मल्टी पैरामीटर प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई द्वारा मानव लिम्फेटिक endothelial कोशिकाओं का अलगाव

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Summary

इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग मानव लसीका कुरूपता पुटी-तरह के जहाजों और foreskins अस्तर लसीका endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए है। इसके बाद सेल संवर्धन और इन कोशिकाओं के विस्तार, आनुवंशिक प्रोटिओमिक, कार्यात्मक और सेल भेदभाव के अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक मिलावट के एक नए स्तर परमिट।

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Lokmic, Z., Ng, E. S., Burton, M., Stanley, E. G., Penington, A. J., Elefanty, A. G. Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (99), e52691, doi:10.3791/52691 (2015).

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Abstract

ऐसे प्राथमिक lymphedema, लसीका विकृतियों और लसीका ट्यूमर के रूप में लसीका प्रणाली विकारों महत्वपूर्ण रुग्णता का कारण है, लेकिन थोड़ा उनके जीव विज्ञान के बारे में जाना जाता है कि दुर्लभ स्थितियों रहे हैं। रोगग्रस्त और स्वस्थ ऊतकों से अत्यधिक शुद्ध मानव लसीका endothelial कोशिकाओं (LECs) अलग, आनुवंशिक आणविक और सेलुलर स्तर पर लसीका अन्तःचूचुक के अध्ययन की सुविधा होगी। यह इन जांच के लिए इन शर्तों के नैदानिक ​​प्रबंधन परिवर्तित हो सकता है कि नए उपचार के लिए लक्ष्य प्रकट हो सकता है कि अनुमान है। LECs और लसीका कुरूपता लसीका endothelial कोशिकाओं (एल एम LECs) चमड़ी मानव के अलगाव का वर्णन एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। प्राप्त करने के लिए एक एकल कक्ष निलंबन ऊतक कीमा और enzymatically dispase द्वितीय और collagenase द्वितीय का उपयोग कर इलाज किया गया था। जिसके परिणामस्वरूप एकल कक्ष निलंबन फिर भेदभाव (सीडी) मार्कर CD34, CD31, संवहनी endothelial वृद्धि कारक-3 (VEGFR-3) और PODOPLANIN के क्लस्टर के लिए एंटीबॉडी के साथ चिह्नित किया गया। Staiनेड व्यवहार्य कोशिकाओं अन्य endothelial और गैर endothelial कोशिकाओं से CD34 कम CD31 स्थिति VEGFR -3 स्थिति PODOPLANIN स्थिति एलएम LEC आबादी को अलग करने के लिए एक fluorescently सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) पर हल किया गया। छाँटे गए एलएम LECs सुसंस्कृत थे और आगे प्रयोगात्मक उपयोग के लिए फ़ाइब्रोनेक्टिन-लेपित बोतल पर विस्तार किया।

Introduction

लसीका नाड़ी तंत्र का एक प्रमुख समारोह लसीका, लिपिड, प्रोटीन और सेलुलर घटकों से युक्त एक अतिरिक्त मध्य द्रव को अवशोषित, और रक्त शिराओं व्यवस्था करने के लिए यह आचरण है। लसीका केशिकाओं का एक नेटवर्क है यह विदेशी एंटीजन, प्रतिरक्षा निगरानी और विदेशी एंटीजन को बेअसर करने के लिए सफेद रक्त कोशिकाओं की तैनाती में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया की उपस्थिति के लिए जांच की है, जहां लिम्फ नोड्स के लिए लिम्फ निर्देशन।

ऊनि दिशात्मक लसीका प्रणाली प्रारंभिक लसीका केशिका, लिम्फ प्रविष्टि 1,2 की अनुमति है कि विशेष सेल जंक्शनों के साथ पतली दीवारों फ्लैट endothelial कोशिकाओं की एक असंतत एक परत के साथ एक अद्वितीय संरचना के साथ ऊतकों में शुरू होता है। ये केशिकाओं वृद्धि हुई मध्य दबाव 3 की उपस्थिति में पोत पतन को रोकने के लिए filaments के प्रस्तोता के माध्यम से पड़ोसी संयोजी ऊतक मैट्रिक्स से जुड़े होते हैं। लसीका केशिकाओं संग्रह में खाली प्रारंभिक लसीका केशिकाओंकि बड़ा लसीका वाहिकाओं या नसों में संगठित होना। इसकी तुलना में लसीका वाहिकाओं मोटा वाहिनियों की दीवारों, बनती लसीका वाल्व है और कुछ चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं 4 एम्बेडेड रहे हैं, जिसमें एक असंतत तहखाने झिल्ली से encased हैं इकट्ठा करने, लसीका केशिका वाहिकाओं प्रारंभिक। चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के समन्वित खोलने और लसीका वाल्व को बंद करने और संकुचन लिम्फ 3 के प्रवाह की सुविधा। वक्ष वाहिनी और सही लसीका वाहिनी: मनुष्यों में, शरीर के विभिन्न क्षेत्रों से लसीका नसों दो लसीका नलिकाओं के लिए फार्म का विलय जो लसीका चड्डी फार्म करने के लिए शामिल हो। वक्ष वाहिनी छाती के नीचे शरीर के बाईं ओर से और दाईं ओर से लसीका नालियों जबकि सिर, गर्दन और छाती के दाहिने हाथ और दाईं ओर से सही लसीका वाहिनी नालियों लिम्फ। दोनों नलिकाओं गर्दन 5 में अवजत्रुकी नसों में लिम्फ आचरण।

लसीका प्रणाली के विकार को मोटे तौर पर हासिल कर ली एक में बांटा जाता हैएन डी जन्मजात (1 टेबल)। का अधिग्रहण शर्तों के उदाहरण लसिकावाहिनीशोथ और माध्यमिक lymphedema हैं। लसिकावाहिनीशोथ कारण बैक्टीरिया के संक्रमण के लिए एक लसीका पोत की सूजन है। प्रभावित lymphatics चौड़ा करना और पीब युक्त polymorphonuclear कोशिकाओं के साथ भरें। त्वचा में, इन lymphatics अक्सर जुड़े draining लिम्फ नोड (लिम्फाडेनिटिस) 6 की वृद्धि के साथ लाल, दर्दनाक चमड़े के नीचे धारियाँ के रूप में दिखाई दे रहे हैं। माध्यमिक lymphedema लसीका पोत या लिम्फ नोड रुकावट के लिए क्षति या रुकावट का एक परिणाम के रूप में उठता है। इस वजह से क्षति या रुकावट के लिए लिम्फ डिस्टल के संचय के लिए पुरानी प्रगतिशील सूजन हो जाती है। विकसित देशों में, माध्यमिक lymphedema सबसे सामान्यतः metastasizing ट्यूमर लसीका वाहिकाओं या क्षेत्रीय लिम्फ नोड्स में बाधा डालती है, या एंटी-कैंसर के उपचार का एक परिणाम के रूप में लिम्फ नोड्स, के बाद विकिरण फाइब्रोसिस और पोस्ट भड़काऊ throm के सर्जिकल हटाने के बाद जहां दुष्टता के साथ जुड़ा हुआ हैbosis और scarring 7। दुनिया के अन्य भागों में, माध्यमिक lymphedema ऐसे Wuchereria bancrofti के रूप में 6 परजीवी कीड़े की वजह से लसीका रुकावट के लिए माध्यमिक हो सकता है।

लिम्फेटिक नाड़ी तंत्र के विकार
प्राप्त जन्मजात
लिम्फाडेनिटिस
माध्यमिक lymphedema
प्राथमिक lymphedema 10 छिटपुट लिम्फेटिक विकृतियां 13 सिंड्रोम 13 के साथ लसीका विकृतियों एसोसिएटेड
जैसे
Milroy सिंड्रोम
Meige सिंड्रोम
सरल:
लिम्फेटिक विकृतियां
जैसे
Klippel-Tranaunay सिंड्रोम
पार्क वेबर सिंड्रोम
Sturge-वेबर सिंड्रोम
संयुक्त:
केशिका-लसीका विकृतियों
केशिका-लसीका-शिरापरक कुरूपता
केशिका-लसीका-धमनी कुरूपता
केशिका-लसीका शिरापरक-धमनी कुरूपता

लसीका नाड़ी तंत्र के विकारों की तालिका 1. अवलोकन।

लसीका प्रणाली के जन्मजात विकारों आनुवंशिक परिवर्तन, lymphangiectasia और लसीका प्रणाली 8,9 की विसंगतियों की वजह से होने लगा प्राथमिक (इडियोपैथिक) lymphedema शामिल हैं। प्राथमिक lymphedema संभवतः डी नोवो म्यूटेशन के कारण, या विरासत में मिला छिटपुट हो सकता है। लिम्फेटिक विकार भी अलग हो सकता है या एक अधिक सामान्यीकृत सिंड्रोम 10 के भाग के शामिल कर सकते हैं। लसीका के बाल चिकित्सा आबादी में 97%शोफ क्षेत्रीय लिम्फ जल निकासी 11 क्षीण कि लसीका वाहिका संरचना में असामान्यताओं के साथ छिटपुट है। Milroy बीमारी जन्म के समय स्पष्ट या बाद जल्द ही 12 VEGFR-3 जीन में उत्परिवर्तन के कारण प्राथमिक lymphedema का एक उदाहरण है। ज्यादातर पारिवारिक हालत हालांकि, Milroy रोग भी Milroy बीमारी 32 के परिवार के इतिहास के बिना शिशुओं में पहचाना जा सकता है। किसी भी lymphedema की गंभीरता लिम्फ उत्पादन और शिरापरक संचलन से 6 लिम्फ वापस करने के लिए परिवहन की क्षमता की मात्रा पर निर्भर है।

नैदानिक ​​प्रस्तुति पर और सीटू endothelial सेल प्रसार में आधार पर, लसीका प्रणाली की विसंगतियों लसीका ट्यूमर या लसीका विकृतियों 13 के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं। Kaposiform lymphangiomatosis एक LEC ट्यूमर 14 का एक उदाहरण है। लिम्फेटिक विकृतियां भ्रूण के विकास के दौरान पैदा होती है और बच्चे 15,16 के अनुपात में विकसित करने के लिए लगा रहे हैं। वे शायद ही कभी निकासी लेकिन remai कर सकते हैंएन स्पर्शोन्मुख आघात या संक्रमण नैदानिक ​​जटिलताओं के लिए अग्रणी तेजी से विकास precipitates तक। ऊपर वर्णित शिरापरक संचलन के लिए ऊतक से लसीका नेटवर्क और लसीका के चालन के अर्दली संरचना लसीका तरल पदार्थ से भरा असामान्य सिस्टिक संरचनाओं के स्थानीय संग्रह से मिलकर बनता है जो लसीका विकृतियों में आनाकानी कर रहा है। इन सिस्टिक जहाजों वे कार्यात्मक लसीका वाल्व होते हैं कि लसीका परिसंचरण से जुड़ा है या कर रहे हैं कि कोई नैदानिक ​​या प्रयोगात्मक सबूत नहीं है, वहीं उनके लसीका पहचान ऐसे PODOPLANIN, CD31, लसीका पोत अंतर्कलीय रिसेप्टर 1 के रूप में लसीका सेल मार्कर की सीमा की अभिव्यक्ति के द्वारा की पुष्टि की है (LYVE-1), प्रोस्पेरो homeobox प्रोटीन 1 (प्रोक्स -1) और VEGFR -3 15,17,18। ये पित्ताशय संरचनाओं या तो छोटे (microcystic) या बड़े (macrocystic) हो सकता है, लेकिन सबसे लसीका विकृतियों microcystic और macrocystic घटकों (चित्रा 1) 16 दोनों होते हैं। सर्जरी के बाद, injectioएन sclerotherapy और / या रेडियोफ्रीक्वेंसी लसीका विकृतियों अक्सर reoccur पृथक।

चित्र 1
मानव लसीका वाहिकाओं और लसीका विकृतियों के चित्रा 1. आकृति विज्ञान है। सामान्य मानव लसीका (ए) और PODOPLANIN करने के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल लसीका कुरूपता वाहिकाओं (बी और सी) (भूरे रंग का लेबल, तीर)। मानव लसीका कुरूपता जहाजों के रूप में चिह्नित फैलाव और लुमेन आकार में काफी भिन्नता की विशेषता है। ये सभी स्थानीयकृत असामान्य सिस्टिक संरचनाओं छोटे (microcystic, *) (बी) या बड़े (macrocystic, #) (सी) या तो किया जा सकता है। अधिकांश लसीका विकृतियों दोनों microcystic और macrocystic घटक होते हैं। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। </ P>

कुछ जांचकर्ताओं लसीका विकृतियों LECs असामान्य वृद्धि संभावित नहीं है, लेकिन बजाय सामान्य परिसंचरण 19 से कनेक्ट करने में विफल रहा है, जिसमें लसीका वाहिका संरचना के विकास संबंधी विकार का प्रतिनिधित्व करते हैं कि सुझाव दिया है। हालांकि, हम एल एम LECs तेजी पैदा करना और LECs 15 एलएम LECs में एक प्राथमिक दोष यह है कि वहाँ का सुझाव दे चमड़ी की तुलना में एपोप्टोसिस के लिए प्रतिरोधी हो पाया है। एलएम LECs एक माउस xenograft मॉडल में प्रत्यारोपित किया जाता है, वे लसीका विकृतियों 15 की याद ताजा संरचनाओं के रूप में। इस लसीका विकृतियों भ्रूण के विकास के दौरान एल एम LECs में उत्पन्न होने वाली एक या अधिक दैहिक म्यूटेशन के कारण हो सकता है कि एक परिकल्पना का समर्थन करता है। दरअसल, हाल ही में रिपोर्ट Phosphoinositide-3-kinase (PIK3CA) जीन 20 की p110α उत्प्रेरक सबयूनिट में ऐसे ही एक उत्परिवर्तन की पहचान की है।

डीएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकी, प्रासंगिक म्यूटेशन ग के क्षेत्र में प्रगति को देखते हुएould और अधिक आसानी से इन शर्तों के भविष्य के अध्ययन मार्गदर्शक, पृथक एलएम LECs में पहचाना जा। व्यवहार्य LECs के अलगाव कम पोषक तत्वों की उपलब्धता या समर्थक apoptotic एजेंट 15 के जवाब में इस तरह के प्रवास, प्रसार, ट्यूब बनाने की क्षमता और अस्तित्व के रूप में assays में असामान्य और सामान्य LECs के बीच तुलना की सुविधा होगी। पृथक LECs आगे नए LEC के उप-जनसंख्या चित्रित करने के लिए, सेल विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति और प्रोटिओमिक अध्ययन प्रदर्शन करने के लिए सक्षम और लसीका विकृतियों के नैदानिक ​​प्रबंधन के लिए उपयुक्त उपन्यास औषधीय एजेंटों की खोज करेंगे।

हम पहले नवजात चमड़ी और लसीका विकृतियों 15 से LECs के चुंबकीय मनका जुदाई के आधार पर एक LEC अलगाव विधि प्रकाशित किया है। हम CD31 के लिए सकारात्मक चयन करने के लिए CD34 Neg सेल अंश को subjecting द्वारा पीछा CD34 अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति पर आधारित संवहनी endothelial कोशिकाओं से सामान्य और रोगग्रस्त LECs को अलग करने की एक रणनीति की सूचना दी।हालांकि, इस पद्धति अवशिष्ट गैर endothelial कोशिकाओं की उपस्थिति के द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया था। यह बाद में संयोजी ऊतक पाचन के लिए पहले एपिडर्मिस को हटाने के स्वतंत्र था। इन contaminants आम तौर पर और अधिक तेजी से proliferated है और इस प्रकार अंत में LEC के अलगाव को दोहराने के लिए बाद के प्रयासों के बावजूद endothelial सेल संस्कृतियों overgrew। दरअसल, 5% से 2% तक कम गैर endothelial कोशिकाओं की एक शुरुआती संदूषण LEC आबादी 15 डूब करने के लिए पर्याप्त था। इस LEC सेल उपज और शुद्धता में सुधार करने के लिए एक विकल्प के रूप में fluorescently सक्रिय सेल छँटाई विधि का पता लगाने के लिए हमें प्रेरित किया। इसके अलावा, हम CD34 कम CD31 स्थिति VEGFR -3 स्थिति PODOPLANIN स्थिति LECs की पहचान करने के लिए चयन मार्करों के लिए VEGFR -3 और PODOPLANIN, उनका कहना है LEC आबादी की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए छँटाई मल्टी पैरामीटर का इस्तेमाल किया।

इन मार्करों के चयन के लिए तर्क रिपोर्ट के आधार पर किया गया था कि LECs और रक्त संवहनी endothelial सीई, जबकिरक्त संवहनी endothelial कोशिकाओं 21-23 की तुलना में जब LLS ऐसे CD31 के रूप में आम में कई कोशिका की सतह मार्करों है, LECs CD34, PODOPLANIN और VEGFR -3 कोशिका की सतह मार्कर की उनकी अभिव्यक्ति में प्ररूपी भिन्नता दिखा। CD31 भी प्लेटलेट endothelial सेल आसंजन अणु 1 (PECAM-1) के रूप में जाना जाता है एक 130 केडीए ट्रांसमेम्ब्रेन ग्लाइकोप्रोटीन है। ऐसा लगता है कि रक्त और लसीका वाहिकाओं 21,24,25 के सभी प्रकार पर व्यक्त की है के बाद से एक अखिल endothelial सेल मार्कर माना जाता है। CD34 सबसे हिमेटोपोयटिक पूर्वज पर 110 केडीए ट्रांसमेम्ब्रेन ग्लाइकोप्रोटीन मौजूद है और कोशिकाओं, संवहनी endothelial कोशिकाओं और कुछ लसीका वाहिकाओं 26 स्टेम।

VEGFR -3, संवहनी endothelial वृद्धि के लिए रिसेप्टर, सी और डी कारकों माउस भ्रूण में विकसित करने नसों पर शुरू में मौजूद है, लेकिन प्रतिलेखन द्वारा विनियमित लसीका विनिर्देश निम्नलिखित (sox) -18, सी hicken sry से संबंधित एचएमजी बॉक्स कारकों valbumin यू के pstreaएम पी romoter टी ranscription अभिनेता 2 (COUPTF-द्वितीय) और प्रोक्स -1, VEGFR -3 शिरापरक अभिव्यक्ति खो दिया है और यह भ्रूण LECs 25,27 तक ही सीमित हो जाता है। PODOPLANIN, एक 38 केडीए झिल्ली mucoprotein, पहली माउस भ्रूण के विकास के लिए 28 के लगभग भ्रूण लसीका वाहिकाओं दिन 11 (~ E11.0) पर ध्यान दिया जाता है और यह दृढ़ता से माइक्रोवैस्कुलर लसीका वाहिकाओं, लसीका विकृतियों में macrocystic लसीका अन्तःचूचुक द्वारा PODOPLANIN अभिव्यक्ति द्वारा व्यक्त की गई है जबकि 15 और चर रहा है। प्रयोगों के कम से कम कुछ CD34 उच्च CD31 स्थिति endothelial कोशिकाओं लसीका मार्कर PODOPLANIN 29 व्यक्त सुझाव है कि प्रवाह cytometry। मानव लसीका विकृतियों में LYVE -1 और PODOPLANIN धुंधला की व्यवस्थित मूल्यांकन दोनों LYVE-1 प्रारंभिक लसीका में मजबूती से उपस्थित होने की सूचना मिली थी, सामान्य ऊतकों में, लसीका कुरूपता अन्तःचूचुक 30 धुंधला में प्रभावी रहे हैं पता चला है कि यद्यपिकेशिका अन्तःचूचुक लेकिन कम और एकत्रित लसीका अन्तःचूचुक 31 में भी अनुपस्थित। हमारा उद्देश्य अलग करने के लिए है के रूप में हम दोनों का विकल्प चुना है प्रारंभिक और एकत्रित लसीका endothelial कोशिकाओं हमारे सेल चयन की रणनीति के हिस्से के रूप में LYVE-1 उपयोग करने के लिए नहीं। अंत में, इन मार्करों को रोजगार के लिए निर्णय भी सूक्ष्म इमेजिंग के लिए लसीका वाहिकाओं लेबलिंग के लिए diagnostically इस्तेमाल कर रहे हैं कि एंटीबॉडी की उपलब्धता, प्रवाह cytometry और Immunofluorescent पढ़ाई के बीच संबंध की अनुमति होगी कि एक फीचर पर आधारित था।

यह लेख चमड़ी और लसीका कुरूपता से CD34 कम CD31 स्थिति VEGFR -3 स्थिति PODOPLANIN स्थिति LECs के सफल अलगाव के रूप में अच्छी तरह से CD34 उच्च CD31 स्थिति VEGFR -3 स्थिति PODOPLANIN स्थिति endothelial कोशिकाओं के लिए आवश्यक ऊतक पाचन विधि, सेल धुंधला हो जाना और FACS सेटिंग्स का वर्णन करेंगे ऊतक।

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Protocol

आचार बयान: लसीका कुरूपता और चमड़ी के ऊतकों के संग्रह के लिए नैतिक अनुमोदन रॉयल बच्चों के अस्पताल, मेलबोर्न, ऑस्ट्रेलिया में मानव अनुसंधान आचार समितियों से प्राप्त हुई थी। हस्ताक्षर किए गए सहमति सर्जरी से पहले मरीजों के माता-पिता से प्राप्त किया गया था। ऊतक के नमूने वैकल्पिक खतना के दौर से गुजर उनके नैदानिक ​​प्रबंधन के हिस्से के रूप में शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के दौर से गुजर एलएम और रोगियों के निदान के साथ रोगियों से एकत्र किए गए थे। सभी प्रयोगों राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद, ऑस्ट्रेलिया के दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया।

चमड़ी और लसीका कुरूपता ऊतकों से सेल निलंबन के 1. तैयारी

  1. बफ़र और मीडिया तैयारी।
    1. ईजीएम -2 मीडिया वार्मिंग और धीरे से 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में किट घटकों विगलन द्वारा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईजीएम -2 एमवी बुलेट किट का उपयोग कर पूरा endothelial सेल मीडिया तैयार करें। वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में, asepticallyईजीएम -2 मीडिया के लिए प्रत्येक घटक जोड़ें। एक बार सभी घटकों मीडिया में जुड़ जाते हैं, 'पूरा endothelial सेल मीडिया' के रूप में इस मीडिया को देखें। का उपयोग करने से पहले सामग्री मिश्रण करने के लिए बाँझ 50 एमएल पिपेट का प्रयोग करें।
      नोट: सेल संस्कृति से संबंधित सभी चरणों का एक वर्ग द्वितीय Biohazard कैबिनेट में प्रदर्शन कर रहे हैं। सभी समाधान 'निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है और उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर गरम कर रहे हैं। पूरा endothelial सेल मीडिया, सेल संस्कृति buffers और एंजाइम समाधान का उपयोग करने से पहले 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गरम कर रहे हैं।
    2. 50 एनजी / एमएल वीईजीएफ़-सी के साथ पूरा endothelial सेल मीडिया अनुपूरक। उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब और दुकान में पूरक endothelial सेल मीडिया विभाज्य। 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जब मीडिया में कम से कम 4 हफ्तों के लिए स्थिर है।
    3. 8.752 छ NaCl, 1.416 जी ना 2 HPO भंग करके कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) तैयार 4 .2H 2 हे औरपानी के 1000 मिलीलीटर में 0.395 जी के.एच. 2 पीओ 4। 7.4 पीएच को समायोजित करें। फ़िल्टर 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.22 माइक्रोन फिल्टर और दुकान का उपयोग पीबीएस बाँझ। (: 100 1 में प्रयुक्त) antimycotic / एंटीबायोटिक समाधान जोड़ने का उपयोग करने से पहले।
    4. , मानव फ़ाइब्रोनेक्टिन को तैयार बाँझ पानी के 10 एमएल में फ़ाइब्रोनेक्टिन की 1 मिलीग्राम भंग करने के लिए। स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 μl aliquots में समाधान का पुनर्गठन किया। उपयोग की दिन फ़ाइब्रोनेक्टिन विभाज्य के 100 μl बाँझ पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ने पर (10 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम काम एकाग्रता देने के लिए)।
    5. एंजाइम मीडिया के लिए, बाँझ पीबीएस में 0.04% Dispase द्वितीय, 0.25% Collagenase द्वितीय और 0.01% DNase मैं युक्त समाधान तैयार करते हैं। सबसे पहले, एक बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में dispase और collagenase, जगह तौलना पीबीएस की आवश्यक मात्रा जोड़ने और भंग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ 30 मिनट के लिए सेते हैं। एक बार जैव सुरक्षा हुड में बाँझ फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन फिल्टर) dispase / collagenase समाधान, भंग कर दिया। Aseptically 37 डिग्री सेल्सियस पर DNase आई स्टोर तक एंजाइमी समाधान जोड़नेका उपयोग करें।
      नोट: DNase मैं बाँझ lyophilized पाउडर के रूप में उपलब्ध एक वाणिज्यिक सेल संस्कृति ग्रेड अभिकर्मक है।

चमड़ी और लसीका विकृतियों से सेल निलंबन के 2. तैयारी

  1. DMEM / 2% एंटीबायोटिक antimycotic समाधान के 10 मिलीग्राम से युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब वजन। इस ट्यूब ऊतक संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  2. लसीका कुरूपता और चमड़ी के ऊतकों के सर्जिकल हटाने के बाद, aseptically सेल कल्चर प्रयोगशाला के लिए बर्फ पर ट्यूब और हस्तांतरण करने के लिए ऊतक नमूना जोड़ें।
  3. ऊतक युक्त ट्यूब वजन और ऊतक वजन की गणना। ऊतक को पचाने के लिए जरूरी एंजाइमी समाधान की मात्रा की गणना करने के लिए इस वजन का उपयोग करें।
  4. एक द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट में, एक 100 मिमी टिशू कल्चर डिश में ऊतक और मीडिया हस्तांतरण करने के लिए बाँझ संदंश का उपयोग करें। सूक्ष्मता ~ 1 मिमी 3 टुकड़ों में ऊतक कीमा बाँझ कैंची का प्रयोग करें।
  5. स्थानांतरण कीमा बनाया हुआ ऊतक मीडिया मैं के साथ मिलायाबाँझ DMEM / 2% एंटीबायोटिक antimycotic समाधान का एक अतिरिक्त 10 मिलीग्राम से युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब Nto। ऊतक फिर से निलंबित करने के लिए उलटा द्वारा मिक्स। 5 मिनट के लिए 300 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र।
  6. सतह पर तैरनेवाला निकालें। ऊतक वजन के आधार पर, पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) collagenase द्वितीय कीमा बनाया हुआ ऊतक के 100 मिलीग्राम प्रति / DNase मैं / Dispase द्वितीय पाचन समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। आम तौर पर, कीमा बनाया हुआ ऊतक के लगभग 1 ग्राम के लिए एंजाइम समाधान के 10 एमएल का उपयोग करें।
  7. लगातार 200 rpm पर झटकों के साथ 20-90 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ऊतक सेते हैं। इस अवधि के अंत में, कि लगभग सभी ऊतक के ठीक टुकड़ों में पच जाता है सुनिश्चित करते हैं।
    नोट: प्राथमिक ऊतकों को प्रभावित करती है सेल अस्तित्व से अलगाव के समय में collagenase और dispase कोशिकाओं के संपर्क में। हम तंतुमय लसीका कुरूपता नमूने पाचन के 60-90 मिनट की आवश्यकता हो सकती है, जबकि सबसे नवजात चमड़ी नमूने बेहतर, पाचन के 20-30 मिनट की आवश्यकता है कि अनुभव से पाया है। एलएम LEC उपजएस उपस्थित फाइब्रोसिस की राशि से प्रभावित हैं, और अधिक रेशेदार ऊतक के कारण संभवतः collagenase द्वितीय और dispase द्वितीय करने के लिए लंबे समय तक निवेश के हानिकारक प्रभाव को कम कोशिकाओं से बेदखल।
  8. पाचन के बाद, जैव सुरक्षा कैबिनेट ट्यूब हस्तांतरण और एक बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में रखा गया एक 70 माइक्रोन झरनी के माध्यम से पचा ऊतक समाधान गुजरती हैं। बाह्य मैट्रिक्स की ही छोटी निशान मनाया जाता है जब तक रबर सवार के साथ 3 मिलीलीटर सिरिंज पिस्टन का प्रयोग, शेष ऊतक नीचे पीस।
  9. छलनी करने के लिए और एंजाइमों को निष्क्रिय करने के लिए अटक कोशिकाओं को ठीक करने के लिए एंजाइम मध्यम dissociating की मात्रा करने के लिए endothelial सेल मध्यम बराबर की मात्रा के साथ सेल झरनी धो लें। उदाहरण के लिए, कीमा बनाया हुआ ऊतक को पचाने के लिए एंजाइम मध्यम dissociating के 2 मिलीलीटर के लिए, एंजाइम निष्क्रिय करने के लिए endothelial सेल मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  10. 5 मिनट के लिए 300 XG पर सेल समाधान अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण। आर> पीबीएस के 10 एमएल में कोशिकाओं को ई-रोक देते हैं। 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं5 मिनट के लिए, तो दो बार सेल धोने दोहराने सतह पर तैरनेवाला हटा दें। > एन्दोथेलिअल सेल के माध्यम से 20 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend। Trypan नीले रंग तो बीज का उपयोग कोशिकाओं की गणना 2 एक्स 10> 150 सेमी में 6 कोशिकाओं> 2 कुप्पी एन्दोथेलिअल सेल के माध्यम से 20 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में फ़ाइब्रोनेक्टिन के साथ पूर्व में लिपटे। Humidified हवा इनक्यूबेटर में 5% सीओ> 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति।>
    नोट: यह trypan नीले अपवर्जन द्वारा अनुमानित रूप में एकल कक्षों की 75% -90% ऊतक पाचन जीवित रहने की संभावना है। प्रारंभिक सेल गिनती सेल निलंबन के सभी एकल कोशिकाओं (यानी केरेटिनकोशिकाओं, ल्यूकोसाइट्स, मैक्रोफेज, संयोजी ऊतक कोशिकाओं और रक्त वाहिनियों की कोशिकाओं) को दर्शाता है। 5-7 दिनों में सेल गिनती, संलग्न बच गया और सेल संस्कृति के दौरान proliferated है कि कोशिकाओं को दर्शाता है। फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ टिशू कल्चर बोतल कोटिंग भी बाद में LEC और एल एम LEC के अस्तित्व को बेहतर बनाता है।
  11. रात ऊष्मायन के बाद, पी के साथ तीन washes में दूर अनबाउंड कोशिकाओं को धोनेबी एस / 1% एंटीबायोटिक antimycotic समाधान और ताजा endothelial सेल के माध्यम जोड़ें। प्रभावी ढंग से फ्लास्क में मौजूद अपार कोशिकाओं और लाल रक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए तीन washes बाहर ले। हर दूसरे दिन मीडिया बदलें। प्रकोष्ठों 5-7 दिनों के बाद ~ 80% मिला हुआ हो जाएगा।

फ्लो के लिए लिम्फेटिक Endothelial सेल सतह मार्कर के लिए कोशिकाओं 3. एंटीबॉडी धुंधला

  1. कोशिकाओं पीबीएस के साथ 80% संगम, महाप्राण मध्यम और कुल्ला कोशिकाओं तक पहुँच चुके हैं।
  2. इस तरह के 150 सेमी 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-7 मिनट के लिए 2 फ्लास्क प्रति Accutase के रूप में सेल टुकड़ी समाधान के 7 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं incubating द्वारा पक्षपाती कोशिकाओं को अलग करें।
  3. हार्वेस्ट अलग कोशिकाओं, endothelial सेल के माध्यम से 3 मात्रा जोड़कर सेल टुकड़ी समाधान निष्क्रिय है और एक नया बाँझ ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण।
  4. 5 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
  5. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और पीबीएस के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, एस हटा देंupernatant तो सेल धोने दोहराएँ। पीबीएस के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
  6. व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना। 0.4% trypan नीले रंग के 90 μl के साथ सेल निलंबन के 10 μl मिलाएं। इस निलंबन के स्थानांतरण 10 μl गिनती के लिए hemocytometer करने के लिए।
    नोट: अंतिम सेल उपज संसाधित नमूना आकार पर निर्भर करेगा। व्यवहार्य कोशिकाओं के 7 एक्स 10 5-1.2 एक्स 10 6 से 150 सेमी 2 फ्लास्क पर्वतमाला प्रति सामान्य सेल उपज।
  7. सेल धुंधला के लिए एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
    नोट: निम्न dilutions के 100 μl के एक धुंधला मात्रा में 1 एक्स 10 6 धुंधला करने के लिए titrated गया।
    1. पतला पीई संयुग्मित माउस विरोधी मानव VEGFR-3 (01:50); पीई Cy7 संयुग्मित माउस विरोधी मानव संयुग्मित CD34 (1: 200); एपीसी संयुग्मित माउस विरोधी मानव CD31 (1: 100) और एलेक्सा 488 संयुग्मित चूहा विरोधी मानव PODOPLANIN (1: 200) 100 μl ऊतक नमूना प्रति बाँझ 5% FBS के / पीबीएस समाधान की कुल मात्रा में। की तैयारी के बादएंटीबॉडी समाधान, उपयोग करें जब तक बर्फ पर रहते हैं। इसी प्रकार फाटकों प्रवाह cytometry की स्थापना की सुविधा के लिए पतला निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करते हैं।
  8. एंटीबॉडी के बंधन अविशिष्ट को कम करने के लिए, अपकेंद्रित्र कोशिकाओं 2 मिनट के लिए 300 XG पर, सतह पर तैरनेवाला तो बाँझ 5% FBS के / नमूना प्रति पीबीएस समाधान कलंकित किया जा करने के लिए 100 μl में कोशिकाओं को निलंबित हटा दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  9. 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, संयुग्मित एंटीबॉडी कॉकटेल में कोशिकाओं से निलंबित कर रहे हैं तो सतह पर तैरनेवाला हटा दें। इसके अलावा 100 μl निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी मिश्रण में कोशिकाओं (1 एक्स 10 5) के एक छोटे से विभाज्य दाग। 20 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  10. , अनबाउंड एंटीबॉडी निकालें 5 मिनट के लिए 300 XG पर एफ बी एस / पीबीएस समाधान और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं 2% के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और धोने दोहराएँ।
  11. निर्धारण नियंत्रण और एंटीबॉडी दाग ​​नमूना के लिए सेल गोली Resuspend / एमएल propidium कब 0.5 मिलीग्राम के 300 μl में हल किया जानाdide / 2% FBS के / पीबीएस समाधान। छँटाई जब तक बर्फ पर ट्यूबों रखें।

4. सेल छंटनी

  1. साधन स्थापित करने के लिए निम्नलिखित सामग्री का उपयोग करें; ऐसे में इस तरह के Accudrop फ्लोरोसेंट मोती के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट कणों, फॉस्फेट बफर खारा आधारित म्यान तरल पदार्थ और ड्रॉप देरी मोती, के रूप में संरेखण मोती।
  2. एक मल्टी पैरामीटर प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई साधन पर शुद्ध मानव LECs पृथक। साधन सेट करें और निर्माता की सिफारिशों के अनुसार पंक्ति में। इसके अलावा, मुआवजा मैट्रिक्स उत्पन्न करने के लिए प्रत्येक प्रकार के साथ एकल दाग मुआवजा नियंत्रण चलाने के लिए और इस प्रकार इस तरह के पीई Cy चैनल में पीई के रूप में fluorochromes के उत्सर्जन के माध्यम से पर्याप्त खून को खत्म करने के लिए।
    नोट: एक 100 माइक्रोन नोक प्रयोग किया जाता है और कोशिकाओं endothelial सेल माध्यम में हल कर रहे हैं यदि कोशिकाओं को हल FACS के एक उच्च अनुपात अलगाव जीवित रहते हैं।

5. सेल संस्कृति पोस्ट FACS क्रमबद्धआईएनजी

  1. 5 मिनट के लिए 300 XG पर छँटाई, अपकेंद्रित्र कोशिकाओं के बाद। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और (सेल बीज के लिए इस्तेमाल किया कुप्पी के आधार पर) मीडिया के 5-10 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend। 50,000 से कम कोशिकाओं को हल कर रहे हैं, कोशिकाओं फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित 25 सेमी 2 फ्लास्क में संवर्धित कर रहे हैं।
  2. अन्यथा संस्कृति एक 5% सीओ 2, हवा humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 75 सेमी 2 fibronectin लेपित फ्लास्क में कोशिकाओं। 2 दिनों के बाद मीडिया को बदलें।
    नोट: मीडिया परिवर्तन के बीच समय समय को बढ़ाने के लिए गैर endothelial कोशिकाओं के अस्तित्व के पक्ष में दिखाई देता है क्योंकि सेल मीडिया हर दूसरे दिन बदल रहा है। कोशिकाओं को आगे विस्तार 15 के लिए पहले विभाजित कर रहे हैं जब प्रोक्स -1, VEGFR -3, Podoplanin, CD34 और CD31: हम मार्करों के immunohistochemical का पता लगाने का उपयोग कर लसीका endothelial सेल phenotype के लिए मान्य है।

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Representative Results

प्रारंभिक ऊतक पाचन के बाद, unfractionated नमूनों की संस्कृति में 24 घंटे के बाद, अलग endothelial सेल कालोनियों एक साथ fibroblast कोशिकाओं की तरह है और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ (2A चित्रा) मनाया जा सकता है। बाद छंटाई और सेल संस्कृति में 24 घंटे के बाद, CD34 कम CD31 स्थिति VEGFR -3 स्थिति Podoplanin स्थिति कोशिकाओं देते हैं और ठेठ cobblestone आकारिकी (चित्रा 2 बी और सी) दिखा। ऊपर वर्णित FACS विधि का प्रयोग, हम CD34 उच्च CD31 स्थिति VEGFR -3 स्थिति Podoplanin स्थिति endothelial कोशिकाओं से उन्हें 99.8% शुद्धता के लिए कोशिकाओं को शुद्ध और भेद करने में सक्षम हैं। रणनीति gating और चित्रा 3 में प्रस्तुत कर रहे हैं छँटाई के प्रतिनिधि परिणाम है। यह मुद्दों चुंबकीय मनका अलगाव विधि का उपयोग करते समय अनुभवी संकल्प किया है। तिथि करने के लिए, हम एल एम LECs और LEC चमड़ी, इस मार्ग के बाद पारित होने के 13 अप करने के लिए इन कोशिकाओं passaged हैएस morphological परिवर्तन और कम कोशिका विभाजन के साथ, वार्धक्य शुरू करते हैं।

चित्र 2
चित्रा 2. चमड़ी LECs और एल एम-LEC। चौबीस घंटे enzymatic पाचन के बाद, unsorted कोशिकाओं एन्दोथेलिअल (तीर) और गैर-endothelial कोशिकाओं (ए) दोनों होते हैं। CD34 कम CD31 स्थिति VEGFR -3 स्थिति Podoplanin स्थिति FACS सेल अलगाव के बाद, LECs (बी) और एल एम-LECs (सी) चमड़ी गैर endothelial कोशिकाओं से रहित हैं और cobblestone आकारिकी बनाए रखें। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र तीन
सेल नाड़ी की छँटाई और लसीका endothelial सेल के लिए gating रणनीतियों छँटाई चित्रा 3. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेलएस। (ए) जीवित कोशिकाओं पहले क्रमशः VEGFR -3 और PODOPLANIN gating के लिए क्रमबद्ध संवहनी (बी) और लसीका एन्दोथेलिअल (सी) कोशिकाओं द्वारा, CD34 और CD31 अभिव्यक्ति पर gated पालन कर रहे हैं। > 98% संवहनी endothelial सेल phenotype के अनुसार क्रमबद्ध CD34 उच्च CD31 स्थिति VEGFR -3 स्थिति PODOPLANIN स्थिति कोशिकाओं से पता चलता (डी) फिर से विश्लेषण। CD34 कम CD31 स्थिति VEGFR -3 स्थिति PODOPLANIN स्थिति फेनोटाइप के हिसाब से (ई) LEC कोशिकाओं को भी> 98% शुद्ध कर रहे हैं। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

LECs द्रव समस्थिति, विदेशी एंटीजन और अवशोषण और कुछ पोषक तत्वों के परिवहन के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। LEC समस्थिति ऐसे जीवाणु संक्रमण और ट्यूमर मेटास्टेसिस के रूप में रोग प्रक्रियाओं से प्रभावित किया जा सकता है, लेकिन LECs भी प्रभावित रोगियों के लिए बेकार लसीका वाहिकाओं के गठन और महत्वपूर्ण रुग्णता में परिणाम है कि दैहिक म्यूटेशन विकसित कर सकते हैं। इन विवो आरोपण और पूर्व vivo प्रयोगों के माध्यम से लसीका कुरूपता एटियलजि की अधिक समझ हासिल है, और नए उपचार के विकल्प की खोज करने के लिए, हम पहली बार CD34 Neg CD31 के स्थान चयन की रणनीति 15 का उपयोग कर चुंबकीय मनका चयन रणनीति के आधार पर एक LEC अलगाव विधि विकसित की है। हालांकि, जिसके परिणामस्वरूप संस्कृतियों अक्सर दूर करने के लिए मुश्किल थे कि endothelial कोशिकाओं की तुलना में अन्य कोशिकाओं निहित। इसके बाद, विधि CD34 कम CD31 स्थिति VEGR3 पी व्यक्त कि LECs सॉर्ट करने के लिए FACS का उपयोग करके परिष्कृत किया गयाओएस PODOPLANIN स्थिति फेनोटाइप। इस दृष्टिकोण के बाद छँटाई चेक पर <गैर CD34 कम CD31 स्थिति VEGR3 स्थिति PODOPLANIN स्थिति कोशिकाओं के 0.5% से युक्त अपेक्षाकृत समरूप LEC संस्कृतियों में हुई। व्यावहारिक दृष्टि से, FACS द्वारा कोशिकाओं छँटाई का लाभ <0.5% करने के लिए गैर LECs उपस्थिति की है कि कमी है। संवर्धित LECs और एल एम LECs एक ठेठ cobblestone आकारिकी है और पारित होने के 13 के आसपास वृद्ध होनेवाला हो जाते हैं।

इस अध्ययन में हम कोशिका की सतह मार्करों के एक कमरे (CD34 कम CD31 स्थिति VEGR3 स्थिति PODOPLANIN पीओएस) की उनकी अभिव्यक्ति के आधार पर सामान्य और असामान्य ऊतकों से अलगाव और अत्यधिक समृद्ध LECs की संस्कृति के लिए एक फ्लो आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन किया है। कोशिकाओं में इन विट्रो विस्तार के 5-7 दिन, अलगाव के समय में ऊतकों में उनकी आवृत्ति की तुलना में LEC की पर्याप्त संवर्धन के परिणामस्वरूप एक कदम के बाद प्राथमिक ऊतकों से हल किया गया। के दौरानurgery हम कई माइक्रोग्राम से वजन में ग्राम के दसियों को लेकर ऊतकों प्राप्त करते हैं। इस ऊतक मौजूद लसीका कुरूपता वाहिकाओं, ऊतक scarring और लसीका कुरूपता पुटी थ्रोम्बी की उपस्थिति की मात्रा के संबंध में इसकी संरचना में काफी भिन्न हो सकते हैं। इन सभी घटकों रोगग्रस्त ऊतकों से अलग किया जा सकता है कि कितने कोशिकाओं को प्रभावित करती है। इसलिए शुरू करने सेल नंबर कई लाख कोशिकाओं के लिए कुछ हजार कोशिकाओं से लेकर कर सकते हैं। इसी तरह, इस सेल निलंबन की संरचना को प्रभावित करती है और हल कोशिकाओं की संख्या भी एक नमूना से दूसरे करने के लिए अलग होगा जिसका अर्थ है कि सेल नंबर शुरू कर देंगे।

एलएम LECs 0.8% से 12.43% तक होती है जबकि संस्कृति में 5-7 दिनों के बाद unsorted चमड़ी नमूनों में LECs की आवृत्ति, 0.52% से 4.7% के बीच है। LEC संस्कृतियों शामिल> 99% CD34 कम CD31 स्थिति VEGR3 स्थिति PODOPLANIN स्थिति कोशिकाओं को फिर से विश्लेषण छँटाई-पोस्ट और बनाए रखा एक ठेठ cobbleston के बादगैर एन्दोथेलिअल तत्वों द्वारा अतिवृद्धि के बिना पारित होने पर वार्धक्य ~ 13 तक संस्कृति में ई आकृति विज्ञान।

यह प्रारंभिक ऊतक पाचन के बाद और चमड़ी या लसीका कुरूपता कोशिकाओं या तो की उपज आम तौर पर कम है क्योंकि छँटाई कोशिकाओं पूर्व vivo विस्तार करने के लिए आवश्यक है। इस प्रकार, लसीका endothelial कोशिकाओं की पूर्व विस्तार मैं n इन विट्रो एक माउस चैम्बर बीज के लिए की जरूरत ~ 2x10 6 कोशिकाओं की पीढ़ी की अनुमति देता है। यह 5-7 दिनों की एक में इन विट्रो विस्तार मंच की आवश्यकता है। हम सेल संस्कृति प्राथमिक कोशिकाओं में प्ररूपी परिवर्तन उत्पन्न हो सकता है कि को स्वीकार करते हैं, हम इन संवर्धित कोशिकाओं एक माउस xenograft मॉडल 15 में लसीका कुरूपता संरचनाओं की तरह फार्म करने के लिए अपनी क्षमता को बनाए रखने के दिखाया है।

FACS द्वारा कोशिकाओं छँटाई जब सफलता की डिग्री का निर्धारण कि प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सबसे महत्वपूर्ण कदम collagenase कोशिकाओं के संपर्क में आने का समय हैकदम 2.7 में वर्णित के रूप में और प्राथमिक ऊतकों से अलगाव के दौरान dispase। यह केवल राशि और वर्तमान लेकिन यह भी इस्तेमाल किया एंजाइमों के बैच से ऊतक के प्रकार से प्रभावित नहीं है। इसके अलावा, सेल आबादी विशेषताएँ इस्तेमाल fluorescently लेबल एंटीबॉडी titrated और बेहतर मोनोक्लोनल करने की आवश्यकता है। हम ऐसे / trypsin EDTA, EDTA, TrypLE का चयन करें और सेल टुकड़ी समाधान के रूप में कई अलग अलग सेल टुकड़ी समाधान का परीक्षण किया। हम EDTA के अक्सर बनी कोशिकाओं और अवशिष्ट सेल clumps अलग करने के लिए समय की एक लम्बी अवधि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता था कि पाया। इसके विपरीत, एकल कक्ष निलंबन trypsin / EDTA, सेल टुकड़ी समाधान और TrypLE का चयन ऊष्मायन के 3-5 मिनट के भीतर उत्पन्न किया गया। हम एंजाइम समाधान से किसी के साथ इलाज के बाद CD31, CD34, Podoplanin और VEGFR -3 की अभिव्यक्ति में कोई खास अंतर नहीं पाया। एकल दाग नमूने भी ओवरलैप नहीं है कि fluorochrome के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा सुनिश्चित करने के लिए हर छँटाई प्रयोग के साथ किया जाना चाहिए औरइसलिए गलत रीडिंग दे। ये महत्वपूर्ण कदम भी सेल प्रोटोकॉल के लिए संशोधन छँटाई प्रवाह cytometry के दौरान आवश्यक या समस्या निवारण किया जा सकता है, जहां चरणों का गठन करते हैं।

LECs 15 के हमारे पहले प्रकाशित चुंबकीय मनका अलगाव की तुलना में, FACS द्वारा अलग-थलग LECs का लाभ निम्नलिखित शामिल हैं: एक विषम नमूना भीतर उच्च शुद्धता और असतत सेल सबसेट और दुर्लभ आबादी की पहचान के साथ कोशिकाओं के और अधिक तेजी से अलगाव। FACS आधारित LEC और एल एम LEC के अलगाव का प्रमुख सीमाओं के आसपास सेल छँटाई परिणामों के बाद सत्यापन के लिए उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या सीमित घूमती है। हर प्रयास हमारे assays और उपकरण सेट-अप मानकीकृत करने के लिए किया जाता है, जबकि इसके अलावा, ये वही मापदंडों जरूरी अन्य प्रयोगशालाओं में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं हो सकता। इसलिए, परिणाम में कुछ परिवर्तनशीलता हो सकती है। इसके अलावा, लसीका जीव विज्ञानियों का सामना करना है कि मुद्दों में से एक सेल विशिष्ट मार्करों का अभाव हैकि प्रारंभिक केशिका LEC मार्करों और केशिका LEC मार्करों इकट्ठा करने के बीच अंतर होता है। इस स्तर पर, हम अभी तक स्वस्थ LECs और एल एम LECs के बीच अंतर होता है कि LEC मार्कर की पहचान नहीं की है। लसीका कुरूपता ऊतक भी शामिल है के बाद से लसीका वाहिकाओं (चित्रा 1 ए) सामान्य लग रही है, जिसके परिणामस्वरूप CD34 कम CD31 स्थिति VEGR3 स्थिति PODOPLANIN स्थिति एक सामान्य LECs के अनुपात के रूप में अच्छी तरह से रोगग्रस्त phenotype के उन शामिल होंगे। भविष्य के अध्ययन की जांच LEC और एल एम LEC जीन अभिव्यक्ति और प्रोटिओमिक्स एक ही ऊतक में LECs से एलएम LECs भेद सकता है कि और अधिक विशिष्ट एलएम LEC मार्कर की दिशा में हमें सीधा करने में सक्षम हो सकता है।

भविष्य में, हम दोनों चमड़ी और लसीका विकृतियों में LEC आबादी के दुर्लभ कैंपेन्स की पहचान करने के प्रयास में FACS के और इन नए LEC मार्कर का उपयोग करने की उम्मीद है। यह हमें इन सेल आबादी को अलग करने और lymp के विकास में अपनी भूमिका का अध्ययन करने की अनुमति होगीhatic नाड़ी तंत्र और लसीका विकृतियों।

CD34 कम CD31 स्थिति VEGR3 स्थिति PODOPLANIN स्थिति के आधार पर अलग LECs और एल एम LECs काफी गैर endothelial सेल संदूषण कम कर दिया। इसके अलावा, FACS प्रौद्योगिकी हमें CD31, PODOPLANIN और VEGFR -3 कोशिका की सतह मार्करों की अभिव्यक्ति के आधार पर उपप्रकारों में LECs अलग करने के लिए और सेल वंश विकास के संदर्भ में इस बात को समझ अनुमति देता है। रोगग्रस्त LECs के लिए, यह इन विट्रो में और पशु xenograft मॉडल में विभिन्न सेल उत्तेजनाओं को प्रतिक्रिया करने के लिए LEC के रोगों और LEC क्षमता के कारण जीन पर आगे प्रकाश डाला जाएगा कि सेल विशिष्ट अध्ययन के लिए अनुमति देता है।

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Acknowledgments

लेखकों बेकर फाउंडेशन और Zerina Lokmic के समर्थन रॉयल बच्चों के फाउंडेशन 'विज्ञान फैलोशिप में महिलाओं को स्वीकार करना होगा। एंड्रयू जी Elefanty और एडुअर्ड जी स्टेनली NHMRC वरिष्ठ रिसर्च फैलो हैं। उनके प्रयोगशालाओं में काम NHMRC और स्टेम सेल ऑस्ट्रेलिया द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies (Gibco) 11965-092 Used to collect tissue samples from the operating theatre.
EGM-2 MV Bullet Kit Lonza CC-3202 EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.
VEGF-C R&D Systems 2179-VC-025 Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/ml VEGF-C
Antibiotic-antimycotic solution (100x) Life Technologies (Gibco) 15240-062 This solution contains 10,000 U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F2006 Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 °C and maintained sterile. Use 7 ml to coat 150 cm2 flask.
StemPro Accutase Cell dissociation reagent Life Technologies (Gibco) A11105-01 StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.
0.4% Trypan Blue dye Life Technologies (Gibco) 15250-061 Used as a viability stain.
Dispase II Roche Applied Biosciences 4942078001 Used at 0.04%
Collagenase II Worthington Lab 4176 Used at 0.25%
DNase I Roche Applied Biosciences 11284932001 Used at 0.01%
70 mm nylon cell strainers BD Falcon 352350
Name Company Catalog Number Comments
PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 BioLegend 356204 Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 BioLegend 343516 Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 BioLegend 303116, Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated rat anti human Podoplanin, clone NC-80. BioLegend 337006 Used at 1:200 dilution
PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400112 Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400126 Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400120 Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 BioLegend 400525 Used at 1:200 dilution

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