안구 환경

눈의 생리 기능을 최적화하고 ERG 기록을 표준화, 유지 보수를 필요로한다. 학생들은 표준 크기 여야합니다; 이것은 눈이 최대 팽창을 달성하기 위해, 상품으로서 도포, 동형 달성된다. 설치류, 아트로핀 또는 페닐 (23)를 사용한다. 각막 수화가 기록에 앞서, 카보 머 중합체의인가에 의해 유지된다; 이 또한 양극과 각막 사이의 전기 전도도를 안정화시킨다. 각막 탈수가되면, 각막 반흔 및 백내장 형성 (24)를 발생할 수 있습니다. 백내장은 쥐 25에서 일반적이며, 각막 수화를 유지하는 여러 방법이 수성 유체 또는 일정한 흐름을 포함 마우스 ERG 녹음에 사용 된맞춤 접촉 스타일 전극 각막 표면 (12)에 그 트랩 수화.

망막의 적응 상태

이 주요 변수이다. 상기 제공된 프로토콜은 망막의 가장 민감한 상태로, 어두운 적응되는 것을 보장하도록 설계된다. 이상적으로, 색소 쥐, 완전히 어두운 적응 등의 스프 돌리 쥐와 같은 비 색소 동물, 동안으로 어두운 주택의 3 시간을 필요 5 시간 (26)의 최소 필요합니다. 그것은 암순응 망막 전위도 녹음 12 시간 동안 밤새 동물을 적응하기위한 표준 방법입니다. 광에 부분적 또는 완전한 적응 쉽고 빠르게 Ganzfeld 자극기의 표준 강도 배경 점등에 의해 달성 될 수있다. 빛 적응 한 후, 그러나, 전체 어두운 적응은 달성하기 위해 시간이 걸립니다; 따라서 극단주의의 제안은 눈을 녹음하기 전에 빛에 실수로 노출되지 않도록합니다.

에르그 기록 기술은에 의해 제한된다결정 요인 (즉, 망막 전위도 및 자극 셋업)과 망막 전위도 검사에서 연구자의 ​​능력 이상. 경험이 연구원은 변수 에르그 녹음을 할 가능성이있다. 차이는 시각적 기능의 감소 또는 이득 등 결과를 비교하기 위해 충분히 큰 샘플 크기를 생성함으로써 감소 될 수있다. 또한, 르 녹음은 기본 녹음 및 후 처리 녹음 사이에 정상화 될 수있다. 정규화 된 데이터는 그룹화되고 분석 될 수있다. ERG 데이터를 제시 할 때, 그룹 데이터 대표적인 파형을 표시하는 표준 관행이다.

위의 모든주의 깊게 제어되는 경우, ERG의 진폭은 망막의 기능 상태의 척도이다. ERG 일관 광 손상 또는 변성 27,28 유도 유전자에 의한 감광 층의 고갈에 의해 진폭이 감소된다. 반대로, 이러한 RIP 같은 개입의 보호 효과는 AMPL에서 검출 될 수있다망막 전위도 (29)의 itude. 망막 전위도 망막 8-10,30에 허혈, 저산소 전처리, 운동,식이 사프란의 보호 효과를 입증에 사용되어왔다.

운동 모델링 광 수용체에 phototransduction 알려진 생리 학적 이벤트를 기반으로하지만 로돕신의 phototransduction 캐스케이드의 역학에 대한 지식이 성장하고, 망막의 시냅스 연결, 에르그 세대 모델의 개발, 정교한 ERG 파형 분석을 격려했다하는 것은 가능하다 , 및 내부 망막 회로 (31)에 대한 우리의 이해. 예를 들어, 파장 운동 모델 phototransduction 동안 발생 및 모델을 피팅하는 것은 이러한 피크 응답, 타이밍 및 지연 감도 (14) 모델 파라미터의 비교를 가능하게 생화학 적 단계에 기초한다.

모델의 단점은 망막 circuitr 대한 가정에 의존한다는 것이다Y는만을 가정 할 수만큼 유익 할 수있다. 이러한 단점에 비추어, 파 운동 모델은 최근 파에게 역학 (32)를 지나치게 단순화에 대한 비판을 받아왔다. 감광체 변성 연구에서 ERG 파형 분석은 일반적으로 다른 이유로 수행되지 않는다. 광 수용체의 변성은 시각 기능 결과적으로, 파 및 b 파 매개 변수의 추가 분석이 보증되지 8,9,27,30에서 극적인 손실의 결과로, 종종 심한. 에 관계없이, 파 및 b 파의 ERG 모델링 많은 설치류 연구 및 망막 전위도 모델링에 대한 자세한 내용은 표준 관행으로 채택 된, 파를 들어, B 파 및 OPS는 후드, 검토에 의해 연구에서 찾을 수 있습니다 웨이 머스 및 Vingrys, Frishman 및 Wachtmeister 11,32-34에 의해 기사.

요약하면, 암순응 ERG 방법은 신경 보호와의 간섭없이 S 망막 변성 측정 간의 차이를 기록 할 수 제시원격 허혈 양상으로 UCH. 신뢰성 ERG 녹음 필수적인 요소 기술되었다. 광 수용체 및 내부 망막 기능의 망막 전위도의 측정은 망막의 변성을 공부하는 연구자 및 시각 기능에 다양한 유전자 바이오 의약품 및 약리 개입의 효과에 유용하다.

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Disclosures

조나단 스톤 CSCM Pty 주식 회사의 이사

Acknowledgements

저자는 설치류 모니터링, 처리 및 실험에서 부인 샤론 SPANA의 도움에 감사합니다. 박사 자금 지원은 비전에서 우수 시드니 대학과 호주 연구 센터에 의해 제공되고있다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware AD Instruments PL 35044 Acquistion of ERG
Animal Bio Amp AD Instruments FE 136 Amplifier for ERG
Lab chart AD Instruments Signal collection software
Ganzfield Photometric solutions FS-250A Light stimulus
Ganzfield operating system Photometric solutions
Research Radiometer International light technologies ILT-1700 calibrate light series
Lux meter LX-1010B check red light illumanation
Excel Microsoft
Lead wires AD Instruments Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator AD Instruments ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95% A&E metals postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet SDR E205 negative electode
26 G needle BD ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe Harvard Appartus 507222F
Atropine 1% w/v Bausch & Lomb topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v Bausch & Lomb topical anaesthetic
Visco tears eye drops Novartis carbomer polymer
Thread retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive Blu tac Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd muscle relaxant
Scale

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References

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Comments

3 Comments

  1. The article is very helpful to setup ERG to discriminate cone and rod electrical contributions. Could you please, let me know how can I access TABLE1 that it is mentioned in the article.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 14, 2016 - 2:00 PM
  2. Hi Marcelo,

    Below is a link to table 1 as a pdf file. Not the voltages used were based on our calibration, and you may need to adjust your voltage settings to reach equivalent light intensities.
    http://tiny.cc/he5vay

    Reply
    Posted by: Alice B.
    April 17, 2016 - 10:18 PM
  3. Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 18, 2016 - 10:19 AM

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