Использование электроретинограммы чтобы оценить функцию в грызунов Retina и защитные эффекты дистанционного конечностей ишемического прекондиционирования

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brandli, A., Stone, J. Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning. J. Vis. Exp. (100), e52658, doi:10.3791/52658 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Эрг электрический потенциал, создаваемый сетчатки в ответ на свет, и записаны с поверхности роговицы глаза. Когда условия записи будут тщательно управлять, ЭРГ может быть использована в различных способов оценки функции сетчатки. Здесь мы описали, как записать 'флэш ЭРГ', потенциал генерируется, когда сетчатка подвергается краткого, яркой вспышкой, представленной в Ganzfeld фоне. Ganzfeld рассеивает свет равномерно и вспышка света достигает сетчатки весь приблизительно равномерно. Если сетчатка адаптируются к темноте перед записью, и темно-адаптация сохраняется, как животное готовится к записи, ЭРГ получены порождается как палочек и колбочек фоторецепторов.

Темно-адаптированы флэш ЭРГ имеет характерный сигнала, который был проанализирован в двух направлениях. Во-первых, ранние и поздние компоненты сигнала ЭРГ были отмечены, и связана с последовательностью нейронааль активации в сетчатке. Раннее компонент короткое время ожидания отрицательно собирается потенциал, волны (рис 1). Это сопровождается положительным потенциалом-происходит, называется би-волну. Растет фаза б-волны показывает колебания, которые считаются отдельным компонентом (колебательные потенциалы или ОП). Волны считается порождается фоторецепторов, б-волна клетками внутренней ядерного слоя, и ОП по амакринных клеток 1.

Основываясь на прочность стимула, ответы на очень тусклые вспышки называется скотопическое порог срабатывания возможно. Скотопическое порог срабатывания понимается быть получены из ганглиозных клеток сетчатки 2-4. Во-вторых, флэш-ЭРГ может быть отделена от световой адаптации, или в соответствии с протоколом двух флэш описано ниже, в rod- и конусных приводом компонентов. Под фотопических условиях, волны не прощупывается у крыс, потому что население конус низкий, но ОПС и б-волна вясно 5. У приматов, чьи сетчатки имеют более высокие населения конуса, и rod- и cone- пути генерации обнаруживаемого а-волна 6.

Два полезных мероприятия часто, извлеченные из вспышки ERG являются амплитуды а- и В-волн, измеренные как показано на рисунке 1, с типичными ответами флэш показанных на рисунке 2. При население фоторецепторов снижается, например, воздействия разрушительно яркий свет, все компоненты ЭРГ снижаются. Нейропротекторные вмешательства, такие как удаленный ишемическая предварительной подготовки (RIP), может быть подтверждено сохранение амплитуд а- и В-волн (рис 3). В целом, анализ ЭРГ позволяет сравнивать между здоровой, легкой и поврежденных neuroprotected сетчатки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол следует рекомендациям по уходу животное университета Сиднея.

1. Внесение Электроды

  1. Построить положительный электрод (тот, который будет контактировать с роговицы) с короткого (5 см) длины платиновой проволоки 1-2 мм в диаметре. Изготовьте его в петлю на несколько мм в диаметре. Подключите эту петлю к обычной свинца, достаточно долго, чтобы достичь входного каскада усилителя (рисунок 4).
  2. Построить отрицательный электрод (который пойдет в рот животного), используя Ag / AgCl осаждения 1-2 мм в диаметре, также подключенный к конференц-свинец (рисунок 4).
  3. Как электрод (который будет идти в крупе животного), используйте чистую иглу (23 G), также подключенный к проводу соответствующей длины (см рисунок 4).
  4. В идеале, используйте три свинцовых кабелей, предоставляемые производителями приборов, чтобы соединить три электрода (положительного U94; Роговица, отрицательный → рот ссылка → крупу) к усилителю.

2. Подключение и калибровка световой раздражитель и ERG Set-вверх

  1. Создание (или местонахождение) небольшую лабораторию записи, которые могут быть сделаны темными. Одета с одного или обоих из света более-скамейки из красного или красной головой лампы.
  2. Используйте метр люкса, чтобы подтвердить, что красный свет освещенности идущие глаз крысы во время установки не превышает 1 лк.
    Примечание: фильтр нейтральной плотности может быть использован для уменьшения яркости лампы и источником света лампы должны излучать специально красный свет. Темно-адаптация будет нарушена, если источники света излучают более низкие (видимые) длины волн.
  3. Заглушить все рассеянный свет, поступающий в лабораторию записи (это часто требует настойчивости с непрозрачной лентой) и подготовить фильтр нейтральной плотности (это могут быть приобретены в листах), достаточно большой, чтобы соответствовать по, и так скептически, любой экран компьютера у вас будет в лаборатория
    Примечание: Рассеянный свет исвет экрана достаточно, чтобы нанести ущерб темно адаптации крыс глаз.
  4. Подключите усилитель к оборудованию сбора данных. Подключите положительные, отрицательные и справочные ведет к усилителю. Убедитесь, что компьютер и LED Ganzfeld блок питания надежно подключен к источнику заземления.
    Примечание: Некоторые лаборатории специализируются точки заземления, подключается к строительной площадке; водопровод является эффективной альтернативой.
  5. Калибровка светодиодный источник света с исследования качества радиометра. Fix датчик измерителя в положение, при котором глаз животного будет находиться во время эксперимента.
  6. Запрограммируйте Ganzfeld светодиоды запустить полный поле ERG протокол с ступенчатых увеличивается в флэш энергии, длительности вспышки, вспышки повторения и время между вспышками, называется interstimuls интервал (ISI), настройки. Для протокола пример полного поля табл 1.
    Примечание: полный поле ERG мигает увеличится с повторяющимися вспышками тусклых бправый мигает в такт мудрым моды. Близнец программа флэш вытекает из протокола полный поля и позволяет изоляции палочек и колбочек ответов.

3. За день до ERG экспериментированию

  1. Темно-адаптировать Спрэг Dawley крыс в течение 12 часов до начала записи. Это удобно делать это в лаборатории записи, когда рассеянный свет был ликвидирован.

4. День ERG экспериментированию

  1. Организовать животных, чтобы быть осторожно нагревают во время записи. Мы используем легкого металла платформу, созданную таким образом, чтобы голова животного может отдохнуть в правильной точке на входе в Ganzfeld. Платформа имеет встроенный трубки, через которую мы перекачивать воду, предварительно нагретую до 40 ° С на водяной бане.
    Примечание: Опыт показывает, что это удерживает внутреннюю температуру животного при 37 ° С.
  2. Взвесьте крысы в ​​условиях низкой освещенности. Вес Запись и составляют правильный кетамин (60 мг / кг) и Ксилазин (5 мг / кг) дозы. Задержите крысу поколенияTLY и ввести анестетик внутрибрюшинно.
  3. Примечание время инъекции. После того, как животное находится в бессознательном состоянии (обычно в течение 5 мин) проверить глубину анестезии, слегка зажимая одну ногу площадку, чтобы увидеть, если рефлекторный ответ присутствует. Лучше всего подождать, пока этот рефлекс не отсутствует или слабый, прежде чем продолжить.
  4. Нанесите каплю атропина и другой из proxmethacaine к роговице.
  5. Вырезать 10 см длины черной ниткой. Сделайте петлю с простым узлом и скольжения петли над экватором глаза. Затянуть слегка; Эффект привлечь глазное яблоко немного вперед, с минимальным давлением. Это позволяет роговицы видно из век.
  6. Применить карбомер глазные капли на поверхности роговицы. Убедитесь, карбомер остается на поверхности роговицы и не проливать на веки или лица.
  7. Поместите впитывающую постельные принадлежности поверх нагретой платформы.
  8. Положение крысы на постельные принадлежности, с головой в рекомендуемой место в открытии Ganzfeld.
  9. Вставьте INTernal датчик температуры в прямой кишке. Безопасный температурный зонд в положении лентой зонд шнур к хвосту.
  10. Вставьте электрод сравнения (23 г) иглы подкожно в заднюю ногу, и подключиться к усилителю.
  11. Поместите отрицательный электрод (осадок Ag / AgCl) надежно во рту. Чтобы предотвратить это ускользает из рот, закрепите соединительный провод к устойчивой поверхности.
  12. Поместите положительный электрод по центру роговицы. Использование микроманипулятора, убедитесь, что электрод касается роговицы осторожно.
  13. Проверьте температура тела на 37,0 - 37,5 ° С.
  14. После того, как животное правильно и электроды находятся в месте, задрапировать всю установку (Ganzfeld и животных) с непрозрачного материала (для сохранения темно адаптации). Мы используем мягкую черную ткань.
  15. В программное обеспечение сбора, установленного при частоте дискретизации 2 кГц при времени сбора 100-1000 мс с 5 мс выборки предварительно сбора. Установите полосовые фильтры 1-1,000Гц и обеспечить отбор срабатывает попробовать период ~ 250 мс следующей вспышки.
  16. Проверьте записи базового. Он должен быть свободным от посторонних шумов, но показать некоторые усилитель шума и дыхательной колебания.
  17. Если базовый показывает посторонний шум, начинают поиск и устранение неисправностей. Большинство проблем связано с проскальзывание в положении электрода или заземления. Используйте клетка Фарадея, чтобы записи были свободны от посторонних шумов.
  18. Запуск тестовой вспышки, 0,4 журнала шотландец cd.sm -2. ЭРГ сигнала как на рисунке 2А должен появиться. В наших лабораторных типичных ответов на 0,4 журнала шотландец cd.sm -2 вспышки являются (волны: -474 ± 39 мкВ и б-волны: 1512 ± 160 мкВ, п = 11).
  19. Разрешить животных до темно-ре-адаптации в течение 10 мин. Это удобно использовать эти 10 минут, чтобы перепроверить базовый уровень.
  20. После подтверждения стабильного сигнала начать запись.
  21. В конце сессии записи, проверить, что тела TEMPERATЮр была сохранена. Удалить электродов. Повторно карбомер полимера к роговицы. Разрешить животных для восстановления на тепловой площадку до тех пор, пока полностью мобильным и активным, прежде чем вернуться в помещениях для содержания животных.

5. Дистанционное ишемии

  1. Выполните дистанционного ишемии либо активных или обезболивание грызунов.
  2. Если животное находится под наркозом, положите его на разогретую платформы (выше) и скольжения сфигмоманометрическая манжету на верхней части задних конечностей, с отрывом от колена.
  3. Если животные используются для обрабатывается, можно выполнить эту процедуру без анестезии; это требует двух человек. Один человек сдерживает животное осторожно и второй применяется сфигмоманометрическая манжеты и работает сфигмоманометре.
  4. Для активных животных, использовать кусок полотенце ~ 15 см х 30-50 см, чтобы мягко обернуть животное, с одной задней конечности бесплатно. Положите животное на спину на (скажем) левого предплечья, с его головы заправленные между рукой и туловищем владельца и местаманжеты, как описано выше.
  5. Выпустите манжету и обеспечить клапан давления воздуха закрыт. Насос манжету до 160 мм рт.ст. обезболивание животных и 180 мм рт.ст. в активных животных. Это превышает систолическое давление (обычно 140 мм рт.ст. и 160 мм рт.ст. соответственно).
  6. Поддержание этого давления по мере необходимости, с помощью ручного насоса.
  7. После запланированное время для ишемии (мы используем 2 периода по 5 минут, разделенных на 5 мин реперфузии), выкачать давление в манжете, ослабив клапан давления воздуха.
  8. Подтверждение эффект дистанционного ишемии с температуры кожи зонда, прикрепленного к подушечку лапы. Температура кожи, как правило, падает с 32-30 ° С, в течение 5 мин и восстанавливает на реперфузии.

6. Свет Нанесенный

  1. Убедитесь, что крысы в ​​темно-адаптированы ночь, перед процедурой легкий ущерб.
  2. В соответствующее время после ишемии конечности (в наших опытах без задержки), каждое животное помещают отдельно в плексиглас коробки, Wiй воды и пищи в пол на основе контейнеров.
    Примечание: Свет-индуцированного повреждения могут быть предприняты только в белых животных.
  3. Включение предварительно откалиброван 1000 лк белым светом при стандартной времени (как правило, 9 утра) и поддерживать это состояние в течение 24 ч.

7. ЭРГ Извлечение данных и анализ

  1. Приобретать усредненные волновые формы ЭРГ. При необходимости, правильно для ненулевого базовой, путем вычитания.
  2. Измерьте амплитуду а-волны (представленной на средних и высоких интенсивностей стимулирования), а разность напряжений между линией и первым (<30 мс задержки) корыто (Рисунок 1).
  3. Измерьте амплитуду б-волны как разность напряжений между пиком а-волны и позитив следующей волны, как правило, происходит в латентности 80-100 мс (рис 1).
  4. Изолировать колебательные потенциалы с помощью преобразования Фурье для фильтрации данных из 60-235 Гц, с 90 Гц переходной полосой
  5. Неявный (задержки) из а- и б-волновых пиков также может быть полезной мерой (Рисунок 1). Используйте двойной вспышки, чтобы изолировать реакцию стержня. Вычтите ответ конуса (флэш 2) из смешанного ответ (флэш-1), чтобы изолировать реакцию стержня (рис 2).
  6. Нормализовать отдельному интенсивности света а-волну и б амплитуд (пост-обработка / пост-обработка-Baseline), или в среднем по группам лечения. Кривые интенсивности-ответ участок амплитуды групповых и ошибки в отношении флэш-энергии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Протокол может быть использован для измерения зрительной функции сетчатки грызунов в естественных условиях. Волны, мера функции фоторецепторов, и б-волна, мера внутренней функции сетчатки, в примечаниях на рисунке 1.

Стержневые доминируют ERG сигнала возрастает с увеличением светового стимула, как показано на рисунке 2А. Волны становится очевидным при ~ 0,4 журнала шотландец cd.sm -2 и амплитуда волн увеличивается до уровня насыщения в 2,5 журнала шотландец cd.sm -2 (не показано). Твин флэш парадигма была использована для разделения смешанного сигнала ЭРГ в конуса и стержень изолята ответ, а на фиг.2В.

Этот метод записи ЭРГ может быть использована для проверки нейропротекторные вмешательства. Исходные записи завершил неделю до легкого вреда являются показано на рисунке 3А. Свет урон снижен как а-волну и б амплитуд, показан на рисЮр 3B. Удаленная ишемическая предварительная удалось снизить потери амплитуды ЭРГ, как видно на рисунке 3C. Техника дистанционного ишемии зависит от правильного применения жгута выше колена "". Неправильное применение жгута не мешает свет повреждения сетчатки, как показано на рисунке 3D.

Фигура 1
Рисунок 1: Измерение а-волны и В-волны от темно-адаптированы ERG след, показанной записывается с роговицы темно-адаптированы глаза к яркой вспышкой света данного в то время показано t0.. Амплитуда а-волны измеряется от базовой линии до первого желоба (красная стрелка). Амплитуда б-волны измеряется от корыта а-волны до следующего положительного пика (синяя стрелка). Неявный (задержки) измеряется от раздражителяартефакт (t0) в точке интереса на след, такие, как корыто а-волны (квадратная скобка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2: Развитие темно-адаптированы ERG с увеличением силы вспышки и разделения палочек и колбочек ответов следы, показанные записываются от роговицы темно-адаптированы глаза к увеличению вспышки света.. Волны появляется в ярких интенсивности. (А) Сравнение 1,4 до 0,4 лог Scot cd.sm -2, б-волны пик насыщенный но-волна продолжает расти. В (Б), близнецы мигает накладываются. Два журнала 2.0 шотландец cd.sm -2 мигает разделены 500 мс ISI. Первая вспышка генерирует смешанныеответ (черный), и вторая вспышка генерирует ответ конус только (пунктирная линия). Вычитая ответ конус дает ответ изолированный стержень (серый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: ЭРГ обеспечивает меру функции сетчатки Типичные формы сигналов показаны здесь для (А) нормальной сетчатки, (B) сетчатки повреждены света, (С) сетчатки обусловлено RIP, прежде чем воздействию повреждающей света, и. (D) сетчатки неэффективно обусловлено RIP и затем подвергают воздействию повреждающей света. Энергия вспышки же был использован для каждой записи (журнал 2.0 cd.sm -2). Для записи в D давление в манжетена задней конечности неправильно размещены и ишемии не было установлено. Свет повреждения уменьшает амплитуду ЭРГ (B) и RIP смягчает снижение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4:. Закройте ЭРГ электроды Электроды должны быть построены показаны слева направо; положительный электрод, чтобы связаться с роговицы, отрицательный электрод, чтобы быть помещены в рот и опорного электрода, который состоит из аллигатора клипа, подключенного к игле, которая затем вставляется в ягодичной области подкожно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию из этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Флэш-метод темного приспособлены ЭРГ описано выше надежный метод для оценки функции сетчатки у крыс. И волны и б-волна сократились на свет повреждения. Удаленная ишемическая предварительная смягчены сокращения легкие повреждения, вызванной в а-волны и В-волны. Это сохранение функции сетчатки позволяет предположить, что дистанционное ишемическая предварительная побудило нейропротекцию, напоминающие другие формы защитного предварительной таких как гипоксия, ишемия и упражнения 8-10. Сигнал записывается ЭРГ определяется тремя наборами факторов - настройки записи, параметры световой раздражитель, и состояние животного.

Запись установки

ЭРГ уменьшается амплитуда когда электроды размещены неправильно или неполно препарат заземлены 11. Правильное заземление соседнего электрооборудования важно, чтобы снизить уровень шума в записи; если шум сохраняется значительная в Фарадаай клетка должна быть использована. Положительный электрод должен быть надежно установлен в центре роговицы с подтверждением позиции проверены перед началом протокола ERG полного поля и при завершении. Важно, чтобы этот электрод контактов только роговица; соприкосновение с веком или даже усы может уменьшить амплитуду сигнала. Свободный хлопчатобумажная нить была использована в данном протоколе, чтобы предотвратить веки от прикосновения положительный электрод. Некоторые исследователи разработали контактные линзы с положительным электродом встроенного обеспечить надежный контакт и предотвращение век трогательной 12.

Световой раздражитель настроить

Стимулятор мы использовали обеспечивает широкого спектра белого света, от светодиодных источников. Другие источники света пригодны в качестве световых раздражителей, таких как ксенон строб освещения и галогенных ламп, см Уэймут и Vingrys для сравнений между легкой стимулов 11. Преимущество светодиодной подсветкой, однако, яS, что продолжительность каждой вспышки и ее энергии легко программируется и быстро сбросить на широкий спектр интенсивности света. Мы разработали набор вспышек калиброванного энергии, что, в темно-адаптированы диапазоне грызунов от порога (производящих только что выявляемой реакции) к насыщая (изготовление максимальный отклик).

Методом проб и ошибок, мы установили межстимульный интервалов (ISIS), которые обеспечивают амплитуда ответ на вспышки зависит от предшествующей вспышке той же интенсивностью. Ярче вспышка, больше МСИ требуется для этой независимости.

Также путем проб и ошибок мы создали минимальное количество ответов, необходимых для каждой энергии, чтобы обеспечить чистый сигнал. В среднем более ответы всегда обеспечит чистый сигнал. Мы используем минимумы, так что серия энергия может быть завершена быстро (в нашем протокол 11 мин); быстрое завершение уменьшает изменение в связи с изменением анестетика государства и аллоWS время для других переменных, которые будут изучены, если это необходимо.

Государство животного

Некоторые параметры физиологии животного важны для оптимизации и стандартизации записи ЭРГ, полученные.

Температура

Сигнал волны генерируется из светло-индуцированной активации G-белками фототрансдукции каскада в наружный сегмент; динамика этого каскада, как и все ферментативных реакций, в зависимости от температуры 13,14. Грызуны под анестезией склонны к гипотермии и требуют внешнего нагрева, чтобы поддерживать внутреннюю температуру 37,5 ° С на протяжении записи. Если температура тела падает более чем на 1-2 ° C, амплитуды а-волны и б-волна уменьшится и их задержки увеличить 15.

Анестезия

Стабильные записи ERG требуют животное будет неподвижно. Нервно блокаторы и anaesthetIC агенты используются в ERG экспериментов для достижения бессознательного и неподвижном состоянии. Там были только пять докладов активных записей ЭРГ крыс 16-20. В этих исследованиях, электроды хирургическим предварительно имплантировали в черепа и два из этих исследований тестировали эффект анестезии на ЭРГ 17,20.

Наиболее распространенным анестетик, применяемый для записи ЭРГ был комбинацией кетамина и ксилазина (в наших экспериментах 60 мг / кг кетамина и 5 мг / кг ксилазина используется). Это влияет на ЭРГ менее газообразные анестезии такого ИФ и галотана, и оказалось относительно нетоксичным, с высоким уровнем восстановления 17,21,22. Этот подход сохраняет животное неподвижно в течение ~ 40 мин; половину дозы может быть использован для расширения условий записи на аналогичный период. Исследование Chang непосредственно по сравнению эрг с и без анестезии, показали, что кетамин-ксилазин же заметно возмущать амплитуду и задержки а- и b-волны 17. Большинство исследователей стандартизировать условия анестезии, а затем проверить экспериментальные параметры; некоторый эффект анестетиков не может быть полностью со счетов.

Глазные среда

Физиология глаза требует технического обслуживания, оптимизировать и стандартизировать запись ERG. Ученики должны быть стандартного размера; это достигается с мидриатический, применяется в виде глазных капель, для достижения максимальной дилатации. У грызунов, атропин или фенилэфрин используется 23. Гидратация роговицы сохраняется путем применения карбомер полимера до записи; Это также стабилизирует электрическую проводимость между положительным электродом и роговицы. Если роговица становится обезвоженной, рубцевание роговицы, катаракта может произойти образование 24. Образование катаракты является более распространенным у мышей 25, и различные методы поддержания роговицы гидратации были использованы в мыши ЭРГ записей, в том числе постоянный поток жидкости на водной основе илизаказ контактные электроды, стиль ловушка гидратации на поверхности роговицы 12.

Адаптивная состояние сетчатки

Это является важным фактором. Протокол указано выше предназначен для того, чтобы сетчатка темно-адаптированы, чтобы ее наиболее чувствительной состоянии. В идеале, пигментные крыс требуется 3 ч темного корпуса, чтобы быть полностью адаптируются к темноте, пока непигментированных животных, таких как Спрэг Dawley крыс, требуют минимум 5 часов 26. Это стандартная практика для скотопических записи ERG, чтобы приспособиться животных на ночь в течение 12 часов. Частичная или полная адаптация к свету может быть легко и быстро достигнуты путем включения стандартного фона интенсивность света в стимулятора Ganzfeld. После легкой адаптации, однако, полный темно-адаптация занимает несколько часов, чтобы достичь; следовательно, предположение о чрезвычайной осторожностью, чтобы гарантировать, что глаза не подвержены случайно на свет перед записью.

Техника записи ЭРГ ограниченовыше определяющих факторов (например, ERG и стимулом набор) и языком исследователя при тестировании ERG. Неопытные исследователи, вероятно, имеют различные записи ЭРГ. Разница может быть уменьшено путем создания достаточно большие размеры выборки, чтобы сравнить результаты, такие как сокращение или прирост в зрительной функции. Кроме того, ERG записи могут быть нормализованы между исходными записями и записями после лечения. Нормированные данные затем могут быть выделены и проанализированы. При представлении данных ERG, это стандартная практика, чтобы показать данные группы и представительства сигналов.

Когда все вышеперечисленное тщательно контролируют, амплитуда ЭРГ является мерой функционального состояния сетчатки. ЭРГ последовательно уменьшен по амплитуде истощением слоя фоторецептора, вызванного повреждением легкого или генетически индуцированной дегенерации 27,28. С другой стороны, защитный эффект вмешательства, такие как RIP могут быть обнаружены в AMPLшироты места в ERG 29. ЭРГ также используется для демонстрации защитные эффекты ишемического прекондиционирования, гипоксического прекондиционирования, физических упражнений и диетического шафрана на сетчатке 8-10,30.

Рост знания динамики фототрансдукции каскада родопсина, и синаптических связей сетчатки, поощряет развитие моделей поколения ERG и сложный анализ сигнала ERG можно хоть кинетическое моделирование на основе известных физиологических событий фототрансдукции в фоторецепторов , и наше понимание внутренней сетчатки схемы 31. Например, кинетические модели волны на основе биохимических шагов, которые происходят во время фототрансдукции и подгонки модель позволяет сравнение параметров модели, таких как пиковые ответов, временных задержек и чувствительности 14.

Недостатком является то, что моделирование она опирается на предположения о сетчатки circuitrу, и может быть только информативным предположения позволяют. В свете этого недостатка, кинетическая модель волны была недавно критиковали за упрощаю-волновая динамика 32. В дегенерацию фоторецепторов исследований, анализ формы волны ЭРГ, как правило, не выполняется по другой причине. Дегенерацию фоторецепторов часто тяжелой, в результате драматических потерь в зрительной функции и, следовательно, дальнейший анализ а-волны и В-волны параметров не оправдано 8,9,27,30. Несмотря на это, ЭРГ моделирование а-волны и В-волны была принята в качестве стандартной практики во многих исследованиях на грызунах и подробную информацию о ERG моделирования, для волны, б-волны и ОП можно найти в работах Гуда, и рассмотрения статьи Уэймут и Vingrys, Фришман, и вахмистр 11,32-34.

В целом, метод темного приспособлены ЭРГ представлены можете записывать измеряемые различия между дегенерации сетчатки с и без вмешательств с нейропротективныхуч как удаленный ишемической предварительной. Элементы, необходимые для надежных ЭРГ записей были описаны. Измерения ЭРГ фоторецепторов и внутренней функции сетчатки полезны для исследователей, изучающих вырождения сетчатки, и воздействия различных генетических, биотехнологических и фармакологических вмешательств на зрительной функции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Джонатан Стоун директор КБСС Pty Ltd

Acknowledgements

Авторы благодарны за помощь миссис Шарон Spana в мониторинга грызунов, обработки и экспериментов. Поддержка кандидат финансирование было предусмотрено университета Сиднея и австралийской научно-исследовательского центра передового опыта в Vision.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware AD Instruments PL 35044 Acquistion of ERG
Animal Bio Amp AD Instruments FE 136 Amplifier for ERG
Lab chart AD Instruments Signal collection software
Ganzfield Photometric solutions FS-250A Light stimulus
Ganzfield operating system Photometric solutions
Research Radiometer International light technologies ILT-1700 calibrate light series
Lux meter LX-1010B check red light illumanation
Excel Microsoft
Lead wires AD Instruments Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator AD Instruments ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95% A&E metals postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet SDR E205 negative electode
26 G needle BD ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe Harvard Appartus 507222F
Atropine 1% w/v Bausch & Lomb topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v Bausch & Lomb topical anaesthetic
Visco tears eye drops Novartis carbomer polymer
Thread retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive Blu tac Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd muscle relaxant
Scale

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arden, G. B., Heckenlively, J. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. MIT Press. 139-183 (2006).
  2. Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. Journal of Physiology-London. 555, (1), 153-173 (2004).
  3. Fortune, B., et al. Selective ganglion cell functional loss in rats with experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, (6), 1854-1862 (2004).
  4. Alarcon-Martinez, L., et al. Short and long term axotomy-induced ERG changes in albino and pigmented rats. Molecular Vision. 15, (254-255), 2373-2383 (2009).
  5. Lyubarsky, A. L., et al. Functionally rodless mice: transgenic models for the investigation of cone function in retinal disease and therapy. Vision Research. 42, (4), 401-415 (2002).
  6. Bush, R. A., Sieving, P. A. A PROXIMAL RETINAL COMPONENT IN THE PRIMATE PHOTOPIC ERG A-WAVE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35, (2), 635-645 (1994).
  7. Liu, K., et al. Development of the electroretinographic oscillatory potentials in normal and ROP rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, (12), 5447-5452 (2006).
  8. Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, (3), 1348-1354 (2003).
  9. Lawson, E. C., et al. Aerobic Exercise Protects Retinal Function and Structure from Light-Induced Retinal Degeneration. Journal of Neuroscience. 34, (7), 2406-2412 (2014).
  10. Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8, (7), 718-724 (2002).
  11. Weymouth, A. E., Vingrys, A. J. Rodent electroretinography: Methods for extraction and interpretation of rod and cone responses. Progress in Retinal and Eye Research. 27, (1), 1-44 (2008).
  12. Bayer, A. U., Cook, P., Brodie, S. E., Maag, K. P., Mittag, T. Evaluation of different recording parameters to establish a standard for flash electroretinography in rodents. Vision Research. 41, (17), 2173-2185 (2001).
  13. Pugh, E. N., Lamb, T. D. AMPLIFICATION AND KINETICS OF THE ACTIVATION STEPS IN PHOTOTRANSDUCTION. Biochimica Et Biophysica Acta. 1141, (2-3), 111-149 (1993).
  14. Breton, M. E., Schueller, A. W., Lamb, T. D., Pugh, E. N. ANALYSIS OF ERG A-WAVE AMPLIFICATION AND KINETICS IN TERMS OF THE G-PROTEIN CASCADE OF PHOTOTRANSDUCTION. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35, (1), 295-309 (1994).
  15. Mizota, A., Adachi-Usami, E. Effect of body temperature on electroretinogram of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, (12), 3754-3757 (2002).
  16. Szabo-Salfay, O., et al. The electroretinogram and visual evoked potential of freely moving rats. Brain Research Bulletin. 56, (1), 7-14 (2001).
  17. Charng, J., et al. Conscious Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potentials in Rats. Plos One. 8, (9), (2013).
  18. Galambos, R., Juhasz, G., Kekesi, A. K., Nyitrai, G., Szilagyi, N. NATURAL SLEEP MODIFIES THE RAT ELECTRORETINOGRAM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (11), 5153-5157 (1994).
  19. Galambos, R., Szabo-Salfay, O., Szatmar, E., Szilagyi, N., Juhasz, G. Sleep modifies retinal ganglion cell responses in the normal rat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (4), 2083-2088 (2001).
  20. Guarino, I., Loizzo, S., Lopez, L., Fadda, A., Loizzo, A. A chronic implant to record electroretinogram, visual evoked potentials and oscillatory potentials in awake, freely moving rats for pharmacological studies. Neural Plasticity. 11, (3-4), 241-250 (2004).
  21. Huang, J. C., Salt, T. E., Voaden, M. J., Marshall, J. NON-COMPETITIVE NMDA-RECEPTOR ANTAGONISTS AND ANOXIC DEGENERATION OF THE ERG B-WAVE IN-VITRO. Eye (London). 5, (4), 476-480 (1991).
  22. Sasovetz, D. KETAMINE HYDROCHLORIDE - EFFECTIVE GENERAL ANESTHETIC FOR USE IN ELECTRORETINOGRAPHY. Annals of Ophthalmology. 10, (11), 1510-1514 (1978).
  23. Mojumder, D. K., Wensel, T. G. Topical Mydriatics Affect Light-Evoked Retinal Responses in Anesthetized Mice). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, (1), 567-576 (2010).
  24. Fraunfel, F. t, Burns, R. P. ACUTE REVERSIBLE LENS OPACITY - CAUSED BY DRUGS, COLD, ANOXIA, ASPHYXIA, STRESS, DEATH AND DEHYDRATION. Experimental Eye Research. 10, (1), 19 (1970).
  25. Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. ACUTE REVERSIBLE CATARACT INDUCED BY XYLAZINE AND BY KETAMINE-XYLAZINE ANESTHESIA IN RATS AND MICE. Experimental Eye Research. 42, (4), 331-337 (1986).
  26. Behn, D., et al. Dark adaptation is faster in pigmented than albino rats. Documenta Ophthalmologica. 106, (2), 153-159 (2003).
  27. Sugawara, T., Sieving, P. A., Bush, R. A. Quantitative relationship of the scotopic and photopic ERG to photoreceptor cell loss in light damaged rats. Experimental Eye Research. 70, (5), 693-705 (2000).
  28. Machida, S., et al. P23H rhodopsin transgenic rat: Correlation of retinal function with histopathology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, (10), 3200-3209 (2000).
  29. Brandli, A., Stone, J. Remote Ischemia Influences the Responsiveness of the Retina. Observations in the Rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, (4), 2088-2096 (2014).
  30. Maccarone, R., Di Marco, S., Bisti, S. Saffron supplement maintains morphology and function after exposure to damaging light in mammalian retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, (3), 1254-1261 (2008).
  31. Hood, D. C., Birch, D. G. Assessing abnormal rod photoreceptor activity with the a-wave of the electroretinogram: Applications and methods. Documenta Ophthalmologica. 92, (4), 253-267 (1996).
  32. Robson, J. G., Frishman, L. J. The rod-driven a-wave of the dark-adapted mammalian electroretinogram. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 1-22 (2014).
  33. Hood, D. C., Birch, D. G. A COMPUTATIONAL MODEL OF THE AMPLITUDE AND IMPLICIT TIME OF THE B-WAVE OF THE HUMAN ERG. Visual Neuroscience. 8, (2), 107-126 (1992).
  34. Wachtmeister, L. Oscillatory potentials in the retina: what do they reveal. Progress in Retinal and Eye Research. 17, (4), 485-521 (1998).

Comments

3 Comments

  1. The article is very helpful to setup ERG to discriminate cone and rod electrical contributions. Could you please, let me know how can I access TABLE1 that it is mentioned in the article.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 14, 2016 - 2:00 PM
  2. Hi Marcelo,

    Below is a link to table 1 as a pdf file. Not the voltages used were based on our calibration, and you may need to adjust your voltage settings to reach equivalent light intensities.
    http://tiny.cc/he5vay

    Reply
    Posted by: Alice B.
    April 17, 2016 - 10:18 PM
  3. Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 18, 2016 - 10:19 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics