自动凝胶尺寸选择,以提高下一代测序文库的质量,从环境水样准备

1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory
Published 4/17/2015
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Uyaguari-Diaz, M. I., Slobodan, J. R., Nesbitt, M. J., Croxen, M. A., Isaac-Renton, J., Prystajecky, N. A., et al. Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples. J. Vis. Exp. (98), e52685, doi:10.3791/52685 (2015).

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Abstract

Protocol

1.水收集和过滤

  1. 收集来自各部位( 图1)的淡水样品。通过一系列的过滤器通过样品:1微米的过滤器,0.2微米的过滤器,和30 kDa的截止切向流过滤器,以系统地分开真核生物,细菌和病毒大小的颗粒,分别。
    注意:只有在纯化和回收在0.2微米的过滤器(自由生活的细菌)的材料的分析在本报告中进行了说明,但类似的方法可用于从过滤器回收的其它颗粒。

2.细菌浓度,DNA提取和纯化

  1. 除去从水过滤系统(示意图, 图2)的0.2微米的膜过滤器(多个)。折叠为0.2μm盘式过滤器在一半并将其放入50ml管与打开的一面朝上。加入5 ml的1×磷酸缓冲液(PBS)及0.01%吐温,pH 7.4中进管。如果一个以上的过滤器的过程中使用的采用每一个过滤器的不同管中。商店管(多个)带过滤器在4℃下直到处理。否则,继续执行步骤2.2。
  2. 删除50毫升管,用无菌镊子0.2微米的滤膜过滤。在一个培养皿的地方过滤器(多个)(离开PBS缓冲液在管中)。
    1. 用无菌镊子和无菌剪刀,剪去滤波器成小条带(1毫升×1厘米)。通过浸泡在70%的异丙醇,用DNA表面去污剂擦拭和与第一类型不同的样品之间的超纯水漂洗消毒镊子和剪刀。
  3. 放置切成条状的过滤器放回同样的50毫升管。加入10 mL的1×PBS和0.01%吐温,pH 7.4中的过滤器,使总共15 ml缓冲液中的50ml管中有。
  4. 添加6洁净钨珠(直径3)每次50毫升管,覆盖管封口膜和涡大力为20分钟(使用50ml试管涡适配器)。如果MULTIPLE过滤器从一个样品,转移和池中的所有匀浆处理成清洁的50ml管中。离心管在3300 XG为15分钟,在4℃。
  5. 悬浮颗粒和等份的细菌细胞(〜1ml等份)插入1.7毫升离心管。需要注意的是将有每个样品5微量离心管中。
  6. 降速的离心管以10,000rpm离心10分钟,并移除大部分上清液降到〜200微升标记。
  7. 存储所述样品在-80℃下,或进行通过使用市售的DNA分离试剂盒按照制造商的说明提取细菌的DNA。在细菌的DNA提取使用PBS或水作为阴性提取控制和E.大肠杆菌作为阳性对照提取。
  8. 因为从多个管的DNA被提取,汇集平行子等份从同一样品放入1个2毫升管。然后通过使用包括0.1的溶液进行O / N沉淀体积的3M乙酸钠,2体积的100%乙醇和5微升5微克/微升的线性丙烯酰胺。搅拌均匀,将标本在-80℃。
  9. 以最大速度离心(17000×g离心)处理30分钟,在4℃。用1ml冰冷的70%乙醇,空气干燥在生物安全柜中于不超过5分钟,重悬DNA沉淀在34微升10毫摩尔Tris-CL,pH值8.5洗沉淀。
    注:线性丙烯酰胺有利于O / N沉淀后可视化DNA沉淀。
  10. 确定使用高灵敏度荧光核酸定量测定和一个微量分光光度计,分别按照制造商的说明(见表材料)的DNA的数量和质量。
    注意:如果多个样品制备的时候,可以用于定量双链DNA和板为基础的荧光计/分光光度计的超灵敏荧光核酸测定法来代替。

3. DNA库准备

  1. 细菌DNA的使用转座子为基础的方法(tagmentation)酶促片段1纳克。添加适配器和索引序列到片段化DNA按照制造商的说明进行操作。受试者tagmented样品的PCR 12个循环,在制造商的说明,在该点的测序索引被并入表示。

4.自动凝胶尺寸选择

  1. 跳过在制造商的说明书中所述的标准PCR后清理步骤(见表材料)。大小选择PCR后的样品直接用自动基于凝胶的大小选择平台。
    1. 加入3.5微升加样缓冲液到每个样品。
    2. 根据制造商的协议中,加载样品到电泳工作站,指定的500-800碱基对的大小选择目标,在一个300μl的提取液离子量,使用的是预铸1.5%琼脂糖盒。
    3. 集中的原始输出材料(300微升)下降到通过乙醇沉淀25微升。
      注:另外,用电泳工作站自动浓度的样品通过过滤板和真空歧管更大的数字。
      1. 沉淀用0.1倍体积的3M乙酸钠,2体积的100%乙醇和5微升5微克/微升的线性丙烯酰胺的原料的洗脱体积。拌匀,放置样品在-80°CO / N。离心样品在17000×g离心30分钟。
      2. 丢弃上清液,然后继续用1ml冰冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀。
      3. 离心样品再次在17000×g离心30分钟,弃去上清液,空气干燥,最后重悬DNA沉淀在25微升10毫摩尔Tris-CL,pH值8.5。
  2. (可选)使用1微升的DNA库的大小与自动化凝胶大小选择平台选择做一个五倍稀释使用的Tris-EDTA缓冲溶液,pH为8.0。分析使用基于芯片的毛细管电泳仪,根据生产商的说明来分析双链DNA质量库。

5.图书馆规范化和测序

  1. 进行到正常化使用如制造商的指导制备描述库正常化珠粒(包含转座子为基础的文库制备试剂盒)的样品。
    1. 可替代地,使用高灵敏度荧光核酸定量测定,接着汇集于等摩尔比,以达到为2nM的终双链DNA浓度测量双链DNA文库。继续以变性,用10微升汇集库和10μl的0.2N的氢氧化钠库,孵育5分钟,在室温。用稀释杂交缓冲液(包含转座子为基础制备试剂盒),以1毫升的最终体积的下午11时05分和浓度变性库。
  2. 加载样品在下一代测序平台S按以下所述制造商的标准测序方案。

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Representative Results

DNA浓度和质量评估

细菌的DNA浓度范围为0.01至0.11纳克/毫升%的不同流域部位的水样品( 见表1)。 DNA细菌部分分离了一个260/280和A 260/230比例为1.4〜1.8和0.3〜1.6,分别为。虽然一些甲二百三十〇分之二百六十比率相对较低,没有明显的抑制作用,观察在制备的文库和其它下游应用。这些应用包括PCR和qPCR测试靶向16S rRNA和CPN 60,和随后的扩增子测序(数据未示出)。

游侠技术

制备具有高通量自动化的平台中选择的基于转座子的方法和凝胶尺寸的DNA文库,得到500-800碱基( 图3)之间的DNA片段的一个紧的范围。这种另类公关otocol得到浓度范围从0.3到3.4毫微克/微升( 表1)。使用平均650基点的DNA片段的大小,平均浓度为这个图书馆是3.81纳米的输入材料。图书馆是一贯的尺寸从多个分水岭位置准备所有的DNA库中选择。

DNA测序QC参数

在Illumina的MiSeq此库的DNA测序产生的1198 K / mm 2的群密度。的簇的传球滤波器的百分比为84.2%与9.2千兆估算产率。此外,7.4 GB或的82.8%读了质量评分≥30。自动化凝胶大小选择平台利用率一直导致适合产量和最小在200 bp的不必要的片段集群。

图1 <BR /> 图1.水样从城市(A)和农业(B)的影响流域收集。

图2
图2.用于从淡水样品基于转座子的DNA文库的方法的示意图。 请点击此处查看图的放大版本。

图3
图3的电泳从淡水样品中产生的DNA文库:(一 )之前大小选择和(B)的DNA文库大小PCR后DNA文库使用自动选凝胶尺寸选择平台(目标范围:500-800基点)。所有样品稀释5倍的TE缓冲液。

<TD> 0.04(0.04)
环境样品 细菌的DNA浓度
(纳克/毫升)*
一个260/280 一个260/230 大小选择前DNA浓度(ng /μL),体积:25微升 DNA浓度(ng /微升)的大小选择后,音量:25微升
1 0.11(0.16) 1.8 1.4 27 1.2
2 0.11(0.20) 1.8 1.3 27.4 3.3
3 0.10(0.37) 1.8 1.6 19.5 3.4
4 1.5 0.5 24.4 1.6
0.11(0.13) 1.7 1.0 26.1 1.1
6 0.05(0.03) 1.5 0.7 15.2 0.4
7 0.01(0.01) 1.4 0.3 15.1 0.3
8 0.03(0.05) 1.6 0.7 17 0.9
*数值表示的双链DNA浓度使用高灵敏度荧光核酸定量测定。括号中的数字代表使用微量分光光度计浓度。

表1质量和DNA免受环境淡水样品中提取的数量的评估,以及之前和之后基于转座子的库自动凝胶尺寸选择。

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Discussion

适配器二聚体和小尺寸插入优先被测序在现有平台的集群的存在代表了可用率和利用不足的设备的能力15的下降。使用珠击方法结合座子为基础的方法来制备文库可以导致更多的DNA剪切相比萃取4,5的其他方法。然而,提取和文库制备的所有方法可能引入偏倚测序的分布读取8,16。使用自动核酸提取平台,结合一个连接基法的实验观察,似乎没有去除过量的从鸟枪文库适配器二聚体(数据未显示)。本研究采用修改后的协议非常具体的范围内,通过准备大小选择的DNA片段,从环境样品库,从而最大限度地减少适配器二聚体或小的结转的DNA片段。 500-800碱基( 图3)在特定的范围内使用的自动凝胶大小选择平台产生的DNA文库可再现痕迹。而生更大数目读取(〜150万),进行比较,以其他清理( 2倍于0.5×比率)和改性协议这里描述的,只有55%的用标准治疗(顺磁珠在0.5倍的比例)中得到这些读取每个样品均大于225基点。使用修改协议生成至少75%的读出大于225碱基对每个样品的百分比的读取。在标准处理中,大量的读取指示在库过短表示读取。与顺磁性珠(标准治疗)中选出的片段大小已报道为变量相比,凝胶尺寸选择接近17。这个修改​​后的协议生成比顺磁珠更多的信息读取。使用凝胶选择建立图书馆有LSO表示在嵌合体的发病率的降低,从约5%至0.02%,9。

本议定书的关键步骤包括考虑输入DNA的PCR扩增预混,在DNA库量和化学正常化。取决于起始输入DNA浓度上,这可能是耗时的测量和稀释该DNA下降到通过这里,并由此加快可自动化珠为基础的方法用于标准化输入DNA也转座子为基础的方法需要为1ng量在初始样品制备18被考虑。以下tagmentation索引和掺入样品直接尺寸使用在这项研究中所描述的电泳工作站选中。在此过程中的一个关键步骤是的DNA加载到系统的量。最小样品DNA浓度为光学检测取决于样品的性质(扩增子与鸟枪法测序)。内在的回收率已经示出保持了低的输入样本和回收效率> 75%。可以通过这里所描述的自动凝胶大小选择系统检测到的最低DNA量为1.5纳克的总DNA(内斯比特,M.和Slodoban,J.,2014年,未发表的数据)。然而,不要求样品的光的检测,进行大小选择,如双染料标记用于确定在何处大小选择一个特定的目标。之前从环境样品制备文库装载到平台上,DNA的浓度是使用荧光计定量。 PCR后的样品( 见表1)中检测到一个比较窄的范围内的DNA的浓度。虽然这些样品含有盐,二聚体,DNA聚合酶的混合物,扩增环境的DNA,和未公开的试剂19,这些浓度表示的至少252倍不是DNA的报告最低量检测的电泳工作站更高。通常情况下,DNA破片的尺寸选择ments将在缓冲溶液中,而不是在PCR主混合物中进行。即使在这个协议中使用的有关信息的PCR主混合物是从制造商未公开的,初步试验以跟踪在混合双染料标记物的迁移(数据未显示)。在PCR主混合物的高离子强度缓冲液将改变样品的电泳迁移率,并且因此该变量需要被容纳于。在这项研究中所描述的自动凝胶选择平台暴露了一个选项,以指示是否一个样品是在高离子强度。当使用此选项,然后改变电泳迁移率曲线和延迟波段跟踪参数使用。因此,可能的是,PCR混合物的化学性质将具有在装载缓冲液和标记物产生影响,并影响DNA片段的迁移的凝胶。

有市售的自动化或半自动化凝胶大小选择几个系统。这些仪器还提供分离,回收,和文件在不到1小时。不过,也有局限性,当涉及到的样品,这些系统可以处理,并与耗材17,20的相关费用数目。在这种情况下,这里所描述的技术可以处理的琼脂糖凝胶大小选择和分析的各个方面。多达96个样品可以是大小在单次运行中选择,而高达192样品可被表征高分辨率电泳。此外,该仪器还可以完成一般的液体处理任务的用户期望从自动化工作站。

这个协议的原始洗脱体积为100〜400微升的范围内,根据不同的目标范围内(25基点至40 KB)。在仪器的该方面可被视为一种限制,但必须注意的是,用含300微升体积的DNA文库将具有301 PM的平均浓度(数据未显示)。这个结果值repre货物内有26倍以上的测序在MiSeq平台所要求的最终浓度(〜下午11时05分)较高。在本研究中,乙醇沉淀为代表的在库中制备采用时间上的附加步骤。目前,该洗脱体积可进一步通过使用一个使用商用过滤板并适合于甲板(升级)的真空歧管的上甲板真空过滤步骤减少。使用这种设置,原始洗脱体积转移到过滤板,浓缩,然后在25微升(Slodoban,J。,2014年,个人通讯)重悬。在这项研究中,DNA的沉淀物进行,以保持与作为转座子为基础的试剂盒中所述所需的归一化样步骤中的输入体积相一致的工作流程。

这种改进的方法可以适用于从其他环境样品如海水,废水处理厂,沉积物,土壤或微生物席制备DNA或cDNA文库。汽车这里报告配合的凝胶尺寸的选择平台可以以最小的修改不仅Illumina的测序平台,也给其他下一代测序平台,包括罗氏454,Life Technologies公司,和太平洋生物科学应用。特别要考虑到其他平台,包括装载阱容量(高达51微升),上浆引用或标记,以及琼脂糖凝胶卡带百分比(依赖于目标分数)适应这种技术。这种高通量全自动凝胶尺寸选择技术是净化的歧视形式是足够的低成本电泳表征。其他可从该技术获益的应用包括RNA测序项目,长片段测序(包括功能宏基因组学),基因合成,伴侣配对文库构建, 从头和复杂的基因组测序,限制性消化分析,和基因分型。

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Disclosures

贾里德R.斯洛博丹·马太J.内斯比特均持有沿海基因组学,是一家私人拥有的不列颠哥伦比亚省公司提供游侠科技股。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series Thermo Scientific  1400-1620
0.2 µm Supor Membrane VWR CA28143-969 Pall Corporation, Ann Harbor, MI
Tungsten carbide beads 3 mm (200) Qiagen 69997
Isopropyl alcohol 70% Jedmon Products 825751 Healthcare Plus
DNA away VWR 7010 Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA
Milli-Q water purification system Fisher Scientific ZMQS6VF0Y Merck Millipore. This system has been discontinued.
20x PBS pH 7.5 VWR E703-1L Amresco, Inc., Solon, OH
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100 Fisher chemicals
Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes VWR 13000-V1-50 MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) VWR SI-0236 Scientific Industries, Inc.
Beckman Centrifuge Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd Model J-6B
PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit VWR 12855-100 MoBio, Carlsbad, CA
Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes VWR 13000-V1-24 MoBio, Carlsbad, CA
Microfuge 18 centrifuge Beckman Coulter 367160
Nimbus Select workstation with Ranger Technology Hamilton Robotics 92720-01 Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware)
Ranger reagent kit Coastal Genomics CG-10600-150-12-21 Includes loading buffer and cassettes
Ethyl alcohol (anhydrous) Commercial Alcohols P016EAAN Greenfield Ethanol
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889-250G
Linear acrylamide (5 mg/ml) Life Technologies AM9520 Ambion
Eppendorf refrigerated centrifuge Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. 5417R
Buffer EB (250 ml) Qiagen 19086
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific ND-1000
Qubit fluorometer Life Technologies Q32857 Invitrogen. This product has been discontinued.
Qubit dsDNA HS assay kit Life Technologies Q32854 Invitrogen
High sensitivity DNA reagent Agilent Technologies 5067-4626
High sensitivity DNA chips Agilent Technologies 5067-4626
Agilent 2011 Bioanalyzer Agilent Technologies G2938B
Nextera XT DNA sample preparation kit Illumina FC-131-1024
Nextera XT index kit Illumina FC-131-1001
MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) Illumina MS-102-2003
Miseq system Illumina SY-410-1003

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References

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