स्वचालित जेल आकार चयन पर्यावरण पानी के नमूनों से तैयार अगली पीढ़ी के अनुक्रमण पुस्तकालय की गुणवत्ता में सुधार

1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory
Published 4/17/2015
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Uyaguari-Diaz, M. I., Slobodan, J. R., Nesbitt, M. J., Croxen, M. A., Isaac-Renton, J., Prystajecky, N. A., et al. Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples. J. Vis. Exp. (98), e52685, doi:10.3791/52685 (2015).

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Abstract

Protocol

1. जल संग्रह और निस्पंदन

  1. विभिन्न साइटों (चित्रा 1) से मीठे पानी के नमूने ले लीजिए। फिल्टर की एक श्रृंखला के माध्यम से नमूने दर्रा: 1 माइक्रोन फिल्टर, 0.2 माइक्रोन फिल्टर, और 30 केडीए कटऑफ स्पर्शरेखा प्रवाह फिल्टर क्रमशः व्यवस्थित ढंग से अलग यूकेरियोटिक, बैक्टीरियल और वायरल कण आकार, करने के लिए।
    नोट: केवल शुद्धि और 0.2 माइक्रोन फिल्टर (मुक्त रहने वाले बैक्टीरिया) पर बरामद सामग्री का विश्लेषण इस रिपोर्ट में वर्णित किया गया है, लेकिन इसी तरह के दृष्टिकोण फिल्टर से बरामद अन्य कणों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

2. बैक्टीरियल एकाग्रता, डीएनए निष्कर्षण और शोधन

  1. पानी छानने का काम प्रणाली (योजनाबद्ध आरेख, चित्रा 2) से 0.2 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर (ओं) को हटा दें। छमाही में 0.2 माइक्रोन डिस्क फिल्टर मोड़ो और खुले पक्ष के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में जगह। में 1x फॉस्फेट बफर समाधान के 5 मिलीलीटर (पीबीएस) और 0.01% बीच, 7.4 पीएच जोड़ेंट्यूब। एक से अधिक फिल्टर की प्रक्रिया के दौरान प्रयोग किया जाता है, तो फिल्टर प्रति एक अलग ट्यूब रोजगार। 4 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर के साथ दुकान ट्यूब (एस) जब तक संसाधित। अन्यथा, 2.2 कदम आगे बढ़ना।
  2. बाँझ संदंश के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब से 0.2 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर निकालें। एक पेट्री डिश पर प्लेस फिल्टर (ओं) (ट्यूब में पीबीएस बफर छोड़)।
    1. बाँझ संदंश और बाँझ कैंची के साथ, छोटे स्ट्रिप्स में फिल्टर (1 सेमी एक्स 1 सेमी) में कटौती। 70% isopropanol में भिगोने एक डीएनए सतह decontaminant साथ पोंछते और विभिन्न नमूनों के बीच टाइप 1 के ultrapure पानी के साथ rinsing द्वारा संदंश और कैंची कीटाणुरहित।
  3. वापस उसी 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्ट्रिप्स में कटौती फिल्टर रखें। 50 मिलीलीटर ट्यूब में बफर के 15 मिलीलीटर की कुल रहे है तो फिल्टर करने के लिए 1x पीबीएस के 10 एमएल और 0.01% बीच, 7.4 पीएच जोड़ें।
  4. , प्रत्येक 50 मिलीलीटर ट्यूब को 6 साफ टंगस्टन मोती (3 मिमी व्यास) जोड़ें 20 मिनट (50 मिलीलीटर ट्यूब भंवर अनुकूलक का उपयोग करें) के लिए सख्ती Parafilm के साथ ट्यूब, और भंवर को कवर किया। Mult हैंiple फिल्टर एक स्वच्छ 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक नमूना, स्थानांतरण और पूल सब homogenate से कार्रवाई कर रहे हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 3300 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  5. 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में गोली और विभाज्य बैक्टीरियल कोशिकाओं (~ 1 एमएल aliquots) Resuspend। नमूना प्रति 5 microcentrifuge ट्यूब कि वहाँ होगा ध्यान दें।
  6. 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर microcentrifuge ट्यूब नीचे स्पिन, और 200 ~ करने μl निशान नीचे सतह पर तैरनेवाला के सबसे को हटा दें।
  7. -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान, या निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए अलगाव किट का उपयोग करके जीवाणु के डीएनए निकालने के लिए आगे बढ़ें। जीवाणु के डीएनए निष्कर्षण उपयोग या तो पीबीएस या पानी एक नकारात्मक निकासी नियंत्रण के रूप में, और के दौरान एक सकारात्मक निकासी नियंत्रण के रूप में कोलाई।
  8. कई ट्यूब से डीएनए निकाला जा रहा है, क्योंकि एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में ही नमूना से समानांतर उप aliquots के पूल। तो 0.1 के शामिल एक समाधान का उपयोग करके एक हे / एन वर्षा का संचालन3 एम सोडियम एसीटेट, 100% इथेनॉल के दो संस्करणों, और 5 माइक्रोग्राम प्रति / μl रैखिक acrylamide का 5 μl की मात्रा। अच्छी तरह मिक्स और दुकान के नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अधिकतम गति (17,000 XG) पर अपकेंद्रित्र। 10 मिमी Tris-CL, पीएच 8.5 से 34 μl में अधिक से अधिक 5 मिनट और resuspend डीएनए गोली के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में बर्फ ठंड 70% इथेनॉल, शुष्क हवा के 1 मिलीलीटर के साथ गोली धो लें।
    नोट: रैखिक एक्रिलामाइड हे / एन वर्षा के बाद डीएनए गोली कल्पना करने में मदद मिलेगी।
  10. 'निर्माताओं के निर्देश (सामग्री की तालिका देखें), क्रमशः, एक उच्च संवेदनशीलता फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड quantitation के परख और एक microvolume स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग निम्न डीएनए मात्रा और गुणवत्ता का निर्धारण करते हैं।
    नोट: कई नमूने समय पर तैयार कर रहे हैं, dsDNA और प्लेट आधारित fluorometer / स्पेक्ट्रोफोटोमीटर बढ़ाता के लिए एक ultrasensitive फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड परख बजाय प्रयोग किया जा सकता है।

3. डीएनए पुस्तकालय तैयारी

  1. एक transposon आधारित पद्धति (tagmentation) का उपयोग जीवाणु के डीएनए की enzymatically टुकड़ा एक nanogram। निर्माता के निर्देशों का पालन खंडित डीएनए पर अनुकूलक और सूचकांक दृश्यों जोड़ें। अनुक्रमण अनुक्रमित शामिल कर रहे हैं, जो बिंदु पर निर्माता के निर्देशों में संकेत के रूप में विषय पीसीआर के 12 चक्रों के लिए नमूने tagmented।

4. स्वचालित जेल आकार चयन

  1. निर्माता के निर्देशों में वर्णित मानक बाद पीसीआर क्लीन-अप कदम को छोड़ (सामग्री की तालिका देखें)। आकार का चयन बाद पीसीआर नमूने सीधे एक स्वचालित जेल आधारित आकार चयन मंच का उपयोग।
    1. प्रत्येक नमूने के लिए लोड हो रहा है बफर के 3.5 μl जोड़ें।
    2. निर्माता प्रोटोकॉल के बाद, एक 300 μl निकालने में, 500-800 बीपी का एक आकार-चयन लक्ष्य को निर्दिष्ट, वैद्युतकणसंचलन वर्कस्टेशन पर नमूने लोडएक पूर्व डाली 1.5% agarose के कैसेट का उपयोग कर आयन मात्रा।
    3. इथेनॉल वर्षा के माध्यम से 25 μl करने के लिए नीचे कच्चे उत्पादन सामग्री (300 μl) ध्यान लगाओ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, फिल्टर प्लेट और वैक्यूम कई गुना के माध्यम से नमूनों की बड़ी संख्या के लिए एकाग्रता को स्वचालित करने वैद्युतकणसंचलन कार्य केंद्र का उपयोग करें।
      1. 3 एम सोडियम एसीटेट के 0.1 संस्करणों, 100% इथेनॉल के दो संस्करणों और 5 माइक्रोग्राम प्रति / μl रैखिक acrylamide का 5 μl का उपयोग कच्चे क्षालन मात्रा वेग। -80 डिग्री सीओ / एन में, अच्छी तरह से जगह नमूने मिलाएं। नमूने अपकेंद्रित्र 30 मिनट के लिए 17,000 XG पर।
      2. Supernatants त्यागें और ठंडा 70% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ डीएनए गोली धोने के लिए आगे बढ़ें।
      3. अपकेंद्रित्र नमूने फिर 30 मिनट के लिए 17,000 XG पर, supernatants, शुष्क हवा त्यागें, और अंत में 10 मिमी Tris-CL, पीएच 8.5 के 25 μl में डीएनए गोली resuspend।
  2. (वैकल्पिक) एक पांच बनाने के लिए स्वचालित जेल आकार चयन मंच के साथ चयनित डीएनए पुस्तकालयों आकार की एक μl का प्रयोग करेंTris-EDTA के बफर समाधान, पीएच 8.0 का उपयोग कर गुना कमजोर पड़ने। निर्माता के निर्देशों के अनुसार dsDNA गुणवत्ता का विश्लेषण करने के लिए एक चिप आधारित केशिका वैद्युतकणसंचलन साधन का उपयोग पुस्तकालयों का विश्लेषण करें।

5. लाइब्रेरी सामान्यीकरण और अनुक्रमण

  1. निर्माता की तैयारी गाइड में वर्णित के रूप में (transposon आधारित पुस्तकालय तैयारी किट में शामिल है) पुस्तकालय सामान्य बनाने के मनकों का उपयोग कर नमूने मानक के अनुसार आगे बढ़ें।
    1. वैकल्पिक रूप से, 2 एनएम के अंतिम dsDNA एकाग्रता तक पहुँचने के लिए equimolar अनुपात में पूलिंग द्वारा पीछा एक उच्च संवेदनशीलता फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड quantitation के परख, का उपयोग dsDNA पुस्तकालयों को मापने। जमा पुस्तकालयों के 10 μl और 0.2 एन NaOH के 10 μl का उपयोग कर पुस्तकालयों denature करने के लिए आगे बढ़ना है, आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। 11:05 के अंतिम 1 मिलीलीटर की मात्रा और एकाग्रता के लिए (transposon आधारित तैयारी किट के साथ शामिल है) संकरण बफर का उपयोग विकृत पुस्तकालयों पतला।
  2. लोड नमूनानिर्माता के मानक अनुक्रमण प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एक अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच में एस।

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Representative Results

डीएनए एकाग्रता, और गुणवत्ता मूल्यांकन

जीवाणु के डीएनए सांद्रता 0.01 से 0.11 एनजी / अलग वाटरशेड साइटों के पानी का नमूना प्रति मिलीलीटर (1 टेबल) को लेकर। बैक्टीरियल अंश से अलग डीएनए क्रमश: 1.6 करने के लिए एक 260/280 और 1.4-1.8 की एक 260/230 अनुपात और 0.3 थी। एक 260/230 अनुपात के कुछ अपेक्षाकृत कम थे, कोई स्पष्ट निषेध तैयार पुस्तकालय और अन्य बहाव के अनुप्रयोगों में मनाया गया। इन आवेदनों पीसीआर और qPCR -16 rRNA और सीपीएन 60, और बाद में amplicon अनुक्रमण (नहीं दिखाया डेटा) को लक्षित परीक्षण शामिल।

रेंजर प्रौद्योगिकी

एक उच्च throughput स्वचालित मंच के साथ चयनित एक transposon आधारित पद्धति और जेल के आकार के साथ तैयार डीएनए पुस्तकालयों 500-800 बीपी (चित्रा 3) के बीच डीएनए टुकड़े के एक तंग रेंज झुकेंगे। इस वैकल्पिक जनसंपर्कotocol 0.3 से 3.4 एनजी / μl (1 टेबल) को लेकर सांद्रता झुकेंगे। डीएनए टुकड़ा आकार के 650 बीपी के एक औसत का उपयोग करना, इस पुस्तकालय के लिए औसत एकाग्रता इनपुट सामग्री की 3.81 एनएम था। पुस्तकालय लगातार कई वाटरशेड स्थानों से तैयार सब डीएनए पुस्तकालयों में चयनित आकार के थे।

डीएनए अनुक्रमण क्यूसी पैरामीटर्स

Illumina MiSeq पर इस पुस्तकालय का डीएनए अनुक्रमण 1198 कश्मीर / 2 मिमी के एक क्लस्टर घनत्व उत्पन्न। क्लस्टर गुजर फिल्टर का प्रतिशत 84.2% 9.2 जीबी की अनुमानित आय के साथ था। इसके अलावा, 7.4 जीबी या की 82.8% एक गुणवत्ता स्कोर ≥30 था पढ़ता है। एक स्वचालित जेल आकार चयन मंच की उपयोगिता लगातार उपयुक्त पैदावार में हुई और 200 बीपी के तहत अवांछित टुकड़े की क्लस्टरिंग कम से कम।

चित्र 1 <br /> चित्रा 1. पानी के नमूने शहरी (ए) और कृषि (बी) प्रभावित वाटरशेड से एकत्र किए गए थे।

चित्र 2
चित्रा 2. मीठे पानी के नमूनों से transposon आधारित डीएनए पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा मीठे पानी के नमूनों से उत्पन्न डीएनए पुस्तकालयों में से 3. Electropherograms: (ए) का आकार चयन और (बी) के डीएनए पुस्तकालयों आकार करने से पहले बाद पीसीआर डीएनए पुस्तकालयों स्वचालित का उपयोग करते हुए चयनितजेल आकार चयन मंच (लक्ष्य रेंज: 500-800 बीपी)। सभी नमूनों ते बफर के साथ पांच गुना पतला थे।

<टीडी> 0.04 (0.04)
पर्यावरण नमूना जीवाणु के डीएनए एकाग्रता
(एनजी / एमएल) *
एक 260/280 एक 260/230 आकार चयन से पहले डीएनए एकाग्रता (एनजी / μl), मात्रा: 25 μl डीएनए एकाग्रता (एनजी / μl) का आकार चयन के बाद, मात्रा: 25 μl
1 0.11 (0.16) 1.8 1.4 27 1.2
2 0.11 (0.20) 1.8 1.3 27.4 3.3
3 0.10 (0.37) 1.8 1.6 19.5 3.4
4 1.5 0.5 24.4 1.6
5 0.11 (0.13) 1.7 1.0 26.1 1 1
6 0.05 (0.03) 1.5 0.7 15.2 0.4
7 0.01 (0.01) 1.4 0.3 15.1 0.3
8 0.03 (0.05) 1.6 0.7 17 0.9
* मूल्यों को एक उच्च संवेदनशीलता फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड quantitation के परख का उपयोग dsDNA एकाग्रता से संकेत मिलता है। कोष्ठक में नंबर एक microvolume स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है।

तालिका 1. गुणवत्ता और पर्यावरण मीठे पानी के नमूनों से निकाले डीएनए की मात्रा का आकलन, और पहले और बाद में transposon आधारित पुस्तकालयोंस्वचालित जेल आकार चयन।

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Discussion

एडाप्टर dimers और रियायत के मौजूदा प्लेटफार्मों में अनुक्रम किया जा रहा है छोटे डालने के आकार के क्लस्टरिंग की उपस्थिति में useable पैदावार में और अंडर उपयोग उपकरणों की क्षमता 15 की कमी का प्रतिनिधित्व करते हैं। पुस्तकालयों को तैयार करने के लिए एक transposon-आधारित दृष्टिकोण के साथ संयुक्त मनका पिटाई तरीकों का उपयोग निष्कर्षण 4,5 के अन्य तरीकों की तुलना में अधिक डीएनए कर्तन में हो सकता है। अनुक्रमण के वितरण 8,16 पढ़ता करने के लिए फिर भी, निकासी और पुस्तकालय तैयारी के सभी तरीकों संभावित पूर्वाग्रहों परिचय। एक बंधाव आधारित पद्धति के साथ संयुक्त एक स्वचालित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण मंच, का उपयोग कर प्रयोगात्मक टिप्पणियों, बन्दूक पुस्तकालयों से एडाप्टर dimers से अधिक दूर करने के लिए प्रतीत नहीं किया था (डेटा) नहीं दिखाया। इस अध्ययन जिससे एडाप्टर dimers या छोटे का भार कम से कम एक बहुत ही विशिष्ट श्रेणी के भीतर आकार का चयन डीएनए टुकड़े द्वारा पर्यावरण के नमूनों से पुस्तकालयों को तैयार करने के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल कार्यरतडीएनए टुकड़े। एक स्वचालित जेल आकार चयन मंच का उपयोग 500-800 बीपी (चित्रा 3) के एक विशिष्ट श्रेणी के भीतर डीएनए पुस्तकालयों की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निशान उत्पन्न। कच्चे की एक बड़ी संख्या में पढ़ता है जबकि (~ 1.5 करोड़ डॉलर) अन्य सफाई की (यानी, दो 0.5x अनुपात में बार) और संशोधित प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है, केवल 55% की तुलना में मानक उपचार (0.5x अनुपात में समचुंबक मोती) का उपयोग कर प्राप्त किया गया उन से अधिक 225 बीपी थे नमूना प्रति पढ़ता है। का प्रतिशत 225 बीपी से अधिक से अधिक पढ़ता के संशोधित प्रोटोकॉल कम से कम 75% उत्पन्न का उपयोग कर नमूना प्रति पढ़ता है। मानक उपचार में, पढ़ता की बड़ी संख्या कम के प्रतिनिधित्व पर एक पुस्तकालय में पढ़ता संकेत दिया। जेल आकार चयन की तुलना में समचुंबक मोती (मानक उपचार) के साथ चुना टुकड़ा आकार 17 दृष्टिकोण चर होने की सूचना दी गई हैं। इस संशोधित प्रोटोकॉल अधिक सूचनात्मक समचुंबक मोतियों से पढ़ता उत्पन्न। पुस्तकालयों का निर्माण करने के लिए जेल चयन का उपयोग किया है एकlso ~ 5% से 0.02% करने के लिए 9 काइमेरा की घटनाओं में कमी का संकेत दिया।

वर्तमान प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम पीसीआर मास्टर मिश्रण के इनपुट डीएनए, पुस्तकालयों में डीएनए की राशि है, और रसायन शास्त्र को सामान्य बनाने के लिए कारणों में शामिल हैं। शुरू होने वाले इनपुट डीएनए एकाग्रता पर निर्भर करता है, यह समय लेने वाली और उपाय भी इनपुट डीएनए को सामान्य करने के लिए यहाँ है और इस तरह तेजी से automatable मनका-आधारित दृष्टिकोण कर सकते हैं इस्तेमाल किया transposon आधारित पद्धति द्वारा अपेक्षित एक एनजी की राशि के लिए नीचे डीएनए पतला करने के लिए हो सकता है प्रारंभिक नमूना तैयार 18 में विचार किया। इंडेक्सेस की tagmentation और समावेश के बाद, नमूने इस अध्ययन में वर्णित वैद्युतकणसंचलन कार्य केंद्र का उपयोग कर चयनित सीधे आकार के थे। इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम प्रणाली से भरी हुई डीएनए की राशि है। ऑप्टिकल पता लगाने के लिए न्यूनतम नमूना डीएनए एकाग्रता नमूना की प्रकृति (amplicon बनाम बन्दूक अनुक्रमण) पर निर्भर करता है। आंतरिक वसूली की पैदावार कर दिया गया हैकम इनपुट के नमूने और वसूली क्षमता> 75% के साथ पकड़ करने के लिए दिखाया गया है। यहाँ वर्णित स्वचालित जेल आकार चयन प्रणाली से पता लगाया जा सकता है कि सबसे कम डीएनए राशि कुल डीएनए (Nesbitt, एम और Slodoban, जे, 2014, अप्रकाशित डेटा) के 1.5 एनजी है। दोहरी डाई मार्कर जहां आकार को निर्धारित करने के लिए एक विशेष लक्ष्य का चयन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं फिर भी, जैसा नमूने के ऑप्टिकल पहचान, आकार चयन संचालन करने के लिए आवश्यक नहीं है। पर्यावरण के नमूनों से तैयार पुस्तकालयों मंच में भरी हुई थी, इससे पहले डीएनए एकाग्रता एक fluorometer का उपयोग मात्रा निर्धारित किया गया था। डीएनए सांद्रता के एक अपेक्षाकृत संकीर्ण सीमा के बाद पीसीआर नमूने (1 टेबल) में पाया गया था। इन नमूनों एक लवण, dimers, डीएनए पोलीमरेज़ का मिश्रण, प्रवर्धित पर्यावरण डीएनए, और अज्ञात अभिकर्मकों 19, कम से कम प्रतिनिधित्व इन सांद्रता निहित हालांकि वैद्युतकणसंचलन कार्य केंद्र द्वारा detectable डीएनए की सूचना सबसे कम राशि से अधिक 252 गुना। आम तौर पर, डीएनए frag के आकार चयनबयान के बजाय पीसीआर मास्टर मिश्रण का एक बफर समाधान में किया जाएगा। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल के बारे में जानकारी पीसीआर मास्टर मिश्रण निर्माता से अज्ञात था, भले ही प्रारंभिक परीक्षणों मिश्रण में दोहरी डाई मार्कर के प्रवास को ट्रैक करने के लिए आयोजित किया गया था (डेटा) नहीं दिखाया। पीसीआर मास्टर मिश्रण में एक उच्च शक्ति ईओण बफर नमूने की electrophoretic गतिशीलता बदल जाएगा, और इस तरह इस चर के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में वर्णित स्वचालित जेल चयन मंच एक नमूना उच्च आयनिक शक्ति में है इंगित करने के लिए एक विकल्प को उजागर करता है। इस विकल्प का प्रयोग किया जाता है, तो बदल electrophoretic गतिशीलता घटता है और देरी बैंड ट्रैकिंग मापदंडों कार्यरत हैं। इसलिए, यह पीसीआर मिश्रण के रसायन शास्त्र लोड हो रहा है बफर और मार्कर पर असर पड़ेगा कि संभव है, और जेल में डीएनए टुकड़े के पलायन को प्रभावित करता है।

स्वचालित या अर्ध-स्वचालित जेल आकार चयन के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कुछ प्रणालियों रहे हैं। इनयंत्र भी कम से कम एक घंटा में जुदाई, वसूली, और प्रलेखन प्रदान करते हैं। यह इन प्रणालियों संभाल कर सकते हैं कि नमूने, और उपभोग्य 17,20 के साथ जुड़े लागत की संख्या की बात आती है तो भी, सीमाएं हैं। इस संदर्भ में, यहाँ वर्णित तकनीक agarose जेल आकार चयन और विश्लेषण दोनों के पहलुओं को संभालती है। अप करने के लिए 192 नमूनों उच्च संकल्प वैद्युतकणसंचलन के साथ होती जा सकता है, जबकि अप करने के लिए 96 नमूने, एक ही समय में चयनित आकार के हो सकते हैं। इसके अलावा, साधन भी उपयोगकर्ताओं को एक स्वचालित कार्य केंद्र से उम्मीद सामान्य तरल से निपटने कार्यों को पूरा कर सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल के कच्चे क्षालन मात्रा लक्ष्य रेंज (25 बीपी को 40 केबी) पर निर्भर करता है, 100 से 400 μl से चलता है। साधन के इस पहलू एक सीमा के रूप में माना जा सकता है, यह 300 μl की एक मात्रा के साथ eluted डीएनए पुस्तकालयों 301 प्रधानमंत्री के एक औसत एकाग्रता होता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए (डेटा) नहीं दिखाया। इस परिणामी मूल्य प्रतिनिधिsents एक एक MiSeq मंच में अनुक्रमण के लिए आवश्यक अंतिम एकाग्रता (~ 23:05) की तुलना में अधिक 26 गुना। वर्तमान अध्ययन में, इथेनॉल वर्षा पुस्तकालय तैयारी में कार्यरत समय के संदर्भ में एक अतिरिक्त कदम का प्रतिनिधित्व किया। वर्तमान में, क्षालन मात्रा आगे एक वाणिज्यिक फिल्टर प्लेट और डेक (उन्नयन) पर फिट बैठता है कि एक वैक्यूम कई गुना का उपयोग करता है कि एक पर डेक वैक्यूम निस्पंदन कदम का उपयोग करके कम किया जा सकता है। इस सेटअप का उपयोग करना, कच्चे क्षालन मात्रा, फिल्टर थाली में स्थानांतरित ध्यान केंद्रित किया और फिर 25 μl (Slodoban, जे, 2014, व्यक्तिगत संचार) में resuspended है। इस अध्ययन के लिए, डीएनए वर्षा transposon आधारित किट में वर्णित के रूप में सामान्य बनाने नमूना कदम के लिए आवश्यक इनपुट मात्रा के साथ संगत कार्यप्रवाह रखने के लिए आयोजित किया गया।

इस संशोधित तकनीक ऐसे समुद्री जल, अपशिष्ट उपचार संयंत्र, तलछट, मिट्टी, या माइक्रोबियल मैट के रूप में अन्य पर्यावरणीय नमूने से तैयार डीएनए या सीडीएनए पुस्तकालयों के लिए लागू किया जा सकता है। ऑटोयहां बताया mated जेल आकार चयन मंच Illumina अनुक्रमण प्लेटफार्मों के लिए, लेकिन यह भी रॉश 454, जीवन टेक्नोलॉजीज, और प्रशांत बायोसाइंसेज सहित अन्य अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्लेटफार्मों के लिए न केवल न्यूनतम संशोधनों के साथ लागू किया जा सकता है। अन्य प्लेटफार्मों लोड हो रहा है अच्छी तरह से (51 μl तक) क्षमता, नौकरशाही का आकार घटाने संदर्भ या मार्कर, और agarose जेल कैसेट का प्रतिशत (लक्ष्य अंश पर निर्भर) शामिल करने के लिए विशेष विचार इस तकनीक के लिए अनुकूल है। इस उच्च throughput स्वचालित जेल आकार चयन तकनीक शुद्धि की एक भेदभाव रूप है और कम लागत electrophoretic अभिलक्षण के लिए पर्याप्त है। इस तकनीक से फायदा हो सकता है कि अन्य अनुप्रयोगों आरएनए Seq परियोजनाओं, (कार्य metagenomics सहित) लंबा टुकड़ा अनुक्रमण, जीन संश्लेषण, दोस्त जोड़ी पुस्तकालय निर्माण, नए सिरे से और जटिल जीनोम अनुक्रमण, प्रतिबंध विश्लेषण पचाने, और जीनोटाइपिंग शामिल हैं।

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Disclosures

जारेड आर स्लोबोदान और मैथ्यू जे Nesbitt दोनों तटीय जीनोमिक्स, रेंजर प्रौद्योगिकी की पेशकश एक निजी स्वामित्व वाली ब्रिटिश कोलंबिया निगम के शेयरों पकड़।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series Thermo Scientific  1400-1620
0.2 µm Supor Membrane VWR CA28143-969 Pall Corporation, Ann Harbor, MI
Tungsten carbide beads 3 mm (200) Qiagen 69997
Isopropyl alcohol 70% Jedmon Products 825751 Healthcare Plus
DNA away VWR 7010 Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA
Milli-Q water purification system Fisher Scientific ZMQS6VF0Y Merck Millipore. This system has been discontinued.
20x PBS pH 7.5 VWR E703-1L Amresco, Inc., Solon, OH
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100 Fisher chemicals
Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes VWR 13000-V1-50 MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) VWR SI-0236 Scientific Industries, Inc.
Beckman Centrifuge Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd Model J-6B
PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit VWR 12855-100 MoBio, Carlsbad, CA
Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes VWR 13000-V1-24 MoBio, Carlsbad, CA
Microfuge 18 centrifuge Beckman Coulter 367160
Nimbus Select workstation with Ranger Technology Hamilton Robotics 92720-01 Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware)
Ranger reagent kit Coastal Genomics CG-10600-150-12-21 Includes loading buffer and cassettes
Ethyl alcohol (anhydrous) Commercial Alcohols P016EAAN Greenfield Ethanol
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Linear acrylamide (5 mg/ml) Life Technologies AM9520 Ambion
Eppendorf refrigerated centrifuge Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. 5417R
Buffer EB (250 ml) Qiagen 19086
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific ND-1000
Qubit fluorometer Life Technologies Q32857 Invitrogen. This product has been discontinued.
Qubit dsDNA HS assay kit Life Technologies Q32854 Invitrogen
High sensitivity DNA reagent Agilent Technologies 5067-4626
High sensitivity DNA chips Agilent Technologies 5067-4626
Agilent 2011 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938B
Nextera XT DNA sample preparation kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT index kit Illumina FC-131-1001
MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) Illumina MS-102-2003
Miseq system Illumina SY-410-1003

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