कृंतक रेटिना और रिमोट अंग इस्केमिक शर्त के सुरक्षात्मक प्रभाव में समारोह का आकलन करने के लिए Electroretinogram का प्रयोग

1Discipline of Physiology and Bosch Institute, Sydney Medical School, University of Sydney
Neuroscience

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Brandli, A., Stone, J. Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning. J. Vis. Exp. (100), e52658, doi:10.3791/52658 (2015).

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Abstract

Introduction

एर्ग प्रकाश के जवाब में रेटिना द्वारा उत्पन्न की, और आंख की कॉर्निया की सतह से दर्ज एक विद्युत क्षमता है। रिकॉर्डिंग की शर्तों को ध्यान से प्रबंधित कर रहे हैं, एर्ग रेटिना समारोह का आकलन करने के तरीकों की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ हम 'फ्लैश एर्ग', रेटिना एक Ganzfeld पृष्ठभूमि में प्रस्तुत एक संक्षिप्त, उज्ज्वल फ्लैश के संपर्क में है जब उत्पन्न संभावित रिकॉर्ड करने के लिए कैसे का वर्णन किया। Ganzfeld homogenously प्रकाश disperses और प्रकाश की फ्लैश लगभग समान रूप से पूरे रेटिना तक पहुँचता है। रेटिना रिकॉर्डिंग से पहले अंधेरे अनुकूलित है, और जानवर रिकॉर्डिंग के लिए तैयार किया जाता है के रूप में अंधेरा-अनुकूलन बनाए रखा जाता है, तो एर्ग दोनों रॉड और कोन फोटोरिसेप्टर द्वारा उत्पन्न होता है प्राप्त की।

काले अनुकूलित फ्लैश एर्ग दो तरीकों से विश्लेषण किया गया है जो एक विशेषता तरंग है। सबसे पहले, एर्ग तरंग की जल्दी और देर घटकों प्रतिष्ठित है, और न्यूरॉन के अनुक्रम से संबंधित कर दिया गया हैरेटिना में अल सक्रियण। जल्द से जल्द घटक एक छोटी-विलंबता नकारात्मक जा रहा संभावित, एक लहर (चित्रा 1) है। यह एक सकारात्मक जा रहा संभावित द्वारा पीछा किया जाता है, बी-लहर बुलाया। बी-लहर की बढ़ती चरण एक अलग घटक (oscillatory क्षमता या ऑप्स) माना जाता है जो दोलनों को दिखाती है। एक लहर फोटोरिसेप्टरों द्वारा उत्पन्न किया जा करने के लिए माना जाता है, amacrine कोशिकाओं 1 से भीतर परमाणु परत की कोशिकाओं, और ऑप्स द्वारा बी-लहर।

उत्तेजना शक्ति के आधार पर, बहुत मंद चमक के लिए प्रतिक्रियाओं scotopic दहलीज प्रतिक्रिया संभव हो रहे हैं करार दिया। scotopic दहलीज प्रतिक्रिया रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं 2-4 से उत्पन्न हो समझा जाता है। दूसरा, फ्लैश एर्ग प्रकाश अनुकूलन के द्वारा अलग किया जा सकता है, या एक दो फ्लैश प्रोटोकॉल द्वारा rod- और कोन संचालित घटकों में, नीचे वर्णित है। Photopic शर्तों के तहत, शंकु जनसंख्या कम है क्योंकि एक-लहर, चूहों में नहीं detectable है, लेकिन ऑप्स और एक बी लहर है5 साफ है। जिसका retinas के उच्च शंकु आबादी है प्राइमेट्स में, rod- और cone- रास्ते दोनों एक detectable एक लहर 6 उत्पन्न करते हैं।

अक्सर फ्लैश एर्ग से निकाले गए दो उपयोगी उपायों फोटोरिसेप्टर आबादी damagingly उज्ज्वल के लिए जोखिम के उदाहरण के लिए, कम हो जाता है जब चित्रा 2 में दिखाया गया ठेठ फ्लैश के हिमायती हैं। साथ चित्र 1 में के रूप में मापा एक- और बी-तरंगों के आयाम, कर रहे हैं, प्रकाश, एर्ग के सभी घटकों को कम कर रहे हैं। जैसे दूरदराज के इस्कीमिक शर्त (आरआईपी) के रूप में न्यूरोप्रोटेक्टिव हस्तक्षेप, ए और बी-तरंगों (चित्रा 3) के आयाम के संरक्षण द्वारा मान्य किया जा सकता है। सारांश में, एर्ग के विश्लेषण क्षतिग्रस्त स्वस्थ, प्रकाश और neuroprotected रेटिना के बीच तुलना में सक्षम बनाता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल के सिडनी विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल दिशा निर्देशों के बाद।

1. मेकिंग इलेक्ट्रोड्स

  1. सकारात्मक इलेक्ट्रोड प्लैटिनम तार व्यास में 1-2 मिमी की एक छोटी (5 सेमी) की लंबाई से (कॉर्निया से संपर्क करेगा, जो एक) का निर्माण। एक पाश में व्यास में कुछ मिमी यह फैशन। अपने एम्पलीफायर के इनपुट चरण तक पहुंचने के लिए काफी लंबे समय से, एक पारंपरिक नेतृत्व करने के लिए इस पाश से कनेक्ट (चित्रा 4 देखें)।
  2. एक एजी / AgCl भी एक सम्मेलन का नेतृत्व करने के लिए लॉग इन व्यास में 1-2 मिमी, गोली का उपयोग कर (पशु के मुंह में जाना होगा) नकारात्मक इलेक्ट्रोड निर्माण (चित्रा 4 देखें)।
  3. (जानवर की दुम में जाना होगा जो) एक संदर्भ इलेक्ट्रोड, भी उचित लंबाई के नेतृत्व से जुड़ा एक साफ चमड़े के नीचे सुई (23 जी), उपयोग के रूप में (चित्रा 4 देखें)।
  4. आदर्श रूप में, (सकारात्मक यू तीन इलेक्ट्रोड कनेक्ट करने के लिए, उपकरण निर्माताओं द्वारा प्रदान की तीन-सीसा केबल का उपयोग94; कॉर्निया, नकारात्मक → मुंह, एम्पलीफायर को दुम → संदर्भ)।

हल्की उत्तेजना और एर्ग सेट अप के 2. कनेक्शन और कैलिब्रेशन

  1. अंधेरे बनाया जा सकता है जो एक छोटे रिकॉर्डिंग प्रयोगशाला, बनाएँ (या पता लगाने)। लाल बना एक से अधिक-बेंच प्रकाश या एक लाल सिर दीपक की या तो या दोनों के साथ लैस।
  2. 1 लक्स से अधिक नहीं है सेटअप के दौरान चूहे की आंखों तक पहुंच गया है कि लाल बत्ती illuminance पुष्टि करने के लिए एक लक्स मीटर का प्रयोग करें।
    नोट: एक तटस्थ घनत्व फिल्टर दीपक चमक को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और दीपक प्रकाश के स्रोत के लिए विशेष रूप से लाल बत्ती फेंकना चाहिए। प्रकाश स्रोतों कम (दृश्य) तरंग दैर्ध्य फेंकना अगर डार्क रूपांतरण समझौता हो जाएगा।
  3. (यह अक्सर अपारदर्शी टेप के साथ दृढ़ता की आवश्यकता है) रिकॉर्डिंग प्रयोगशाला में प्रवेश करने के लिए सभी आवारा प्रकाश सील और अधिक फिट करने के लिए काफी बड़ी है, और इतनी मंद एक तटस्थ घनत्व फिल्टर (इस शीट में खरीदा जा सकता है) को तैयार है, किसी भी कंप्यूटर स्क्रीन आप में होगा लैब।
    नोट: आवारा प्रकाश औरएक स्क्रीन के प्रकाश चूहा आंख की तमोनुकूलन पूर्वाग्रह के लिए पर्याप्त हैं।
  4. डाटा अधिग्रहण हार्डवेयर के लिए एम्पलीफायर कनेक्ट करें। एम्पलीफायर को सकारात्मक, नकारात्मक और संदर्भ सुराग कनेक्ट करें। कंप्यूटर और एलईडी Ganzfeld यूनिट बिजली की आपूर्ति सुरक्षित रूप से एक जमीन स्रोत से जुड़े हैं सुनिश्चित करें।
    नोट: कुछ प्रयोगशालाओं एक इमारत जमीन से जुड़ा है, ग्राउंडिंग अंक विशेष है; एक पानी के पाइप एक कारगर विकल्प है।
  5. एक शोध की गुणवत्ता रेडियोमीटर के साथ एलईडी प्रकाश स्रोत जांचना। पशु की आंख एक प्रयोग के दौरान स्थित हो जाएगा, जिस पर स्थिति में मीटर के संवेदक को ठीक करें।
  6. Ganzfeld एल ई डी चमक के बीच फ़्लैश ऊर्जा, फ़्लैश अवधि, फ्लैश पुनरावृत्ति और समय में कदम वार बढ़ जाती है के साथ एक पूर्ण क्षेत्र एर्ग प्रोटोकॉल को चलाने के लिए कार्यक्रम, interstimuls अंतराल (आईएसआई), सेटिंग्स करार दिया। एक उदाहरण के पूरे क्षेत्र प्रोटोकॉल के लिए 1 टेबल देखें।
    नोट: एर्ग चमक दोहराए मंद चमक से वृद्धि पूरे क्षेत्र खएक कदम बुद्धिमान फैशन में सही चमक। जुड़वां फ़्लैश कार्यक्रम पूरे क्षेत्र प्रोटोकॉल से चलता है और रॉड और कोन प्रतिक्रियाओं के अलगाव के लिए सक्षम बनाता है।

एर्ग प्रयोग करने के लिए 3. दिन पहले

  1. डार्क रिकॉर्डिंग से पहले 12 घंटे के लिए Sprague-Dawley चूहों अनुकूलित। यह आवारा प्रकाश का सफाया कर दिया गया है, एक बार रिकॉर्डिंग प्रयोगशाला में यह करने के लिए सुविधाजनक है।

एर्ग प्रयोग के 4. दिवस

  1. पशु जबकि रिकॉर्डिंग धीरे गरम होने के लिए व्यवस्थित करें। हम पशु के सिर Ganzfeld के लिए प्रवेश में सही बिंदु पर आराम कर सकते हैं कि इतना बनाया गया एक प्रकाश धातु मंच का उपयोग करें। मंच हम एक पानी के स्नान में 40 डिग्री सेल्सियस के लिए preheated पानी पंप के माध्यम से जो इनबिल्ट ट्यूबिंग है।
    नोट: यह अनुभव 37 डिग्री सेल्सियस पर जानवर की कोर तापमान रहता है कि पता चलता है।
  2. अंधेरे शर्तों के तहत चूहे वजन। रिकॉर्ड वजन और सही ketamine (60 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine श्रृंगार (5 मिलीग्राम / किग्रा) खुराक। चूहे जनरल नियंत्रितtly और intraperitoneally संवेदनाहारी इंजेक्षन।
  3. इंजेक्शन के समय पर ध्यान दें। पशु बेहोश हो जाने के बाद (आमतौर पर 5 मिनट के भीतर) हल्के से एक पलटा प्रतिक्रिया मौजूद है, तो देखने के लिए, एक पैर पैड pinching द्वारा संज्ञाहरण की गहराई से जाँच करें। यह इस पलटा आगे बढ़ने से पहले, अनुपस्थित या कमजोर है जब तक प्रतीक्षा करने के लिए सबसे अच्छा है।
  4. कॉर्निया को proxmethacaine की एक भी atropine की बूंद और एक अन्य को लागू करें।
  5. काले धागे की एक 10 सेमी लंबाई में कटौती। एक साधारण गाँठ के साथ एक पाश बनाने और आंख की भूमध्य रेखा के ऊपर पाश पर्ची। यह थोड़ा मजबूत करनी होगी; प्रभाव कम से कम दबाव के साथ, थोड़ा आगे नेत्रगोलक आकर्षित करने के लिए है। इस पलकों से स्पष्ट कॉर्निया रहता है।
  6. लागू करें carbomer आंख के कॉर्निया की सतह के लिए चला जाता है। सुनिश्चित करें carbomer कॉर्निया की सतह पर बनी हुई है और पलकें या चेहरे पर गिर नहीं करता है।
  7. गरम मंच के शीर्ष पर शोषक बिस्तर रखें।
  8. Ganzfeld के उद्घाटन में सिफारिश की जगह में सिर के साथ बिस्तर पर स्थिति चूहा,।
  9. सम्मिलित करें int केमलाशय में ernal तापमान जांच। पूंछ के लिए जांच की हड्डी टेप द्वारा की स्थिति में सुरक्षित तापमान जांच।
  10. Subcutaneously पीछे पैर में संदर्भ इलेक्ट्रोड (23 जी सुई) डालें, और एम्पलीफायर से कनेक्ट।
  11. सुरक्षित रूप से मुँह में नकारात्मक इलेक्ट्रोड (एजी / AgCl गोली) रखें। इस मुंह बाहर होता जा रहा रोकने के लिए, एक स्थिर सतह को जोड़ने के नेतृत्व प्रत्यय।
  12. कॉर्निया के केंद्र पर सकारात्मक इलेक्ट्रोड स्थिति। एक micromanipulator का प्रयोग, इलेक्ट्रोड धीरे कॉर्निया कि छू जाता है।
  13. 37.5 डिग्री सेल्सियस - चेक शरीर का तापमान 37.0 से कम है।
  14. पशु ठीक से तैनात है और इलेक्ट्रोड जगह में हैं होने के बाद, एक अपारदर्शी सामग्री के साथ पूरे सेटअप (Ganzfeld और जानवर) कपड़ा (तमोनुकूलन संरक्षित करने के लिए)। हम एक नरम काले कपड़े का उपयोग करें।
  15. पूर्व संग्रह नमूने के 5 मिसे के साथ 100-1000 मिसे का एक संग्रह समय के साथ एक 2 kHz नमूना दर पर सेट अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में। 1-1,000 के लिए बैंड पास फिल्टर सेट करेंहर्ट्ज और कहा कि नमूना सुनिश्चित एक फ्लैश निम्नलिखित ~ 250 मिसे की अवधि के नमूने के लिए शुरू हो रहा है।
  16. रिकॉर्डिंग के आधार रेखा की जाँच करें। यह बाहरी शोर से मुक्त होना है, लेकिन कुछ एम्पलीफायर शोर और एक सांस की दोलन दिखाना चाहिए।
  17. आधारभूत बाहरी शोर से पता चलता है, तो समस्या निवारण शुरू करते हैं। अधिकांश समस्याओं इलेक्ट्रोड की स्थिति, या ग्राउंडिंग में कमी से संबंधित हैं। रिकॉर्डिंग बाहरी शोर से मुक्त कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए एक फैराडे पिंजरे का प्रयोग करें।
  18. एक परीक्षण फ्लैश, 0.4 प्रवेश स्काटलैंड का निवासी cd.sm -2 चलाएँ। इसी तरह की एक इ तरंग 2A प्रकट करना चाहिए आंकड़ा। एक 0.4 प्रवेश स्काटलैंड का निवासी cd.sm -2 फ्लैश के लिए हमारी प्रयोगशाला ठेठ प्रतिक्रिया में (: -474 ± 39 μV और बी-लहर: एक लहर 1,512 ± 160 μV, एन = 11) हैं।
  19. अंधेरे के लिए जानवरों की 10 मिनट के लिए फिर से अनुकूलन की अनुमति दें। यह आधारभूत पुनः जाँच करने के लिए इन 10 मिनट उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है।
  20. स्थिर संकेत के बाद पुष्टि की रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं।
  21. रिकॉर्डिंग सत्र के अंत में, कि शरीर temperat जाँचure बनाए रखा गया था। इलेक्ट्रोड निकालें। कॉर्निया को carbomer बहुलक पुन: लागू। यह पशु आवास के लिए लौटने से पहले पूरी तरह से मोबाइल और सक्रिय है जब तक पशु एक गर्मी पैड पर ठीक करने के लिए अनुमति दें।

5. रिमोट Ischemia

  1. जाग या anesthetised कृन्तकों में या तो दूरदराज के ischemia के प्रदर्शन करना।
  2. पशु anesthetized है, तो (ऊपर) एक गर्म मंच पर रखना और घुटने के स्पष्ट हिन्द-अंग, के ऊपरी भाग पर रक्तदाबमापी कफ पर्ची।
  3. जानवरों संभाला जा रहा करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, यह संज्ञाहरण के बिना इस प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए संभव है; यह दो लोगों की आवश्यकता है। एक व्यक्ति धीरे पशु restrains और दूसरा रक्तदाबमापी कफ लागू होता है और रक्तदाबमापी चल रही है।
  4. जाग जानवरों के लिए, धीरे से एक hindlimb मुफ्त साथ, पशु रैप करने के लिए तौलिया का एक टुकड़ा ~ 15 सेमी x 30-50 सेमी का उपयोग करें। उसके सिर धारक के हाथ और धड़, और जगह के बीच tucked के साथ, बाएं प्रकोष्ठ (कहते हैं) पर अपनी पीठ पर पशु निर्धारित करनाकफ के रूप में बस का वर्णन किया।
  5. कफ खंडन करना और हवा के दबाव वाल्व बंद कर दिया है सुनिश्चित करते हैं। Anesthetised पशुओं में 160 एमएमएचजी को कफ पंप, और जाग पशुओं में 180 एमएमएचजी करने के लिए। इस सिस्टोलिक प्रेशर (आमतौर पर 140 एमएमएचजी और 160 एमएमएचजी क्रमशः) से अधिक है।
  6. हाथ से आयोजित पंप का उपयोग आवश्यक है, के रूप में इन दबावों को बनाए रखें।
  7. Ischemia के लिए योजना बनाई समय के बाद (हम 5 मिनट reperfusion के द्वारा अलग 5 मिनट के 2 अवधि का उपयोग करें), हवा के दबाव वाल्व ढीला द्वारा कफ दबाव खंडन करना।
  8. लुटेरा से जुड़ी त्वचा तापमान जांच के साथ दूरदराज के ischemia के प्रभाव की पुष्टि करें। त्वचा का तापमान आम तौर पर 5 मिनट से अधिक, 32-30 डिग्री सेल्सियस से गिर जाता है और reperfusion की पर ठीक हो जाए।

6. प्रकाश क्षति

  1. चूहों एक काले अनुकूलित रातोंरात, इससे पहले प्रकाश क्षति प्रक्रिया में हैं सुनिश्चित करें।
  2. (देरी के बिना हमारे प्रयोगों में) अंग ischemia के निम्न उचित समय पर, प्रत्येक जानवर एक Plexiglass बॉक्स, वाई में अकेले रखा गया हैमंजिल के आधार पर कंटेनरों में वें पानी और भोजन।
    नोट: प्रकाश प्रेरित क्षति केवल सूरजमुखी मनुष्य पशुओं में किया जा सकता है।
  3. एक मानक समय (आमतौर पर 9 बजे) पर एक पूर्व calibrated 1,000 लक्स सफेद प्रकाश पर स्विच और 24 घंटे के लिए इस शर्त को बनाए रखें।

7. एर्ग डेटा निष्कर्षण और विश्लेषण

  1. एर्ग की औसतन लहर रूपों मोल। घटाव करके, एक गैर शून्य आधारभूत के लिए, सही यदि आवश्यक हो।
  2. आधारभूत और पहले के बीच वोल्टेज अंतर के रूप में, (उच्च उत्तेजना तीव्रता के मध्य में प्रस्तुत) एक लहर के आयाम को मापने (<30 मिसे विलंबता) गर्त (चित्रा 1)।
  3. आम तौर पर 80-100 मिसे (चित्रा 1) के एक विलंबता पर होने वाली, एक लहर के शिखर और निम्न लहर के सकारात्मक बीच वोल्टेज अंतर के रूप में बी-लहर आयाम को मापने।
  4. एक 90 हर्ट्ज संक्रमण बैंड के साथ, 60-235 हर्ट्ज से डेटा फ़िल्टर को बदलने की एक फूरियर का उपयोग करके oscillatory क्षमता अलग
  5. एक- और बी-लहर चोटियों के अंतर्निहित समय (विलंबता) ने भी एक उपयोगी उपाय (चित्रा 1) हो सकता है। रॉड प्रतिक्रिया को अलग करने के जुड़वां चमक का प्रयोग करें। मिश्रित प्रतिक्रिया (फ्लैश 1) रॉड प्रतिक्रिया अलग करने के लिए (चित्रा 2) से कोन प्रतिक्रिया (2 फ़्लैश) घटाएँ।
  6. व्यक्ति के प्रकाश की तीव्रता एक लहर और बी-लहर आयाम (के बाद इलाज / उपचार के बाद आधारभूत) मानक के अनुसार या उपचार समूहों के लिए औसत। तीव्रता-प्रतिक्रिया घटता फ़्लैश ऊर्जा के खिलाफ समूह आयाम और त्रुटि साजिश है।

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Representative Results

प्रोटोकॉल विवो में कृंतक रेटिना के दृश्य समारोह को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक-लहर फोटोरिसेप्टर समारोह का एक उपाय है, और बी-लहर, भीतरी रेटिना समारोह का एक उपाय, चित्रा 1 में एनोटेट कर रहे हैं।

2A चित्रा में दिखाया गया के रूप में बढ़ प्रकाश उत्तेजना के साथ छड़ी बहुल एर्ग संकेत बढ़ जाती है। एक लहर 0.4 प्रवेश स्काटलैंड का निवासी cd.sm -2 और 2.5 प्रवेश स्काटलैंड का निवासी cd.sm पर संतृप्ति तक एक-लहर बढ़ जाती है के आयाम -2 () नहीं दिखाया ~ पर स्पष्ट हो जाता है। जुड़वां फ़्लैश प्रतिमान चित्रा 2B में के रूप में, कोन और रॉड को अलग प्रतिक्रिया में मिश्रित एर्ग संकेत अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

इस एर्ग रिकॉर्डिंग तकनीक न्यूरोप्रोटेक्टिव हस्तक्षेप की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बेसलाइन रिकॉर्डिंग प्रकाश क्षति के लिए पहले चित्रा 3 ए में देखा जाता है एक सप्ताह में पूरा किया। छवि में प्रदर्शन एक लहर और बी-लहर आयाम दोनों कम प्रकाश क्षति,ure 3 बी। रिमोट इस्कीमिक शर्त चित्रा -3 सी के रूप में देखा, एर्ग आयाम के नुकसान को कम करने में सक्षम था। दूरस्थ ischemia के तकनीक "घुटने के ऊपर" बंधन का सही आवेदन पर निर्भर करता है। चित्रा 3 डी के रूप में देखा बंधन का गलत आवेदन, रेटिना को प्रकाश नुकसान को रोकने नहीं करता है।

चित्र 1
चित्रा 1:। समय दिखाया t0 पर दिया प्रकाश की एक उज्ज्वल फ्लैश करने के लिए एक काले अनुकूलित आंख की कॉर्निया से दर्ज की गई है दिखाया एक काले अनुकूलित एर्ग का पता लगाने से एक लहर और बी-तरंगों की माप। एक लहर के आयाम पहले गर्त (लाल तीर) के लिए आधारभूत से मापा जाता है। बी-लहर के आयाम निम्नलिखित सकारात्मक शिखर (नीले तीर) के लिए एक लहर की गर्त से मापा जाता है। अंतर्निहित समय (विलंबता) उत्तेजना से मापा जाता हैपता लगाने पर ब्याज के मुद्दे पर मूर्ति (t0), एक ऐसी लहर (वर्ग ब्रैकेट) के गर्त के रूप में। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: बढ़ती फ़्लैश शक्ति और रॉड और कोन प्रतिक्रियाओं की जुदाई के साथ काले अनुकूलित एर्ग का विकास प्रकाश की चमक बढ़ाने के लिए एक काले अनुकूलित आंख की कॉर्निया से दर्ज कर रहे हैं दिखाया निशान।। एक लहर उज्जवल तीव्रता में दिखाई देता है। स्काटलैंड का निवासी cd.sm -2, शिखर बी-लहर संतृप्त लेकिन एक लहर बढ़ने के लिए जारी किया गया है 1.4 प्रवेश 0.4 के मुकाबले (ए)। (बी) में, जुड़वां चमक मढ़ा जाता है। दो 2.0 प्रवेश स्काटलैंड का निवासी cd.sm -2 चमक एक 500 मिसे आईएसआई से अलग हो रहे हैं। पहली फ्लैश एक मिश्रित उत्पन्न करता हैप्रतिक्रिया (काला), और दूसरा फ़्लैश एक शंकु के ही प्रतिक्रिया (बिंदीदार रेखा) उत्पन्न करता है। कोन प्रतिक्रिया घटाकर पृथक रॉड प्रतिक्रिया (ग्रे) अर्जित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। एर्ग प्रतिनिधि तरंग, चीर द्वारा (सी) रेटिना वातानुकूलित हानिकारक प्रकाश को उजागर किया जा रहा से पहले (ए) सामान्य रेटिना रेटिना प्रकाश से क्षतिग्रस्त हो, (बी) के लिए यहां दिखाए गए हैं रेटिना के समारोह का एक उपाय प्रदान करता है, और (डी) रेटिना नालायकी से चीर से वातानुकूलित है और फिर हानिकारक प्रकाश के संपर्क में। एक ही फ्लैश ऊर्जा प्रत्येक अभिलेख (2.0 प्रवेश cd.sm -2) के लिए इस्तेमाल किया गया था। विकास में रिकॉर्ड दबाव कफ के लिएपिछले अंग पर गलत तरीके से रखा गया था और ischemia स्थापित नहीं किया गया। हल्की क्षति एर्ग (बी) के आयाम को कम कर देता है और चीर कमी mitigates। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। एर्ग इलेक्ट्रोड बंद इलेक्ट्रोड सही करने के लिए छोड़ दिया है, दिखाया जाता है का निर्माण किया जाना; इलेक्ट्रोड सकारात्मक, नकारात्मक इलेक्ट्रोड मुंह और फिर दुम subcutaneously में डाला जाता है कि एक सुई से जुड़ा एक मगरमच्छ क्लिप से बना है जो संदर्भ इलेक्ट्रोड में रखा जाना करने के लिए कॉर्निया संपर्क करने के लिए। कृपया यहाँ क्लिक करें एक बड़ा संस्करण देखने के लिए इस आंकड़े की।

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Discussion

ऊपर वर्णित काले अनुकूलित फ्लैश एर्ग विधि चूहों में रेटिना समारोह का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका है। एक लहर और बी-लहर दोनों प्रकाश क्षति से कम हो गई थी। रिमोट इस्कीमिक शर्त एक लहर और बी-लहर में प्रकाश क्षति प्रेरित कटौती को कम किया। रेटिना समारोह का यह संरक्षण दूरस्थ इस्कीमिक शर्त ऐसे हाइपोक्सिया, ischemia और व्यायाम 8-10 के रूप में सुरक्षात्मक शर्त के अन्य रूपों जैसी neuroprotection प्रेरित किया गया है कि पता चलता है। रिकॉर्डिंग सेटअप, प्रकाश उत्तेजना के मापदंडों, और जानवर के राज्य - दर्ज की एर्ग संकेत कारकों में से तीन सेट से निर्धारित होता है।

रिकॉर्डिंग सेटअप

इलेक्ट्रोड को गलत तरीके से रखा जाता है जब एर्ग आयाम में कम हो जाता है या तैयारी अधूरे 11 पर आधारित है। आस-पास के बिजली के उपकरणों का सही ग्राउंडिंग रिकॉर्डिंग में शोर को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है,; महत्वपूर्ण शोर एक फैराड बनी रहती हैप्र पिंजरे इस्तेमाल किया जाना चाहिए। सकारात्मक इलेक्ट्रोड सुरक्षित एर्ग पूरे क्षेत्र प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले और पूरा होने पर जाँच की स्थिति की पुष्टि के साथ कॉर्निया के केंद्र में तैनात किया जाना चाहिए। यह इस इलेक्ट्रोड संपर्कों कि केवल कॉर्निया महत्वपूर्ण है; पलक के साथ संपर्क या यहां तक ​​कि मूंछ संकेत आयाम को कम कर सकते हैं। एक ढीले सूती धागे सकारात्मक इलेक्ट्रोड को छू से पलकों को रोकने के लिए इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया है। कुछ जांचकर्ताओं विश्वसनीय संपर्क और पलक छू 12 की रोकथाम सुनिश्चित करने के लिए एम्बेडेड सकारात्मक इलेक्ट्रोड के साथ संपर्क लेंस विकसित किया है।

प्रकाश प्रोत्साहन की स्थापना

हम इस्तेमाल किया है उत्तेजक एलईडी स्रोतों से व्यापक स्पेक्ट्रम सफेद रोशनी प्रदान करता है। अन्य प्रकाश स्रोतों ऐसे क्सीनन स्ट्रोब प्रकाश और हलोजन रोशनी, प्रकाश उत्तेजनाओं 11 के बीच तुलना के लिए सेंट्रल यूरोप और Vingrys देखने के रूप में प्रकाश उत्तेजनाओं के रूप में उपयुक्त हैं। एलईडी प्रकाश का लाभ, हालांकि, मैंप्रत्येक फ्लैश और अपनी ऊर्जा की अवधि को आसानी से प्रोग्राम कर रहे हैं और तेजी से प्रकाश की तीव्रता की एक विस्तृत श्रृंखला पर रीसेट है। हम दहलीज से काले अनुकूलित कृंतक रेंज में संतृप्त करने के लिए (एक अधिक से अधिक प्रतिक्रिया उत्पादन) (एक बस-पहचाने प्रतिक्रिया उत्पादन) जो वर्गीकृत ऊर्जा की चमक का एक सेट विकसित किया है।

परीक्षण और त्रुटि के द्वारा, हम एक फ्लैश के जवाब के आयाम एक ही तीव्रता का एक पूर्ववर्ती फ्लैश के स्वतंत्र है कि जो यह सुनिश्चित अंतराल (आईएसआईएस) interstimulus की स्थापना की है। फ़्लैश उज्जवल, अब आईएसआई इस स्वतंत्रता के लिए जरूरी है।

इसके अलावा परीक्षण और त्रुटि से हम एक साफ संकेत प्रदान करने के लिए प्रत्येक ऊर्जा पर आवश्यक प्रतिक्रियाओं की एक न्यूनतम संख्या की स्थापना की है। औसत अधिक की प्रतिक्रियाएं हमेशा एक क्लीनर संकेत प्रदान करेगा। ऊर्जा श्रृंखला (हमारे प्रोटोकॉल 11 मिनट में) जल्दी से पूरा किया जा सकता है, ताकि हम न्यूनतम का उपयोग करें; तेजी से पूरा करने के allo के कारण संवेदनाहारी राज्य और में बदलाव के लिए भिन्नता कम कर देता हैयदि आवश्यक हो तो अन्य चर के लिए WS समय, अध्ययन किया जाएगा।

जानवर के राज्य

जानवर के शरीर क्रिया विज्ञान के कई मापदंडों का अनुकूलन और प्राप्त एर्ग रिकॉर्डिंग के मानकीकरण के लिए महत्वपूर्ण हैं।

तापमान

एक-लहर संकेत बाहरी क्षेत्र में एक जी प्रोटीन-युग्मित phototransduction झरना का प्रकाश प्रेरित सक्रियण से उत्पन्न होता है; इस झरना की गतिशीलता, सभी कर रहे हैं एंजाइमी प्रतिक्रियाओं की तरह, तापमान पर निर्भर 13,14। संज्ञाहरण के तहत चूहे हाइपोथर्मिया से ग्रस्त हैं और रिकॉर्डिंग के दौरान 37.5 डिग्री सेल्सियस के एक कोर तापमान बनाए रखने के लिए बाहरी हीटिंग की आवश्यकता होती है। शरीर के तापमान से अधिक 1-2 डिग्री सेल्सियस गिर जाता है, तो एक-लहर और बी-लहर आयाम कम होती है और उनके सुप्तावस्था में 15 वृद्धि हुई है।

बेहोशी

स्थिर एर्ग रिकॉर्डिंग स्थिर होना पशु की आवश्यकता होती है। Neuromuscular ब्लॉकर्स और anaesthetआईसी एजेंट एक बेहोश और स्थिर राज्य को प्राप्त करने के लिए एर्ग प्रयोग किया जाता है। केवल चूहों 16-20 में जाग एर्ग रिकॉर्डिंग के पाँच रिपोर्ट किया गया है। इन अध्ययनों में, इलेक्ट्रोड शल्य चिकित्सा द्वारा खोपड़ी में पूर्व प्रत्यारोपित किया गया और इन अध्ययनों के दो एर्ग 17,20 पर संज्ञाहरण के प्रभाव का परीक्षण किया।

एर्ग रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल सबसे आम संवेदनाहारी ketamine और xylazine का एक संयोजन किया गया है (हमारे प्रयोगों में ketamine और 5 मिलीग्राम की 60 मिलीग्राम / किग्रा / xylazine किलो प्रयोग किया जाता है)। यह गैसीय संज्ञाहरण ऐसे isoflurane और halothane की तुलना में एर्ग कम को प्रभावित करता है, और उच्च वसूली दर 17,21,22 के साथ, अपेक्षाकृत गैर विषैले साबित कर दिया है। यह दृष्टिकोण ~ 40 मिनट के लिए पशु स्थिर रहता है; एक आधा खुराक एक समान अवधि के लिए रिकॉर्डिंग शर्तों का विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चांग ने अध्ययन के साथ सीधे और संज्ञाहरण के बिना एर्ग तुलना और ketamine-xylazine कुछ हद तक एक- और बी के आयाम और सुप्तावस्था उपद्रव करता है कि पता चलालहरों 17। सबसे शोधकर्ताओं संवेदनाहारी शर्तों के मानकीकरण और फिर प्रयोगात्मक मापदंडों का परीक्षण; एनेस्थेटिक्स का कुछ प्रभाव पूरी तरह से रियायती नहीं किया जा सकता।

नेत्र वातावरण

आंख के शरीर क्रिया विज्ञान का अनुकूलन और एर्ग रिकॉर्डिंग का मानकीकरण करने, रखरखाव की आवश्यकता है। विद्यार्थियों के लिए एक मानक आकार का होना चाहिए; इस आँख अधिक से अधिक फैलाव को प्राप्त करने के लिए, बूंदों के रूप में लागू किया जाता है, एक Mydriatic के साथ हासिल की है। कृन्तकों में, atropine या phenylephrine 23 प्रयोग किया जाता है। कॉर्निया की जलयोजन रिकॉर्डिंग करने से पहले एक carbomer बहुलक के आवेदन के द्वारा बनाए रखा है; यह भी सकारात्मक इलेक्ट्रोड और कॉर्निया के बीच विद्युत चालकता स्थिर। कॉर्निया निर्जलित हो जाता है, कॉर्निया scarring और मोतियाबिंद गठन 24 हो सकती है। मोतियाबिंद गठन चूहों 25 में ज्यादा आम है, और कॉर्निया जलयोजन बनाए रखने के विभिन्न तरीकों जलीय द्रव या के एक निरंतर प्रवाह सहित माउस एर्ग रिकॉर्डिंग में नियोजित किया गया हैकस्टम बनाया संपर्क शैली इलेक्ट्रोड कॉर्निया की सतह से 12 पर उस जाल जलयोजन।

रेटिना के अनुकूली राज्य

यह एक प्रमुख चर रहा है। ऊपर दी गई प्रोटोकॉल रेटिना इसकी सबसे संवेदनशील राज्य के लिए, काले अनुकूलित है कि यह सुनिश्चित करने के लिए बनाया गया है। आदर्श रूप में, पिगमेंट चूहों, पूरी तरह से काले अनुकूलित ऐसे Sprague Dawley चूहों के रूप में गैर पिगमेंटड जानवर, whilst के होने का अंधेरा आवास की 3 घंटा आवश्यक 5 घंटा 26 की एक न्यूनतम आवश्यकता होती है। यह scotopic एर्ग रिकॉर्डिंग 12 घंटा के लिए रात भर जानवरों के लिए अनुकूलित करने के लिए मानक अभ्यास है। प्रकाश को आंशिक या पूर्ण अनुकूलन आसानी से और जल्दी Ganzfeld उत्तेजक में एक मानक तीव्रता पृष्ठभूमि पर प्रकाश मोड़ के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। प्रकाश अनुकूलन के बाद, हालांकि, पूर्ण तमोनुकूलन प्राप्त करने के लिए घंटे लगते हैं; इसलिए अत्यधिक सावधानी के सुझाव आँखों रिकॉर्डिंग से पहले प्रकाश में गलती से उजागर नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए।

एर्ग रिकॉर्डिंग तकनीक के द्वारा सीमित हैनिर्धारित कारकों (यानी, एर्ग और प्रोत्साहन सेट अप) और एर्ग परीक्षण में शोधकर्ता के प्रवीणता के ऊपर। अनुभवहीन शोधकर्ताओं चर एर्ग रिकॉर्डिंग की संभावना है। विचरण ऐसे दृश्य समारोह में कटौती या लाभ के रूप में परिणाम है, तुलना करने के लिए काफी बड़ी नमूना आकार बनाने के द्वारा कम किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एर्ग रिकॉर्डिंग आधारभूत रिकॉर्डिंग और उपचार के बाद रिकॉर्डिंग के बीच सामान्यीकृत किया जा सकता है। सामान्यीकृत डेटा तो वर्गीकृत किया है और विश्लेषण किया जा सकता है। एर्ग आंकड़े पेश करते हैं, तो यह समूह डेटा और प्रतिनिधि waveforms दिखाने के लिए मानक अभ्यास है।

ऊपर के सभी सावधानी से नियंत्रित कर रहे हैं, एर्ग के आयाम रेटिना के कार्यात्मक राज्य का एक उपाय है। एर्ग लगातार प्रकाश क्षति या आनुवंशिक रूप से प्रेरित अध: पतन 27,28 की वजह से फोटोरिसेप्टर परत की कमी से आयाम में कम हो जाता है। इसके विपरीत, इस तरह चीर के रूप में एक हस्तक्षेप के सुरक्षात्मक प्रभाव ampl में पता लगाया जा सकता हैएर्ग 29 की itude। एर्ग भी रेटिना 8-10,30 पर इस्कीमिक शर्त, hypoxic शर्त, व्यायाम, और आहार केसर के सुरक्षात्मक प्रभाव प्रदर्शन में इस्तेमाल किया गया है।

गतिज मॉडलिंग फोटोरिसेप्टरों में phototransduction के नाम से जाना जाता शारीरिक घटनाओं पर आधारित है, हालांकि rhodopsin की phototransduction झरना की गतिशीलता का ज्ञान बढ़ रहा है, और रेटिना के synaptic कनेक्शन की, एर्ग पीढ़ी के मॉडल का विकास, और परिष्कृत एर्ग तरंग विश्लेषण के लिए प्रोत्साहित किया गया है संभव है , और भीतर रेटिना circuitry के 31 के बारे में हमारी समझ। उदाहरण के लिए, एक-लहर गतिज मॉडल phototransduction के दौरान हो और मॉडल फिटिंग जैसे चोटी प्रतिक्रियाओं, समय देरी और संवेदनशीलता के रूप में 14 मॉडल मानकों की तुलना में सक्षम बनाता है कि जैव रासायनिक चरणों पर आधारित हैं।

मॉडलिंग का नुकसान यह रेटिना circuitr के बारे में धारणा पर निर्भर करता हैवाई, और केवल मान्यताओं की अनुमति देने के रूप में के रूप में जानकारीपूर्ण किया जा सकता है। इस नुकसान के प्रकाश में, एक-लहर गतिज मॉडल ने हाल ही में एक लहर गतिशीलता 32 oversimplifying के लिए आलोचना की गई है। फोटोरिसेप्टर अध: पतन के अध्ययन में, एर्ग तरंग विश्लेषण आम तौर पर एक अलग कारण के लिए नहीं किया जाता है। फोटोरिसेप्टर अध: पतन दृश्य समारोह और इसके परिणामस्वरूप, एक लहर और बी-लहर मापदंडों के आगे के विश्लेषण के warranted नहीं है 8,9,27,30 में नाटकीय नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप, अक्सर गंभीर है। भले ही, एक-लहर और बी-लहर की एर्ग मॉडलिंग कई कृंतक अध्ययन और एर्ग मॉडलिंग के बारे में विस्तृत जानकारी में मानक अभ्यास के रूप में अपनाया गया है, एक लहर के लिए, ख की लहर और ऑप्स हूड, और समीक्षा द्वारा अध्ययन में पाया जा सकता है वेमाउथ और Vingrys, Frishman, और Wachtmeister 11,32-34 के लेख।

सारांश में, काले अनुकूलित एर्ग विधि के साथ और न्यूरोप्रोटेक्टिव हस्तक्षेप के बिना रेटिना अध: पतन के बीच औसत दर्जे का मतभेद रिकॉर्ड कर सकते हैं प्रस्तुतदूरदराज के इस्कीमिक शर्त के रूप में uch। विश्वसनीय एर्ग रिकॉर्डिंग करने के लिए आवश्यक तत्वों का वर्णन किया गया है। फोटोरिसेप्टर और भीतरी रेटिना समारोह के एर्ग माप रेटिना के degenerations का अध्ययन शोधकर्ताओं, और दृश्य समारोह पर विभिन्न आनुवंशिक बायोफर्मासिटिकल और औषधीय हस्तक्षेप के प्रभाव के लिए उपयोगी होते हैं।

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Disclosures

जोनाथन स्टोन CSCM प्राइवेट लिमिटेड के निदेशक है

Acknowledgements

लेखकों कृंतक निगरानी, ​​हैंडलिंग और प्रयोग में श्रीमती शेरोन Spana की सहायता के लिए आभारी हैं। पीएचडी धन का समर्थन विजन में उत्कृष्टता के लिए सिडनी विश्वविद्यालय और ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान केंद्र द्वारा प्रदान की गई है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware AD Instruments PL 35044 Acquistion of ERG
Animal Bio Amp AD Instruments FE 136 Amplifier for ERG
Lab chart AD Instruments Signal collection software
Ganzfield Photometric solutions FS-250A Light stimulus
Ganzfield operating system Photometric solutions
Research Radiometer International light technologies ILT-1700 calibrate light series
Lux meter LX-1010B check red light illumanation
Excel Microsoft
Lead wires AD Instruments Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator AD Instruments ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95% A&E metals postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet SDR E205 negative electode
26 G needle BD ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe Harvard Appartus 507222F
Atropine 1% w/v Bausch & Lomb topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v Bausch & Lomb topical anaesthetic
Visco tears eye drops Novartis carbomer polymer
Thread retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive Blu tac Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd muscle relaxant
Scale

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References

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Comments

3 Comments

  1. The article is very helpful to setup ERG to discriminate cone and rod electrical contributions. Could you please, let me know how can I access TABLE1 that it is mentioned in the article.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 14, 2016 - 2:00 PM
  2. Hi Marcelo,

    Below is a link to table 1 as a pdf file. Not the voltages used were based on our calibration, and you may need to adjust your voltage settings to reach equivalent light intensities.
    http://tiny.cc/he5vay

    Reply
    Posted by: Alice B.
    April 17, 2016 - 10:18 PM
  3. Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 18, 2016 - 10:19 AM

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