Kemirgen Retina ve Uzaktan Ekstremite İskemik Önkoşullamanın Koruyucu Etkileri Fonksiyonu Değerlendirmek Üzere elektroretinogram kullanma

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brandli, A., Stone, J. Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning. J. Vis. Exp. (100), e52658, doi:10.3791/52658 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

ERG ışığa karşılık olarak retina tarafından oluşturulur ve gözün korneal yüzeyi kaydedilen bir elektrik potansiyeli. Kayıt koşulları dikkatle idare edildiğinde, ERG retina fonksiyonunu değerlendirmek için çeşitli şekillerde kullanılabilir. İşte biz 'flaş ERG', retina, bir Ganzfeld arka planda sunulan kısa, parlak flaş maruz kaldığında oluşan potansiyeli kaydetmek nasıl tarif. Ganzfeld homojen ışık dağıtır ve ışık flaş yaklaşık eşit bütün retina ulaşır. Retina kaydetmeden önce koyu adapte edilir ve hayvan kayıt için hazırlanmış gibi koyu adaptasyonu devam edilirse, ERG hem çubuk ve koni fotoreseptör tarafından oluşturulan aldı.

koyu adapte flaş ERG iki şekilde analiz edilmiştir karakteristik dalga biçimi vardır. İlk olarak, ERG, dalga biçiminin, erken ve geç bileşenleri ayırt ve nöron sekansına ilişkilendirilmiştirretina al aktivasyonu. erken bileşen kısa gecikme negatif gidiş potansiyel bir dalga (Şekil 1). Bu olumlu bir gidiş potansiyeli takip ediyor, b- dalgası olarak adlandırılan. b- dalga yükselen aşaması ayrı bir bileşen (osilatör potansiyelleri veya OP) olarak kabul edilir salınımları göstermektedir. a-dalgası fotoreseptör tarafından oluşturulan olarak kabul edilir, amacrine hücreleri 1 ile iç nükleer tabaka hücreleri ve ops b-dalgası.

Uyarıcı gücüne dayalı, çok loş flaşlar tepkiler skotopik eşik tepkisi mümkündür adlandırılan. skotopik sınır tepkisi, retinal bez hücrelerin 2-4 elde edilmesi anlaşılmalıdır. İkincisi, flaş ERG ışık adaptasyon ile ayrılabilir veya bir iki flaş protokolü tarafından çubuk ve koni odaklı bileşenleri içine, aşağıda anlatılan. Fotopik koşullar altında, koni nüfusu düşük olduğu için dalga, sıçanlarda değil saptanabilir, ancak Operasyonel ve b-dalgası5 açık. Kimin retinalar yüksek koni nüfusa sahip primatlar, olarak, çubuk ve koni yollar hem saptanabilir bir dalga 6 üretir.

Genellikle flaş ERG çıkarılan iki yararlı önlemler fotoreseptör nüfusu zarar verici parlak maruz bırakılarak, örneğin azalır, Şekil 2'de gösterilen tipik bir flaş yanıtları. Şekil 1 'deki gibi ölçülür A ve B amplitüdü, Hangi Işık, ERG tüm bileşenleri azalır. Gibi uzak iskemik önkoşullama (RIP) olarak nöroprotektif müdahaleler, a- b-dalgaları (Şekil 3) genliklerinin korunması ile doğrulanabilir. Özetle, ERG analizi hasarlı sağlıklı, hafif ve neuroprotected retina arasındaki karşılaştırmalar sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokol University of Sydney hayvan bakım kurallarına uyar.

1. Yapımı elektrotlar

  1. Pozitif elektrot platin tel çapı 1-2 mm kısa (5 cm) uzunluğu (kornea irtibata geçecektir biri) Construct. Bir döngü içine çapında bir kaç mm o moda. Senin amplifikatör giriş aşamaya ulaşmak için yeterince uzun bir geleneksel kurşun bu döngü bağlayın (Şekil 4).
  2. Bir Ag / AgCl de kongre kablosuna bağlı çapı 1-2 mm, pelet kullanılarak (hayvanın ağzına gidecek) negatif elektrot Construct (Şekil 4).
  3. (Hayvanın kıç girecek) referans elektrot, aynı zamanda uygun uzunlukta bir kurşun bağlanmış temiz derialtı iğne (23 G) kullanmak gibi (Şekil 4).
  4. İdeal olarak, (pozitif U üç elektrotları bağlamak için, cihaz üreticileri tarafından sağlanan üç kurşun kablolar kullanın94; Kornea, negatif → ağız, amplifikatör kıç → referans).

Işık Stimulus ve ERG Set-up 2. Bağlantı ve Kalibrasyon

  1. Karanlık yapılabilir küçük bir kayıt laboratuvarı, oluşturun (veya bulmak). Kırmızı yapılan over-the-tezgah ışık veya kırmızı kafa lambasının ya da her ikisi ile donatın.
  2. 1 lux geçmemesi kurulum sırasında sıçan göz ulaşan kırmızı ışık aydınlık onaylamak için bir lüks metre kullanın.
    Not: Bir nötral yoğunluk filtresi lamba parlaklığını azaltmak için kullanılabilir ve lamba ışık kaynağı, özellikle kırmızı ışık yayarlar gerekir. Işık kaynakları düşük (görünür) dalga boylarını yayan eğer karanlık adaptasyonu tehlikeye olacak.
  3. (Bu genellikle şeffaf bant ile sebat gerektirir) kayıt laboratuvarı giren tüm sokak ışık kapatmak ve üzerinde sığacak kadar büyük ve o kadar loş bir nötral yoğunluk filtresi (bu yaprak satın alınabilir) hazırlamak, herhangi bir bilgisayar ekranı içinde olacak laboratuvar.
    Not: Kaçak ışık veBir ekranın ışık sıçan gözün karanlık adaptasyonu halel için yeterlidir.
  4. Veri toplama donanımına amplifikatörü bağlayın. Amplifikatöre pozitif, negatif ve referans uçlarını bağlayın. Bilgisayar ve LED Ganzfeld güç kaynağı ünitesi güvenli bir zemin kaynağına bağlı olduğundan emin olun.
    Not: Bazı laboratuvarlar bina toprağa bağlı, topraklama noktaları uzman var; Bir su borusu etkili bir alternatiftir.
  5. Bir araştırma kalitesinde Radyometresiz LED ışık kaynağı ayarlayın. Hayvanın gözü bir deney sırasında yer alacak hangi pozisyonda metrenin sensörünü sabitleyin.
  6. Ganzfeld LED'ler yanıp söner arasındaki flaş enerji, flaş süresi, flaş tekrarı ve zaman içinde adım adım artışlar tam saha ERG protokolünü çalıştırmak Program, interstimuls aralığı (ISI), ayarlar olarak adlandırılan. Bir örnek tam saha protokolü için bakınız Tablo 1.
    Not: ERG yanıp söner tekrarlayan loş yanıp söner yükselecek tam saha bBir adım akıllıca bir şekilde doğru yanıp söner. ikiz Flash program tam saha protokolü üzerinde izler ve çubuk ve koni yanıtları izolasyonunu sağlar.

ERG Deney 3. Gün önce

  1. Karanlık kaydetmeden önce 12 saat Sprague-Dawley sıçanları adapte. Bu kaçak ışık ortadan edildikten sonra, kayıt laboratuvarda bunu yapmak uygundur.

ERG Deney 4. Gün

  1. Hayvan kayıt sırasında hafifçe ısıtılır olabilmesi için düzenleyin. Biz hayvanın kafası Ganzfeld girişinde doğru noktada dinlenme böylece inşa hafif metal platformu kullanmak. platform, bir su banyosu içinde 40 ° C'ye ısıtılmış su pompası içinden dahili boru vardır.
    Not: Deneyim bu 37 ° C'de hayvanın çekirdek sıcaklığını korur olduğunu göstermektedir.
  2. Karanlık koşullarda sıçan tartılır. Telaffuz ağırlığı ve doğru ketamin (60 mg / kg) ve ksilazin oluşturan (5 mg / kg) dozda. Sıçan gen dizginlemektly ve intraperitoneal anestezik enjekte.
  3. Enjeksiyon zamanı not edin. Hayvan bilinçsiz sonra (genellikle 5 dakika içinde) hafifçe bir refleks yanıtı mevcut olup olmadığını görmek için, tek ayak pedi kısma anestezi derinliğini kontrol edin. Bu refleks geçmeden önce, yok ya da zayıf olana kadar beklemek en iyisidir.
  4. Korneaya proxmethacaine tek atropin damla ve başka uygulayın.
  5. Siyah iplik 10 cm uzunluğunda kesin. Basit bir düğüm ile bir döngü yapın ve göz ekvator üzerinde döngü kayma. Hafifçe sıkın; etkisi minimum basınç, hafif öne göz küresinin çekmektir. Bu göz kapaklarında net kornea tutar.
  6. Uygula karbomer göz kornea yüzeyine düşer. Emin Karbomer kornea yüzeyinde kalır ve göz kapakları veya yüz dökülmemesine değildir.
  7. Isıtmalı platformun üstüne emici yatak yerleştirin.
  8. Ganzfeld açılışında önerilen yerde baş yatak üzerinde Pozisyonu sıçan.
  9. Ekle intrektum içine ernal ısı probu. Kuyruk prob kablosunu bantlama pozisyon Güvenli ısı probu.
  10. Subkutan arka bacak içine referans elektrodu (23 G iğne) yerleştirin ve amplifikatör bağlanın.
  11. Güvenli ağızda negatif elektrot (Ag / AgCl pelet) yerleştirin. Bu ağız kaymasını önlemek için, sabit bir yüzeye bağlanarak kurşun yapıştırın.
  12. Korneanın merkezi üzerinde pozitif elektrot yerleştirin. Bir mikromanipülatör kullanarak, elektrot hafifçe kornea dokunur emin olun.
  13. 37.5 ° C - Kontrol vücut ısısı 37.0 yer almaktadır.
  14. Hayvan düzgün yerleştirilmiş ve elektrotlar yerdesiniz sonra, opak malzeme ile tüm kurulum (Ganzfeld ve hayvan) asmak (karanlık adaptasyonu korumak için). Biz yumuşak siyah bir bez kullanın.
  15. Ön toplama örnekleme 5 milisaniye ile 100-1000 msn koleksiyonu zaman 2 KHz örnekleme hızında ayarlanmış edinme yazılımında. 1-1,000 bant geçiren filtreler ayarlayınHz ve bu örnekleme sağlamak bir flaş aşağıdaki ~ 250 msn dönemini örnek tetiklenir.
  16. Kayıt taban çizgisini kontrol edin. Bu gereksiz gürültü özgür olmak, ancak bazı amplifikatör gürültü ve solunum salınım göstermesi gerekir.
  17. Bazal gereksiz gürültüyü gösteriyorsa, sorun giderme başlar. Çoğu problem elektrot pozisyonu veya topraklama kaymaya ilişkilidir. Kayıtlar gereksiz gürültü serbest olmasını sağlamak için bir Faraday kafesi kullanın.
  18. Bir test flaş, 0.4 günlük scot cd.sm -2 çalıştırın. Benzer bir ERG dalga 2A görünmelidir Şekil. 0.4 günlük scot cd.sm -2 flaş laboratuvar tipik tepkiler (: -474 ± 39 mV ve b-dalgası: a-dalgası 1,512 ± 160 mV, n = 11) 'dir.
  19. Karanlık hayvan 10 dakika süreyle yeniden adapte izin verin. Bu taban çizgisini yeniden kontrol etmek, bu 10 dakika kullanmak daha uygun olur.
  20. Istikrarlı sinyal aşağıdaki onay kaydı başlar.
  21. Kayıt oturumun sonunda, vücut temperat kontrolURE muhafaza edilmiştir. Elektrotları çıkarın. Kornealara karbomer polimer yeniden uygulayın. Hayvan konut dönmeden önce, tamamen mobil ve aktif olana kadar hayvan bir ısı pad üzerinde kurtarmak için izin verin.

5. Uzaktan İskemi

  1. Uyanık veya anesteziye kemirgenlerde ya uzaktan iskemi gerçekleştirin.
  2. Hayvan anestezi ise, (yukarıda) ısıtılmış bir platform üzerine yattı ve diz net arka ekstremite, üst kısmı üzerinde tansiyon aleti Kolluğu kayma.
  3. Hayvanlar işlenen için kullanılırsa, anestezi olmadan bu yordamı gerçekleştirmek mümkündür; Bu iki kişi gerekir. Bir kişi hafifçe hayvan kısıtlayan ve ikinci tansiyon aleti manşeti uygular ve sfingomanometre çalışır.
  4. Uyanık hayvanlar için, yavaşça tek hindlimb ücretsiz, hayvan sarmak için havlu bir parça ~ 15 cm x 30-50 cm kullanın. Merkez sahibinin kol ve gövde, ve yeri arasında sıkışmış olan, sol önkol (diyelim ki) onun sırtında hayvan LayManşet tıpkı nitelendirdi.
  5. Manşeti Deflate ve hava basınç valfi kapalı olduğundan emin olun. Narkoz hayvanlarda 160 mmHg manşeti Pompa ve uyanık hayvanlarda 180 mmHg. Bu sistolik basıncı (genellikle 140 mmHg ve 160 mmHg sırasıyla) aşıyor.
  6. El pompası kullanılarak, gerektiğinde bu baskıları koruyun.
  7. Iskemi için planlanan bir süre sonra (biz 5 dk reperfüzyon ile ayrılmış, 5 dakika 2 dönemleri kullanın), hava basınç valfi gevşeterek manşet basıncını Söndür.
  8. Footpad bağlı bir cilt sıcaklık probu ile uzaktan iskemi etkisini onaylayın. Cilt sıcaklığı tipik olarak 5 dakika boyunca, 32-30 ° C'ye düşer ve reperfüzyon kurtarır.

6. Işık Hasar

  1. Sıçanlar koyu adapte gecede, önce hafif hasar prosedüründe olduğundan emin olun.
  2. (Gecikmeden bizim deneylerde) ekstremite iskemi aşağıdaki uygun zamanda, her bir hayvan, bir pleksiglas kutular, wi içine tek başına yerleştirilirzemin tabanlı kaplarda inci su ve gıda.
    Not: Işık kaynaklı hasar sadece albino hayvanlarda yapılabilir.
  3. Standart bir süre (genellikle 09:00) bir önceden kalibre 1,000 lux beyaz ışık açın ve 24 saat süreyle bu durumu korumak.

7. ERG Veri çıkarımı ve Analizi

  1. ERG ortalama dalga formları edinin. Çıkarma ile sıfır olmayan bir taban için, gerekirse ayarlanır.
  2. Başlangıç ​​ve birinci arasındaki gerilim farkı olarak, (yüksek uyaran yoğunluklarına orta ve sunulan) a dalgasının genlik ölçün (<30 msn gecikme) oluk (Şekil 1).
  3. Tipik 80-100 msn (Şekil 1) bir gecikme meydana gelen bir dalgasının tepe ve şu dalganın pozitif arasındaki gerilim farkı olarak b-dalgası genliği ölçün.
  4. 90 Hz geçiş bandı ile, 60-235 Hz verileri süzmek için bir dönüşüm Fourier kullanarak osilatör potansiyelleri izole edin
  5. a- ve b-dalgası zirveleri örtülü süresi (gecikme) da yararlı bir tedbir (Şekil 1) olabilir. Çubuk yanıtı izole etmek için ikiz yanıp kullanın. Karışık tepki (flaş 1) çubuk tepkisini izole etmek (Şekil 2) koni yanıt (flaş 2) çıkarın.
  6. Bireysel ışık yoğunluğu bir dalga ve b-dalgası genlikleri (tedavi sonrası / post-tedavi-bazal) Normale veya tedavi grupları için ortalama. Yoğunluk-yanıt eğrileri flaş enerjiye karşı grup genlikleri ve hatayı arsa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

protokolü, in vivo olarak, kemirgen retina görme fonksiyonu ölçmek için kullanılabilir. a-dalgası, fotoreseptör fonksiyonunun bir ölçüsü, ve b-dalgası, iç retina fonksiyonun bir ölçümü olan, Şekil 1 'de açıklanmış bulunmaktadır.

Şekil 2A gösterildiği gibi artan ışık uyaran ile çubuk hakim ERG sinyal artar. a-dalgası 0.4 günlük scot cd.sm -2 ve 2.5 log Scot cd.sm de doyuma kadar a-dalgası artar genlik -2 (gösterilmemiştir) ~ en belirgin hale gelir. ikiz flaş paradigma Şekil 2B'de olduğu gibi, koni ve çubuk izole yanıtı Karma ERG sinyalini ayırmak için kullanılır olmuştur.

Bu ERG kayıt tekniği nöroprotektif müdahaleleri kontrol etmek için kullanılabilir. Baseline kayıtları ışık hasar öncesinde Şekil 3A görülen bir hafta tamamladı. Şekil gösterildiği bir dalga ve b-dalgası genlikleri hem düşük ışık hasarı,ure 3B. Uzaktan iskemik önkoşullama Şekil 3C görüldüğü gibi, ERG genlik kaybını azaltmak için başardı. Uzaktan iskemi tekniği "diz" yukarıdaki turnike doğru uygulanmasına bağlıdır. Şekil 3D görüldüğü gibi turnike Yanlış uygulama, retinaya ışık hasarı önlemek değildir.

Şekil 1
Şekil 1:. Zaman gösterilen t0 verilen parlak bir ışık flaş koyu adapte gözün kornea itibaren kaydedilir gösterilen koyu adapte ERG iz bir dalgası ve b dalgaların ölçümü. a-dalgasının genliği ilk çukur (kırmızı ok) başlangıca göre ölçülür. b- dalgasının genliği aşağıdaki olumlu tepe (mavi ok) bir dalgasının çukur ölçülür. Örtülü süresi (gecikme) uyaran ölçülüriz faiz noktasına yapay doku (t0), böyle bir dalga (köşeli parantez) çukur olarak. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2: artan flaş gücü ve çubuk ve koni yanıtları ayrılması koyu adapte ERG Kalkınma ışık yanıp artan bir koyu adapte gözün kornea kaydedilen Gösterilen izleri.. a-dalgası parlak şiddetlerde görünür. Scot cd.sm -2, zirve b-dalgası doymuş ama dalga büyümeye devam etmektedir 1.4 günlük 0.4 karşılaştırarak (A). (B), ikiz yanıp söner üst üste. İki 2.0 günlük scot cd.sm -2 yanıp söner 500 milisaniye ISI tarafından ayrılır. İlk flaş karışık üretiryanıtı (siyah) ve ikinci bir flaş koni tek bir yanıt (noktalı çizgi) oluşturur. Koni yanıtını Çıkarma izole çubuk tepkisi (gri) verir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3:. ERG Temsilcisi dalga, RIP tarafından (C) retina şartlandırılmış zarar ışığa maruz önce (A) Normal retina retina ışık zarar, (B) burada gösterilmiştir retina fonksiyonunun bir ölçüsünü sağlar ve (D) retina etkisiz RIP tarafından şartlandırılmış ve daha sonra zarar ışığa maruz. Aynı flaş enerjisi her kayıt (log 2.0 cd.sm -2) kullanıldı. D rekor basıncı manşet içinarka bacak üstüne yanlış yerleştirilmiş ve iskemi kurulmuş değildi. Hafif hasar ERG (B) genliğini azaltır ve RIP azalma azaltır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4:. ERG elektrotlar Yakın elektrotlar soldan sağa, gösterilen inşa edilecek; pozitif elektrot negatif elektrot ağız ve daha sonra kıç derialtı sokulan bir iğne bağlanan bir timsah klibi oluşur referans elektrot yerleştirilecek kornea başvurun. tıklayınız daha büyük bir versiyonunu görmek için Bu rakamın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yukarıda tarif edilen koyu adapte flaş ERG yöntemi sıçanlarda retina fonksiyonlarını değerlendirmek için güvenilir bir yöntemdir. A-dalgası ve b-dalgası Hem hafif hasar azaltılmıştır. Uzaktan iskemik önkoşullama a-dalgası ve b dalga ışık hasar kaynaklı azalmalar hafifletilmiş. Retina fonksiyonunun Bu muhafaza uzak iskemik önkoşullama gibi hipoksi, iskemi ve egzersiz 8-10 gibi koruyucu önkoşullama diğer formları andıran, nöro kaynaklı olduğunu göstermektedir. Kayıt kurulumu, ışık uyaran parametreleri ve hayvan devlet - kaydedilen ERG sinyal faktörleri üç set tarafından belirlenir.

Kayıt kurulum

Elektrotlar yanlış yerleştirilmiş zaman ERG genlik azalır veya hazırlık eksik 11'e topraklanır. Yakındaki elektrikli ekipmanın doğru topraklama kaydında gürültüyü azaltmak için önemlidir; önemli gürültü farad devam ederseay kafes kullanılır. pozitif elektrot güvenli ERG tam saha protokolü başlamadan önce ve bitiminde kontrol pozisyonun onayı ile kornea merkezinde konumlandırılmış olmalıdır. Bu elektrot temas sadece kornea önemlidir; göz kapağı ile temas ya da bıyıkları sinyal genliği azaltabilir. Gevşek pamuk ipliği pozitif elektrot dokunmadan göz kapaklarını önlemek için bu protokolü kullanılmıştır. Bazı araştırmacılar, güvenilir temas ve göz kapağı dokunmadan 12 önlenmesini sağlamak için gömülü pozitif elektrot ile kontakt lensler geliştirdik.

Işık uyaran kurmak

biz kullandık stimülatörü LED kaynaklardan geniş spektrumlu beyaz ışık sağlar. Diğer ışık kaynakları gibi xenon flaş aydınlatma ve halojen aydınlatma, ışık uyaranlara 11 arası karşılaştırmalar için Weymouth ve Vingrys gördüğünüz gibi hafif uyaranlar olarak uygundur. LED ışığı avantajı, ancak,Her flaş ve enerjisi süresi kolaylıkla programlanabilir ve hızla ışık şiddetlerinde geniş bir yelpazede üzerinde reset olduğunu s. Biz eşik koyu adapte kemirgen aralığında doyurarak (a maksimal tepkisi üreten) (adil-saptanabilir tepkisini üreten) kademeli enerji yanıp söner, bir dizi geliştirdik.

Deneme yanılma yoluyla, biz bir flaş yanıt genlik aynı yoğunlukta bir önceki flaş bağımsız olmasını sağlamak aralıklarla (ISIS) interstimulus kurduk. Flaş parlak, uzun ISI bu bağımsızlık için gerekli.

Ayrıca deneme yanılma ile temiz bir sinyal sağlamak için her enerji gerekli yanıtları az sayıda kurduk. Ortalama daha tepkiler her zaman temiz bir sinyal verecektir. Enerji serisi (bizim protokol 11 dakika içinde) hızlı tamamlanabilir böylece minimum kullanın; hızla bitirilmesi allo nedeniyle anestezi devlet ve değişikliklere varyasyonu azaltırGerekirse diğer değişkenler için ws zaman, çalışılacak.

Hayvan State

Hayvanın fizyolojisinin birkaç parametre optimize etmek ve elde edilen ERG kayıtları standardize etmek önemlidir.

Sıcaklık

a-dalgası sinyali dış segmente bir G protein birleştirilmiş fototransdüksiyon kaskadının ışık kaynaklı aktivasyonu oluşturulur; Bu çağlayan dinamikleri, tüm enzimatik reaksiyonlar gibi, sıcaklığa bağlıdır 13,14. Anestezi altında Kemirgenler hipotermi yatkındır ve kayıt boyunca 37.5 ° C'lik bir iç sıcaklığı muhafaza etmek, harici ısıtma gerektirir. Vücut ısısı fazla 1-2 ° C düşerse, a-dalgası ve b-dalgası genlikleri azalır ve gecikmeleri 15 artar.

Anestezi

Kararlı ERG kayıtları hareketsiz olmasını hayvan gerektirir. Nöromüsküler blokerler ve Anaesthetic ajanları bilinçsiz ve hareketsiz duruma ulaşmak için ERG deneme kullanılır. Sadece sıçanlarda 16-20 Uyanık ERG kayıtları beş bildirilmiştir. Bu çalışmalarda, elektrotlar cerrahi kafatası içine önceden implante edildi ve bu çalışmaların iki ERG 17,20 anestezi etkisi test edilmiştir.

ERG kayıtları için kullanılan en yaygın anestezik ketamin ve ksilazin kombinasyonu olmuştur (bizim deneylerde ketamin ve 5 mg 60 mg / kg / ksilizin kg kullanılır). Bu gaz anestezi gibi izofluran ve halotan daha ERG az etkiler ve yüksek geri kazanım oranlarına 17,21,22 ile nispeten toksik olmayan kanıtlamıştır. Bu yaklaşım, ~ 40 dakika boyunca, hayvan hareketsiz tutan; Yarım doz benzer bir dönem için kayıt şartlarını uzatmak için kullanılabilir. Chang tarafından çalışma, doğrudan ve anestezi olmadan ERG karşılaştırıldı ve ketamin-ksilizin ölçülebilir a- b- ve genlik ve gecikmeleri karıştırmayı olmadığını gösterdiDalgalar 17. Çoğu araştırmacı anestezik koşulları standardize ve daha sonra deneysel parametreleri test; anestezik bazı etkileri tamamen indirimli olamaz.

Göz ortam

Gözün fizyolojisi optimize etmek ve ERG kayıt standardize etmek, bakım gerektirir. Öğrenciler, standart boyutta olmalıdır; bu göz maksimum genleşme elde etmek için, damlalar olarak tatbik edilen, midriatik ile elde edilir. Kemirgenlerde, atropin veya fenilefrin 23 kullanılır. Kornea hidratasyon kayıtları öncesinde karbomer polimerin uygulanması ile korunur; bu da pozitif elektrot ve kornea arasındaki elektrik iletkenliği stabilize eder. Kornea susuz hale gelirse, kornea çizilmesi ve katarakt oluşumu 24 oluşabilir. Katarakt oluşumu farelerde 25 daha sık görülür ve kornea hidrasyon sürdürmenin çeşitli yöntemler sulu sıvı veya bir sabit akış dahil, fare ERG kayıtları istihdam edilmiştirısmarlama iletişim tarzı elektrotlar kornea yüzeyinin 12 o tuzak hidrasyon.

Retinanın Adaptif devlet

Bu büyük bir değişkendir. Yukarıda verilen protokol retinanın en duyarlı duruma, karanlığa adapte olmasını sağlamak için tasarlanmıştır. İdeal olarak, pigmente sıçanlarda, tamamen karanlığa adapte gibi Sprague Dawley sıçanlar gibi olmayan pigmentli hayvanlar, iken olmaya karanlık konut 3 saat gerekli 5 saat 26 en az gerektirir. Bu scotopic ERG kayıtları 12 saat gecede hayvanları adapte standart bir uygulamadır. Işığa Kısmi ya da tam adaptasyon kolay ve hızlı Ganzfeld Stimülatördeki standart yoğunluk arka plan ışığını açarak elde edilebilir. Işık adaptasyon sonra, ancak, tam karanlık adaptasyonu sağlamak için saat sürer; dolayısıyla aşırı dikkatli öneri gözler Kayıttan önce ışığa maruz yanlışlıkla emin olmak için.

ERG kayıt tekniği ile sınırlıdırbelirleyen faktörlerin (örneğin, ERG ve uyarıcı set-up) ve ERG testi de araştırmacının yeterlik üstünde. Deneyimsiz araştırmacılar değişken ERG kayıtları olması muhtemeldir. Varyans böyle görme fonksiyonunun azalma veya kazançlar da sonuçlarını karşılaştırmak için yeterince büyük örneklem büyüklüğü oluşturarak azaltılabilir. Alternatif olarak, ERG kayıtları baz kayıtları ve tedavi sonrası kayıtlar arasında normalize edilebilir. normalize veriler gruplandırılmış ve analiz edilebilir. ERG verilerini sunarken, bu grup veri ve temsili dalga şekilleri göstermek için standart bir uygulamadır.

Yukarıdaki tüm dikkatli bir şekilde kontrol edildiği zaman, ERG genlik retina fonksiyonel durumunun bir ölçüsüdür. ERG, sürekli ışık hasarına ya da genetik kaynaklı dejenerasyon 27,28 kaynaklanan fotoreseptör tabakasının incelmesi ile genlik azaltılır. Tersine, RIP gibi bir müdahale koruyucu etkisi büyütülen saptanabilirERG 29 itude. ERG ayrıca retina 8-10,30 iskemik önkoşullamanın, hipoksik önkoşullama, egzersiz ve diyet safran koruyucu etkilerini göstermede kullanılır olmuştur.

Kinetik modelleme Fotoreseptörlerin içinde fototransdüksiyon bilinen fizyolojik olaylar dayalı olsa rodopsin fototransdüksiyon kaskad dinamikleri hakkında bilgi Büyüyen ve retinanın sinaptik bağlantıları, ERG nesil modellerinin geliştirilmesini ve sofistike ERG dalga analizi teşvik etmiştir mümkün ve iç retina devresi 31 anlayışımız. Örneğin, bir dalga kinetik modeller fototransdüksiyon sırasında meydana ve modelini uydurma gibi tepe yanıtları, zamanlama gecikme ve duyarlılık 14 olarak model parametrelerinin karşılaştırılmasını sağlayan biyokimyasal adımlar dayanmaktadır.

modelleme dezavantajı retina circuitr ilgili varsayımlara dayanıyor olmasıdıry ve sadece varsayımlar elverdiği bilgilendirici olabilir. Bu dezavantaj ışığında bir dalga kinetik model son zamanlarda-dalgasını dinamiklerini 32 basitleştirerek için eleştiriliyor. Fotoreseptör dejenerasyonu çalışmalarda, ERG dalga analizi genellikle farklı bir nedenden dolayı yapılmaz. Fotoreseptör dejenerasyonu görme fonksiyonunun ve dolayısıyla bir dalga ve b-dalgası parametrelerinin daha fazla analiz garanti edilmez 8,9,27,30 dramatik kayıplar, genellikle şiddetlidir. Ne olursa olsun, bir dalga b-dalga ERG modellemesi birçok kemirgen çalışmaları ve ERG modelleme hakkında ayrıntılı bilgi standart uygulama olarak kabul edilmiştir, bir dalga için, b-dalgası ve Operasyonel Hood ve incelemesini çalışmalarda bulunabilir Weymouth ve Vingrys, Frishman ve Wachtmeister 11,32-34 tarafından makaleler.

Özetle, koyu adapte ERG yöntemi ile ve nöroprotektif müdahaleler s olmadan retina dejenerasyonu arasındaki ölçülebilir farklar kaydedebilirsiniz sunduUzak iskemik ön olarak uch. Güvenilir ERG kayıtları için gerekli unsurlar tarif edilmiştir. Fotoreseptör ve iç retina fonksiyonunun ERG ölçümleri retina dejenerasyonu çalışan araştırmacılar, ve görme fonksiyonu çeşitli genetik biyofarmasötik ve farmakolojik tedavilerin etkileri için de yararlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Jonathan Stone CSCM Pty Ltd direktörü

Acknowledgements

Yazarlar kemirgen izleme, işleme ve deney Bayan Sharon Spana yardımı için müteşekkiriz. Doktora finansman desteği Vizyon Mükemmellik University of Sydney ve Avustralya Araştırma Merkezi tarafından sağlanmıştır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware AD Instruments PL 35044 Acquistion of ERG
Animal Bio Amp AD Instruments FE 136 Amplifier for ERG
Lab chart AD Instruments Signal collection software
Ganzfield Photometric solutions FS-250A Light stimulus
Ganzfield operating system Photometric solutions
Research Radiometer International light technologies ILT-1700 calibrate light series
Lux meter LX-1010B check red light illumanation
Excel Microsoft
Lead wires AD Instruments Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator AD Instruments ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95% A&E metals postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet SDR E205 negative electode
26 G needle BD ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe Harvard Appartus 507222F
Atropine 1% w/v Bausch & Lomb topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v Bausch & Lomb topical anaesthetic
Visco tears eye drops Novartis carbomer polymer
Thread retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive Blu tac Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd muscle relaxant
Scale

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arden, G. B., Heckenlively, J. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. MIT Press. 139-183 (2006).
  2. Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. Journal of Physiology-London. 555, (1), 153-173 (2004).
  3. Fortune, B., et al. Selective ganglion cell functional loss in rats with experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, (6), 1854-1862 (2004).
  4. Alarcon-Martinez, L., et al. Short and long term axotomy-induced ERG changes in albino and pigmented rats. Molecular Vision. 15, (254-255), 2373-2383 (2009).
  5. Lyubarsky, A. L., et al. Functionally rodless mice: transgenic models for the investigation of cone function in retinal disease and therapy. Vision Research. 42, (4), 401-415 (2002).
  6. Bush, R. A., Sieving, P. A. A PROXIMAL RETINAL COMPONENT IN THE PRIMATE PHOTOPIC ERG A-WAVE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35, (2), 635-645 (1994).
  7. Liu, K., et al. Development of the electroretinographic oscillatory potentials in normal and ROP rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, (12), 5447-5452 (2006).
  8. Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, (3), 1348-1354 (2003).
  9. Lawson, E. C., et al. Aerobic Exercise Protects Retinal Function and Structure from Light-Induced Retinal Degeneration. Journal of Neuroscience. 34, (7), 2406-2412 (2014).
  10. Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8, (7), 718-724 (2002).
  11. Weymouth, A. E., Vingrys, A. J. Rodent electroretinography: Methods for extraction and interpretation of rod and cone responses. Progress in Retinal and Eye Research. 27, (1), 1-44 (2008).
  12. Bayer, A. U., Cook, P., Brodie, S. E., Maag, K. P., Mittag, T. Evaluation of different recording parameters to establish a standard for flash electroretinography in rodents. Vision Research. 41, (17), 2173-2185 (2001).
  13. Pugh, E. N., Lamb, T. D. AMPLIFICATION AND KINETICS OF THE ACTIVATION STEPS IN PHOTOTRANSDUCTION. Biochimica Et Biophysica Acta. 1141, (2-3), 111-149 (1993).
  14. Breton, M. E., Schueller, A. W., Lamb, T. D., Pugh, E. N. ANALYSIS OF ERG A-WAVE AMPLIFICATION AND KINETICS IN TERMS OF THE G-PROTEIN CASCADE OF PHOTOTRANSDUCTION. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35, (1), 295-309 (1994).
  15. Mizota, A., Adachi-Usami, E. Effect of body temperature on electroretinogram of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, (12), 3754-3757 (2002).
  16. Szabo-Salfay, O., et al. The electroretinogram and visual evoked potential of freely moving rats. Brain Research Bulletin. 56, (1), 7-14 (2001).
  17. Charng, J., et al. Conscious Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potentials in Rats. Plos One. 8, (9), (2013).
  18. Galambos, R., Juhasz, G., Kekesi, A. K., Nyitrai, G., Szilagyi, N. NATURAL SLEEP MODIFIES THE RAT ELECTRORETINOGRAM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (11), 5153-5157 (1994).
  19. Galambos, R., Szabo-Salfay, O., Szatmar, E., Szilagyi, N., Juhasz, G. Sleep modifies retinal ganglion cell responses in the normal rat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (4), 2083-2088 (2001).
  20. Guarino, I., Loizzo, S., Lopez, L., Fadda, A., Loizzo, A. A chronic implant to record electroretinogram, visual evoked potentials and oscillatory potentials in awake, freely moving rats for pharmacological studies. Neural Plasticity. 11, (3-4), 241-250 (2004).
  21. Huang, J. C., Salt, T. E., Voaden, M. J., Marshall, J. NON-COMPETITIVE NMDA-RECEPTOR ANTAGONISTS AND ANOXIC DEGENERATION OF THE ERG B-WAVE IN-VITRO. Eye (London). 5, (4), 476-480 (1991).
  22. Sasovetz, D. KETAMINE HYDROCHLORIDE - EFFECTIVE GENERAL ANESTHETIC FOR USE IN ELECTRORETINOGRAPHY. Annals of Ophthalmology. 10, (11), 1510-1514 (1978).
  23. Mojumder, D. K., Wensel, T. G. Topical Mydriatics Affect Light-Evoked Retinal Responses in Anesthetized Mice). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, (1), 567-576 (2010).
  24. Fraunfel, F. t, Burns, R. P. ACUTE REVERSIBLE LENS OPACITY - CAUSED BY DRUGS, COLD, ANOXIA, ASPHYXIA, STRESS, DEATH AND DEHYDRATION. Experimental Eye Research. 10, (1), 19 (1970).
  25. Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. ACUTE REVERSIBLE CATARACT INDUCED BY XYLAZINE AND BY KETAMINE-XYLAZINE ANESTHESIA IN RATS AND MICE. Experimental Eye Research. 42, (4), 331-337 (1986).
  26. Behn, D., et al. Dark adaptation is faster in pigmented than albino rats. Documenta Ophthalmologica. 106, (2), 153-159 (2003).
  27. Sugawara, T., Sieving, P. A., Bush, R. A. Quantitative relationship of the scotopic and photopic ERG to photoreceptor cell loss in light damaged rats. Experimental Eye Research. 70, (5), 693-705 (2000).
  28. Machida, S., et al. P23H rhodopsin transgenic rat: Correlation of retinal function with histopathology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, (10), 3200-3209 (2000).
  29. Brandli, A., Stone, J. Remote Ischemia Influences the Responsiveness of the Retina. Observations in the Rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, (4), 2088-2096 (2014).
  30. Maccarone, R., Di Marco, S., Bisti, S. Saffron supplement maintains morphology and function after exposure to damaging light in mammalian retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, (3), 1254-1261 (2008).
  31. Hood, D. C., Birch, D. G. Assessing abnormal rod photoreceptor activity with the a-wave of the electroretinogram: Applications and methods. Documenta Ophthalmologica. 92, (4), 253-267 (1996).
  32. Robson, J. G., Frishman, L. J. The rod-driven a-wave of the dark-adapted mammalian electroretinogram. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 1-22 (2014).
  33. Hood, D. C., Birch, D. G. A COMPUTATIONAL MODEL OF THE AMPLITUDE AND IMPLICIT TIME OF THE B-WAVE OF THE HUMAN ERG. Visual Neuroscience. 8, (2), 107-126 (1992).
  34. Wachtmeister, L. Oscillatory potentials in the retina: what do they reveal. Progress in Retinal and Eye Research. 17, (4), 485-521 (1998).

Comments

3 Comments

  1. The article is very helpful to setup ERG to discriminate cone and rod electrical contributions. Could you please, let me know how can I access TABLE1 that it is mentioned in the article.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 14, 2016 - 2:00 PM
  2. Hi Marcelo,

    Below is a link to table 1 as a pdf file. Not the voltages used were based on our calibration, and you may need to adjust your voltage settings to reach equivalent light intensities.
    http://tiny.cc/he5vay

    Reply
    Posted by: Alice B.
    April 17, 2016 - 10:18 PM
  3. Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 18, 2016 - 10:19 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics