שימוש בelectroretinogram כדי להעריך את התפקוד ברשתית מכרסמים וההשפעות המגנות של האיבר המרוחק איסכמי אכשור קד

1Discipline of Physiology and Bosch Institute, Sydney Medical School, University of Sydney
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brandli, A., Stone, J. Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning. J. Vis. Exp. (100), e52658, doi:10.3791/52658 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

ERG הוא פוטנציאל חשמלי שנוצר על ידי הרשתית בתגובה לאור, ונרשם מפני הקרנית של העין. כאשר תנאים של הקלטה מנוהלים בקפידה, ERG ניתן להשתמש במגוון דרכים כדי להעריך את תפקוד רשתית. כאן אנו תיארנו כיצד להקליט את 'הבזק ERG', את הפוטנציאל שנוצר כאשר הרשתית חשופה לבזק קצר, בהיר מוצג ברקע Ganzfeld. Ganzfeld מפזר את אור homogenously והבזק של אור מגיע לכל הרשתית כ אחיד. אם הרשתית כהה מותאמת לפני ההקלטה, וכהה ההסתגלות נשמר כחיה מוכנה להקלטה, ERG הושג מופק על ידי שני קולטני האור המוט וחרוט.

יש פלאש ERG הכהה מותאמת גל אופייני, שכבר נותח בשתי דרכים. ראשון, מוקדם ומאוחרת רכיבים של צורת גל ERG כבר להבחין, וקשורים לרצף של נוירוןהפעלת אל ברשתית. הרכיב הראשון הוא קצר חביון פוטנציאל הולך שלילי, הגל (איור 1). זה ואחריו פוטנציאל הולך חיובי, נקרא ב-הגל. שלב העלייה של ב-גל תערוכות תנודות, שנחשבים רכיב נפרד (פוטנציאלי oscillatory או Ops). הגל נחשב שיופקו על ידי קולטני אור, ב-הגל על ידי תאים של שכבת הגרעין הפנימית, וOps על ידי תאי amacrine 1.

בהתבסס על כוח הגירוי, תגובות להבזקים מאוד עמומים כינו את תגובת סף scotopic אפשרית. תגובת סף scotopic הוא הבין שיופקו מתאי הגנגליון ברשתית 2-4. שנית, ניתן להפריד פלאש ERG על ידי הסתגלות אור, או על ידי פרוטוקול שני פלאש מתואר להלן, למרכיבי rod- ומונע קונוס. בתנאי photopic, הגל הוא לא להבחין בחולדות, כי אוכלוסיית קונוס היא נמוכה, אבל Ops וב-גל הואברור 5. בפרימטים, רשתיות שיש אוכלוסיות חרוט גבוהות, שני rod- ומסלולי cone- ליצור גל לזיהוי 6.

שני מדדים שימושיים לעתים קרובות מופקים פלאש ERG הם אמפליטודות של a- וB-גלים, נמדדה כמו באיור 1, עם תגובות אופייניות הבזק מוצגות באיור 2. כאשר אוכלוסיית קולטי האור מצטמצמת, לדוגמא על ידי חשיפה למזיקה בהיר אור, כל הרכיבים של ERG מופחתים. התערבויות neuroprotective, כגון מרוחק נפשית מראש איסכמי (RIP), יכולות להיות מאומתות על ידי השמירה על אמפליטודות של a- וB-גלים (איור 3). לסיכום, הניתוח של ERG מאפשר השוואות בין בריא, האור הפגום ורשתית neuroprotected.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של אוניברסיטת סידני.

1. אלקטרודות ביצוע

  1. לבנות את האלקטרודה החיובית (אחד שייצור קשר עם הקרנית) מאורך קצר (5 סנטימטרים) של חוט פלטינה 1-2 מ"מ קוטר. אופנה אותו ללולאה כמה מ"מ קוטר. חבר לולאה זה ליתרון קונבנציונלי, מספיק זמן כדי להגיע לשלב הקלט של המגבר שלך (ראה איור 4).
  2. לבנות את האלקטרודה השלילית (שילך בפיו של בעל החיים) באמצעות Ag / AgCl גלולה 1-2 מ"מ בקוטר, קשור גם ליתרון אמנה (ראה איור 4).
  3. כאלקטרודה התייחסות (שתיכנס לעכוזו של בעל החיים), להשתמש במחט מזרק נקייה (23 G), קשורה גם ליתרון של אורך המתאים (ראה איור 4).
  4. באופן אידיאלי, להשתמש בכבלים שלוש-עופרת מסופקים על ידי יצרני מכשיר, להתחבר שלוש אלקטרודות (U החיובי94; קרנית, שלילי → פה, התייחסות → עכוז) למגבר.

2. חיבור וכיול של גירוי האור וERG סט-אפ

  1. צור (או אתר) מעבדה הקלטה קטנה, אשר יכול להתבצע כהה. לצייד עם שניהם אור מעל לספסל עשה אדום או ראש-מנורה אדומה או או.
  2. השתמש מטר סוויטה דה לוקס כדי לאשר שהארת האור האדומה מגיעה עין של החולדה במהלך ההתקנה אינו עולה על לוקס 1.
    הערה: מסנן צפיפות ניטראלי יכול לשמש כדי להפחית מנורת בהירות והמקור של אור המנורה חייב במיוחד פולט אור אדום. adaption הכהה תהיה בסכנה אם מקורות אור פולטי אורכי גל נמוכים (גלוי).
  3. לאטום את כל האור התועה שנכנס למעבדה ההקלטה (זה לעתים קרובות דורש התמדה עם קלטת אטומה) ולהכין מסנן צפיפות ניטראלי (זה ניתן לרכוש בגיליונות) גדול מספיק כדי להתאים מעל, וכך עמום, כל מסך מחשב יהיה לך ב מעבדה.
    הערה: אור תועה והאור של מסך יש בם כדי לפגוע בהסתגלות כהה של העין החולדה.
  4. חבר את המגבר לחומרת רכישת נתונים. חבר מוביל חיובי, שלילי והתייחסות למגבר. ודא שהמחשב ויחידת אספקת חשמל Ganzfeld LED מחובר היטב למקור קרקע.
    הערה: מעבדות חלקם מתמחים נקודות הארקה, מחוברים לקרקע בניין; צינור מים הוא אלטרנטיבה יעילה.
  5. לכייל את מקור אור LED עם מד קרינת מחקר באיכות. תקן החיישן של המטר במצב שבו העין של החיה תהיה ממוקמת בניסוי.
  6. תכנית נוריות Ganzfeld להפעיל פרוטוקול ERG שדה מלא עם עליות צעד חכם באנרגיית הבזק, הבזק משך, הבזק חזרה וזמן בין הבזקים, מכונה מרווח interstimuls (ISI), הגדרות. לדוגמא פרוטוקול מלא שדה ראה טבלה 1.
    הערה: השדה מלא הבזקי ERG להגדיל מהבזקים עמומים חוזר על עצמו לbהבזקים תקין באופן חכם צעד. תכנית הבזק התאום הבאה על מפרוטוקול השדה המלא ומאפשרת בידוד של תגובות מוט וחרוט.

3. יום לפני הניסויים ERG

  1. Dark להסתגל Sprague-Dawley חולדות לשעה 12 לפני ההקלטה. זה נוח לעשות את זה במעבדה ההקלטה, פעם אור תועה כבר בוטל.

4. יום של ניסויים ERG

  1. לארגן את החיה להיות בעדינות מחוממת בעת ההקלטה. אנו משתמשים בפלטפורמת מתכת אור הבנויה כך שהראש של החיה יכול לנוח בנקודה הנכונה בכניסה לGanzfeld. יש פלטפורמת צינורות מובנים שבאמצעותו אנו לשאוב מים שחומם מראש ל 40 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    הערה: הניסיון מראה שזה שומר על טמפרטורת הליבה של החיה על 37 מעלות צלזיוס.
  2. לשקול את העכברוש בתנאים חשוכים. שיא במשקל ולהפוך את קטמין הנכון (60 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (5 מ"ג / קילוגרם) במינון. לרסן את העכברוש gently ולהזריק חומר ההרדמה intraperitoneally.
  3. הערה זמן הזרקה. ברגע שבעלי החיים הוא לא מודע (בדרך כלל תוך 5 דקות) לבדוק לעומק של הרדמה על ידי צביטה קלה כרית רגל אחת, כדי לראות אם תגובת רפלקס היא הווה. עדיף לחכות עד שרפלקס זה הוא נעדר או חלש, לפני שתמשיך.
  4. החל טיפה אחת של אטרופין ועוד proxmethacaine לקרנית.
  5. לחתוך באורך 10 סנטימטר של חוט שחור. לעשות לולאה עם קשר פשוט ולהחליק את הלולאה מעל קו המשווה של העין. הדק אותו מעט; ההשפעה היא למשוך את גלגל העין מעט קדימה, עם לחץ מינימאלי. הדבר זה שומר את הקרנית ברורה מהעפעפיים.
  6. טיפות עיני קרבומר יחולו על פני השטח של הקרנית. ודא קרבומר נשאר על פני השטח של קרנית ולא לשפוך על העפעפיים או הפנים.
  7. הנח מצעים סופגים על גבי פלטפורמה מחוממת.
  8. עכברוש עמדה על המצעים, עם הראש במקום המומלץ בפתיחת Ganzfeld.
  9. int הכנסבדיקה טמפרטורת ernal לתוך פי הטבעת. בדיקה מאובטחת טמפרטורה בעמדה ידי מקליטה כבל בדיקה לזנב.
  10. הכנס את האלקטרודה ההתייחסות (מחט 23 G) תת עורי לרגל האחורית, ולהתחבר למגבר.
  11. מניחים את האלקטרודה השלילית (גלולה Ag / AgCl) מאובטח בפה. כדי למנוע זאת מחליקה את הפה, להדביק את ההובלה בחיבור למשטח יציב.
  12. מקם את האלקטרודה החיובית על המרכז של הקרנית. באמצעות micromanipulator, להבטיח כי האלקטרודה נוגעת הקרנית בעדינות.
  13. טמפרטורת גוף בדוק היא ב37.0-37.5 מעלות צלזיוס.
  14. ברגע שבעלי החיים ממוקם כראוי ואלקטרודות נמצאות במקום, לעטוף את ההתקנה כולה (Ganzfeld ובעלי חיים) עם חומר אטום (לשמר הסתגלות כהה). אנו משתמשים בבד שחור רך.
  15. ברכישת התוכנה להגדיר בקצב דגימה 2 קילוהרץ עם זמן אוסף של 100-1,000 msec עם 5 אלפיות השניים של דגימה מראש אוסף. הגדר את המסננים לעבור להקה ל1-1,000הרץ ולהבטיח דגימה שמופעל כדי לטעום את התקופה ~ 250 אלפיות השנייה הבא פלאש.
  16. בדוק את בסיס ההקלטה. זה צריך להיות חופשי של רעש מיותר, אבל להראות קצת רעש מגבר ותנודה בדרכי הנשימה.
  17. אם בסיס תערוכות רעש מיותר, להתחיל פתרון בעיות. רוב הבעיות הקשורות לזליגה בעמדת אלקטרודה, או הארקה. השתמש כלוב פאראדיי כדי להבטיח הקלטות הן ללא רעש מיותר.
  18. הפעל הבזק בדיקה, 0.4 יומן סקוטי cd.sm -2. גל ERG דומה לאיור 2A אמור להופיע. בתגובות האופייניות המעבדה שלנו לcd.sm -2 הבזק סקוטי 0.4 יומן הם (גל: -474 ± 39 μV וב-גל: 1,512 ± 160 μV, n = 11).
  19. לאפשר לבעלי חיים לכהים מחדש להסתגל במשך 10 דקות. זה נוח לשימוש 10 דקות אלה לבדוק שוב את נקודת ההתחלה.
  20. האישור הבא של אות יציבה להתחיל בהקלטה.
  21. בסוף פגישת ההקלטה, לבדוק שטמפרטורות הגוףיור נשמר. הסר אלקטרודות. מרח את קרם פולימר קרבומר לקרניות. לאפשר לבעלי החיים להתאושש על כרית חום עד שהוא נייד ופעיל באופן מלא, לפני שתחזור לדיור בעלי חיים.

5. איסכמיה מרחוק

  1. בצע איסכמיה המרוחקת בשני מכרסמים ער או anesthetised.
  2. אם בעל החיים מורדמים, להניח אותה על פלטפורמה מחוממת (לעיל) ולהחליק את שרוול מד לחץ דם על החלק העליון של האיבר האחורי-, ברור של הברך.
  3. אם בעלי החיים המשמשים לטיפולו, ניתן לבצע הליך זה ללא הרדמה; זה דורש שני אנשים. אדם אחד מרסן את החיה בעדינות והשנייה חל שרוול מד לחץ דם ומפעיל את מד לחץ דם.
  4. לבעלי חיים ער, להשתמש פיסת המגבת ~ 15 סנטימטרים x 30-50 סנטימטר לעטוף בעדינות את החיה, עם hindlimb אחד חינם. הנח את החיה על גבה על (נניח) זרוע השמאל, עם הראש שלו תחוב בין זרועו של בעל ופלג הגוף עליון, ומקוםהשרוול שכתואר.
  5. להוציא את האוויר השרוול ולהבטיח את שסתום לחץ האוויר סגור. לשאוב את השרוול עד 160 מ"מ כספית בבעלי החיים anesthetised, ועד 180 מ"מ כספית בבעלי חיים ער. זה עולה לחץ הסיסטולי (בדרך כלל 140 מ"מ כספית ו -160 מ"מ כספית בהתאמה).
  6. לשמור על לחצים אלה כנדרש, תוך שימוש במשאבת כף היד.
  7. לאחר הזמן המתוכנן לאיסכמיה (אנו משתמשים 2 תקופות של 5 דקות מופרדות על ידי 5 reperfusion דקות), להוציא את האוויר בלחץ השרוול על ידי שחרור שסתום לחץ האוויר.
  8. אשר את ההשפעה של איסכמיה מרחוק עם בדיקה טמפרטורת עור מחוברת לשודד. טמפרטורת עור בדרך כלל נופלת 32-30 מעלות צלזיוס, במשך 5 דקות ומתאוששת בreperfusion.

6. נזק קל

  1. ודא שחולדות נמצאות בלפני הלילה כהה מותאם, הליך נזק קל.
  2. בזמן המתאים הבא איסכמיה איבר (בניסויים שלנו ללא דיחוי), כל חיה ממוקמת ביחידות לתיבות פרספקס, wiמים ה ומזון במכלים מבוסס רצפה.
    הערה: נזק הנגרם אור יכול להתבצע רק בבעלי החיים לבקן.
  3. לעבור על אור לבן 1,000 לוקס-מכויל מראש בזמן סטנדרטי (בדרך כלל 09:00) ולשמור על מצב זה למשך 24 שעות.

7. ERG הפקת נתונים וניתוח

  1. לרכוש צורות גל בממוצע של ERG. במידת צורך, נכון לתחילת מחקר אינו אפס, על ידי חיסור.
  2. מדוד את משרעת של הגל (שהוצג באמצע לעוצמות גירוי גבוהות), כהפרש בין המתח הבסיסי והראשון (<30 אלפיות השני חביון) שוקת (איור 1).
  3. מדוד את משרעת ב-גל כהפרש בין המתח לשיא של הגל והחיובי של הגל הבא, בדרך כלל המתרחש בהשהיה של 80-100 אלפיות שני (איור 1).
  4. לבודד פוטנציאלי oscillatory באמצעות התמרת פורייה לסנן נתונים 60-235 הרץ, עם להקת מעבר 90 הרץ
  5. הזמן הסמוי (חביון) של פסגות a- וב-גל יכול להיות גם אמצעי שימושי (איור 1). השתמש בהבזקי התאום לבודד את תגובת המוט. הפחת את תגובת קונוס (פלאש 2) מהתגובה המעורבת (פלאש 1) כדי לבודד את תגובת המוט (איור 2).
  6. לנרמל עוצמת אור בודדת-גל ואמפליטודות ב-גל (לאחר טיפול / פוסט-טיפול-בסיס) או בממוצע לקבוצות טיפול. עקומות עוצמת תגובת העלילה אמפליטודות הקבוצה וטעייה נגד הבזק אנרגיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול יכול לשמש למדידת תפקוד ראייה של רשתית המכרסמים in vivo. הגל, מדד לתפקוד קולטי האור, וב-הגל, מדד לתפקוד רשתית פנימי, הם מבואר באיור 1.

עליות-נשלט מוט ERG האות עם גירוי האור הגובר, כפי שמוצג באיור 2 א. הגל מתברר ב~ cd.sm סקוטי 0.4 יומן -2 ואת המשרעת של העליות-הגל עד רוויה בcd.sm סקוטי 2.5 יומן -2 (לא מוצג). הפרדיגמה הבזק התאום נעשתה שימוש כדי להפריד אות ERG מעורבת בתגובה חרוט והמבודד מוט, כמו באיור 2.

טכניקת הקלטה זו ERG יכול לשמש כדי לבדוק התערבויות נוירו. הקלטות Baseline הושלמו בשבוע שלפני נזק אור נראה באיור 3 א. נזק קל המופחת שני-גל ואמפליטודות ב-גל, הפגין באיור3B יור. נפשית מראש איסכמי מרחוק היה מסוגל להפחית את האובדן של משרעת ERG, כפי שניתן לראות באיור 3 ג. טכניקת איסכמיה מרחוק תלויה ביישום הנכון של חוסם עורקים מעל "הברך". יישום לא נכון של חוסם עורקים אינו מונע נזק קל לרשתית, כפי שניתן לראות באיור 3D.

איור 1
איור 1: מדידה של הגל ו- B-גלים מERG העקבות כהות מותאם הראו נרשם מהקרנית של העין כהה מותאמת לבזק האור בהיר שניתן בt0 הזמן שמוצג.. המשרעת של הגל נמדדת מנקודת ההתחלה לשוקת הראשונה (חץ אדום). המשרעת של B-הגל נמדדת מהשפל של הגל לשיא הבא החיובי (חץ כחול). זמן סמוי (חביון) נמדד מהגירויartefact (t0) עד לנקודה של ריבית על העקבות, כגון השוקת של הגל (הסוגר מרובע). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: פיתוח של ERG הכהה מותאם עם כוח הבזק הגדלת והפרדה של תגובות מוט חרוט העקבות הראו נרשמים מהקרנית של העין כהה מותאם להגדלת הבזקי אור.. הגל מופיע בעוצמות בהירות. (א) בהשוואה 1.4-0.4 יומן סקוטי cd.sm -2, ב-גל השיא כבר רווי אבל הגל ממשיך לגדול. ב( ב '), הבזקי התאום הם כיסו. שתי cd.sm סקוטי 2.0 יומן -2 ההבזקים מופרדים על ידי ISI msec 500. פלאש הראשון יוצר מעורבתגובה (שחור), והבזק השני יוצר תגובה חרוטה בלבד (קו מקווקו). הפחתת תגובת קונוס מניבה תגובה המבודדת מוט (האפורה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: ERG מספק מידה מסוימת של התפקוד של רשתית גל נציג מוצג כאן לרשתית נורמלית (), (ב) נפגע הרשתית על ידי אור, (ג) רשתית מותנית על ידי RIP לפני שנחשף לאור המזיק, ו. רשתית (ד ') על ידי מזגן לא יעיל RIP ולאחר מכן נחשפה לאור מזיק. אותה אנרגיית הבזק שימשה עבור כל רשומה (-2 cd.sm 2.0 יומן). לשיא בD שרוול הלחץעל הגפיים האחוריות הוצב באופן שגוי ואיסכמיה לא הוקמה. נזק קל מפחית את המשרעת של ERG (B) וRIP ממתן את הירידה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4:. סגור את האלקטרודות ERG אלקטרודות להיבנות מוצגות משמאל לימין; האלקטרודה החיובית לפנות לקרנית, האלקטרודה השלילית כדי להיות ממוקמת בפה ואת האלקטרודה ההתייחסות שמורכבת מקליפ תנין מחובר למחט שמוחדרת מתחת לעור אז לעכוז. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטת ERG הכהה מותאמת הבזק שתוארה לעיל היא שיטה אמינה להערכת תפקוד רשתית בחולדות. שני-הגל ו- B-הגל הופחתו נזק קל. מרחוק נפשית מראש איסכמי מיתנו ירידות מושרה נזק קלים ב- הגל ו- B-גל. שימור זה של תפקוד רשתית עולה כי נפשית מראש איסכמי מרחוק מושרה neuroprotection, מזכיר צורות אחרות של מגן נפשית מראש כגון היפוקסיה, איסכמיה ופעילות גופנית 8-10. אות ERG נרשמה נקבעה על ידי שלוש קבוצות של גורמים - הגדרת ההקלטה, פרמטרים של גירוי האור, והמצב של בעלי החיים.

הגדרת הקלטה

ERG מצטמצם במשרעת כאשר האלקטרודות מונחות בצורה לא נכונה או ההכנה מעוגנת 11 חלקית. הארקה נכונה של ציוד חשמלי בקרבת המקום חשובה, כדי להפחית את הרעש בהקלטה; אם רעש משמעותי נמשך פָרָדאיי יש להשתמש כלוב. האלקטרודה החיובית צריכה להיות ממוקמת היטב במרכז של הקרנית עם אישור של עמדת בדיקה לפני תחילת הפרוטוקול מלא שדה ERG ובהשלמה. חשוב שקשר זה אלקטרודה רק הקרנית; קשר עם העפעף או אפילו שפם יכול להפחית משרעת אות. חוט כותנה רפוי נעשה שימוש בפרוטוקול זה כדי למנוע את העפעפיים מלגעת האלקטרודה החיובית. חוקרים אחדים פיתחו עדשות מגע עם האלקטרודה החיובית המוטבעת על מנת להבטיח קשר אמין ומניעת של 12 נגיעת עפעף.

גירוי האור להגדיר

ממריץ השתמשנו מספק אור לבן ספקטרום רחב, ממקורות LED. מקורות אור אחרים מתאימים כמו גירויי אור כגון תאורת קסנון והבזק תאורת הלוגן, לראות Weymouth וVingrys להשוואות בין גירויי אור 11. היתרון של אור LED, לעומת זאת, אניזה שמשך הזמן של כל הבזק והאנרגיה שלה בקלות ובמהירות לתכנות לאפס על פני טווח רחב של עוצמות אור. פיתחנו סדרה של הבזקים של אנרגיה מדורגת, אשר בטווח המכרסמים הכהה מותאמת מסף (ייצור תגובה רק-לזיהוי) ללהרוות (ייצור תגובה מקסימלי).

על ידי ניסוי וטעייה, הקמנו interstimulus מרווחים (ISIS) אשר להבטיח שהמשרעת של תגובה לבזק היא עצמאית של הבזק הקודם של אותה העצמה. הבזק בהיר, כבר ISI הנדרשת לעצמאות זו.

גם על ידי ניסוי וטעייה הקמנו מספר מינימאלי של תגובות הנדרשות בכל אנרגיה כדי לספק אות נקייה. יותר תגובות בממוצע תמיד תספק אות נקיה יותר. אנו משתמשים במינימום כך שסדרת האנרגיה ניתן להשלים במהירות (בדקות 11 פרוטוקול שלנו); השלמתה המהירה מפחיתה וריאציה עקב שינויים במדינה וההרדמה allows הזמן למשתנים אחרים שלמד, במידת הצורך.

המדינה לבעלי החיים

כמה פרמטרים של הפיסיולוגיה של בעלי החיים הם חשובים כדי לייעל ולתקנן את הקלטות ERG הושגו.

טמפרטורה

האות-הגל שנוצר מההפעלה מושרה האור של מפל phototransduction G- חלבון בקטע החיצוני; הדינמיקה של מפל זה היא, כמו כל התגובות אנזימטיות, טמפרטורה תלויה 13,14. מכרסמים תחת הרדמה נוטים היפותרמיה ודורשים חימום חיצוני כדי לשמור על טמפרטורת ליבה של 37.5 מעלות צלזיוס לאורך כל ההקלטה. אם טמפרטורת גוף נופלת יותר מ 1-2 מעלות צלזיוס, אמפליטודות-הגל ו- B-גל להקטין ולהגדיל את השיהוי שלהם 15.

הרדמה

הקלטות ERG יציבים דורשות בעלי החיים להיות ללא תנועה. חוסמי וanaesthet Neuromuscularסוכני IC המשמשים בניסויים ERG להשיג מדינת מחוסר הכרה וללא תנועה. היו רק חמישה דיווחים של הקלטות ERG ערה בחולדות 16-20. במחקרים אלה, אלקטרודות היו בניתוח מראש מושתלות לתוך הגולגולת ושני המחקרים הללו בדקו את ההשפעה של הרדמה על ERG 17,20.

ההרדמה הנפוצה ביותר בשימוש להקלטות ERG הייתה שילוב של קטמין ו xylazine (בניסויים שלנו 60 מ"ג / קילוגרם של קטמין ו5 מ"ג / קילוגרם של xylazine משמש). זה משפיע על ERG פחות מisoflurane כגון הרדמה גזים והלותן, והוכיח יחסית לא רעיל, עם שיעורי החלמה גבוהים 17,21,22. גישה זו שומרת נייחת בעלי החיים ל~ 40 דקות; מחצית מינון יכול לשמש כדי להרחיב את תנאי הקלטה לתקופה דומה. המחקר של צ'אנג לעומת ישירות ERG עם ובלי הרדמה, והראה כי קטמין-xylazine אין מדידה לטרוד את המשרעת ושיהוי של a- וB-גלים 17. רוב החוקרים לתקן תנאי הרדמה ולאחר מכן לבדוק פרמטרים של ניסוי; כמה השפעה של חומרי הרדמה לא ניתן לשלול לחלוטין.

סביבת Ocular

הפיסיולוגיה של העין דורשת תחזוקה, כדי לייעל ולתקנן הקלטת ERG. התלמידים צריכים להיות בגודל סטנדרטי; זו מושגת עם mydriatic, הוחל כטיפי עיניים, כדי להשיג התרחבות מקסימלי. במכרסמים, אטרופין או phenylephrine משמש 23. הידרציה של הקרנית מתוחזק על ידי יישום של פולימר קרבומר לפני הקלטות; זה גם מייצב מוליכות חשמליות בין האלקטרודה החיובית והקרנית. אם הקרנית הופכת להיות מיובשת, היווצרות צלקות וקטרקט קרנית עלולה להתרחש 24. היווצרות קטרקט היא שכיחה יותר בעכברים 25, ושיטות שונות של שמירה על לחות קרנית כבר מועסקות בהקלטות ERG עכבר, כוללים זרימה מתמדת של נוזל או מימייםאלקטרודות מחוייט קשר סגנון שלחות מלכודת על פני השטח של קרנית 12.

מדינת הסתגלות של רשתית

זה משתנה משמעותי. הפרוטוקול המפורט לעיל נועד להבטיח כי הרשתית היא כהה מותאם, למדינה רגישה ביותר שלה. באופן אידיאלי, חולדות פיגמנט נדרשו 3 שעות של דיור כהה להיות כהה מותאם באופן מלא תוך חיות הלא-פיגמנט, כגון חולדות ספראג Dawley, דורשות מינימום של 5 שעות 26. זה מקובל להקלטות ERG scotopic להתאים בעלי חיים לילה לשעה 12. הסתגלות חלקית או מלאה לאור ניתן להשיג בקלות ובמהירות על ידי הפעלת אור רקע עוצמת סטנדרטית בממריץ Ganzfeld. לאחר הסתגלות קלה, עם זאת, הסתגלות כהה מלאה לוקחת שעות כדי להשיג; לכן ההצעה של זהירות רבה על מנת להבטיח כי העיניים לא נחשפו בטעות לאור לפני ההקלטה.

טכניקת הקלטת ERG מוגבלת על ידימעל גורמי קביעה (כלומר, הגדרת ERG וגירוי) והמיומנות של החוקר בבדיקת ERG. חוקרים מנוסים עשויים להיות להם הקלטות ERG משתנים. שונות יכולות להיות מופחתות על ידי יצירת גדלי מדגם גדולים מספיק כדי להשוות את תוצאות, כגון הפחתה או רווחים בתפקוד ראייה. לחלופין, יכולות להיות מנורמלות הקלטות ERG בין הקלטות תחילת המחקר והקלטות שלאחר טיפול. אז יכולים להיות מקובצים נתונים מנורמלים ונותחו. בעת הצגת נתוני ERG, זה מקובל להציג נתונים קבוצה וגל נציג.

כאשר כל האמור לעיל נשלטים בקפידה, המשרעת של ERG היא מדד למצב התפקודי של הרשתית. ERG מצטמצם באופן עקבי במשרעת ידי דלדול שכבת קולטי האור הנגרמת על ידי נזק קל או ניוון מושרה גנטי 27,28. לעומת זאת, ההשפעה המגנה של התערבות כגון RIP יכולה להיות מזוהה בamplitude של ERG 29. ERG שימש גם במדגים את ההשפעות המגנות של נפשית מראש איסכמי, נפשית מראש חוסר חמצן, פעילות גופנית, תזונה וזעפרן על 8-10,30 הרשתית.

גידול ידע של הדינמיקה של מפל phototransduction של רודופסין, ושל הקשרים סינפטיים של הרשתית, עודד פיתוח המודלים של דור ERG, וניתוח צורת גל ERG מתוחכם אפשרי למרות דוגמנות הקינטית המבוסס על אירועים פיסיולוגיים ידועים של phototransduction בקולטני אור , וההבנה של מעגלי רשתית פנימיים 31. לדוגמא, המודלים הקינטית-הגל מבוססים על המדרגות ביוכימיים המתרחשים במהלך phototransduction והולם את המודל מאפשרת השוואות של פרמטרים מודל כגון תגובות שיא, עיכובי עיתוי ורגישות 14.

החסרון של דוגמנות הוא שהיא מסתמכת על הנחות לגבי circuitr רשתיתy, ויכול רק להיות אינפורמטיבי כמו ההנחות לאפשר. לאור חסרון זה, המודל הקינטית-גל זכה לביקורת לאחרונה לפשטני מדי-גל דינמיקה 32. במחקרי ניוון קולטי האור, ניתוח צורת גל ERG הוא בדרך כלל לא בוצע מסיבה אחרת. ניוון קולטי האור הוא לעתים קרובות קשה, וכתוצאה מכך הפסדים דרמטיים בתפקוד חזותי ו8,9,27,30 כתוצאה מכך, ניתוח נוסף של גל ופרמטרים ב-גל אינו מוצדק. ללא קשר, דוגמנות ERG של הגל והגל ב-אומצה כמקובל במחקרים במכרסמים רבים ומידע מפורט על דוגמנות ERG, ל- גל, ניתן למצוא ב-גל וOps במחקרים על ידי הוד, וביקורת מאמרים של Weymouth וVingrys, פרישמן, ואוברווכטמייסטר 11,32-34.

לסיכום, שיטת ERG הכהה מותאם הציגה יכולה להקליט הבדלים מדידים בין ניוון רשתית עם ובלי התערבויות של נוירוuch כמו נפשית מראש איסכמי מרחוק. המרכיבים החיוניים להקלטות ERG אמינות תוארו. מדידות ERG של קולטי האור ותפקוד רשתית פנימי שימושיות לחוקרים לומדים degenerations של הרשתית, ואת ההשפעות של התערבויות גנטיות, ביולוגיות ותרופתיות שונות על תפקוד ראייה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יונתן אבן היא מנהל CSCM Pty Ltd

Acknowledgements

המחברים מודים לסיוע של הגב 'שרון Spana בניטור מכרסמים, טיפול וניסויים. תמיכה במימון דוקטורט כבר ניתן על ידי אוניברסיטה של ​​סידני ואוסטרלי מרכז מחקר למצוינות בחזון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware AD Instruments PL 35044 Acquistion of ERG
Animal Bio Amp AD Instruments FE 136 Amplifier for ERG
Lab chart AD Instruments Signal collection software
Ganzfield Photometric solutions FS-250A Light stimulus
Ganzfield operating system Photometric solutions
Research Radiometer International light technologies ILT-1700 calibrate light series
Lux meter LX-1010B check red light illumanation
Excel Microsoft
Lead wires AD Instruments Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator AD Instruments ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95% A&E metals postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet SDR E205 negative electode
26 G needle BD ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe Harvard Appartus 507222F
Atropine 1% w/v Bausch & Lomb topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v Bausch & Lomb topical anaesthetic
Visco tears eye drops Novartis carbomer polymer
Thread retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive Blu tac Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd muscle relaxant
Scale

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arden, G. B., Heckenlively, J. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. MIT Press. 139-183 (2006).
  2. Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. Journal of Physiology-London. 555, (1), 153-173 (2004).
  3. Fortune, B., et al. Selective ganglion cell functional loss in rats with experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, (6), 1854-1862 (2004).
  4. Alarcon-Martinez, L., et al. Short and long term axotomy-induced ERG changes in albino and pigmented rats. Molecular Vision. 15, (254-255), 2373-2383 (2009).
  5. Lyubarsky, A. L., et al. Functionally rodless mice: transgenic models for the investigation of cone function in retinal disease and therapy. Vision Research. 42, (4), 401-415 (2002).
  6. Bush, R. A., Sieving, P. A. A PROXIMAL RETINAL COMPONENT IN THE PRIMATE PHOTOPIC ERG A-WAVE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35, (2), 635-645 (1994).
  7. Liu, K., et al. Development of the electroretinographic oscillatory potentials in normal and ROP rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, (12), 5447-5452 (2006).
  8. Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, (3), 1348-1354 (2003).
  9. Lawson, E. C., et al. Aerobic Exercise Protects Retinal Function and Structure from Light-Induced Retinal Degeneration. Journal of Neuroscience. 34, (7), 2406-2412 (2014).
  10. Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8, (7), 718-724 (2002).
  11. Weymouth, A. E., Vingrys, A. J. Rodent electroretinography: Methods for extraction and interpretation of rod and cone responses. Progress in Retinal and Eye Research. 27, (1), 1-44 (2008).
  12. Bayer, A. U., Cook, P., Brodie, S. E., Maag, K. P., Mittag, T. Evaluation of different recording parameters to establish a standard for flash electroretinography in rodents. Vision Research. 41, (17), 2173-2185 (2001).
  13. Pugh, E. N., Lamb, T. D. AMPLIFICATION AND KINETICS OF THE ACTIVATION STEPS IN PHOTOTRANSDUCTION. Biochimica Et Biophysica Acta. 1141, (2-3), 111-149 (1993).
  14. Breton, M. E., Schueller, A. W., Lamb, T. D., Pugh, E. N. ANALYSIS OF ERG A-WAVE AMPLIFICATION AND KINETICS IN TERMS OF THE G-PROTEIN CASCADE OF PHOTOTRANSDUCTION. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35, (1), 295-309 (1994).
  15. Mizota, A., Adachi-Usami, E. Effect of body temperature on electroretinogram of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, (12), 3754-3757 (2002).
  16. Szabo-Salfay, O., et al. The electroretinogram and visual evoked potential of freely moving rats. Brain Research Bulletin. 56, (1), 7-14 (2001).
  17. Charng, J., et al. Conscious Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potentials in Rats. Plos One. 8, (9), (2013).
  18. Galambos, R., Juhasz, G., Kekesi, A. K., Nyitrai, G., Szilagyi, N. NATURAL SLEEP MODIFIES THE RAT ELECTRORETINOGRAM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (11), 5153-5157 (1994).
  19. Galambos, R., Szabo-Salfay, O., Szatmar, E., Szilagyi, N., Juhasz, G. Sleep modifies retinal ganglion cell responses in the normal rat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (4), 2083-2088 (2001).
  20. Guarino, I., Loizzo, S., Lopez, L., Fadda, A., Loizzo, A. A chronic implant to record electroretinogram, visual evoked potentials and oscillatory potentials in awake, freely moving rats for pharmacological studies. Neural Plasticity. 11, (3-4), 241-250 (2004).
  21. Huang, J. C., Salt, T. E., Voaden, M. J., Marshall, J. NON-COMPETITIVE NMDA-RECEPTOR ANTAGONISTS AND ANOXIC DEGENERATION OF THE ERG B-WAVE IN-VITRO. Eye (London). 5, (4), 476-480 (1991).
  22. Sasovetz, D. KETAMINE HYDROCHLORIDE - EFFECTIVE GENERAL ANESTHETIC FOR USE IN ELECTRORETINOGRAPHY. Annals of Ophthalmology. 10, (11), 1510-1514 (1978).
  23. Mojumder, D. K., Wensel, T. G. Topical Mydriatics Affect Light-Evoked Retinal Responses in Anesthetized Mice). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, (1), 567-576 (2010).
  24. Fraunfel, F. t, Burns, R. P. ACUTE REVERSIBLE LENS OPACITY - CAUSED BY DRUGS, COLD, ANOXIA, ASPHYXIA, STRESS, DEATH AND DEHYDRATION. Experimental Eye Research. 10, (1), 19 (1970).
  25. Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. ACUTE REVERSIBLE CATARACT INDUCED BY XYLAZINE AND BY KETAMINE-XYLAZINE ANESTHESIA IN RATS AND MICE. Experimental Eye Research. 42, (4), 331-337 (1986).
  26. Behn, D., et al. Dark adaptation is faster in pigmented than albino rats. Documenta Ophthalmologica. 106, (2), 153-159 (2003).
  27. Sugawara, T., Sieving, P. A., Bush, R. A. Quantitative relationship of the scotopic and photopic ERG to photoreceptor cell loss in light damaged rats. Experimental Eye Research. 70, (5), 693-705 (2000).
  28. Machida, S., et al. P23H rhodopsin transgenic rat: Correlation of retinal function with histopathology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, (10), 3200-3209 (2000).
  29. Brandli, A., Stone, J. Remote Ischemia Influences the Responsiveness of the Retina. Observations in the Rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, (4), 2088-2096 (2014).
  30. Maccarone, R., Di Marco, S., Bisti, S. Saffron supplement maintains morphology and function after exposure to damaging light in mammalian retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, (3), 1254-1261 (2008).
  31. Hood, D. C., Birch, D. G. Assessing abnormal rod photoreceptor activity with the a-wave of the electroretinogram: Applications and methods. Documenta Ophthalmologica. 92, (4), 253-267 (1996).
  32. Robson, J. G., Frishman, L. J. The rod-driven a-wave of the dark-adapted mammalian electroretinogram. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 1-22 (2014).
  33. Hood, D. C., Birch, D. G. A COMPUTATIONAL MODEL OF THE AMPLITUDE AND IMPLICIT TIME OF THE B-WAVE OF THE HUMAN ERG. Visual Neuroscience. 8, (2), 107-126 (1992).
  34. Wachtmeister, L. Oscillatory potentials in the retina: what do they reveal. Progress in Retinal and Eye Research. 17, (4), 485-521 (1998).

Comments

3 Comments

  1. The article is very helpful to setup ERG to discriminate cone and rod electrical contributions. Could you please, let me know how can I access TABLE1 that it is mentioned in the article.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 14, 2016 - 2:00 PM
  2. Hi Marcelo,

    Below is a link to table 1 as a pdf file. Not the voltages used were based on our calibration, and you may need to adjust your voltage settings to reach equivalent light intensities.
    http://tiny.cc/he5vay

    Reply
    Posted by: Alice B.
    April 17, 2016 - 10:18 PM
  3. Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 18, 2016 - 10:19 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics