Выбор размера Автоматизированная гель для улучшения качества секвенирования библиотек следующего поколения, полученного из окружающей среды проб воды

1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory
Published 4/17/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Environment

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Uyaguari-Diaz, M. I., Slobodan, J. R., Nesbitt, M. J., Croxen, M. A., Isaac-Renton, J., Prystajecky, N. A., et al. Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples. J. Vis. Exp. (98), e52685, doi:10.3791/52685 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Вода Сбор и фильтрация

  1. Соберите образцы пресной воды с различных сайтов (рисунок 1). Проход образцы через серию фильтров: 1 мкм фильтр, 0,2 мкм фильтр, и 30 кДа среза фильтра тангенциального потока систематически отдельные эукариотической, бактериальные и вирусные частицы размера, соответственно.
    Примечание: только очищение и анализ материала извлеченного на фильтрах 0,2 мкм (свободно живущие бактерии) описано в этом докладе, но аналогичные подходы могут быть использованы для других частиц, извлеченных из фильтров.

2. концентрация бактерий, ДНК Выделение и очистка

  1. Извлеките мембранный фильтр (ы) 0,2 мкм от системы фильтрации воды (схеме, рис 2). Сложите фильтр 0,2 мкм диска пополам и поместите его в 50 мл пробирку с открытым стороной вверх. Добавить 5 мл 1x фосфатным буферным раствором (PBS) и 0,01% Tween, рН 7,4 вТрубка. Если более чем один фильтр используется в процессе используют различные трубки на фильтр. Магазин трубка (и) с фильтром при 4 ° С до обработки. В противном случае перейдите к шагу 2.2.
  2. Извлеките 0,2 мкм мембранный фильтр с 50 мл пробирку с стерильным пинцетом. Место фильтр (ы) на чашку Петри (оставить буфер PBS в трубку).
    1. С стерильным пинцетом и стерильными ножницами, вырезать фильтр на мелкие полоски (1 см х 1 см). Лечить щипцы и ножницы путем замачивания в 70% изопропанола, вытирая с ДНК поверхности дезинфицирующим и промывки сверхчистой воды типа 1 между различными образцами.
  3. Поместите фильтр разрезают на полосы обратно в ту же пробирку на 50 мл. Добавьте 10 мл 1x PBS и 0,01% Твин, рН 7,4 с фильтром, так что в общей сложности 15 мл буфера в 50 мл пробирку.
  4. Добавить 6 чистые шарики вольфрама (диаметром 3 мм) в каждую 50 мл пробирку, закройте пробирку с парафильмом и вихрь энергично в течение 20 мин (используйте 50 мл пробирки вихревой адаптер). Если мультниям фильтры обрабатываются от одного образца, передачи и бассейна всего гомогената в чистую пробирку на 50 мл. Центрифуга трубки на 3300 мкг в течение 15 мин при 4 ° С.
  5. Ресуспендируют осадок и аликвотных бактериальных клеток (~ 1 мл аликвоты) в 1,7 мл микроцентрифужных пробирках. Следует отметить, что там будет 5 микроцентрифужных пробирках в образце.
  6. Спин вниз микроцентрифужных пробирок на 10 000 мкг в течение 10 мин, и удалить большинство из супернатанта до ~ 200 мкл метки.
  7. Храните образцы при -80 ° С, или перейти извлечь бактериальной ДНК с помощью имеющихся в продаже набор для выделения ДНК в соответствии с инструкциями изготовителя. В бактериальной использованием экстракции ДНК либо PBS или воды в качестве отрицательного контроля экстракции и Е. палочки в качестве положительного контроля экстракции.
  8. Потому что ДНК из нескольких трубок извлечении, бассейн параллельных суб-аликвот из одной и той же пробы в одном 2 мл пробирку. Затем провести осаждение N / O с использованием раствора, состоящего из 0,1Объемы 3 М ацетата натрия, 2 объемами 100% -ного этанола и 5 мкл 5 мкг / мкл линейной акриламид. Все хорошо перемешать и хранить образцы при -80 ° C.
  9. Центрифуга на максимальной скорости (17000 х г) в течение 30 мин при 4 ° С. Вымойте гранул с 1 мл ледяной 70% этанола, сухой воздух в шкафу биобезопасности не более чем на 5 мин и ресуспендируют осадок ДНК в 34 мкл 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5.
    Примечание: Линейный акриламида поможет визуализировать ДНК гранул после O / N осадков.
  10. Определить количество ДНК и качество с высокой чувствительностью люминесцентные нуклеиновой количественного кислота анализа и микрообъема спектрофотометр, соответственно, следуя инструкциям изготовителя (табл материалов).
    Примечание: Если несколько образцов готовятся в то время, сверхчувствительные флуоресцентный анализ нуклеиновой кислоты для количественного дц и пластины на основе флуорометр / спектрофотометр может быть использован вместо.

3. ДНК Подготовка Библиотека

  1. Ферментативно фрагмент один нанограмм бактериальной ДНК с использованием способа на основе транспозона (tagmentation). Добавить адаптер и индекса последовательности на фрагментированной ДНК, следуя инструкциям изготовителя. Тема tagmented образцы до 12 циклов ПЦР, как указано в инструкциях изготовителя, и в этот момент индексы секвенирования Incorporated.

Выбор размера 4. Автоматизированная гель

  1. Перейти стандартную после ПЦР очистке шаг, описанный в инструкции завода-изготовителя (табл материалов). Выбрать размер образцов после ПЦР непосредственно с помощью автоматизированной гель на основе выбора формата платформы.
    1. Добавить 3,5 мкл загрузочного буфера к каждому образцу.
    2. В соответствии с протоколом производителя, загрузить образцы на станции электрофореза, определяющая цель размер отбор 500-800 б.п., в экстракте 300 мклионный объем, с использованием сборных 1,5% агарозном кассету.
    3. Концентрат сырой выходного материала (300 мкл) до 25 мкл с помощью осаждения этанолом.
      Примечание: Также можно использовать рабочую станцию ​​электрофореза для автоматизации концентрации для большего числа образцов через пластину фильтра и вакуумного коллектора.
      1. Осадок объем сырой элюции с использованием 0,1 объемов 3 М ацетата натрия, 2 объемами 100% -ного этанола и 5 мкл 5 мкг / мкл линейной акриламид. Все хорошо перемешать, место образцов при -80 ° CO / N. Центрифуга образцов при 17000 х г в течение 30 мин.
      2. Отменить супернатанты и приступить к мыть ДНК гранул с 1 мл охлажденного льдом 70% этанола.
      3. Центрифуга образцов снова при 17000 х г в течение 30 мин, отбросить супернатанты, сухой воздух, и, наконец, ресуспендируют осадок ДНК в 25 мкл 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5.
  2. (Необязательно) Используйте 1 мкл размер библиотек ДНК, выбранного с помощью автоматизированной выбора размера гель платформы, чтобы сделать пять-кратной разбавления с использованием буферного раствора трис-ЭДТА, рН 8,0. Анализ библиотеки, используя чип на основе капиллярного электрофореза инструмент для анализа двухцепочечной ДНК качества в соответствии с инструкциями изготовителя.

5. Библиотека Нормализация и секвенирование

  1. Перейдите к нормализации образцов с использованием библиотеки бисер нормализации (входящих в состав препарата библиотека комплекта транспозонов основе), как описано в Руководство по подготовке производителя.
    1. Кроме того, мера дцДНК библиотеки с использованием высокой чувствительности флуоресцентного нуклеиновой количественный кислота анализа, а затем путем объединения в эквимолярных соотношениях, чтобы достичь конечной концентрации дц 2 нм. Перейдите к денатурации библиотеки, используя 10 мкл объединенных библиотек и 10 мкл 0,2 N NaOH, инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре. Развести денатурированные библиотек с использованием гибридизации буфер (поставляется с комплектом подготовки транспозонов основе) до конечного объема 1 мл и концентрации 11:05 вечера.
  2. Образец нагрузкис в секвенирования платформы следующего поколения, следуя стандартным протоколам секвенирования производителя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Концентрация ДНК и оценки качества

Бактериальные концентрации ДНК в диапазоне от 0,01 до 0,11 нг / мл в пробе воды из различных сайтов водосборных (таблица 1). ДНК, выделенная из бактерий фракции было 260/280 и А 260/230 отношения от 1,4 до 1,8 и от 0,3 до 1,6, соответственно. В то время как некоторые из 260/230 соотношения были относительно низкими, никаких видимых ингибирования не наблюдалось в подготовленном библиотекой и другими нижестоящими приложений. Эти приложения включены ПЦР и КПЦР тесты, нацеленные на 16S рРНК и КПН 60 и последующее секвенирование ампликона (данные не показаны).

Ranger Technology

Библиотеки ДНК, полученной с транспозонов основе метода и гель выбранного размера с высокой пропускной автоматизированной платформе дали узкому диапазону фрагментов ДНК между 500-800 б.п. (рис 3). Эта альтернатива прotocol дали концентрациях в пределах от 0,3 до 3,4 нг / мкл (Таблица 1). Использование в среднем 650 п.н. размера фрагмента ДНК, средняя концентрация для этой библиотеки была 3,81 нМ исходного материала. Библиотеки были последовательно выбранного размера во всех библиотек ДНК, полученных из разных мест водосбора.

Параметры Секвенирование ДНК КК

Секвенирование ДНК этой библиотеки на Illumina MiSeq генерируется плотность кластера 1198 K / мм 2. Процент кластера проходящих фильтров составила 84,2% при расчетной урожайности 9,2 Гб. Кроме того, 7,4 Гб или 82,8% от чтения было показатель качества ≥30. Использование автоматизированной гель выбора размера платформы последовательно привело в подходящих урожайности и свести к минимуму кластеризации нежелательных фрагментов при 200 б.п..

Фигура 1 <BR /> Рисунок 1. Пробы воды были собраны из городского (А) и в сельском хозяйстве (B) под влиянием водных бассейнов.

Фиг.2
Рисунок 2. Схематическое представление методов, используемых для создания транспозонов основе библиотеки ДНК из образцов пресной воды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3. электрофореграммы библиотек ДНК, полученных из образцов пресной воды: () библиотеки после ПЦР ДНК, предшествующих выбора размера и размера (B) библиотек ДНК выбирается с помощью автоматизированнойРазмер гель выбора платформы (целевой диапазон: 500-800 б.п.). Все образцы разводили в пять раз с ТЕ-буфера.

<TD> 0,04 (0,04)
Проб окружающей среды Бактериальный концентрацию ДНК
(Нг / мл) *
260/280 260/230 Концентрация ДНК (нг / мкл) до выбора размера, объем: 25 мкл Концентрация ДНК (нг / мкл) после выбора размера, объем: 25 мкл
1 0,11 (0,16) 1,8 1,4 27 1,2
2 0,11 (0,20) 1,8 1,3 27,4 3,3
3 0,10 (0,37) 1,8 1,6 19,5 3,4
4 1,5 0,5 24,4 1,6
5 0,11 (0,13) 1,7 1,0 26,1 1,1
6 0,05 (0,03) 1,5 0,7 15,2 0,4
7 0,01 (0,01) 1,4 0,3 15,1 0,3
8 0,03 (0,05) 1,6 0,7 17 0,9
* Значения указывают концентрацию дц помощью высокой чувствительности флуоресцентного нуклеиновой количественный кислота анализа. Номер в скобках представляет концентрацию с помощью микрообъем спектрофотометра.

Таблица 1. Качество и оценка количества ДНК, извлеченной из проб окружающей среды пресноводных и транспозонов основе библиотеки до и послеАвтоматизированная гель для выбора размера.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наличие адаптера димеров и кластеров малых размеров вставки преимущественно быть упорядочены в современных платформах представляют собой уменьшение пригодные для использования выходами и недоиспользование мощность аппарата, в 15. Использование бортовых методов биений в сочетании с подход транспозонов основе подготовить библиотеки может привести к дополнительной сдвига ДНК по сравнению с другими методами экстракции 4,5. Тем не менее, все способы добычи и библиотеки подготовки потенциально ввести предубеждения распределение последовательности читает 8,16. Экспериментальные наблюдения с использованием автоматизированного нуклеиновой кислоты для экстракции платформу, в сочетании с методом лигирования основе, похоже, не удалить избыток адаптера димеров из дробовика библиотек (данные не показаны). Это исследование использовали модифицированный протокол для подготовки библиотеки из проб окружающей среды от фрагментов ДНК выбора размера в очень определенном диапазоне, тем самым минимизируя вынос адаптера димеров или небольшихДНК-фрагменты. Использование автоматизированной гель выбора размера платформы создается воспроизводимые следы ДНК библиотек в определенном диапазоне 500-800 б.п. (рис 3). В то время как большее количество сырья считывает (~ 1500000) были получены с использованием стандартной терапией (парамагнитными гранулами в соотношении 0,5 ×) по сравнению с другими очистке (т.е. в 2 раза при соотношении 0,5 ×) и модифицированный протокол здесь описано, только 55% тех чтений по образцу были больше, чем 225 б.п.. Процент считывает на образец с помощью модифицированного протокола генерируется по меньшей мере, 75% от считывает более 225 п.н.. В стандартной обработки, большое количество просмотров указано более короткого представления считывает в библиотеке. Фрагмент выбранные размеры с парамагнитными гранулами (Стандартное лечение), как сообщается, будет переменная по сравнению с выбора размера гель подходит 17. Этот модифицированный протокол генерируется более информативным чтения больше чем парамагнитных шариков. Использование выбора геля для создания библиотеки имеетРБП указывается снижение заболеваемости химер от ~ 5% до 0,02% 9.

Основные этапы в настоящем Протоколе включать соображения для нормализации входного ДНК, количества ДНК в библиотеках и химии мастер смеси ПЦР. В зависимости от исходной концентрации входного ДНК, это может быть трудоемким для измерения и разбавленной ДНК до количестве 1 нг требуемого методом транспозонов основе используемого здесь и, таким образом, быстрее, автоматизирован шарик подходы к нормализации входного ДНК также может рассматривать в начальной подготовки образца 18. После tagmentation и включение показателей, образцы были непосредственно размер выбран с помощью рабочей станции электрофореза, описанный в данном исследовании. Важным шагом в этой процедуре является количество ДНК загружен в систему. Минимальная концентрация ДНК образца для оптического детектирования в зависимости от природы пробы (по сравнению с ампликона Метод дробовика). Доходность Внутренние восстановления, былиПоказано, провести с низким уровнем входных выборок и эффективность восстановления> 75%. Наименьшее количество ДНК, которые могут быть обнаружены с помощью автоматизированной системы гель выбора размера, описанного здесь 1,5 нг полной ДНК (Nesbitt, М. и Slodoban, J., 2014, неопубликованные данные). Тем не менее, оптическое детектирование образца не требуется проводить по размерам, в качестве маркеров двойные красителей используются, чтобы определить, где размер выбрать конкретную задачу. Перед библиотек, полученных из проб окружающей среды были загружены в платформу, концентрация ДНК количественно с помощью флуориметра. Относительно узкий диапазон концентраций ДНК была обнаружена в пост-ПЦР образцов (таблица 1). Хотя эти образцы содержали смесь солей, димеров ДНК-полимеразы, ДНК, амплифицированного окружающей и нераскрытых реагентов 19, эти концентрации представлены по крайней мере, 252 раз выше, чем сообщалось наименьшее количество ДНК детектируемого с помощью рабочей станции электрофореза. Как правило, выбор размера Frag ДНКные будет осуществляться в буферном растворе, а не на основной смеси ПЦР. Даже если информация о Master Mix ПЦР использовали в этом протоколе было указано от производителя, предварительные испытания проводились отслеживать перемещение маркеров двойной красителя в смеси (данные не показаны). Высокой ионной силы буфера в основную смесь ПЦР изменит электрофоретической подвижности образца, и, таким образом, эта переменная должна быть размещены на. Автоматизированный выбор гель платформа описано в данном исследовании раскрывает вариант, чтобы указать, если образец находится в высокой ионной силой. Когда эта опция используется, используются затем измененные кривые электрофоретической подвижности и замедленные параметры отслеживания группа. Таким образом, вполне возможно, что химический состав ПЦР-смеси будут иметь влияние на загрузочном буфере и маркеров, и влияет на миграцию фрагментов ДНК в геле.

Есть несколько систем, коммерчески доступные для автоматизированного или полуавтоматического выбора размера гель. ЭтиУстройства также обеспечивают разделение, восстановление и документацию менее чем 1 час. Тем не менее, существуют ограничения, когда дело доходит до количества образцов, что эти системы могут обрабатывать, и расходов, связанных с расходными 17,20. В этом контексте, способ, описанный здесь, обрабатывает аспекты как в агарозном геле выбора размера и аналитика. До 96 образцов может быть выбран размер за один проход, в то время как до 192 образцы могут быть охарактеризованы с высокой разрешающей способностью электрофореза. Кроме того, прибор может также завершить общие задачи обработки жидкости пользователи ожидают от автоматизированного рабочего места.

Сырье объем элюирования этого протокола в диапазоне от 100 до 400 мкл, в зависимости от целевого диапазона (25 п.н. до 40 т.п.н.). В то время как этот аспект документа может восприниматься как ограничение, следует отметить, что библиотеки ДНК элюировали объема 300 мкл бы иметь среднюю концентрацию 301 мкМ (данные не показаны). Это результирующее значение представисентов 26 раз выше, чем требуемой конечной концентрации для секвенирования в платформе MiSeq (~ 11:05 вечера). В настоящем исследовании, осаждение этанолом представляет собой дополнительную стадию в плане времени, используемого в библиотеке препарата. В настоящее время объем элюирования может быть дополнительно уменьшено с помощью шаг на палубе фильтрации вакуума, который использует коммерческую фильтра пластину и вакуумный коллектор, который соответствует на палубе (обновления). Используя эту установку, сырой объем элюирования переносится в фильтровальной пластине, концентрировали и затем повторно суспендировали в 25 мкл (Slodoban, J., 2014, личное сообщение). Для этого исследования, осадки ДНК проводили, чтобы рабочий процесс в соответствии с объемом ввода необходимого для образца нормализации стадии, как описано в комплект транспозонов основе.

Этот модифицированный метод может быть применим к ДНК или кДНК библиотек, полученных из других проб окружающей среды, таких как морская вода, очистные сооружения сточных вод, донных отложений, почвы, или микробных матов. АвтоMated гель для выбора размера платформа сообщили здесь могут быть применены с минимальными изменениями не только секвенирования платформ Illumina, но и на другие следующего поколения секвенирования платформ, включая Roche 454, Life Technologies, и Тихого BioSciences. Особые соображения адаптировать эту технологию для других платформ включают грузоподъемность хорошо (до 51 мкл), калибровка ссылки или маркеры, и процент кассеты агарозном геле (в зависимости от целевой фракции). Эта автоматизированная гель метод выбора размера с высокой пропускной способностью является дискриминационным форма очистки и достаточно для недорогих электрофоретических характеристик. Другие приложения, которые могут извлечь выгоду из этой технологии включают в себя РНК-Seq проекты, длинные последовательности фрагментов (в том числе функциональных Метагеномика), синтез гена, приятель пары библиотека строительство, De Novo и сложного секвенирование генома, ограничение переварить анализ и генотипирование.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Джаред Р. Слободан и Мэтью Дж Несбитт и держать акции прибрежных геномики, частная корпорация Британской Колумбии, предлагающий Ranger Technology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series Thermo Scientific  1400-1620
0.2 µm Supor Membrane VWR CA28143-969 Pall Corporation, Ann Harbor, MI
Tungsten carbide beads 3 mm (200) Qiagen 69997
Isopropyl alcohol 70% Jedmon Products 825751 Healthcare Plus
DNA away VWR 7010 Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA
Milli-Q water purification system Fisher Scientific ZMQS6VF0Y Merck Millipore. This system has been discontinued.
20x PBS pH 7.5 VWR E703-1L Amresco, Inc., Solon, OH
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100 Fisher chemicals
Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes VWR 13000-V1-50 MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) VWR SI-0236 Scientific Industries, Inc.
Beckman Centrifuge Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd Model J-6B
PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit VWR 12855-100 MoBio, Carlsbad, CA
Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes VWR 13000-V1-24 MoBio, Carlsbad, CA
Microfuge 18 centrifuge Beckman Coulter 367160
Nimbus Select workstation with Ranger Technology Hamilton Robotics 92720-01 Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware)
Ranger reagent kit Coastal Genomics CG-10600-150-12-21 Includes loading buffer and cassettes
Ethyl alcohol (anhydrous) Commercial Alcohols P016EAAN Greenfield Ethanol
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Linear acrylamide (5 mg/ml) Life Technologies AM9520 Ambion
Eppendorf refrigerated centrifuge Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. 5417R
Buffer EB (250 ml) Qiagen 19086
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific ND-1000
Qubit fluorometer Life Technologies Q32857 Invitrogen. This product has been discontinued.
Qubit dsDNA HS assay kit Life Technologies Q32854 Invitrogen
High sensitivity DNA reagent Agilent Technologies 5067-4626
High sensitivity DNA chips Agilent Technologies 5067-4626
Agilent 2011 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938B
Nextera XT DNA sample preparation kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT index kit Illumina FC-131-1001
MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) Illumina MS-102-2003
Miseq system Illumina SY-410-1003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siuda, W., Chrost, R. J. Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks. Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).
  2. Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. Available from: http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna (2010).
  3. Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology letters. 4, 423-425 (2008).
  4. Liles, M. R., et al. Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms. Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).
  5. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. BioTechniques. 49, 631-640 (2010).
  6. Tebbe, C. C., Vahjen, W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).
  7. Solonenko, S. A., et al. Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes. BMC genomics. 14, 320 (2013).
  8. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome biology. 12, R18 (2011).
  9. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]. 18, 18 (2009).
  10. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).
  11. Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).
  12. Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing. Nature Methods. 7, (2010).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. (2012).
  15. Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).
  16. Marine, R., et al. Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA. Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).
  17. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome research. 22, 939-946 (2012).
  18. Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system. Bmc Biotechnology. 13, (2013).
  19. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome research. (2014).
  20. Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. PloS One. 9, e113501 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats