جل الآلي الحجم التحديد لتحسين نوعية المكتبات تسلسل الجيل المقبل من إعداد من عينات المياه البيئة

1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory
Published 4/17/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Environment

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Uyaguari-Diaz, M. I., Slobodan, J. R., Nesbitt, M. J., Croxen, M. A., Isaac-Renton, J., Prystajecky, N. A., et al. Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples. J. Vis. Exp. (98), e52685, doi:10.3791/52685 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. جمع المياه والترشيح

  1. جمع عينات من المياه العذبة من مواقع مختلفة (الشكل 1). تمرير عينات من خلال سلسلة من الفلاتر: 1 ميكرون فلتر، 0.2 ميكرون التصفية، و 30 كيلو دالتون قطع مرشح تدفق عرضية إلى منهجية حقيقية النواة منفصلة، ​​والجسيمات البكتيرية والفيروسية الحجم، على التوالي.
    يوصف فقط تنقية وتحليل المواد المستردة على 0.2 ميكرومتر مرشحات (البكتيريا التي تعيش بحرية) في هذا التقرير، ولكن نهج مماثلة يمكن استخدامها للجسيمات أخرى تعافى من المرشحات: مذكرة.

2. تركيز الجرثومي، استخراج الحمض النووي وتنقية

  1. إزالة عامل التصفية غشاء 0.2 ميكرون (ق) من نظام تنقية المياه (الرسم التخطيطي، الشكل 2). أضعاف مرشح 0.2 ميكرون القرص في نصف ووضعه في أنبوب 50 مل مع الجانب تصل مفتوحة. إضافة 5 مل من محلول الفوسفات مخزنة 1X (PBS) و 0.01٪ توين، ودرجة الحموضة 7.4 إلىانبوب. إذا تم استخدام أكثر من مرشح واحد أثناء عملية توظيف أنبوب مختلفة لكل مرشح. متجر أنبوب (s) مع مرشح في 4 درجات مئوية حتى معالجتها. خلاف ذلك، انتقل إلى الخطوة 2.2.
  2. إزالة عامل التصفية 0.2 ميكرومتر غشاء من أنبوب 50 مل مع ملقط معقم. فلتر مكان (ق) على طبق بتري (ترك المخزن المؤقت PBS في أنبوب).
    1. مع ملقط معقم ومقص العقيمة، وقطع مرشح إلى شرائح صغيرة (1 سم × 1 سم). تطهير ملقط ومقص عن طريق نقع في 70٪ الأيزوبروبانول، ومحو مع المطهر سطح DNA والشطف بالماء عالى النقاء من نوع 1 بين عينات مختلفة.
  3. وضع مرشح مقطعة إلى شرائح مرة أخرى في نفس أنبوب 50 مل. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X و 0.01٪ توين، ودرجة الحموضة 7.4 إلى تصفية حتى لا يكون هناك ما مجموعه 15 مل من العازلة في أنبوب 50 مل.
  4. إضافة 6 حبات التنغستن نظيفة (3 مم) إلى كل أنبوب 50 مل، تغطية أنبوب مع بارافيلم، ودوامة بقوة لمدة 20 دقيقة (استخدام 50 مل أنابيب محول دوامة). إذا ... المزيد الصورةiple تتم معالجة مرشحات من عينة واحدة، ونقل وتجمع كل جناسة في نظيفة أنبوب 50 مل. أنابيب الطرد المركزي في 3،300 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  5. Resuspend وبيليه وقسامة الخلايا البكتيرية (~ 1 مل مأخوذة) إلى 1.7 مل أنابيب microcentrifuge. لاحظ أنه سيكون هناك 5 أنابيب microcentrifuge لكل عينة.
  6. تدور باستمرار الأنابيب microcentrifuge في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة، وإزالة معظم طاف وصولا إلى ~ 200 علامة ميكرولتر.
  7. تخزين العينات في -80 ° C، أو الشروع في استخراج الحمض النووي البكتيري باستخدام المتاحة تجاريا عدة عزل الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. خلال البكتيرية استخدام استخراج الحمض النووي إما PBS أو الماء كعنصر تحكم استخراج السلبية، وE. القولونية كعنصر تحكم استخراج إيجابية.
  8. لأن الحمض النووي من أنابيب متعددة استخراج، بركة موازية مأخوذة فرعية من نفس العينة إلى أنبوب واحد 2 مل. ثم إجراء O / N هطول الأمطار باستخدام حل تتألف من 0.1حجم 3 خلات الصوديوم M، 2 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪، و 5 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / ميكرولتر الأكريلاميد خطي. تخلط جيدا وتخزينها العينات في -80 ° C.
  9. الطرد المركزي في السرعة القصوى (17،000 x ج) لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. غسل بيليه مع 1 مل من الايثانول 70٪ من الجليد البارد، والهواء الجاف في خزانة السلامة البيولوجية لمدة لا تتجاوز 5 دقائق و resuspend DNA بيليه في 34 ميكرولتر من 10 ملي تريس، الكلور، ودرجة الحموضة 8.5.
    ملاحظة: سوف الخطي الأكريلاميد تساعد على تصور بيليه DNA بعد O / N هطول الأمطار.
  10. تحديد كمية الحمض النووي والجودة باستخدام حساسية عالية الفلورسنت النووي الكميات حمض فحص ومعمل microvolume، على التوالي، في أعقاب تعليمات الصانعين (انظر الجدول من المواد).
    ملاحظة: إذا تم إعداد عينات متعددة في وقت و، وهو الفلورسنت فحص الحمض النووي الفائق لقياس dsDNA ومقرها لوحة-التألق / طيفي يمكن استخدامها بدلا من ذلك.

3. DNA إعداد المكتبة

  1. جزء إنزيمي نانوغرام واحد من الحمض النووي البكتيري باستخدام طريقة القائم على ينقول (tagmentation). إضافة محول ومؤشر على تسلسل الحمض النووي مجزأة باتباع إرشادات الشركة المصنعة. موضوع tagmented عينات إلى 12 دورات PCR كما هو مبين في تعليمات الشركة الصانعة، وعند هذه النقطة يتم دمج المؤشرات التسلسل.

4. جل الآلي الحجم اختيار

  1. تخطي القياسية بعد PCR خطوة تنظيف وصفها في تعليمات الشركة الصانعة (انظر الجدول من المواد). حجم اختيار عينات بعد PCR مباشرة باستخدام منصة اختيار الحجم الآلي القائم على هلام.
    1. إضافة 3.5 ميكرولتر من العازلة تحميل لكل عينة.
    2. وبعد بروتوكول الشركة المصنعة، تحميل العينات على محطة العمل الكهربائي، وتحديد الهدف الحجم مختارة من 500-800 نقطة أساس، في استخراج 300 ميكرولترحجم أيون، وذلك باستخدام 1.5٪ كاسيت الاغاروز الجاهزة.
    3. تركيز المواد الناتج الخام (300 ميكرولتر) وصولا إلى 25 ميكرولتر من خلال الايثانول هطول الأمطار.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم محطة الكهربائي لأتمتة تركيز لأعداد أكبر من العينات عن طريق لوحة تصفية وفراغ متعددة.
      1. ترسيب حجم شطف الخام باستخدام 0.1 كميات من 3 خلات الصوديوم M، 2 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪ و 5 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / ميكرولتر الأكريلاميد خطي. تخلط جيدا، وعينات مكان في -80 درجة CO / N. عينات الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 30 دقيقة.
      2. تجاهل supernatants، والشروع في غسل بيليه الحمض النووي مع 1 مل من الجليد الباردة الايثانول 70٪.
      3. عينات الطرد المركزي مرة أخرى في 17،000 x ج لمدة 30 دقيقة، وتجاهل supernatants، والهواء الجاف، وأخيرا بيليه resuspend الحمض النووي في 25 ميكرولتر من 10 ملي تريس، الكلور، ودرجة الحموضة 8.5.
  2. (اختياري) استخدم 1 ميكرولتر من حجم المكتبات DNA المختارة مع منصة الآلي اختيار حجم هلام لتقديم خمسةتخفيف أضعاف باستخدام تريس، EDTA حل العازلة، ودرجة الحموضة 8.0. تحليل المكتبات باستخدام أداة الكهربائي الشعري يعتمد على الشرائح الالكترونية لتحليل dsDNA الجودة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

5. مكتبة التطبيع وتسلسلها

  1. انتقل إلى تطبيع العينات باستخدام الخرز تطبيع مكتبة (المدرجة في إعداد مكتبة والقائم على ينقول) كما هو موضح في دليل إعداد الشركة المصنعة.
    1. بدلا من ذلك، وقياس مكتبات dsDNA باستخدام حساسية عالية الفلورسنت النووي فحص الكميات الحامض، تليها تجميع في نسب متساوي المولية للوصول إلى تركيز dsDNA النهائي من 2 نانومتر. انتقل إلى تفسد المكتبات باستخدام 10 ميكرولتر من المكتبات المجمعة و 10 ميكرولتر من 0.2 N هيدروكسيد الصوديوم، واحتضان لمدة 5 دقائق على RT تمييع المكتبات التشويه والتحريف باستخدام العازلة التهجين (المدرجة في إعداد عدة القائم على ينقول) إلى الحجم النهائي من 1 مل وتركيز 11:05.
  2. عينة الحملالصورة في منصة تسلسل الجيل المقبل من خلال اتباع البروتوكولات القياسية التسلسل الشركة المصنعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تركيز الحمض النووي، وتقييم جودة

وتراوحت تركيزات DNA البكتيرية 0،01-0،11 نانوغرام / مل لكل عينة مياه من مواقع مختلفة مستجمعات المياه (الجدول 1). DNA معزولة عن جزء البكتيرية زيارتها A 260/280 و A 260/230 نسب 1،4-1،8 و0،3-1،6، على التوالي. في حين أن بعض من نسب A 260/230 كانت منخفضة نسبيا، لم يلاحظ أي تثبيط واضح في استعداد مكتبة والتطبيقات المصب الأخرى. وتشمل هذه التطبيقات PCR وQPCR الاختبارات التي تستهدف 16S الرنا الريباسي والحزب الشيوعي النيبالي 60، والتسلسل اللاحق amplicon (لا تظهر البيانات).

حارس تكنولوجيا

المكتبات DNA أعدت مع طريقة وهلام حجم القائم على ينقول مختارة مع منصة عالية الإنتاجية الآلي أسفرت نطاق ضيق من شظايا الحمض النووي بين 500-800 سنة مضت (الشكل 3). هذا العلاقات العامة بديلةأسفرت otocol تركيزات تتراوح 0،3-3،4 نانوغرام / ميكرولتر (الجدول 1). باستخدام متوسط ​​650 نقطة أساس من حجم جزء الحمض النووي، وكان متوسط ​​تركيز لهذه المكتبة 3.81 نانومتر من المواد الإدخال. تم باستمرار حجم اختيار المكتبات في جميع المكتبات DNA أعدت من مواقع متعددة مستجمعات المياه.

معلمات تسلسل الحمض النووي QC

تسلسل الحمض النووي من هذه المكتبة على البورشيد MiSeq إنشاء كثافة مجموعة من 1،198 K / مم 2. كانت نسبة المرشحات مرور العنقودية 84.2٪ مع عائد يقدر ب 9.2 جيجابايت. وعلاوة على ذلك، 7.4 جيجابايت أو 82.8٪ من يقرأ كان على درجة جودة ≥30. استخدام هلام منصة الآلي اختيار حجم نتج باستمرار في عوائد مناسبة والتقليل من تجميع شظايا غير المرغوب فيها تحت 200 نقطة أساس.

الشكل (1) <ر /> تم جمع عينات الشكل 1. المياه من المناطق الحضرية (A) وزراعيا (B) مستجمعات المياه تتأثر.

الشكل 2
الشكل 2. تمثيل تخطيطي من الأساليب المستخدمة لتوليد المكتبات DNA القائم على ينقول من عينات المياه العذبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. Electropherograms المكتبات DNA المأخوذة من عينات المياه العذبة: (A) مكتبات بعد PCR DNA قبل اختيار حجم و(B) مكتبات DNA حجم المحدد باستخدام الآليحجم هلام (النطاق المستهدف: 500-800 بي بي) منصة الاختيار. وكانت مخففة جميع العينات خمسة أضعاف مع TE العازلة.

<td> 0.04 (0.04)
عينة بيئية تركيز الحمض النووي البكتيري
(نانوغرام / مل) *
A 260/280 A 260/230 تركيز الحمض النووي (نانوغرام / ميكرولتر) قبل اختيار الحجم، حجم: 25 ميكرولتر تركيز الحمض النووي (نانوغرام / ميكرولتر) بعد اختيار الحجم، حجم: 25 ميكرولتر
1 0.11 (0.16) 1.8 1.4 27 1.2
2 0.11 (0.20) 1.8 1.3 27.4 3.3
3 0.10 (0.37) 1.8 1.6 19.5 3.4
4 1.5 0.5 24.4 1.6
5 0.11 (0.13) 1.7 1.0 26.1 1.1
6 0.05 (0.03) 1.5 0.7 15.2 0.4
7 0.01 (0.01) 1.4 0.3 15.1 0.3
8 0.03 (0.05) 1.6 0.7 17 0.9
* القيم تشير إلى تركيز dsDNA باستخدام حساسية عالية الفلورسنت النووي الكميات حمض الفحص. عدد من الأقواس يمثل تركيز باستخدام مقياس الطيف الضوئي microvolume.

الجدول 1. الجودة وتقييم كمية من الحمض النووي المستخرج من عينات المياه العذبة البيئية، والمكتبات القائمة على ينقول قبل وبعدالآلي هلام اختيار الحجم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وجود dimers محول وتجميع أحجام صغيرة إدراج تفضيلي يجري التسلسل في المنصات الحالية تمثل انخفاضا في عائدات صالحة للاستخدام وعدم الاستفادة من قدرات المعدات و15. استخدام أساليب الضرب حبة جنبا إلى جنب مع النهج القائم على ينقول لإعداد المكتبات قد يؤدي إلى مزيد من القص DNA بالمقارنة مع غيرها من أساليب استخراج 4،5. ومع ذلك، فإن جميع طرق استخراج ومكتبة إعداد يحتمل أن أعرض التحيز لتوزيع تسلسل يقرأ 8،16. ، لا يبدو الملاحظات التجريبية باستخدام منصة استخلاص الحمض النووي الآلي، جنبا إلى جنب مع طريقة القائم على ربط لإزالة الفائض من محول dimers من المكتبات بندقية (لا تظهر البيانات). استخدمت هذه الدراسة على بروتوكول تعديل لإعداد المكتبات من العينات البيئية التي كتبها شظايا الحمض النووي اختيار حجم ضمن مجموعة محددة جدا، وبالتالي تقليل المرحل من dimers محول أو صغيرةشظايا الحمض النووي. استخدام هلام منصة الآلي اختيار حجم توليد آثار استنساخه المكتبات DNA داخل نطاق معين من 500-800 سنة مضت (الشكل 3). في حين أن عددا أكبر من الخام يقرأ (~ 1.5 مليون) تم الحصول عليها باستخدام العلاج القياسي (الخرز ممغطس في نسبة 0.5X) مقارنة تنظيفات أخرى (أي 2 مرات في نسبة 0.5X) وبروتوكول تعديل هنا وصفها، فقط 55٪ من تلك يقرأ في العينة كانت أكبر من 225 سنة مضت. النسبة المئوية لليقرأ لكل عينة باستخدام بروتوكول تعديل لدت 75٪ على الأقل من يقرأ أكثر من 225 سنة مضت. في علاج القياسية، أشار عدد كبير من يقرأ على مدى تمثيل باختصار يقرأ في المكتبة. وقد تم الإبلاغ عن أحجام جزء المحدد مع الخرز ممغطس (العلاج القياسي) ليكون متغير بالمقارنة مع اختيار حجم هلام نهج 17. هذا البروتوكول المعدل ولدت يقرأ أكثر إفادة من الخرز ممغطس. استخدام هلام اختيار لبناء مكتبات لديهوأشار يسوتو انخفاضا في معدل الإصابة الوهم من ~ 5٪ إلى 0.02٪ 9.

وتشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول اعتبارات لتطبيع DNA المدخلات، وكمية من الحمض النووي في المكتبات، والكيمياء من مزيج الرئيسي PCR. اعتمادا على تركيز الحمض النووي المدخلات ابتداء، قد يكون لقياس وتمييع DNA وصولا الى مبلغ 1 نانوغرام تتطلبها الطريقة القائمة على ينقول المستخدمة هنا والنهج القائم على حبة وبالتالي أسرع automatable لتطبيع DNA المدخلات يمكن أيضا أن تستغرق وقتا طويلا يعتبر في إعداد العينات الأولية 18. وبعد tagmentation وإدراج الفهارس، وكانت عينات حجم مباشرة المحدد باستخدام محطة العمل الكهربائي الموضحة في هذه الدراسة. خطوة حاسمة في هذا الإجراء هو مقدار DNA تحميل إلى النظام. الحد الأدنى للتركيز الحمض النووي عينة للكشف بصري يعتمد على طبيعة العينة (amplicon مقابل بندقية التسلسل). وكانت عائدات الانتعاش الجوهريةتبين أن تصمد مع عينات ذات المدخلات المنخفضة والكفاءة الانتعاش> 75٪. كمية أدنى DNA التي يمكن الكشف عنها بواسطة هلام نظام اختيار حجم الآلي موضح هنا هو 1.5 نانوغرام من الحمض النووي الإجمالي (نسبيت، M. وSlodoban، J.، عام 2014، بيانات غير منشورة). ومع ذلك، لا يشترط كشف بصري من العينة لإجراء اختيار الحجم، كما تستخدم علامات صبغ المزدوجة لتحديد مكان حجم تحديد هدف محدد. قبل تحميل مكتبات أعدت من العينات البيئية إلى المنصة، وكان كميا تركيز الحمض النووي باستخدام التألق. تم الكشف عن نطاق ضيق نسبيا من تركيز الحمض النووي في عراق ما بعد PCR عينات (الجدول 1). على الرغم من أن هذه العينات تحتوي على خليط من الأملاح، dimers، البلمرة DNA، DNA البيئي تضخيمها، والكواشف لم يكشف عنها 19، هذه التركيزات ممثلة على الأقل 252 أضعاف أعلى من ذكرت أقل مبلغ من الحمض النووي للكشف عن طريق محطة العمل الكهربائي. عادة، اختيار حجم فرج DNAسيتم تنفيذ الإدلاء بالبيانات في حل عازلة بدلا من مزيج الرئيسي PCR. على الرغم من أن المعلومات المتعلقة PCR مزيج الرئيسي المستخدمة في هذا البروتوكول كان لم يكشف عنه من الشركة المصنعة، وقد أجريت الاختبارات الأولية لتتبع هجرة علامات صبغ المزدوجة في مزيج (لا تظهر البيانات). وهناك قوة عازلة الأيونية عالية في مزيج الرئيسي PCR يغير التنقل الكهربي من العينة، وبالتالي يحتاج هذا المتغير ليتم استيعابها لل. منصة اختيار هلام الآلي وصفها في هذه الدراسة تكشف خيار لبيان ما إذا كان عينة هي في ارتفاع القوة الأيونية. عند استخدام هذا الخيار، يتم توظيف ثم غيرت منحنيات التنقل الكهربي وتأخر المعلمات تتبع الفرقة. ولذلك، فمن الممكن أن الكيمياء من مزيج PCR سوف يكون لها تأثير على المخزن المؤقت التحميل وعلامات، ويؤثر على الهجرة من شظايا الحمض النووي في الهلام.

هناك عدد قليل من النظم المتاحة تجاريا لاختيار حجم هلام الآلي أو شبه الآلي. هذهكما توفر الأدوات الانفصال، والانتعاش، والوثائق في أقل من 1 ساعة. ومع ذلك، هناك قيود عندما يتعلق الأمر عدد العينات أن هذه النظم يمكن التعامل معها، والتكاليف المرتبطة المواد الاستهلاكية 17،20. في هذا السياق، فإن تقنية الموضحة هنا يعالج جوانب كل من هلام الاغاروز اختيار حجم وتحليلات. يمكن أن تصل إلى 96 عينات يكون حجم المحدد في تشغيل واحد، في حين يمكن وصفها تصل إلى 192 عينات مع ارتفاع القرار الكهربائي. وعلاوة على ذلك، يمكن للأداة أيضا استكمال العامة المهام معالجة السائل يتوقع المستخدمون من محطة العمل الآلي.

حجم شطف الخام من هذا البروتوكول يتراوح 100-400 ميكرولتر، اعتمادا على النطاق المستهدف (25 نقطة إلى 40 كيلو بايت). في حين أن هذا الجانب من أداة يمكن أن ينظر إليها على أنها الحد، لا بد من الإشارة إلى أن المكتبات DNA مزال مع حجم 300 ميكرولتر من شأنه أن يكون متوسط ​​تركيز 301 م (لا تظهر البيانات). هذا repre قيمة الناتجsents 26 أضعاف أعلى من التركيز المطلوب النهائي في التسلسل في منصة MiSeq (~ 11:05). في هذه الدراسة، يمثل الإيثانول هطول الأمطار خطوة إضافية من حيث الوقت المستخدمة في إعداد مكتبة. حاليا، وحجم شطف يمكن تخفيض إضافي باستخدام فراغ خطوة على سطح السفينة الترشيح التي تستخدم لوحة مرشح التجارية ومشعب الفراغ الذي يناسب على سطح السفينة (ترقية). باستخدام هذا الإعداد، يتم نقل حجم شطف الخام في لوحة التصفية، تتركز ثم معلق في 25 ميكرولتر (Slodoban، J.، عام 2014، اتصال شخصي). لهذه الدراسة، أجريت هطول الأمطار DNA للحفاظ على سير العمل بما يتفق مع حجم المدخلات اللازمة للخطوة عينة التطبيع كما هو موضح في هذه المجموعة على أساس ينقول.

هذه التقنية المعدلة ويمكن أن تنطبق على المكتبات DNA أو كدنا] أعدت من عينات بيئية أخرى مثل مياه البحر، ومحطة معالجة مياه الصرف الصحي، والرواسب، والتربة، أو الحصير الميكروبية. السياراتهلام تزاوج منصة اختيار حجم ذكرت هنا يمكن تطبيقها مع بعض التعديلات الدنيا ليس فقط لمنصات التسلسل البورشيد، ولكن أيضا لغيرها من منصات الجيل المقبل من التسلسل بما في ذلك روش 454، تقنيات الحياة، والعلوم البيولوجية المحيط الهادئ. اعتبارات خاصة للتكيف مع هذه التكنولوجيا لتشمل منصات أخرى قدرة التحميل كذلك (إلى 51 ميكرولتر)، التحجيم إشارات أو علامات، والنسبة المئوية للالاغاروز هلام كاسيت (تعتمد على جزء الهدف). هذه الإنتاجية العالية هلام الآلي تقنية اختيار الحجم هو شكل تمييزا من تنقية وكافية لالأوصاف الكهربي منخفضة التكلفة. وتشمل التطبيقات الأخرى التي يمكن أن تستفيد من هذه التكنولوجيا المشاريع RNA يليها، والتسلسل جزء طويل (بما في ذلك metagenomics الوظيفية)، والتوليف الجيني، بناء مكتبة زوج رفيقة، دي نوفو ومعقدة تسلسل الجينوم، وتقييد الهضم والتحليل، والتنميط الجيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جاريد R. سلوبودان وماثيو J. نسبيت كلا عقد أسهم الساحلية الجينوم، وهي شركة كولومبيا البريطانية المملوكة للقطاع الخاص التي تقدم التكنولوجيا الحارس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series Thermo Scientific  1400-1620
0.2 µm Supor Membrane VWR CA28143-969 Pall Corporation, Ann Harbor, MI
Tungsten carbide beads 3 mm (200) Qiagen 69997
Isopropyl alcohol 70% Jedmon Products 825751 Healthcare Plus
DNA away VWR 7010 Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA
Milli-Q water purification system Fisher Scientific ZMQS6VF0Y Merck Millipore. This system has been discontinued.
20x PBS pH 7.5 VWR E703-1L Amresco, Inc., Solon, OH
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100 Fisher chemicals
Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes VWR 13000-V1-50 MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) VWR SI-0236 Scientific Industries, Inc.
Beckman Centrifuge Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd Model J-6B
PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit VWR 12855-100 MoBio, Carlsbad, CA
Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes VWR 13000-V1-24 MoBio, Carlsbad, CA
Microfuge 18 centrifuge Beckman Coulter 367160
Nimbus Select workstation with Ranger Technology Hamilton Robotics 92720-01 Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware)
Ranger reagent kit Coastal Genomics CG-10600-150-12-21 Includes loading buffer and cassettes
Ethyl alcohol (anhydrous) Commercial Alcohols P016EAAN Greenfield Ethanol
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Linear acrylamide (5 mg/ml) Life Technologies AM9520 Ambion
Eppendorf refrigerated centrifuge Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. 5417R
Buffer EB (250 ml) Qiagen 19086
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific ND-1000
Qubit fluorometer Life Technologies Q32857 Invitrogen. This product has been discontinued.
Qubit dsDNA HS assay kit Life Technologies Q32854 Invitrogen
High sensitivity DNA reagent Agilent Technologies 5067-4626
High sensitivity DNA chips Agilent Technologies 5067-4626
Agilent 2011 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938B
Nextera XT DNA sample preparation kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT index kit Illumina FC-131-1001
MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) Illumina MS-102-2003
Miseq system Illumina SY-410-1003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siuda, W., Chrost, R. J. Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks. Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).
  2. Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. Available from: http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna (2010).
  3. Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology letters. 4, 423-425 (2008).
  4. Liles, M. R., et al. Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms. Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).
  5. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. BioTechniques. 49, 631-640 (2010).
  6. Tebbe, C. C., Vahjen, W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).
  7. Solonenko, S. A., et al. Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes. BMC genomics. 14, 320 (2013).
  8. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome biology. 12, R18 (2011).
  9. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]. 18, 18 (2009).
  10. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).
  11. Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).
  12. Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing. Nature Methods. 7, (2010).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. (2012).
  15. Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).
  16. Marine, R., et al. Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA. Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).
  17. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome research. 22, 939-946 (2012).
  18. Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system. Bmc Biotechnology. 13, (2013).
  19. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome research. (2014).
  20. Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. PloS One. 9, e113501 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats