Använda elektroretinogram att utvärdera funktionen i Gnagare Retina och de skyddande effekterna av fjärr Limb Ischemisk Förkonditionering

1Discipline of Physiology and Bosch Institute, Sydney Medical School, University of Sydney
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brandli, A., Stone, J. Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning. J. Vis. Exp. (100), e52658, doi:10.3791/52658 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

ERG är en elektrisk potential alstras av näthinnan såsom gensvar på ljus, och registrerades från hornhinnans yta hos ögat. När villkoren för inspelning noggrant hanteras, kan ERG användas i en mängd olika sätt att bedöma näthinnefunktion. Här har vi beskrivit hur man spelar in den "flash ERG, potentialen som genereras när näthinnan utsätts för en kort, ljusstarka flash presenteras i en Ganzfeld bakgrund. Den Ganzfeld sprider ljuset homogent och ljusblixt når hela näthinnan ungefär jämnt. Om näthinnan är mörkt anpassas före inspelning, och den mörka-anpassningen bibehålls som djuret är förberedd för inspelning, erhållit ERG genereras av både tappar och stavar fotoreceptorer.

Den mörka anpassade flash ERG har en karakteristisk vågform, som har analyserats på två sätt. För det första har tidiga och sena delar av ERG vågformen har urskiljas, och i samband med sekvensen av neuronal aktivering i näthinnan. Den tidigaste komponenten är en kort latens negativt gående potential, a-våg (Figur 1). Detta följs av en i positiv riktning gående potential, som kallas B-vågen. Den stigande fasen av b-vågen visar svängningar, som betraktas som en separat komponent (oscillerande potential eller OP). A-vågen anses genereras av fotoreceptorer, b-vågen av celler av det inre kärnskiktet, och de operativa programmen genom amakrina celler 1.

Baserat på stimulans styrka, svar på mycket dunkla blinkar benämnd scotopic tröskel svar är möjliga. Den scotopic reaktionströskel är underförstått att genereras från näthinneganglieceller 2-4. För det andra, kan blixten ERG separeras genom ljus anpassning, eller genom en två flash-protokoll som beskrivs nedan, till stång- och kon-drivna komponenter. Under fotopiska förhållanden, är a-våg inte kan upptäckas hos råttor, eftersom kon befolkningen är låg, men operativa och en b-våg ärklar 5. I primater, vars näthinnor har högre kon populationer, både stav och kon- vägar genererar en detekterbar a-våg 6.

Två användbara åtgärder ofta utvinns ur blixten ERG är amplituder av a- och b-vågor, mätt som i figur 1, med typiska flash svar visas i figur 2. När fotoreceptor befolkningen minskas, till exempel genom exponering för damagingly ljus ljus, är alla komponenter av ERG minskas. Neuroprotektiva insatser, såsom fjärr ischemisk prekonditionering (RIP), kan valideras av bevarandet av amplituder av a- och b-vågor (Figur 3). Sammanfattningsvis, analysen av ERG möjliggör jämförelser mellan friska, lätt skadas och neuroprotected näthinnan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll följer riktlinjerna för djurskötsel av University of Sydney.

1. Göra Elektroder

  1. Konstruera den positiva elektroden (den som kommer i kontakt med hornhinnan) från en kort (5 cm) längd platinatråd 1-2 mm i diameter. Dana den i en slinga några mm i diameter. Anslut denna slinga till en konventionell ledning, tillräckligt länge för att nå ingångssteget på din förstärkare (se Figur 4).
  2. Konstruera den negativa elektroden (vilken kommer att gå i djurets mun) med användning av en Ag / AgCl pellet 1-2 mm i diameter, även ansluten till en konvention bly (se fig 4).
  3. Som en referenselektrod (som kommer att gå in i djurets bakdel), använd en ren kanyl (23 G), också ansluten till en ledning på lämplig längd (se figur 4).
  4. Helst använda tre-kablar som tillhandahålls av instrumenttillverkare, för att ansluta de tre elektroderna (positiv U94; hornhinna, negativ → mun, referens → bakdel) till förstärkaren.

2. Anslutning och kalibrering av Ijusstimulus och ERG Set-up

  1. Skapa (eller hitta) en liten inspelning laboratorium, som kan göras mörkt. Utrusta med endera eller båda av en over-the-bänken ljus gjort rött, eller ett rött huvud-lampa.
  2. Använd en lux mätare för att bekräfta att rött ljus belysningen når råttans ögat under installationen inte överstiger 1 lux.
    Obs: En neutral densitet filter kan användas för att reducera lampans ljusstyrka och källan till lampa måste specifikt avger rött ljus. Mörk anpassning kommer att äventyras om ljuskällor avger lägre (synliga) våglängder.
  3. Förslut alla ströljus kommer in i inspelnings laboratoriet (detta kräver ofta uthållighet med ogenomskinlig tejp) och förbereda ett neutralt densitetsfilter (detta kan köpas i ark) tillräckligt stor för att passa över, och så mörk, alla datorskärmen kommer du att ha i lab.
    Obs: Ströljus ochMot bakgrund av en skärm är tillräckliga för att påverka mörkeranpassning av råttans öga.
  4. Anslut förstärkaren till datainsamling hårdvara. Anslut positiva, negativa och referens leder till förstärkaren. Se till att datorn och LED Ganzfeld nätdel är säkert anslutna till en bergvärme.
    Obs: Vissa laboratorier har specialiserat jordpunkter, ansluten till en byggnad jord; en vattenledning är ett effektivt alternativ.
  5. Kalibrera LED-ljuskälla med en forskningskvalitet radiometer. Fäst mätaren sensor i den position vid vilken djurets öga kommer att ligga under ett experiment.
  6. Programmera de Ganzfeld lysdioder för att köra en full-fältet ERG protokoll med stegvisa ökningar av flash energi, blixt varaktighet, flash upprepning och tid mellan blinkar, benämnd interstimuls intervall (ISI), inställningar. För ett exempel full fältprotokoll se tabell 1.
    Obs: Den fullständiga fältet ERG blinkar öka från repetitiva dim blinkar bhöger blinkar i en stegvis sätt. De dubbla flash-programmet är en fortsättning på den fullfältprotokoll och möjliggör isolering av tappar och stavar svar.

3. dag före ERG Experiment

  1. Mörk anpassa Sprague-Dawley-råttor under 12 h före inspelning. Det är lämpligt att göra detta i inspelnings laboratorium, när ströljus har eliminerats.

4. Dag ERG Experiment

  1. Ordna för djuret att vara försiktigt uppvärmd under inspelning. Vi använder ett lättmetall plattform byggd så att djurets huvud kan vila på rätt plats vid ingången till Ganzfeld. Plattformen har inbyggda slang genom vilken vi pumpa vatten som förvärmts till 40 ° C i ett vattenbad.
    Obs: Erfarenheten visar att detta håller djurets kärntemperatur vid 37 ° C.
  2. Väg råttan under mörka förhållanden. Registrera vikten och späd korrekt ketamin (60 mg / kg) och xylazin (5 mg / kg) dos. Hindra råttan allmtly och injicera bedövningsmedel intraperitonealt.
  3. Notera tiden för injektion. När djuret är medvetslöst (vanligen inom 5 min) kontrollera djupet av anestesi genom att lätt nyper en fot pad, för att se om en reflex svar är närvarande. Det är bäst att vänta tills denna reflex är frånvarande eller svag, innan du fortsätter.
  4. Applicera en enda droppe atropin och en annan av proxmethacaine till hornhinnan.
  5. Skär en 10 cm lång svart tråd. Gör en ögla med en enkel knut och glider öglan över ekvatorn av ögat. Dra det något; effekten är att dra ögongloben något framåt, med minimalt tryck. Detta håller hornhinnan framgår av ögonlocken.
  6. Applicera karbomer ögondroppar till hornhinnans yta. Se karbomer kvar på hornhinnans yta och inte spill på ögonlocken eller ansiktet.
  7. Placera absorberande strö ovanpå uppvärmd plattform.
  8. Placera råttan på sängkläder, med huvudet i den rekommenderade plats i öppnandet av Ganzfeld.
  9. Infoga internal temperatursond i rektum. Säker sondtemperatur på plats genom att tejpa sondsladden till svansen.
  10. Sätt referenselektroden (den 23 G-nål) subkutant i det bakre benet, och ansluta till förstärkaren.
  11. Placera den negativa elektroden (Ag / AgCl-pellet) säkert i munnen. För att förhindra detta glider ut munnen, anbringa anslutningskabeln till ett stabilt underlag.
  12. Placera den positiva elektroden över mitten av hornhinnan. Med hjälp av en mikromanipulator, se till att elektroden vidrör hornhinnan försiktigt.
  13. Kontrollera kroppstemperatur är vid 37,0-37,5 ° C.
  14. När djuret är korrekt placerad och elektroderna på plats, drapera hela installationen (Ganzfeld och djur) med ett ogenomskinligt material (för att bevara mörkeranpassning). Vi använder en mjuk svart tyg.
  15. I förvärvs programvara inställd på en 2 KHz samplingsfrekvens med en samling tid 100-1000 ms med 5 ms av pre-samling provtagning. Ställ in bandpassfilter till 1-1000Hz och se till att provtagning utlöses för att prova den tid ~ 250 ms efter en blixt.
  16. Kontrollera inspelnings baslinjen. Det bör vara fri från ovidkommande brus, men visa lite förstärkare buller och andnings svängning.
  17. Om baslinjen visar ovidkommande brus, börjar felsökningen. De flesta problem är relaterade till glidning i elektrod position eller grundstötning. Använd en Faradays bur för att säkerställa inspelningar är fria från ovidkommande brus.
  18. Kör en testblixt, 0,4 log ostraffade cd.sm -2. En ERG vågform liknande figur 2A ska visas. I vårt laboratorium typiska svar för en 0,4 logg scot cd.sm -2 blixt är (a-vågen: -474 ± 39 μV b-vågen: 1512 ± 160 μV, n = 11).
  19. Låt djur till mörk återanpassa under 10 minuter. Det är bekvämt att använda dessa 10 min för att kontrollera igen baslinjen.
  20. Efter bekräftelse av stabil signal börjar inspelningen.
  21. I slutet av inspelningen, kontrollera att kroppen tempure bibehölls. Avlägsna elektroderna. Tillämpa karbomer polymer till hornhinnor. Låt djuret att återhämta sig på en värmedyna tills den är helt mobil och aktiv, innan han återvände till djurstallar.

5. Fjärr Ischemi

  1. Utföra fjärr ischemi i antingen vakna eller sövda gnagare.
  2. Om djuret bedövas, lägg det på en uppvärmd plattform (ovan) och glida blodtrycksmätare manschetten över den övre delen av den bakre-lem, fri från knäet.
  3. Om djuren är vana vid att hanteras, är det möjligt att utföra den här proceduren utan bedövning; Detta kräver två personer. En person hindrar djuret försiktigt och andra tillämpar blodtrycksmätare manschetten och driver blodtrycksmätare.
  4. För vakna djur, använd en bit handduk ~ 15 cm x 30-50 cm för att försiktigt linda djuret, med en bakdelen gratis. Lägg djuret på rygg på (säg) vänster underarm, med dess huvud ligger mellan innehavarens arm och bål, och platsmanschetten såsom just beskrivits.
  5. Tömma manschetten och säkerställa lufttrycket ventilen är stängd. Pumpa manschetten till 160 mmHg i sövda djur, och till 180 mmHg i vakna djur. Detta överstiger det systoliska trycket (vanligen 140 mmHg och 160 mmHg respektive).
  6. Behåll dessa tryck som krävs, med hjälp av handpump.
  7. Efter den planerade tidpunkten för ischemi (vi använder 2 perioder om fem minuter separerade med 5 min reperfusion), tömma manschettrycket genom att lossa lufttrycket ventilen.
  8. Bekräfta effekten av fjärr ischemi med en hudtemperatur sond fäst fotsulan. Hudtemperatur faller typiskt 32-30 ° C, under 5 min och återvinner på reperfusion.

6. Ljus Skador

  1. Se till att råttor är i en mörk anpassad natten, innan ljuset skada förfarandet.
  2. Vid lämplig tidpunkt efter ischemi (i våra experiment utan dröjsmål), är varje djur placeras individuellt i en plexiglaslådor, with vatten och mat i golvbaserade behållare.
    Obs: Ljus-inducerad skada kan endast ske i albinodjur.
  3. Slå på en förkalibrerad 1.000 lux vitt ljus vid en vanlig tid (vanligen 9:00) och upprätthålla detta tillstånd under 24 timmar.

7. ERG Dataextrahera och analys

  1. Förvärva genomsnitt vågformer av ERG. Vid behov korrigera för en icke-noll baslinjen, genom subtraktion.
  2. Mät amplitud av a-våg (presenterades vid medel- till höga stimulans intensiteter), som spänningsskillnaden mellan baslinjen och det första (<30 ms latens) tråg (figur 1).
  3. Mät b-vågsamplitud som spänningsskillnaden mellan toppen av en våg och den positiva av följande vågor, typiskt uppträder vid en latens av 80-100 ms (fig 1).
  4. Isolera oscillerande potentialer genom användning av en Fourier-transform för att filtrera data 60-235 Hz, med en 90 Hz övergångsband
  5. Den implicita tid (latens) i A- och B-vågtoppar kan också vara ett användbart mått (Figur 1). Använd de två blinkar för att isolera stavsvaret. Subtrahera könen svaret (flash 2) från det blandade svaret (flash 1) för att isolera stången svaret (fig 2).
  6. Normalisera enskilda ljusintensiteten en våg och B-vågsamplituder (efterbehandling / efterbehandling-baseline) eller i genomsnitt för behandlingsgrupperna. Intensitet-responskurvor rita grupp amplituder och fel mot blixt energi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet kan användas för att mäta synfunktionen av gnagare näthinnan in vivo. A-våg, ett mått på fotoreceptor funktion och b-vågen, ett mått på inre näthinnan funktion är kommenterad i figur 1.

De stav dominerade ERG signalen ökar med ökande Ijusstimulus, såsom visas i figur 2A. A-våg visar sig vid ~ 0,4 logg scot cd.sm -2 och amplituden av A-Wave ökar tills mättnad vid 2,5 logg scot cd.sm -2 (ej visad). De dubbla flash paradigm har använts för att separera blandade ERG signalen till kon och stav isolat svar, som i figur 2B.

Detta ERG inspelning teknik kan användas för att kontrollera nervskyddande åtgärder. Utgångsvärdena avslutat en vecka före ljusskada ses i figur 3A. Ljus skador reduceras både en våg och B-vågsamplituder, visas i figurure 3B. Remote ischemisk prekonditionering kunde reducera förlusten av ERG amplitud, som visas i figur 3C. Fjärr ischemi teknik beror på en korrekt tillämpning av tryckförband ovanför "knä". Felaktig tillämpning av tryckförband hindrar inte lätt skador på näthinnan, såsom visas i fig 3D.

Figur 1
Figur 1: Mätning av a-våg och b-vågor från en mörk anpassad ERG Spåret visas registreras från hornhinnan av en mörk-anpassad öga till en ljus ljussken ges vid den tid som visas t0.. Amplituden av a-vågen mäts från baslinjen till den första tråget (röd pil). Amplituden hos b-vågen mäts från tråget av a-våg till den följande positiva toppen (blå pil). Implicit tid (latens) mäts från stimulansartefakt (t0) till den punkt av intresse på spåret, såsom tråg av a-våg (hakparentes). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2: Utveckling av mörk anpassade ERG med ökande blixt styrka och separation av tappar och stavar svar Spåren visas registreras från hornhinnan av en mörk-anpassad ögat att öka ljusblixtar.. A-våg uppträder vid ljusare intensiteter. (A) En jämförelse 1,4-0,4 logg ostraffade cd.sm -2 har topp b-vågen mättad men a-vågen fortsätter att växa. I (B), är de två blinkar överlagrade. De två 2,0 log scot cd.sm -2 blinkar skiljs åt av en 500 ms ISI. Den första blixten genererar en blandadrespons (svart), och den andra blixten alstrar en kon-enda svar (streckad linje). Subtrahera konen svar ger den isolerade stavsvaret (grå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: ERG ger ett mått på funktionen hos näthinnans Representativa vågformer Här visas för (A) normalt näthinnan, (B) näthinnan skadas av ljus, (C) näthinnan kondition genom RIP innan de utsätts för de skadliga ljuset, och. (D) näthinnan ineffektivt betingad av RIP och sedan utsätts för skadligt ljus. Samma blixtenergi användes för varje post (2,0 logg cd.sm -2). För att undvika missförstånd i D tryckmanschettenpå bakbenet felaktigt placerade och ischemi inte fastställts. Ljus skador minskar amplituden av ERG (B) och RIP minskar reduktionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4:. Närbild ERG elektroder Elektroderna ska byggas visas, från vänster till höger; den positiva elektroden att kontakta hornhinnan, den negativa elektroden som skall placeras i munnen och den referenselektrod, som består av en krokodilklämma ansluten till en nål som sedan sätts in i gumpen subkutant. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mörk anpassad blixt ERG metod som beskrivits ovan är en tillförlitlig metod för att bedöma näthinnefunktion hos råttor. Både en-vågs- ​​och b-vågen minskades med ljusskada. Fjärr ischemisk prekonditionering mildras lätta skador-inducerade minskningar i en-vågs- ​​och b-vågen. Detta bevarande av retinal funktion tyder på att fjärr ischemisk prekonditionering har lett neuroprotektion, liknar andra former av skyddande prekonditionering såsom hypoxi, ischemi och motion 8-10. ERG signal registreras bestäms av tre uppsättningar av faktorer - inspelnings inställning, parametrar i Ijusstimulus, och tillståndet hos djuret.

Inställning inspelning

ERG reduceras i amplitud när elektroderna är felaktigt placerade eller preparatet ofullständigt jordad 11. Korrekt jordning av närliggande elektrisk utrustning är viktig för att minska bullret i inspelningen; Om betydande störningar kvarstår en faraday bur bör användas. Den positiva elektroden bör vara säkert placerad vid centrum av hornhinnan med bekräftelse av positionen kontrolleras innan ERG fullfältprotokoll och i efterhand. Det är viktigt att denna elektrod kontakter hornhinnan; kontakt med ögonlocken eller ens whiskers kan minska signalens amplitud. En lös bomullstråd har använts i detta protokoll för att förhindra ögonlocken från att röra den positiva elektroden. Vissa forskare har utvecklat kontaktlinser med den positiva elektroden inbäddad för att säkerställa tillförlitlig kontakt och förebyggande av ögonlocket beröring 12.

Den Ijusstimulus inrättat

Stimulatorn har vi använt ger brett spektrum vitt ljus från LED-källor. Andra ljuskällor är lämpliga som ljusstimuli såsom xenon strobe belysning och halogenbelysning, se Weymouth och Vingrys för jämförelser mellan ljus stimuli 11. Fördelen med LED-ljus, men jags att varaktigheten av varje blixt och dess energi är lätt att programmera och snabbt återställa över ett brett spektrum av ljusintensiteter. Vi har utvecklat en uppsättning av blixtar av graderad energi, som i mörkret anpassade gnagare sträcker sig från tröskeln (producerar en rättvis detekterbar respons) för att mätta (som producerar en maximal respons).

Genom försök och misstag, har vi etablerat interstimulus intervall (ISIS) som säkerställer att amplituden för svar på en blixt är oberoende av en föregående blixt av samma intensitet. Den ljusare blixten, desto längre ISI som krävs för detta oberoende.

Också genom trial and error har vi etablerat ett minsta antal svar som krävs vid varje energi för att ge en ren signal. Medelvärde fler svar kommer alltid att ge en renare signal. Vi använder minima så att energin serien kan slutföras snabbt (i våra protokoll 11 min); snabbt slutförande minskar variation på grund av förändringar i anestesi tillstånd och allows tid för andra variabler som skall studeras, om det behövs.

State of djuret

Flera parametrar för djurets fysiologi är viktiga för att optimera och standardisera ERG upptagningar.

Temperatur

A-vågsignalen genereras från ljus-inducerad aktivering av en G-proteinkopplad ljusöver kaskaden i det yttre segmentet; dynamiken i denna kaskad är, liksom alla enzymatiska reaktioner, temperaturberoende 13,14. Gnagare under narkos är benägna att hypotermi och kräver extern uppvärmning för att bibehålla en kärntemperatur på 37,5 ° C under hela inspelningen. Om kroppstemperaturen sjunker mer än 1-2 ° C, A-våg och B-vågsamplituder minskar och deras latenser ökar 15.

Anestesi

Stabila ERG inspelningar kräver att djuret vara stilla. Neuromuskulära blockerare och anaesthetic medel används i ERG experimenterande för att uppnå en medvetslös och orörlig tillstånd. Det har bara varit fem rapporter om vaken ERG inspelningar i råttor 16-20. I dessa studier, elektroder kirurgiskt förväg implanteras i skallen och två av dessa studier testade effekten av anestesi på ERG 17,20.

Den vanligaste bedövningsmedel används för ERG inspelningar har varit en kombination av ketamin och xylazin (i våra experiment 60 mg / kg av ketamin och 5 mg / kg xylazin används). Detta påverkar ERG mindre än gasformiga anestesi sådan isofluran och halotan, och har visat sig vara relativt icke-toxiska, med höga återvinningsnivåer 17,21,22. Detta tillvägagångssätt håller djuret orörlig under ~ 40 min; en halv dos kan användas för att förlänga inspelningsförhållanden för en lika lång period. Studien av Chang direkt jämförde ERG med och utan bedövning och visade att ketamin-xylazin mätbart inte störa amplituden och latenser av a- och b-vågor 17. De flesta forskare standardisera anestesiförhållanden och sedan testa experimentella parametrar; viss effekt av narkosmedel kan inte helt uteslutas.

Okulära miljön

Fysiologi ögat kräver underhåll, för att optimera och standardisera ERG inspelning. Eleverna bör vara en standardstorlek; detta uppnås med en mydriatisk, appliceras som ögondroppar, för att uppnå maximal dilatation. Hos gnagare är atropin eller fenylefrin används 23. Hydratiseringen av hornhinnan upprätthålls genom tillämpning av en karbomer polymer före inspelningar; detta också stabiliserar elektriska konduktansen mellan den positiva elektroden och hornhinna. Om hornhinnan blir uttorkad, kan hornhinnan ärrbildning och kataraktbildning inträffar 24. Cataract bildning är vanligare hos möss 25, och olika metoder för att upprätthålla hornhinnans hydratisering har använts i mus ERG inspelningar, inklusive ett konstant flöde av vatten vätska ellerskräddarsydda kontakt stil elektroder som fällan hydra på hornhinnans yta 12.

Adaptiv tillstånd av näthinnan

Detta är en viktig variabel. Protokollet anges ovan är utformade för att säkerställa att näthinnan är mörk-anpassad, till sitt mest känsliga tillstånd. Helst pigmenterade råttor krävs 3 h mörk bostäder att vara helt mörk anpassad medan icke-pigmenterade djur, såsom Sprague Dawley, kräver ett minimum av 5 h 26. Det är normal praxis för scotopic ERG inspelningar att anpassa djuren över natten för 12 timmar. Partiell eller fullständig anpassning till ljus kan snabbt och enkelt genom att vrida på en standardintensitet bakgrundsbelysning i Ganzfeld stimulatorn. Efter lätt anpassning, men tar fullt mörkeranpassning timmar för att uppnå; därför föreslås av yttersta försiktighet för att säkerställa att ögonen inte utsätts oavsiktligt för ljus före inspelning.

ERG inspelningsteknik begränsas avovan avgörande faktorer (dvs, ERG & stimulans set-up) och kompetensen hos forskaren vid ERG testning. Oerfarna forskare har sannolikt varierande ERG inspelningar. Varians kan minskas genom att skapa tillräckligt stora provstorlekar att jämföra resultaten, såsom minskningar eller vinster i visuell funktion. Alternativt kan ERG inspelningar normaliseras mellan baslinjen inspelningar och efterbehandlings inspelningar. De normaliserade data kan sedan grupperas och analyseras. När den lägger fram ERG uppgifter, är det praxis att visa gruppuppgifter och representativa vågformer.

När allt det ovanstående är noggrant kontrollerad, är amplituden av ERG ett mått på det funktionella tillståndet hos näthinnan. ERG är genomgående minskat i amplitud genom utarmning av ljusmätare lagret orsakats av ljus skada eller genetiskt inducerad degeneration 27,28. Omvänt, den skyddande effekten av en intervention som RIP kan detekteras i amplitude av ERG 29. ERG har också använts för att påvisa de skyddande effekterna av ischemisk prekonditionering, hypoxisk prekonditionering, motion och kost saffran på näthinnan 8-10,30.

Växande kunskap om dynamiken i ljusöver kaskad av rhodopsin, och de synapsförbindelser av näthinnan, har uppmuntrat utvecklingen av modeller för ERG generation, och sofistikerad ERG vågformsanalys är möjligt men kinetisk modellering baserad på kända fysiologiska händelser ljusöver i fotoreceptorer och vår förståelse av inre retinal kretsen 31. Till exempel, är en våg kinetiska modeller baserade på de biokemiska steg som inträffar under ljusöver och montering av modellen möjliggör jämförelser av modellparametrar såsom topp svar, tidsfördröjningar och känslighet 14.

Nackdelen med modellering är att det bygger på antaganden om retinal circuitry, och kan bara vara så informativ som antagandena. Mot bakgrund av denna nackdel, har en våg kinetisk modell nyligen kritiserats för förenklar en våg dynamik 32. I fotoreceptor degeneration studier är ERG vågformsanalys normalt inte utförs av ett annat skäl. Ljusmätare degeneration är ofta svår, vilket resulterar i dramatiska förluster i visuell funktion och därmed ytterligare analys av en våg och B-vågparametrar inte motiverad 8,9,27,30. Oavsett, har ERG modellering av en våg och B-våg antagits som är brukligt i många studier på gnagare och detaljerad information om ERG modellering, för en våg kan hittas b-vågen och operativa i studier av Hood, och översyn artiklar av Weymouth och Vingrys, Frishman och Wachtmeister 11,32-34.

Sammanfattningsvis, den mörka anpassade ERG metod som presenteras kan spela in mätbara skillnader mellan näthinnedegeneration med och utan neuroprotektiva interventioner sn sådan som fjärr ischemisk prekonditionering. De grundläggande elementen pålitliga ERG inspelningar har beskrivits. ERG mätningar av fotoreceptor och inre näthinnan funktion är användbara för forskare som studerar degenerationer av näthinnan, och effekterna av olika genetiska, biofarmaceutiska och farmakologiska interventioner på synfunktionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Jonathan Stone är chef för CSCM Pty Ltd

Acknowledgements

Författarna är tacksamma för hjälp av Mrs Sharon Spana in gnagare övervakning, hantering och experimenterande. PhD finansieringsstöd har tillhandahållits av University of Sydney och svenska forskningscentret för Excellence i Vision.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware AD Instruments PL 35044 Acquistion of ERG
Animal Bio Amp AD Instruments FE 136 Amplifier for ERG
Lab chart AD Instruments Signal collection software
Ganzfield Photometric solutions FS-250A Light stimulus
Ganzfield operating system Photometric solutions
Research Radiometer International light technologies ILT-1700 calibrate light series
Lux meter LX-1010B check red light illumanation
Excel Microsoft
Lead wires AD Instruments Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator AD Instruments ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95% A&E metals postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet SDR E205 negative electode
26 G needle BD ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe Harvard Appartus 507222F
Atropine 1% w/v Bausch & Lomb topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v Bausch & Lomb topical anaesthetic
Visco tears eye drops Novartis carbomer polymer
Thread retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive Blu tac Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd muscle relaxant
Scale

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arden, G. B., Heckenlively, J. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. MIT Press. 139-183 (2006).
  2. Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. Journal of Physiology-London. 555, (1), 153-173 (2004).
  3. Fortune, B., et al. Selective ganglion cell functional loss in rats with experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, (6), 1854-1862 (2004).
  4. Alarcon-Martinez, L., et al. Short and long term axotomy-induced ERG changes in albino and pigmented rats. Molecular Vision. 15, (254-255), 2373-2383 (2009).
  5. Lyubarsky, A. L., et al. Functionally rodless mice: transgenic models for the investigation of cone function in retinal disease and therapy. Vision Research. 42, (4), 401-415 (2002).
  6. Bush, R. A., Sieving, P. A. A PROXIMAL RETINAL COMPONENT IN THE PRIMATE PHOTOPIC ERG A-WAVE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35, (2), 635-645 (1994).
  7. Liu, K., et al. Development of the electroretinographic oscillatory potentials in normal and ROP rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, (12), 5447-5452 (2006).
  8. Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, (3), 1348-1354 (2003).
  9. Lawson, E. C., et al. Aerobic Exercise Protects Retinal Function and Structure from Light-Induced Retinal Degeneration. Journal of Neuroscience. 34, (7), 2406-2412 (2014).
  10. Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8, (7), 718-724 (2002).
  11. Weymouth, A. E., Vingrys, A. J. Rodent electroretinography: Methods for extraction and interpretation of rod and cone responses. Progress in Retinal and Eye Research. 27, (1), 1-44 (2008).
  12. Bayer, A. U., Cook, P., Brodie, S. E., Maag, K. P., Mittag, T. Evaluation of different recording parameters to establish a standard for flash electroretinography in rodents. Vision Research. 41, (17), 2173-2185 (2001).
  13. Pugh, E. N., Lamb, T. D. AMPLIFICATION AND KINETICS OF THE ACTIVATION STEPS IN PHOTOTRANSDUCTION. Biochimica Et Biophysica Acta. 1141, (2-3), 111-149 (1993).
  14. Breton, M. E., Schueller, A. W., Lamb, T. D., Pugh, E. N. ANALYSIS OF ERG A-WAVE AMPLIFICATION AND KINETICS IN TERMS OF THE G-PROTEIN CASCADE OF PHOTOTRANSDUCTION. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35, (1), 295-309 (1994).
  15. Mizota, A., Adachi-Usami, E. Effect of body temperature on electroretinogram of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, (12), 3754-3757 (2002).
  16. Szabo-Salfay, O., et al. The electroretinogram and visual evoked potential of freely moving rats. Brain Research Bulletin. 56, (1), 7-14 (2001).
  17. Charng, J., et al. Conscious Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potentials in Rats. Plos One. 8, (9), (2013).
  18. Galambos, R., Juhasz, G., Kekesi, A. K., Nyitrai, G., Szilagyi, N. NATURAL SLEEP MODIFIES THE RAT ELECTRORETINOGRAM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (11), 5153-5157 (1994).
  19. Galambos, R., Szabo-Salfay, O., Szatmar, E., Szilagyi, N., Juhasz, G. Sleep modifies retinal ganglion cell responses in the normal rat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (4), 2083-2088 (2001).
  20. Guarino, I., Loizzo, S., Lopez, L., Fadda, A., Loizzo, A. A chronic implant to record electroretinogram, visual evoked potentials and oscillatory potentials in awake, freely moving rats for pharmacological studies. Neural Plasticity. 11, (3-4), 241-250 (2004).
  21. Huang, J. C., Salt, T. E., Voaden, M. J., Marshall, J. NON-COMPETITIVE NMDA-RECEPTOR ANTAGONISTS AND ANOXIC DEGENERATION OF THE ERG B-WAVE IN-VITRO. Eye (London). 5, (4), 476-480 (1991).
  22. Sasovetz, D. KETAMINE HYDROCHLORIDE - EFFECTIVE GENERAL ANESTHETIC FOR USE IN ELECTRORETINOGRAPHY. Annals of Ophthalmology. 10, (11), 1510-1514 (1978).
  23. Mojumder, D. K., Wensel, T. G. Topical Mydriatics Affect Light-Evoked Retinal Responses in Anesthetized Mice). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, (1), 567-576 (2010).
  24. Fraunfel, F. t, Burns, R. P. ACUTE REVERSIBLE LENS OPACITY - CAUSED BY DRUGS, COLD, ANOXIA, ASPHYXIA, STRESS, DEATH AND DEHYDRATION. Experimental Eye Research. 10, (1), 19 (1970).
  25. Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. ACUTE REVERSIBLE CATARACT INDUCED BY XYLAZINE AND BY KETAMINE-XYLAZINE ANESTHESIA IN RATS AND MICE. Experimental Eye Research. 42, (4), 331-337 (1986).
  26. Behn, D., et al. Dark adaptation is faster in pigmented than albino rats. Documenta Ophthalmologica. 106, (2), 153-159 (2003).
  27. Sugawara, T., Sieving, P. A., Bush, R. A. Quantitative relationship of the scotopic and photopic ERG to photoreceptor cell loss in light damaged rats. Experimental Eye Research. 70, (5), 693-705 (2000).
  28. Machida, S., et al. P23H rhodopsin transgenic rat: Correlation of retinal function with histopathology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, (10), 3200-3209 (2000).
  29. Brandli, A., Stone, J. Remote Ischemia Influences the Responsiveness of the Retina. Observations in the Rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, (4), 2088-2096 (2014).
  30. Maccarone, R., Di Marco, S., Bisti, S. Saffron supplement maintains morphology and function after exposure to damaging light in mammalian retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, (3), 1254-1261 (2008).
  31. Hood, D. C., Birch, D. G. Assessing abnormal rod photoreceptor activity with the a-wave of the electroretinogram: Applications and methods. Documenta Ophthalmologica. 92, (4), 253-267 (1996).
  32. Robson, J. G., Frishman, L. J. The rod-driven a-wave of the dark-adapted mammalian electroretinogram. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 1-22 (2014).
  33. Hood, D. C., Birch, D. G. A COMPUTATIONAL MODEL OF THE AMPLITUDE AND IMPLICIT TIME OF THE B-WAVE OF THE HUMAN ERG. Visual Neuroscience. 8, (2), 107-126 (1992).
  34. Wachtmeister, L. Oscillatory potentials in the retina: what do they reveal. Progress in Retinal and Eye Research. 17, (4), 485-521 (1998).

Comments

3 Comments

  1. The article is very helpful to setup ERG to discriminate cone and rod electrical contributions. Could you please, let me know how can I access TABLE1 that it is mentioned in the article.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 14, 2016 - 2:00 PM
  2. Hi Marcelo,

    Below is a link to table 1 as a pdf file. Not the voltages used were based on our calibration, and you may need to adjust your voltage settings to reach equivalent light intensities.
    http://tiny.cc/he5vay

    Reply
    Posted by: Alice B.
    April 17, 2016 - 10:18 PM
  3. Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 18, 2016 - 10:19 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics