Bruke elektroretinogrammet å vurdere funksjonen til gnager Retina og den beskyttende effekten av Remote Limb iskemisk prekondisjonering

1Discipline of Physiology and Bosch Institute, Sydney Medical School, University of Sydney
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brandli, A., Stone, J. Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning. J. Vis. Exp. (100), e52658, doi:10.3791/52658 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

ERG er et elektrisk potensial som genereres av netthinnen som reaksjon på lys, og registrert fra hornhinnen overflaten av øyet. Når betingelsene for opptak styres nøye, kan ERG brukes på en rekke forskjellige måter å vurdere retinal funksjon. Her har vi beskrevet hvordan man skal ta opp den "flash ERG ', den potensielle genereres når netthinnen utsettes for en kort, lys flash presentert i en ganzfeld bakgrunn. Den ganzfeld sprer lyset homogent og lysglimt når hele netthinnen omtrent jevnt. Hvis netthinnen er mørkt tilpasses før opptaket, og den mørke-tilpasning er opprettholdt som dyret er klargjort for opptak, ERG oppnådd er generert av både stang og kjegle fotoreseptorer.

Den mørke tilpasset flash ERG har en karakteristisk bølgeform, som har blitt analysert på to måter. For det første har tidlige og sene komponenter av ERG bølgeform blitt preget, og relatert til sekvensen av neuronal aktivering i netthinnen. Den første komponenten er en kort forsinkelse negativtgående potensial, a-bølge (figur 1). Dette er etterfulgt av en positivgående potensial, kalt B-bølgen. Den stigende fasen av b-bølgen viser svingninger, som er ansett som en egen komponent (oscillasjon potensialer eller OPS). Den a-bølgen er ansett å være generert av fotoreseptorer, B-bølgen av celler i det indre kjernesjiktet, og OPS ved amacrine celler 1.

Basert på stimulus styrke, svar på veldig svak blinker kalt scotopic terskelen responsen er mulig. Den scotopic terskelen responsen er forstått skal genereres fra retinal ganglion celler 2-4. For det andre kan den flash ERG separeres ved lett tilpasning, eller ved en to flash-protokoll som er beskrevet nedenfor, inn i stempelstang og kjegledrevet komponenter. Under photopic forhold, er det en bølge ikke påvises i rotter, fordi kjeglen befolkningen er lavt, men ops og en b-bølgen erklart fem. I primater, hvis netthinne har høyere kjegle bestander, både stempelstang og kjegle trasé generere en påvisbar en bølge 6.

To nyttige tiltak ofte hentet fra flash ERG er amplitudene av A- og B-bølger, målt som i figur 1, med typiske flash-responser er vist i figur 2. Når fotoreseptoren befolkningen er redusert, for eksempel ved eksponering for lys damagingly lys, blir alle komponenter av ERG reduseres. Nevro intervensjoner, for eksempel fjern iskemisk prekondisjonering (RIP), kan valideres av bevaring av amplitudene av A- og B-bølger (figur 3). Oppsummert analysen av ERG gjør sammenligninger mellom sunt, lett skadet og neuroprotected netthinnen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen følger retningslinjene fra University of Sydney dyr omsorg.

1. Making Elektroder

  1. Konstruer den positive elektroden (den som vil kontakte hornhinnen) fra et kort (5 cm) lang platinatråd med diameter 1-2 mm. Utforme den i en sløyfe noen mm i diameter. Koble denne sløyfen til en konvensjonell bly, lenge nok til å nå inngangstrinnet på forsterkeren (se figur 4).
  2. Konstruer den negative elektrode (som vil gå i dyrets munn) ved hjelp av en Ag / AgCl pellets 1-2 mm i diameter, også koblet til en konvensjon bly (se figur 4).
  3. Som en referanse-elektrode (som vil gå inn i dyrets bakdel), bruke en ren hypodermisk nål (23 G), også koblet til en leder av passende lengde (se figur 4).
  4. Ideelt bruke tre-kabler som tilbys av instrumentet produsenter, for å koble de tre elektroder (positiv U94; hornhinne, negative → munn, referanse → bakdel) til forsterkeren.

2. Tilkobling og kalibrering av Lys Stimulus og ERG Set-up

  1. Opprett (eller finne) et lite opptak laboratorium, noe som kan gjøres mørkt. Utstyre med en eller begge av en over-the-benk lys laget rød eller rød head-lampe.
  2. Bruk en lux meter for å bekrefte at rødt lys belysnings nå rat øye under installasjonen ikke overstiger 1 lux.
    Merk: En nøytral tetthet filter kan brukes til å redusere lysstyrken lampe og kilden til lampelys må spesifikt avgir rødt lys. Mørk tilpasning vil bli svekket hvis lyskilder avgir lavere (synlige) bølgelengder.
  3. Forsegle alt strølys inn i innspillingen laboratorium (dette ofte krever utholdenhet med ugjennomsiktig tape) og utarbeide en nøytral tetthet filter (dette kan kjøpes i ark) stor nok til å passe over, og så svak, noen dataskjerm du vil ha i lab.
    Merk: Stray lys oglys av en skjerm er tilstrekkelig til skade for mørkt tilpasning av rotte øyet.
  4. Koble forsterkeren til datainnsamling maskinvare. Koble positive, negative og referanse fører til forsterkeren. Kontroller at datamaskinen og LED ganzfeld strømforsyningsenheten er godt festet til en berg.
    Merk: Noen laboratorier har spesialisert jordingspunkter, koblet til en byggegrunn; en vannledning er et effektivt alternativ.
  5. Kalibrere LED lyskilde med en forskningskvalitet radiometer. Fest måleren sensor i den stilling ved hvilken dyrets øye vil befinne seg i løpet av et eksperiment.
  6. Programmet de ganzfeld lysdioder for å kjøre en full-feltet ERG protokoll med trinnvise økninger i flash energi, flash varighet, blits repetisjon og tid mellom blinker, betegnes interstimuls intervall (ISI), innstillinger. For et eksempel full feltet protokoll se tabell 1.
    Merk: Den full feltet ERG blinker øke fra repetitive dim blinker til bhøyre blinker i en trinnvis mote. De doble flash programmet følger på fra full-feltet protokollen og muliggjør isolering av stang og kjegle svar.

3. Dag Før ERG Eksperimentering

  1. Mørk tilpasse Sprague-Dawley rotter i 12 timer før opptak. Det er praktisk å gjøre dette i opptaket laboratoriet, når strølys har blitt eliminert.

4. Day of ERG Eksperimentering

  1. Sørge for at dyret skal være forsiktig oppvarmet under opptak. Vi bruker en lettmetall plattform bygget slik at dyrets hode kan hvile på riktig punkt ved inngangen til ganzfeld. Plattformen har innebygde rør gjennom hvilke vi pumpe vann forvarmet til 40 ° C i et vannbad.
    Merk: Erfaring viser at dette holder dyrets kjernetemperatur på 37 ° C.
  2. Vei rotte under mørke forhold. Vanlig vekt og gjøre opp korrekt ketamin (60 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg) dose. Begrense rotte gently og injisere bedøvelse intraperitonealt.
  3. Legg merke til injeksjonstidspunktet. Når dyret er bevisstløs (vanligvis i løpet av 5 min) kontrollere dybden av bedøvelse ved et lett å klemme en matte, for å se om en refleks reaksjon er til stede. Det er best å vente til denne refleksen er fraværende eller svak, før du fortsetter.
  4. Påfør en eneste dråpe atropin og en annen av proxmethacaine til hornhinnen.
  5. Skjær en 10 cm lang svart tråd. Lag en løkke med en enkel knute og slip løkken over ekvator i øyet. Stram det litt; effekten er å trekke øyeeplet litt fremover, med minimal press. Dette holder hornhinnen klart fra øyelokkene.
  6. Påfør karbomer øyedråper hornhinneoverflaten. Sikre carbomer forblir på hornhinnen overflaten og ikke søles på øyelokkene eller ansiktet.
  7. Plasser absorberende sengetøy på toppen av oppvarmet plattform.
  8. Posisjon rotte på sengetøy, med hodet på anbefalt sted i åpningen av ganzfeld.
  9. Sett internal temperatur sonde inn i endetarmen. Sikker temperaturføler i posisjon ved taping probe ledningen til halen.
  10. Sett referanseelektrode (23 G nål) subkutant i bakre beinet, og koble til forsterker.
  11. Plasser den negative elektrode (Ag / AgCl pellet) fast i munnen. For å unngå dette sklir ut munnen, påføre koble føre til et stabilt underlag.
  12. Plasser den positive elektroden over midten av hornhinnen. Ved hjelp av en micromanipulator, sikre at elektroden berører hornhinnen forsiktig.
  13. Sjekk kroppstemperaturen er på 37,0 til 37,5 ° C.
  14. Når dyret er korrekt plassert, og elektrodene er på plass, drapere hele oppsettet (ganzfeld og dyr) med en ugjennomsiktig materiale (for å bevare mørk tilpasning). Vi bruker en myk svart klut.
  15. I oppkjøpet programvare innstilt på en 2 kHz samplingsfrekvens med en samling tid 100-1000 msek med 5 ms av pre-samlingen prøvetaking. Still inn båndpassfiltre til 1-1000Hz og sikre at prøvetaking utløses å prøve periode på ~ 250 msek etter en flash.
  16. Sjekk opptak baseline. Det bør være fri for uvedkommende støy, men viser noen forsterker støy og en respiratorisk oscillasjon.
  17. Hvis grunnlinjen viser støy utenfra, begynner feilsøking. De fleste problemer er knyttet til glidning i elektrodeposisjon, eller jording. Bruk et Faraday bur for å sikre opptak er fri for støy utenfra.
  18. Kjør en test flash, 0,4 log Scot cd.sm -2. En ERG bølgeform i likhet med figur 2A skal vises. I våre laboratorie typiske svarene for en 0,4 log Scot cd.sm -2 blits er (a-bølge: -474 ± 39 uV og b-bølgen: 1512 ± 160 uV, n = 11).
  19. Tillat dyr til mørk gjen tilpasse i 10 min. Det er praktisk å bruke disse 10 min å sjekker grunnlinjen.
  20. Etter bekreftelse av stabilt signal starte innspillingen.
  21. På slutten av innspillingen, sjekk at kroppen Temperature ble opprettholdt. Fjern elektroder. Påfør carbomer polymer til hornhinner. At dyret kan komme på en varmepute til det er fullt mobile og aktive, før han returnerte til dyr bolig.

5. Remote Iskemi

  1. Utføre fjern iskemi i enten våken eller anesteserte gnagere.
  2. Dersom dyret er bedøvet, legge den på et oppvarmet plattform (ovenfor) og skli sphygmomanometer mansjetten over den øvre del av bakbenet, klar av kneet.
  3. Dersom dyrene vant til å bli håndtert, er det mulig å utføre denne fremgangsmåten uten anestesi; Dette krever to personer. Én person begrenser dyret forsiktig og den andre anvender sphygmomanometer mansjetten og driver sphygmomanometer.
  4. For våken dyr, bruke et stykke håndkle ~ 15 cm x 30-50 cm å forsiktig vikle dyr, med ett bakben gratis. Lå dyret på ryggen på (si) på venstre underarm, med hodet gjemt mellom innehaverens arm og overkropp, og stedMansjetten som nettopp beskrevet.
  5. Tømme mansjetten og sørge for lufttrykket ventilen er lukket. Pump opp mansjetten til 160 mmHg i anesteserte dyr, og til 180 mmHg i våken dyr. Dette overstiger systoliske trykket (vanligvis 140 mmHg og 160 mmHg henholdsvis).
  6. Opprettholde dette presset som er nødvendig, ved hjelp av håndpumpen.
  7. Etter den planlagte tiden for iskemi (vi bruker to perioder på fem minutter adskilt med 5 min reperfusjon), tømme mansjetten trykket ved å løsne lufttrykket ventilen.
  8. Bekrefte effekten av fjern iskemi med en hud temperaturføler festet til fotbladet. Hudtemperatur faller typisk 32-30 ° C, over 5 min og gjen på reperfusjon.

6. Lys Damage

  1. Sikre at rotter er i en mørk-tilpasset over natten, før lyset skader prosedyren.
  2. På riktig tidspunkt følgende lem iskemi (i våre eksperimenter uten forsinkelse), blir hvert dyr plasseres enkeltvis i en plexiglass bokser, with vann og mat i gulvbaserte beholdere.
    Merk: Lys-indusert skade kan bare foretas i albino dyr.
  3. Slå på en pre-kalibrert 1000 lux hvitt lys på en standard tid (vanligvis 9 am) og opprettholde denne tilstanden i 24 timer.

7. ERG data Utvinning og analyse

  1. Tilegne gjennomsnitt bølgeformer ERG. Hvis det er nødvendig, riktig for en ikke-null-basislinje, ved subtraksjon.
  2. Måle amplituden av en bølge (presentert ved middels til høye stimuleringsintensitet), som spenningsforskjellen mellom grunnlinjen og den første (<30 msek latens) rennen (figur 1).
  3. Mål b-bølgeamplituden som spenningsforskjellen mellom toppen av en bølge og den positive av følgende bølge, som typisk forekommer ved en ventetid på 80 til 100 ms (figur 1).
  4. Isoler oscillasjon potensialer ved hjelp av en Fourier-transformasjon for å filtrere data 60-235 Hz, med en 90 Hz overgangsbåndet
  5. Den implisitte tid (latency) av A- og B-bølgetopper kan også være et nyttig tiltak (figur 1). Bruk de to blinker for å isolere stangen respons. Trekk kjeglen respons (flash 2) fra blandet respons (flash 1) for å isolere stangen respons (figur 2).
  6. Normaliser individ lysintensitet a-bølge og b-bølgeamplitudene (etter behandling / post-behandling-grunnlinje) eller midlet for behandlingsgruppene. Intensitet-responskurver plotte gruppe amplituder og feil mot flash energi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen kan brukes til å måle visuell funksjon av gnager retina in vivo. Den a-bølgen, et mål på fotoreseptoren funksjon, og B-bølgen, et mål for indre retina funksjon, blir annotert i figur 1.

De stavdominerte ERG signal øker med økende lys stimulus, som vist i figur 2A. Den a-bølge blir tydelig ved ~ 0,4 log Scot cd.sm -2 og amplituden av en bølge økninger inntil metning på 2,5 log Scot cd.sm -2 (ikke vist). De doble flash paradigmet har vært brukt for å skille blandede ERG signal inn i konusen og stang isolat respons, som vist på figur 2B.

Dette ERG registreringsteknikk kan benyttes til å kontrollere nevrobeskyttende tiltak. Registrert grunn gjennomført en uke før lyset skader er sett i figur 3A. Lys skade redusert både et bølge-og b-bølgeamplitudene, vist i figurure 3B. Fjern ischemisk prekondisjonering var i stand til å redusere tap av ERG amplitude, som vist i figur 3C. Fjern iskemi teknikk avhenger av korrekt bruk av tourniquet over "kneet". Feil bruk av tilstrammende hindrer ikke lett skade på retina, som vist i figur 3D.

Figur 1
Figur 1: Måling av a-bølge og b-bølger fra en mørketilpasset ERG Sporet vist er ført fra hornhinnen av en mørk tilpasset øye til en lys lysglimt gitt ved tidspunktet t0 vist.. Amplituden til en bølge er målt fra grunnlinjen til den første renne (rød pil). Amplituden av B-bølgen blir målt fra bunnen av en bølge til den følgende positive topp (blå pil). Implisitt tid (latency) måles fra stimulusartefakt (t0) til et punkt av interesse på sporet, slik som bunnen av en bølge (hakeparentes). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Utvikling av mørketilpasset ERG med økende styrke og flashseparasjon av stang- og kjegle responser Sporene vist er ført fra hornhinnen av en mørk tilpasset øye å øke lysglimt.. A-bølge vises lysere intensiteter. (A) Sammenligning 1,4 til 0,4 log Scot cd.sm -2, har topp b-bølge mettet, men en bølge fortsetter å vokse. I (B), er de to blinker kledde. De to 2,0 log Scot cd.sm -2 blinker er atskilt med en 500 msek ISI. Den første flash genererer en blandetreaksjon (svart), og den andre flash genererer en kjegle eneste reaksjon (stiplet linje). Subtrahere kjegle respons gir den isolerte stang respons (grå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: ERG gir et mål på funksjonen av retina Representative bølgeformer som er vist her for (A) normal netthinnen, (B) retina skadet av lys, (C) retina betinget av RIP før de blir utsatt for skadelige lys, og. (D) retina ineffektivt betinget av RIP, og deretter utsettes for skadelige lys. Det samme flash energi ble brukt for hver post (2,0 log cd.sm -2). For posten i D trykket mansjettenpå bakbenet ble feilaktig plassert og iskemi ble ikke etablert. Lys skader reduserer amplituden av ERG (B) og RIP begrenser reduksjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Fig. 4: Lukk opp ERG elektroder Elektrodene som skal bygges er vist fra venstre mot høyre; den positive elektrode i kontakt med hornhinnen, den negative elektrode for å bli plassert i munnen, og referanseelektroden som er bygget opp av en krokodilleklemme er koblet til en nål som innføres deretter bakdel subkutant. Trykk her for å vise en større versjon av denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mørke tilpasset flash ERG fremgangsmåten beskrevet ovenfor er en pålitelig metode for å vurdere retinal funksjon hos rotter. Både a-bølge og b-bølge ble redusert med lys skade. Fjern ischemisk prekondisjonering dempet lys skade-indusert reduksjon i a-bølge og b-bølge. Denne bevaring av netthinnefunksjon antyder at fjern iskemisk prekondisjonering har indusert nevro, likner andre former for beskyttende preconditioning som hypoksi, ischemi og mosjon 8-10. ERG signal spilt bestemmes av tre sett av faktorer - Opptaksoppsett, parametere av lyset stimulans, og tilstanden til dyret.

Opptak setup

ERG er redusert i amplitude når elektrodene er feil plassert eller preparatet er ufullstendig jordet 11. Riktig jording av nærmeste elektrisk utstyr er viktig, for å redusere støy i opptaket; hvis betydelig støy vedvarer en faraday bur bør brukes. Den positive elektroden bør støtt på midten av hornhinnen med bekreftelse av posisjonene kontrolleres før ERG full felt-protokoll og ved fullføring. Det er viktig at denne elektroden kontakter bare hornhinnen; kontakt med øyelokket eller værhår kan redusere signal amplitude. En løs bomullstråd har blitt brukt i denne protokollen for å hindre at øyelokkene fra å berøre den positive elektrode. Noen forskere har utviklet kontaktlinser med den positive elektroden innebygd for å sikre pålitelig kontakt og forebygging av øyelokket rørende 12.

Lyset stimulus satt opp

Stimulatoren vi har brukt gir bredspektret hvitt lys, fra LED-kilder. Andre lyskilder er egnet som lette stimuli som xenon strobe lys og halogen belysning, se Weymouth og Vingrys for sammenligninger mellom lys stimuli 11. Fordelen med LED-lys, men jegs at varigheten av hvert lysblink og dens energi er lett programmerbare og hurtig tilbakestilt over et bredt spekter av lysintensiteter. Vi har utviklet et sett av blinker av gradert energi, som i mørket-tilpasset gnager spenner fra terskel (som produserer en just-påvisbar respons) for å mette (produsere en maksimal respons).

Ved prøving og feiling, har vi etablert interstimulus intervaller (ISIS) som sikrer at amplituden svar på en flash er uavhengig av en foregående flash av samme intensitet. Den lysere blitsen, jo lengre ISI som kreves for denne uavhengigheten.

Også ved prøving og feiling har vi etablert et minimum antall responser som kreves ved hvert energi for å tilveiebringe et rent signal. Gjennomsnitt flere svar vil alltid gi et renere signal. Vi bruker minima slik at energien serien kan gjennomføres raskt (i vår protokoll 11 min); hurtig gjennomføring reduserer variasjoner på grunn av endringer i bedøvelse tilstand og allows tid for andre variabler som skal undersøkes, om nødvendig.

State of the animal

Flere parametere av dyrets fysiologi er viktig for å optimalisere og standard ERG registreringer oppnådd.

Temperatur

Den a-bølgesignal blir generert fra lys-indusert aktivering av et G-protein-koblet fototransduksjonskaskade i det ytre segment; dynamikken i denne kaskaden er, som alle enzymatiske reaksjoner, temperaturavhengig 13,14. Gnagere ende under anestesi er utsatt for nedkjøling og krever ekstern oppvarming for å opprettholde en kjernetemperatur på 37,5 ° C i løpet av innspillingen. Hvis kroppstemperaturen faller mer enn 1-2 ° C, a-bølge og b-bølgeamplitudene minske og deres ventetider øker 15.

Anestesi

Stabile ERG opptak krever at dyret skal være urørlig. Neuromuskulære blokkere og anaesthetic midler brukes i ERG eksperimentering for å oppnå en bevisstløs og ubevegelig tilstand. Det har bare vært fem rapporter om våken ERG opptak i rotter 16-20. I disse studiene, elektrodene ble kirurgisk forhånd implantert i skallen, og to av disse studiene testet effekten av anestesi på ERG 17,20.

Den vanligste bedøvelse som brukes for ERG opptak har vært en kombinasjon av ketamin og xylazin (i våre eksperimenter 60 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazin brukes). Dette påvirker ERG mindre enn gassbedøvelse slik isofluran og halotan, og har vist seg relativt ikke-giftig, med høy gjenvinningsgrad 17,21,22. Denne tilnærmingen holder dyret immobile for ~ 40 min; en halv dose kan brukes til å forlenge opptaksbetingelser i et tilsvarende tidsrom. Studien av Chang direkte sammenlignet ERG med og uten bedøvelse, og viste at ketamin-xylazine ikke forurolige målbart amplitude og ventetider for a- og b-bølger 17. De fleste forskere standardanestesi forhold og deretter teste eksperimentelle parametre; noen effekt av bedøvelse kan ikke helt utelukkes.

Okulær miljø

Fysiologi av øyet krever vedlikehold, for å optimalisere og standardisere ERG opptak. Elevene bør være en standard størrelse; Dette oppnås med en mydriatiske, anvendt som øyedråper, for å oppnå maksimal strekkingen. I gnagere, er atropin eller fenylefrin brukt 23. Hydratiseringen av hornhinnen blir opprettholdt ved anvendelse av en karbomer polymeren før opptak; Dette stabiliserer også elektrisk ledningsevne mellom den positive elektrode og hornhinne. Dersom hornhinnen blir dehydrert, kan corneal arrdannelse og kataraktdannelse forekommer 24. Katarakt er mer vanlig hos mus 25, og ulike metoder for å opprettholde hornhinne hydrering har vært ansatt i muse ERG innspillinger, inkludert en konstant strøm av vandig væske ellerskreddersydde kontakt stil elektroder som felle hydration på hornhinnen overflaten 12.

Adaptive tilstand av netthinnen

Dette er en viktig variabel. Protokollen ovenfor er utformet for å sikre at netthinnen er mørk-tilpasset, til sin mest sensitive tilstand. Ideelt sett, pigmenterte rotter som kreves tre timers mørk huset for å være fullt ut mørketilpasset, mens ikke-pigmenterte dyr, slik som Sprague Dawley rotter, krever et minimum av 5 timer 26. Det er vanlig praksis for scotopic ERG opptak for å tilpasse dyr overnatting i 12 timer. Delvis eller full tilpasning til lys kan enkelt og raskt oppnådd ved å slå på en standard intensitet bakgrunn lys i ganzfeld stimulator. Etter lett tilpasning tar imidlertid fullstendig mørkt tilpasning timer for å oppnå; derav forslaget av ekstrem forsiktighet for å sikre at øynene ikke blir utsatt uhell for lys før opptak.

ERG registreringsteknikk er begrenset avovenfor avgjørende faktorer (dvs. ERG og stimulans set-up) og ferdighet av forsker ved ERG testing. Uerfarne forskere er sannsynlig å ha variable ERG opptak. Variansen kan reduseres ved å skape store nok utvalgsstørrelser for å sammenligne resultater, for eksempel reduksjon eller gevinst i synsfunksjon. Alternativt kan ERG opptak normaliseres mellom baseline opptak og etterbehandling opptak. De normaliserte data kan deretter bli gruppert og analysert. Når presentere ERG data, er det vanlig praksis å vise gruppere data og representative kurver.

Når alle de ovennevnte er nøye kontrollert, er amplituden av ERG et mål på den funksjonelle tilstand av netthinnen. ERG er konsekvent redusert i amplitude ved nedbryting av fotoreseptoren lag forårsaket av lys skade eller genetisk indusert degenerering 27,28. Motsatt den beskyttende effekten av et inngrep som RIP kan påvises i AMPLitude av ERG 29. ERG har også blitt brukt i å demonstrere den beskyttende effekten av iskemisk prekondisjonering, hypoksisk preconditioning, mosjon og kosttilskudd safran på netthinnen 8-10,30.

Økende kunnskap om dynamikken i fototransduksjonskaskade rhodopsin, og av de synaptiske forbindelser i netthinnen, har oppmuntret til utvikling av modeller for ERG generasjon, og sofistikert ERG bølgeform analyse er mulig selv om kinetisk modellering basert på kjente fysiologiske hendelsene fototransduksjonskaskade i fotoreseptorene , og vår forståelse av indre retinal kretser 31. For eksempel er en bølgekinetiske modeller basert på de biokjemiske skritt som oppstår under fototransduksjonskaskade og montering av modellen muliggjør sammenligninger av modellparametere som peak reaksjoner, timing forsinkelser og følsomhet 14.

Ulempen med modellering er at den baserer seg på antagelser om netthinne Kretseney, og kan bare være så informativ som forutsetningene tillater. I lys av denne ulempen, har a-bølgen kinetisk modell nylig blitt kritisert for å forenkle en bølge dynamikk 32. I fotoreseptorlidelser degenerasjon studier, ERG bølgeform analyse vanligvis ikke utført av en annen grunn. Fotoreseptoren degenerasjon er ofte alvorlig, noe som resulterer i dramatiske tap i visuell funksjon og dermed er ytterligere analyse av en bølge og b-bølge parametere ikke garantert 8,9,27,30. Uansett, har ERG modellering av en bølge og b-bølgen blitt vedtatt som standard praksis i mange gnagere og detaljert informasjon om ERG modellering, for en bølge, b-bølge og OPS kan bli funnet i studier av Hood, og gjennomgang artikler av Weymouth og Vingrys, Frishman, og Wachtmeister 11,32-34.

I sammendraget, den mørke-tilpasset ERG metoden presenteres kan ta målbare forskjeller mellom retinal degenerasjon med og uten nevro intervensjoner such som fjern iskemisk prekondisjonering. Elementene essensielle til pålitelige ERG opptak har blitt beskrevet. ERG målinger av fotoreseptoren og indre retina-funksjonen er nyttig for forskere som studerer degeneration av netthinnen, og effektene av ulike genetiske, biofarmasøytisk og farmakologiske intervensjoner på synsfunksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Jonathan Stone er direktør for CSCM Pty Ltd

Acknowledgements

Forfatterne er takknemlige for hjelp fra Fru Sharon Spana i gnager overvåking, håndtering og eksperimentering. PhD økonomisk støtte har blitt gitt av University of Sydney og Australian Research Centre for Excellence in Vision.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware AD Instruments PL 35044 Acquistion of ERG
Animal Bio Amp AD Instruments FE 136 Amplifier for ERG
Lab chart AD Instruments Signal collection software
Ganzfield Photometric solutions FS-250A Light stimulus
Ganzfield operating system Photometric solutions
Research Radiometer International light technologies ILT-1700 calibrate light series
Lux meter LX-1010B check red light illumanation
Excel Microsoft
Lead wires AD Instruments Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator AD Instruments ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95% A&E metals postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet SDR E205 negative electode
26 G needle BD ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe Harvard Appartus 507222F
Atropine 1% w/v Bausch & Lomb topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v Bausch & Lomb topical anaesthetic
Visco tears eye drops Novartis carbomer polymer
Thread retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive Blu tac Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd muscle relaxant
Scale

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arden, G. B., Heckenlively, J. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. MIT Press. 139-183 (2006).
  2. Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. Journal of Physiology-London. 555, (1), 153-173 (2004).
  3. Fortune, B., et al. Selective ganglion cell functional loss in rats with experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, (6), 1854-1862 (2004).
  4. Alarcon-Martinez, L., et al. Short and long term axotomy-induced ERG changes in albino and pigmented rats. Molecular Vision. 15, (254-255), 2373-2383 (2009).
  5. Lyubarsky, A. L., et al. Functionally rodless mice: transgenic models for the investigation of cone function in retinal disease and therapy. Vision Research. 42, (4), 401-415 (2002).
  6. Bush, R. A., Sieving, P. A. A PROXIMAL RETINAL COMPONENT IN THE PRIMATE PHOTOPIC ERG A-WAVE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35, (2), 635-645 (1994).
  7. Liu, K., et al. Development of the electroretinographic oscillatory potentials in normal and ROP rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, (12), 5447-5452 (2006).
  8. Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, (3), 1348-1354 (2003).
  9. Lawson, E. C., et al. Aerobic Exercise Protects Retinal Function and Structure from Light-Induced Retinal Degeneration. Journal of Neuroscience. 34, (7), 2406-2412 (2014).
  10. Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8, (7), 718-724 (2002).
  11. Weymouth, A. E., Vingrys, A. J. Rodent electroretinography: Methods for extraction and interpretation of rod and cone responses. Progress in Retinal and Eye Research. 27, (1), 1-44 (2008).
  12. Bayer, A. U., Cook, P., Brodie, S. E., Maag, K. P., Mittag, T. Evaluation of different recording parameters to establish a standard for flash electroretinography in rodents. Vision Research. 41, (17), 2173-2185 (2001).
  13. Pugh, E. N., Lamb, T. D. AMPLIFICATION AND KINETICS OF THE ACTIVATION STEPS IN PHOTOTRANSDUCTION. Biochimica Et Biophysica Acta. 1141, (2-3), 111-149 (1993).
  14. Breton, M. E., Schueller, A. W., Lamb, T. D., Pugh, E. N. ANALYSIS OF ERG A-WAVE AMPLIFICATION AND KINETICS IN TERMS OF THE G-PROTEIN CASCADE OF PHOTOTRANSDUCTION. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35, (1), 295-309 (1994).
  15. Mizota, A., Adachi-Usami, E. Effect of body temperature on electroretinogram of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, (12), 3754-3757 (2002).
  16. Szabo-Salfay, O., et al. The electroretinogram and visual evoked potential of freely moving rats. Brain Research Bulletin. 56, (1), 7-14 (2001).
  17. Charng, J., et al. Conscious Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potentials in Rats. Plos One. 8, (9), (2013).
  18. Galambos, R., Juhasz, G., Kekesi, A. K., Nyitrai, G., Szilagyi, N. NATURAL SLEEP MODIFIES THE RAT ELECTRORETINOGRAM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (11), 5153-5157 (1994).
  19. Galambos, R., Szabo-Salfay, O., Szatmar, E., Szilagyi, N., Juhasz, G. Sleep modifies retinal ganglion cell responses in the normal rat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (4), 2083-2088 (2001).
  20. Guarino, I., Loizzo, S., Lopez, L., Fadda, A., Loizzo, A. A chronic implant to record electroretinogram, visual evoked potentials and oscillatory potentials in awake, freely moving rats for pharmacological studies. Neural Plasticity. 11, (3-4), 241-250 (2004).
  21. Huang, J. C., Salt, T. E., Voaden, M. J., Marshall, J. NON-COMPETITIVE NMDA-RECEPTOR ANTAGONISTS AND ANOXIC DEGENERATION OF THE ERG B-WAVE IN-VITRO. Eye (London). 5, (4), 476-480 (1991).
  22. Sasovetz, D. KETAMINE HYDROCHLORIDE - EFFECTIVE GENERAL ANESTHETIC FOR USE IN ELECTRORETINOGRAPHY. Annals of Ophthalmology. 10, (11), 1510-1514 (1978).
  23. Mojumder, D. K., Wensel, T. G. Topical Mydriatics Affect Light-Evoked Retinal Responses in Anesthetized Mice). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, (1), 567-576 (2010).
  24. Fraunfel, F. t, Burns, R. P. ACUTE REVERSIBLE LENS OPACITY - CAUSED BY DRUGS, COLD, ANOXIA, ASPHYXIA, STRESS, DEATH AND DEHYDRATION. Experimental Eye Research. 10, (1), 19 (1970).
  25. Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. ACUTE REVERSIBLE CATARACT INDUCED BY XYLAZINE AND BY KETAMINE-XYLAZINE ANESTHESIA IN RATS AND MICE. Experimental Eye Research. 42, (4), 331-337 (1986).
  26. Behn, D., et al. Dark adaptation is faster in pigmented than albino rats. Documenta Ophthalmologica. 106, (2), 153-159 (2003).
  27. Sugawara, T., Sieving, P. A., Bush, R. A. Quantitative relationship of the scotopic and photopic ERG to photoreceptor cell loss in light damaged rats. Experimental Eye Research. 70, (5), 693-705 (2000).
  28. Machida, S., et al. P23H rhodopsin transgenic rat: Correlation of retinal function with histopathology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, (10), 3200-3209 (2000).
  29. Brandli, A., Stone, J. Remote Ischemia Influences the Responsiveness of the Retina. Observations in the Rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, (4), 2088-2096 (2014).
  30. Maccarone, R., Di Marco, S., Bisti, S. Saffron supplement maintains morphology and function after exposure to damaging light in mammalian retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, (3), 1254-1261 (2008).
  31. Hood, D. C., Birch, D. G. Assessing abnormal rod photoreceptor activity with the a-wave of the electroretinogram: Applications and methods. Documenta Ophthalmologica. 92, (4), 253-267 (1996).
  32. Robson, J. G., Frishman, L. J. The rod-driven a-wave of the dark-adapted mammalian electroretinogram. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 1-22 (2014).
  33. Hood, D. C., Birch, D. G. A COMPUTATIONAL MODEL OF THE AMPLITUDE AND IMPLICIT TIME OF THE B-WAVE OF THE HUMAN ERG. Visual Neuroscience. 8, (2), 107-126 (1992).
  34. Wachtmeister, L. Oscillatory potentials in the retina: what do they reveal. Progress in Retinal and Eye Research. 17, (4), 485-521 (1998).

Comments

3 Comments

  1. The article is very helpful to setup ERG to discriminate cone and rod electrical contributions. Could you please, let me know how can I access TABLE1 that it is mentioned in the article.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 14, 2016 - 2:00 PM
  2. Hi Marcelo,

    Below is a link to table 1 as a pdf file. Not the voltages used were based on our calibration, and you may need to adjust your voltage settings to reach equivalent light intensities.
    http://tiny.cc/he5vay

    Reply
    Posted by: Alice B.
    April 17, 2016 - 10:18 PM
  3. Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 18, 2016 - 10:19 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics