Isolering av Human Lymphatic endotelceller från Multi-parameter fluorescensaktiverad cellsortering

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Målet med detta protokoll är att isolera lymfatiska endotelceller kantar mänskliga lymfatiska missbildning cysta-liknande fartyg och förhud som använder fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Efterföljande cellodling och expansion av dessa celler möjliggör en ny nivå av experimentell förfining för genetiska, proteomik, funktionella och celldifferentiering studier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lokmic, Z., Ng, E. S., Burton, M., Stanley, E. G., Penington, A. J., Elefanty, A. G. Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (99), e52691, doi:10.3791/52691 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lymfsystemet såsom primära lymfödem, lymfatiska missbildningar och lymfatiska tumörer är sällsynta sjukdomar som orsakar betydande sjuklighet men lite är känt om deras biologi. Isolera mycket rena mänskliga lymfatiska endotelceller (LECS) från sjuka och frisk vävnad skulle underlätta studier av det lymfatiska endotel på genetiska, molekylära och cellulära nivåer. Det förväntas att dessa undersökningar kan avslöja mål för nya behandlingar som kan förändra den kliniska hanteringen av dessa villkor. Ett protokoll som beskriver isolering av human förhud LECS och lymfatiska missbildning lymfatiska endotelceller (LM LECS) presenteras. För att få en enda cell suspension vävnad malet och enzymatiskt behandlas med dispase II och kollagenas II. Den resulterande enkelcellsuspension märktes sedan med antikroppar mot kluster av differentiering (CD) markörer CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) och PODOPLANIN. Stainierade viabla celler sorterades på en fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS) för att separera CD34 Låg CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LM LEC befolkningen från andra endotel- och icke-endotelceller. De sorterade LM LECS odlades och expanderat på fibronektinbelagda flaskor för ytterligare experimentell användning.

Introduction

En viktig funktion hos det lymfatiska kärlsystemet är att absorbera lymfa, ett överskott interstitiell fluid innehållande lipider, proteiner och cellulära komponenter, och föra den till blod vensystemet. Ett nätverk av lymfkapillärer styr lymfan till lymfkörtlarna där det screenas för närvaron av främmande antigener, en viktig process i immun övervakning och spridning av vita blodkroppar för att neutralisera främmande antigen.

Den enkelriktade lymfatiska systemet startar i vävnader med den initiala lymfatiska kapillär, en unik struktur med diskontinuerligt enda skikt av tunnväggiga plana endotelceller med specialiserade cellföreningspunkter som tillåter lymfa inträde 1,2. Dessa kapillärer är fastade till den angränsande bindvävs matrisen via förankringsfilament för att förhindra kärlkollaps i närvaro av ökad interstitiell tryck 3. De första lymfkapillärer tomma till att samla lymfatiska kapillärersom smälter samman till större lymfkärl eller vener. I jämförelse med initial lymfatiska kapillärkärl, samla lymfkärl har tjockare kärlväggarna, parade lymfatiska ventiler och är inneslutna av ett diskontinuerligt basalmembran där några glatta muskelceller är inbäddade 4. Samordnad öppning och stängning av lymfatiska ventiler och kontraktion av glatta muskelceller underlättar flödet av lymfa 3. Hos människa, det lymfatiska vener från olika delar av kroppen förenas för att bilda lymfatiska stammar som slår sig samman för att bilda två lymfvägarna: bröstgången och rätten lymfatiska kanalen. Den lymfgången tömmer lymfan från den vänstra sidan av kroppen och från höger sida under bröstet medan den högra lymfatiska kanal avlopp lymfa från höger arm och höger sida av huvudet, halsen och bröstkorgen. Båda kanalerna genomföra lymfan i subclavia venerna i nacken 5.

Sjukdomar i det lymfatiska systemet är i stort sett delas in i förvärvat ennd kongenital (tabell 1). Exempel på förvärvade villkor är lymfangit och sekundära lymfödem. Lymfangit är en inflammation i en lymfatiska kärl på grund av bakteriell infektion. De drabbade lymfkärlen vidgas och fyll med exsudatceller innehåller polymorfonukleära celler. I huden, dessa lymfkärlen syns som röda, smärtsamma subkutana streck ofta åtföljs av utvidgningen av den tillhörande dränerande lymfkörteln (lymfadenit) 6. Sekundär lymfödem uppstår som en följd av skada eller hinder för det lymfatiska kärl eller lymfkörtlar obstruktion. Detta leder till kronisk progressiv svallning på grund av ansamling av lymfa distalt skadan eller obstruktion. I utvecklade länder, är sekundär lymfödem oftast förknippas med malignitet där metastaserande tumörer hindrar lymfkärl eller regionala lymfkörtlar, eller som en följd av anti-cancerterapi efter kirurgiskt avlägsnande av lymfkörtlar, efter bestrålning fibros och post-inflammatoriska Thrombosis och ärrbildning 7. I andra delar av världen, kan sekundär lymfödem vara sekundärt till lymfatiska obstruktion orsakas av parasitmaskar som Wuchereria bancrofti 6.

Sjukdomar i det lymfatiska kärlsystemet
Förvärvat Medfödd
Lymfadenit
Sekundär lymfödem
Primär lymfödem 10 Sporadiska lymfatiska missbildningar 13 Lymfatiska missbildningar associerade med syndrom 13
t.ex
Milroy syndrom
Meige syndrom
Enkel:
Lymfatiska missbildningar
t.ex
Klippel-Tranaunay syndrom
Parker Weber syndromet
Sturge-Weber syndromet
Kombinerad:
Kapillärliknande lymfatiska missbildningar
Kapillär-lymfatiska-venös missbildning
Kapillär-lymfatiska-arteriovenös missbildning
Kapillär-lymfatiska venös-arteriovenös missbildning

Tabell 1. Översikt över störningar i lymfatiska kärlsystemet.

Medfödda störningar i det lymfatiska systemet inkluderar primär (idiopatisk) lymfödem tros vara orsakad av genetiska mutationer, lymphangiectasia och anomalier i lymfsystemet 8,9. Primär lymfödem kan vara sporadisk förmodligen orsakats av de novo mutationer, eller ärvt. Lymfsystemet kan också vara isolerade eller utgör en del av en mer generell syndrom 10. I den pediatriska populationen, 97% av lymfaödem är sporadisk med avvikelser i lymfkärl struktur som försämrar den regionala lymfdränage 11. Milroy sjukdom är ett exempel på primära lymfödem orsakas av mutation i VEGFR-3-genen uppenbar vid födseln eller strax efter 12. Även om det mesta familjär tillstånd kan Milroy sjukdomen också identifieras hos spädbarn utan familjehistoria av Milroy sjukdom 32. Svårighetsgraden av någon lymfödem beror på mängden av lymfa produktion och förmåga att transportera lymfa tillbaka till venösa cirkulationen 6.

Baserat på kliniska och in situ endotelcellförökning är avvikelser i det lymfatiska systemet klassificeras som lymfatiska tumörer eller lymfatiska missbildningar 13. Kaposiform lymphangiomatosis är ett exempel på en LEC-tumör 14. Lymfatiska missbildningar tros uppstå under fosterutvecklingen och växa i proportion till barnet 15,16. De tillbaka sällan men kan remain asymtomatisk tills trauma eller infektion fällningar snabb tillväxt leder till kliniska komplikationer. Ordnad struktur lymfatiska nätverk och ledning av lymfa från vävnaden till venösa cirkulationen beskrivits ovan störs i lymfatiska missbildningar som består av lokala samlingar av onormala cystisk strukturer fyllda med lymfvätska. Medan det finns inga kliniska eller experimentella bevis för att dessa cystisk fartyg är anslutna till det lymfatiska cirkulationen eller att de innehåller funktionella lymfatiska ventiler, är deras lymfatiska identitet bekräftas genom expression av olika lymfatiska cellmarkörer såsom PODOPLANIN, CD31, lymfkärl endotelreceptor 1 (LYVE-1), Prospero homeobox protein 1 (PROX-1) och VEGFR-3 15,17,18. Dessa cystiska strukturer kan vara antingen små (microcystic) eller stor (macrocystic), men de flesta lymfatiska missbildningar innehåller både microcystic och macrocystic komponenter (figur 1) 16. Efter kirurgi, injection sclerotherapy och / eller radiofrekventa ablation det lymfatiska missbildningar ofta upprepas.

Figur 1
Figur 1. Morfologi av mänskliga lymfkärl och lymfatiska missbildningar. Normal human lymfatiska (A) och lymfatiska missbildnings fartyg (B och C) märkta med antikroppar mot PODOPLANIN (brun etikett, pil). Mänskliga lymfatiska missbildnings fartyg kännetecknas av markant utvidgning och stor variation i lumen storlek. Dessa lokaliserade abnorma cystiska strukturer kan vara antingen små (microcystic, *) (B) eller stora (macrocystic, #) (C). De flesta lymfatiska missbildningar innehåller både microcystic och macrocystic komponenter. Klicka här för att se en större version av bilden. </ P>

Vissa forskare har föreslagit att lymfatiska missbildningar utgör en utvecklingsstörning av lymfatisk kärl där LECS inte har onormal tillväxtpotential utan har misslyckats med att ansluta till den normala cirkulationen 19. Emellertid har vi funnit att de LM LECS prolifererar snabbare och är mer resistenta mot apoptos än förhud LECS 15 tyder på att det är en primär defekt i LM LECS. När LM LECS implanteras i en mus xenograftmodell bildar de strukturer som påminner om lymfatiska missbildningar 15. Detta stöder en hypotes som lymfatiska missbildningar kan orsakas av en eller flera somatiska mutationer uppstår i LM LECS under fosterutvecklingen. I själva verket har nya rapporter identifierat en sådan mutation i p110α katalytiska subenheten av fosfoinositid-3-kinas (PIK3CA) gen 20.

Med tanke på de framsteg inom DNA-sekvenseringsteknologi, relevanta mutationer cOuld vara lättare identifieras i isolerade LM LECS, vägleda framtida studier av dessa villkor. Isoleringen av livskraftiga LECS skulle underlätta jämförelser mellan onormala och normala LECS i analyser som migration, proliferation, rör bildningsförmåga och överlevnad som svar på minskad närings tillgänglighet eller pro-apoptotiska medel 15. Isolerade LECS skulle ytterligare underlätta för oss att utföra cellspecifika genuttryck och proteomik studier, för att beskriva nya LEC subpopulationer och upptäcka nya farmakologiska medel som är lämpliga för klinisk behandling av lymfatiska missbildningar.

Vi har tidigare publicerat en LEC isoleringsmetod baserad på magnetisk pärla separation av LECS från neonatal förhud och lymfatiska missbildningar 15. Vi rapporterade en strategi för att separera normala och sjuka LECS från vaskulära endotelceller som bygger på frånvaro av CD34 uttryck, följt av att utsätta CD34 Neg cellfraktionen till positiv selektion för CD31.Emellertid var denna metod hämmas av närvaron av kvarvarande icke-endotelceller. Detta var oberoende av avlägsna epidermis före efterföljande bindväv matsmältningen. Dessa föroreningar frodats i allmänhet snabbare och därmed så småningom växte över de endothelial cellkulturer trots efterföljande försök att upprepa LEC isolering. Faktum är en initial förorening av icke-endotelceller så låga som 2% till 5% var tillräcklig för att överväldiga LEC befolkningen 15. Detta fick oss att utforska fluorescerande aktiverad cellsortering metod som ett alternativ för att förbättra LEC cellutbyte och renhet. Dessutom använde vi flera parametrar sortering för att förbättra specificiteten hos LEC populationer, lägga VEGFR-3 och PODOPLANIN till urvals markörer för att identifiera CD34 Låg CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LECS.

Skälet till att välja dessa markörer baserades på de rapporter som samtidigt LECS och blod vascular endothelial cells har många cellytmarkörer gemensamt såsom CD31, LECS visar fenotypisk variation i sitt uttryck av CD34, PODOPLANIN och VEGFR-3 cellytmarkör jämfört med blod kärlendotelceller 21-23. CD31 är ett 130 kDa transmembran glykoprotein även känd som trombocyt endotelial celladhesionsmolekyl 1 (PECAM-1). Det anses vara en pan-endotelceller markör eftersom det uttrycks på alla typer av blod och lymfkärl 21,24,25. CD34 är 110 kDa transmembran glykoprotein närvarande på de flesta hematopoietiska progenitor och stamceller, vaskulära endotelceller och vissa lymfkärlen 26.

VEGFR-3, receptorn för vaskulär endotelial tillväxtfaktorer C och D, är initialt närvarande på utvecklings venerna i musembryo, men efter lymfatisk specifikation regleras av transkriptionsfaktorer SRY-besläktad HMG-box (SOX) -18, c hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f skådespelare 2 (COUPTF-II) och PROX-1, är VEGFR-3 venös uttryck förlorat och det blir begränsad till embryonal LECS 25,27. PODOPLANIN en kDa membran 38 mukoprotein, först noteras på lymfkärl till cirka embryonala dag 11 (~ E11.0) av mus embryonal utveckling 28 och samtidigt som det är starkt uttryckt av mikrovaskulära lymfkärl, PODOPLANIN uttryck genom macrocystic lymfatiska endotel i lymfatiska missbildningar är mer varierande 15. Flödescytometri experiment antyder att åtminstone några CD34 Hög CD31 Pos endotelceller uttrycker det lymfatiska markör PODOPLANIN 29. Även om systematisk utvärdering av LYVE-1 och PODOPLANIN färgning i mänskliga lymfatiska missbildningar visade att både är effektiva vid färgning lymfatiska missbildning endotel 30, i normala vävnader, LYVE-1 rapporterades vara starkt närvarande i den initiala lymfatiskakapillärendotelet men minskas och även frånvarande i uppsamlings lymfatiska endotel 31. Eftersom vårt mål är att isolera både de ursprungliga och samla lymfatiska endotelceller vi har valt att inte använda LYVE-1 som en del av vårt utbud cell strategi. Slutligen, beslutet att använda dessa markörer ades också på att det finns antikroppar som används diagnostiskt för att märka lymfkärl för mikroskopisk avbildning, en funktion som skulle möjliggöra korrelation mellan flödescytometri och immunofluorescerande studier.

Denna artikel kommer att beskriva vävnads digestionsmetoden, cellfärgning och FACS inställningar som krävs för framgångsrik isolering av CD34 Låg CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LECS liksom CD34 hög CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos endotelceller från förhuden och lymfatiska missbildning vävnad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik uttalande: etiskt godkännande för insamling av lymfatiska missbildning och förhud vävnader erhölls från den mänskliga forsknings etiska kommittéer vid Royal barn- och ungdomssjukhus, Melbourne, Australien. Signed medgivande mottogs från patienters föräldrar före operation. Vävnadsprover uppsamlades från patienter diagnostiserade med arbetsmarknad genomgår kirurgiska ingrepp som en del av deras kliniska hanteringen och patienter som genomgår elektiv omskärelse. Alla experiment utfördes i enlighet med riktlinjerna i den nationella hälsa- och medicinska forskningsrådet, Australien.

1. Framställning av cellsuspension från förhuden och Lymphatic Malformation vävnader

  1. Buffertar och Media förberedelse.
    1. Förbered fullständig endotelial cellmedia med användning av kommersiellt tillgängliga EGM-2 MV Bullet Kit genom uppvärmning EGM-2 medium och försiktigt upptining kitkomponenterna i 37 ° C vattenbad. I klass II biosäkerhet skåp, aseptisktlägga till varje komponent till EGM-2 medium. När alla komponenter läggs till media hänvisar till detta medium som "komplett endotelceller medier". Använd steril 50 ml pipett för att blanda innehållet före användning.
      NOTERA: Alla steg avseende cellodling utförs i en klass II biologiskt skåp. Samtliga lösningar förvarades vid 4 ° C enligt tillverkarens instruktioner och värmdes till rumstemperatur före användning. De fullständiga endoteliala cellmedier, cellkultur buffertar och enzymlösningar värms vid 37 ° C under 20 min före användning.
    2. Tillägg fullständig endotelial cellmedia med 50 ng / ml VEGF-C. Alikvotera kompletterade endotelcell medier i 50 ml sterila rör och förvara vid 4 ° C fram till användning. Medierna är stabil i minst 4 veckor vid förvaring vid 4 ° C.
    3. Förbered kalcium- och magnesiumfri fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom upplösning av 8,752 g NaCl, 1,416 g Na 2 HPO 4 .2H 2 O och0,395 g KH 2 PO 4 i 1000 ml vatten. Justera pH till 7,4. Filtrera sterilisera PBS genom att använda 0,22 pm filter och förvara vid 4 ° C. Före användning lägga antibiotika / antimykotika lösning (används vid 1: 100).
    4. För att framställa humant fibronektin, upplösa ett mg fibronektin i 10 ml sterilt vatten. Butiks rekonstituerade lösningen i 100 | il alikvoter vid -20 ° C. På dagen för användning till 10 ml steril PBS till 100 | il av fibronektin alikvot (för att ge en slutlig arbetskoncentration av 10 | ig / ml).
    5. För enzym media, bereda en lösning innehållande 0,04% Dispase II, 0,25% kollagenas II och 0,01% DNas I i steril PBS. Först väger dispas och kollagenas, placera i ett sterilt 50 ml rör, tillsätt den erfordrade volymen av PBS och inkubera under 30 min med skakning vid 37 ° C för upplösning. När löst, filtrera sterilisera (0,22 um filter) dispas / kollagenas lösning i biosäkerhet huva. Aseptiskt DNas I. Store den enzymatiska lösningen vid 37 ° C tillsanvända.
      OBS: DNas I är en kommersiell cellodlingskvalitet reagens finns som steril frystorkat pulver.

2. Framställning av cellsuspension från förhuden och lymfatiska missbildningar

  1. Väg en 50 ml rör innehållande 10 ml DMEM / 2% antibiotikum antimykotisk lösning. Detta rör kommer att användas för vävnadssamling.
  2. Efter kirurgiskt avlägsnande av lymfatiska missbildning och förhud vävnader, aseptiskt vävnadsprov till röret och överföring på is till cellodlingslaboratorium.
  3. Väg röret med vävnaden och beräkna vävnadsvikt. Använd denna vikt för att beräkna volymen av enzymatisk lösning som behövs för att smälta vävnaden.
  4. I en klass II biosäkerhet skåp, använd sterila pincett för att överföra vävnad och media i en 100 mm vävnadsodlingsskål. Använd steril sax till fint finhacka vävnaden i ~ 1 mm 3 stycken.
  5. Transfer malet vävnad blandas med medier into en 50 ml rör innehållande ytterligare 10 ml steril DMEM / 2% antibiotikum antimykotisk lösning. Blanda genom inversion att åter suspendera vävnaden. Centrifugera provet vid 300 xg under 5 minuter.
  6. Avlägsna supernatanten. Baserat på vävnadsvikt, tillsätt 1 ml förvärmda (37 ° C) kollagenas II / DNas I / Dispase II matsmältningen lösning per 100 mg av malet vävnad. Generellt använder 10 ml enzymlösning för cirka 1 g malet vävnad.
  7. Inkubera vävnaden i en 37 ° C inkubator i 20-90 min med konstant skakning vid 200 varv per minut. Vid slutet av denna period, se till att nästan all vävnad uppslutes till fina fragment.
    OBS: Exponering av cellerna för kollagenas och dispas vid tiden för isolering från den primära vävnader påverkar cellöverlevnad. Vi har funnit empiriskt att de flesta neonatala förhuds prover kräver optimalt 20-30 min för matsmältningen, medan fibrotiska lymfatiska missbildnings prover kan kräva 60-90 minuter för matsmältningen. LM LEC utbytes påverkas av mängden fibros närvarande mer fibrös vävnad, vilket gav färre celler, möjligen på grund av skadliga effekter av långvarig exponering för kollagenas II och dispas II.
  8. Efter digerering, överföra röret till biosäkerhet skåpet och passera digere vävnaden lösningen genom ett 70 ^ m sil placerades i ett sterilt 50 ml rör. Använda 3 ml sprutkolven med gummikolv, slipa ner återstående vävnaden tills endast små spår av extracellulära matrix observeras.
  9. Tvätta cellfilter med en volym av endotelial cellmedium ekvivalent med volymen av dissociering enzymmediet för att återvinna celler fastnat på såll och för att inaktivera enzymerna. Till exempel för 2 ml av dissociering enzym medium för att smälta den malda vävnaden, tillsätt 2 ml endotelial cellmedium för att inaktivera enzymerna.
  10. Centrifugera cellen lösningen vid 300 xg under 5 min och aspirera supernatanten. R> e-suspendera cellerna i 10 ml PBS. Centrifugera cellerna vid 300 xgunder 5 minuter, avlägsna supernatanten och upprepa celltvätt två gånger. > Resuspendera cellpelleten i 20 ml endotelceller medium. Räkna celler med användning av trypanblått därefter utsäde 2 x 10> 6 celler i 150 cm> 2 kolv förbelagd med fibronektin i en slutlig volym av 20 ml endotelcell-medium. Odling vid 37 ° C i en 5% CO> 2 i fuktad luftinkubator.>
    OBS: Det förväntas att 75% -90% av kärn celler överlever vävnad matsmältningen som uppskattas av trypanblåttuteslutning. Den initiala cellräkning återspeglar alla kärnförsedda celler i cellsuspensionen (dvs. keratinocyter, leukocyter, makrofager, bindvävsceller och blodkärlsceller). Den celltal på 5-7 dagar visar celler som har fäst, överlevt och prolifererade under cellodling. Beläggning vävnadsodlingskolvar med fibronektin också förbättrar efterföljande LEC och LM LEC överlevnad.
  11. Efter inkubation över natten, tvätta bort obundna celler i tre tvättningar med PBS / 1% antibiotika-antimykotika lösning och tillsätt färskt endotelceller medium. Utför tre tvättningar för att effektivt avlägsna obundna celler och röda blodkroppar som finns i kolven. Ändra media varannan dag. Cellerna kommer att vara ~ 80% konfluenta efter 5-7 dagar.

3. Antikropp färgning av celler för lymfatiska endotelceller ytmarkörer för flödescytometri

  1. Efter det att cellerna har nått 80% konfluens, aspirera mediet och skölj celler med PBS.
  2. Drag av vidhäftande celler genom att inkubera celler med 7 ml celllösgör lösning såsom Accutase per 150 cm 2 kolv under 5-7 min vid 37 ° C.
  3. Harvest fristående celler, inaktivera cell lossnar lösningen genom att tillsätta 3 volymer endotelceller medium och överföra cellsuspensionen till ett nytt sterilt rör.
  4. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 minuter.
  5. Sug ut supernatant och återsuspendera cellerna i 5 ml PBS. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 minuter, ta bort supernatant sedan upprepa celltvätt. Re-suspendera cellerna i 5 ml PBS.
  6. Räkna antalet viabla celler. Blanda 10 il cellsuspensionen med 90 pl 0,4% trypanblått. Överför 10 ul av denna suspension till hemocytometer för räkning.
    OBS: Det slutliga cellutbytet beror på provstorleken bearbetas. Den vanliga cellutbytet per 150 cm 2 kolv varierar från 7 x 10 5-1,2 x 10 6 livskraftiga celler.
  7. Bered antikroppslösningar för cellfärgning.
    OBS: Följande utspädningar titrerades för färgning 1 x 10 6 i en färgnings volym av 100 | il.
    1. Späd PE konjugerad mus anti-human VEGFR-3 (1:50); PE-Cy7 konjugerad mus anti-human konjugerat CD34 (1: 200); APC-konjugerad mus anti-human CD31 (1: 100) och Alexa 488-konjugerad rått-anti humant PODOPLANIN (1: 200) i total volym av 100 | j, l steril 5% FBS / PBS-lösning per vävnadsprov. Efter framställning avantikroppslösning, hålla på is tills det ska användas. På samma sätt förbereda utspädd isotypkontrollantikropp blandning för att underlätta fastställandet av flödescytometri grindar.
  8. För att minska ospecifik bindning av antikropparna, centrifugera celler vid 300 xg under 2 minuter, avlägsna supernatanten suspendera sedan cellerna i 100 | al steril 5% FBS / PBS-lösning per prov som skall färgas. Inkubera cellerna på is under 20 minuter vid 4 ° C.
  9. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 minuter, avlägsna supernatanten därefter återsuspendera celler i den konjugerade antikroppscocktail. Fläcka också en mindre alikvot av celler (1 x 10 5) i 100 | il isotypkontrollantikropp blandningen. Inkubera cellerna på is under 20 minuter.
  10. För att ta bort obunden antikropp, tillsätt 2 ml av 2% FBS / PBS-lösning och centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 minuter. Aspirera supernatanten och upprepa tvätten.
  11. Resuspendera cellpelleten för isotypkontroll och provet antikropp färgas ska sorteras i 300 pl av 0,5 mg / ml propidium ioDide / 2% FBS / PBS-lösning. Placera rören på is tills sortering.

4. Cell Sortering

  1. Använd följande material för att ställa in instrumentet; inriktnings pärlor såsom kommersiellt tillgängliga fluorescerande partiklar, fosfatbuffrad saltlösning baserad omslutande vätska och släpp fördröjnings pärlor, såsom Accudrop fluorescerande pärlor.
  2. Isolera renade humana LECS på en multiparameterfluorescensaktiverad cellsorteringsinstrument. Sätt upp instrumentet och rikta in enligt tillverkarens rekommendationer. Dessutom kör enstaka kontroller fläck ersättning med varje slag för att generera kompensationsmatrisen och därmed eliminera betydande blöda igenom av utsläpp av fluorokromer såsom PE i PE-Cy-kanal.
    OBS: En högre andel av de FACS sorterade celler överleva isolering om en 100 | j, m munstycke används och celler sorteras i endotelial cellmedium.

5. Cellkultur Post FACS SorteraIng

  1. Efter sortering, centrifugera celler vid 300 xg under 5 minuter. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 5-10 ml medium (beroende på kolven användes för att ympa cellen). Om mindre än 50.000 celler sorteras cellerna odlas i fibronektin belagd 25 cm 2 kolv.
  2. Annars odla cellerna i 75 cm 2 fibronektin-belagda kolv vid 37 ° C i en 5% CO2, luft fuktad inkubator. Ändra media efter 2 dagar.
    OBS: Cell-media byts varannan dag eftersom förlänga tiden mellan byte av medium verkar gynna överlevnaden av de icke-endotelceller. Vi validera lymfatiska endotelceller fenotyp med användning immunhistokemisk detektion av markörer: PROX-1, VEGFR-3, Podoplanin, CD34 och CD31 när cellerna är första splittringen för ytterligare expansion 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter inledande vävnad matsmältningen, efter 24 timmar i odling av ofraktionerade prover, kan observeras distinkta endoteliala cellkolonier (Figur 2A) tillsammans med fibroblastliknande celler och glatta muskelceller. Efter sortering och efter 24 timmar i cellkultur, CD34 Låg CD31 Pos VEGFR-3 Pos Podoplanin Pos celler fästa och visar typiska kullersten morfologi (Figur 2B och C). Genom att använda FACS ovan beskrivna metoden kan vi rena celler upp till 99,8% renhet och skilja dem från CD34 höga CD31 Pos VEGFR-3 Pos Podoplanin Pos endotelceller. Representativa resultat av grind strategi och sortering presenteras i Figur 3. Detta har löst de frågor som upplevs vid användning av magnetiska pärla isoleringsmetoden. Till dags dato har vi passe dessa celler upp till passage 13. Efter denna passage, LM LECS och förhuden LECs börjar åldrande, tillsammans med morfologiska förändringar och minskad celldelning.

Figur 2
Figur 2. Foreskin LECS och LM-LEC. Tjugofyra timmar efter enzymatisk spjälkning, osorterade celler innehåller både endoteliala (pil) och icke-endotelceller (A). Efter CD34 Låg CD31 Pos VEGFR-3 Pos Podoplanin Pos FACS cellisolering, förhuden LECS (B) och LM-LECS (C) saknar icke-endotelceller och upprätthålla kullersten morfologi. Klicka här för att se en större version av bilden .

Figur 3
Figur 3. Fluorescens-aktiverad cellsortering grind strategier för cellsortering av vaskulära och lymfatiska endotelcellerar. (A) Levande celler först gated på CD34 och CD31 uttryck, följt av VEGFR-3 och PODOPLANIN grind att sortera vaskulär (B) och lymfatiska endotel (C) celler respektive. (D) Åter analys av sorterade CD34 hög CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos celler visar> 98% vascular endothelial cellfenotyp. (E) LEC celler sorterade på CD34 Låg CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos fenotyp är också> 98% ren. Klicka här för att se en större version av bilden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LECS spelar en viktig roll för att upprätthålla vätske homeostas, immunsvar mot främmande antigener och absorption och transport av vissa näringsämnen. LEC homeostas kan påverkas av sjukdomsprocesser såsom bakteriella infektioner och tumörmetastaser, men LECS kan också utveckla somatiska mutationer som leder till bildandet av dysfunktionella lymfkärl och hög sjuklighet för drabbade patienter. För att få mer förståelse för lymfatiska missbildning etiologi genom implantation in vivo och ex vivo experiment, och upptäcka nya behandlingsalternativ, först utvecklade vi en LEC isoleringsmetod baserad på magnetiska pärlor val strategi med hjälp av CD34 Neg CD31 Pos val strategi 15. Men innehöll de resulterande kulturerna ofta andra än endotelceller som var svåra att ta bort celler. Därefter metoden förfinats genom att använda FACS att sortera LECS som uttrycker CD34 Låg CD31 Pos VEGR3 Pos PODOPLANIN Pos fenotyp. Detta tillvägagångssätt resulterade i relativt homogena LEC kulturer innehållande <0,5% av icke-CD34 Låg CD31 Pos VEGR3 Pos PODOPLANIN Pos celler på postsorterings check. I praktiken, är fördelen att sortera celler genom FACS att reduktion av icke LECS närvaro till <0,5%. Odlade LECS och LM LECS har en typisk kullersten morfologi och blir åldrande runt passagen 13.

I denna studie har vi beskrivit en flödescytometri baserat protokoll för isolering och odling av höganrikat LECS från normala och onormala vävnader baserat på deras uttryck av en svit av cellytemarkörer (CD34 Låg CD31 Pos VEGR3 Pos PODOPLANIN Pos). Celler sorterades från primära delar efter 5-7 dagar in vitro-expansionen, ett steg som resulterade i väsentlig anrikning av LEC jämfört med deras frekvens i vävnader vid tiden för isolering. Under arurgery vi får vävnader som sträcker sig från flera mikrogram till tiotals gram i vikt. Denna vävnad kan variera mycket i sin sammansättning med avseende på volymen av lymfatiska missbildnings fartyg närvarande, vävnad ärrbildning och närvaron av lymfatiska missbildning cysta tromber. Alla dessa komponenter kommer att påverka hur många celler kan isoleras från den sjuka vävnaden. Därav utgångscellantalet kan variera från några tusen celler till flera miljoner celler. På samma sätt kommer detta att påverka sammansättningen av cellsuspensionen och utgångscellantal vilket innebär att antalet sorterade celler också kommer att skilja sig från ett prov till ett annat.

Frekvensen av LECS i osorterade förhudsprover efter 5-7 dagar i kultur varierar från 0,52% till 4,7%, medan LM LECS sträcker sig från 0,8% till 12,43%. LEC kulturerna bestod> 99% CD34 Låg CD31 Pos VEGR3 Pos PODOPLANIN Pos celler efter postsortering ny analys och upprätthållit en typisk cobblestone morfologi i kultur tills åldrande vid passage ~ 13 utan överväxt av icke-endotelceller element.

Det är nödvändigt att expandera celler ex vivo efter initiala vävnads matsmältningen och sortering eftersom utbytet av antingen förhuds eller lymfatiska missbildnings celler är i allmänhet låg. Således, enligt känd expansionen av lymfatiska endotelceller v vitro tillåter alstring av de ~ 2x10 6 celler som behövs för att ympa en mus kammaren. Detta kräver ett in vitro expansionsfasen av 5-7 dagar. Samtidigt som vi accepterar att cellodling kan inducera fenotypiska förändringar i de primära cellerna, har vi visat att dessa odlade celler behåller sin förmåga att bilda lymfatiska missbildning liknande strukturer i en mus xenograftmodell 15.

Det finns flera viktiga steg i protokollet som avgör graden av framgång vid sortering celler genom FACS. Det mest kritiska steget är det dags för exponering av cellerna för kollagenasoch dispas under isolering från de primära vävnader som beskrivs i steg 2.7. Detta är inte bara påverkas av mängden och typen av vävnad närvarande men även efter det parti av enzymer som används. Dessutom, fluorescensmärkta antikroppar som används för att karakterisera cellpopulationer behöver titreras och företrädesvis monoklonala. Vi testade flera olika celllösgör lösningar såsom trypsin / EDTA, EDTA, TrypLE Välj och cell lossnar lösning. Vi fann att EDTA måste användas under en längre tidsperiod för att lösgöra celler och resterande cellklumpar ofta kvar. Däremot var enkelcellsuspensioner genereras inom 3-5 minuters inkubation i trypsin / EDTA, cell lossnar lösning och TrypLE Välj. Vi hittade ingen väsentlig skillnad i uttrycket av CD31, CD34, Podoplanin och VEGFR-3 efter behandling med någon av enzymlösningar. Singel färgade prover bör också göras med varje sorterings experiment för att säkerställa att fluorokrom emissionsspektra inte överlappar varandra ochdärför ge felaktiga värden. Dessa kritiska steg utgör också steg där kan behövas eller felsöknings ändringar cell protokollet under flödescytometri sortering.

I jämförelse med våra tidigare publicerade magnetisk pärla isolering av LECS 15 fördelen att isolera LECS av FACS innehåller följande: snabbare isolering av celler med hög renhet och identifiering av diskreta cellgrupper och sällsynta populationer inom ett heterogent prov. De stora begränsningar FACS-baserade LEC och LM LEC isolering kretsar kring ett begränsat antal celler tillgängliga för validering följande cellsortering resultat. Dessutom, medan varje försök görs att standardisera våra analyser och instrument set-up, samma parametrar kan inte nödvändigtvis vara reproducerbar i andra laboratorier. Därför kan vissa variationer i resultaten inträffa. Dessutom en av de frågor som lymfatiska biologer står inför är frånvaron av cellspecifika markörersom skulle skilja mellan ursprungliga kapillär LEC markörer och samla kapillära LEC markörer. I detta skede har vi ännu inte identifierat LEC markörer som skulle skilja mellan friska LECS och LM LECS. Eftersom lymfatiska missbildning vävnad innehåller också normalt utseende lymfkärl (Figur 1A), kommer den resulterande CD34 Låg CD31 Pos VEGR3 Pos PODOPLANIN Pos innehålla en andel av ordinarie LECS liksom de av den sjuka fenotypen. Framtida studier undersöker LEC och LM LEC genuttryck och proteomik kan ha möjlighet att rikta oss mot mer specifika LM LEC markörer som kan skilja LM LECS från LECS i samma vävnad.

I framtiden räknar vi med att använda FACS och dessa nya LEC markörer i ett försök att identifiera sällsynta delmängder av LEC populationer både i förhuden och lymfatiska missbildningar. Detta skulle göra det möjligt för oss att isolera dessa cellpopulationer och studera deras roll i utvecklingen av lymphatic kärlsystemet och lymfatiska missbildningar.

Isolations LECS och LM LECS baserat på CD34 Låg CD31 Pos VEGR3 Pos PODOPLANIN Pos reducerad icke-endothelial cellerna kontamineras betydligt. Vidare medger FACS-teknik oss att separera LECS i subtyper baserat på expressionen av CD31, PODOPLANIN och VEGFR-3 cellytmarkörer och för att förstå detta i samband med cellhärkomst utveckling. För sjuka LECS, ger detta för cellspecifika studier som kommer att kasta ytterligare ljus på gener som orsakar LEC sjukdomar och LEC förmåga att svara på olika cell stimuli in vitro och in djur xenograft-modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Författarna vill tacka för Baker Foundation och Kungliga Barnens stiftelsens Kvinnor och vetenskap Fellowship "stöd för Zerina Lokmic. Andrew G. Elefanty och Edouard G. Stanley är NHMRC Senior Research Fellow. Arbetet i sina laboratorier stöddes av NHMRC och stamceller Australien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies (Gibco) 11965-092 Used to collect tissue samples from the operating theatre.
EGM-2 MV Bullet Kit Lonza CC-3202 EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.
VEGF-C R&D Systems 2179-VC-025 Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/ml VEGF-C
Antibiotic-antimycotic solution (100x) Life Technologies (Gibco) 15240-062 This solution contains 10,000 U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F2006 Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 °C and maintained sterile. Use 7 ml to coat 150 cm2 flask.
StemPro Accutase Cell dissociation reagent Life Technologies (Gibco) A11105-01 StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.
0.4% Trypan Blue dye Life Technologies (Gibco) 15250-061 Used as a viability stain.
Dispase II Roche Applied Biosciences 4942078001 Used at 0.04%
Collagenase II Worthington Lab 4176 Used at 0.25%
DNase I Roche Applied Biosciences 11284932001 Used at 0.01%
70 mm nylon cell strainers BD Falcon 352350
Name Company Catalog Number Comments
PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 BioLegend 356204 Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 BioLegend 343516 Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 BioLegend 303116, Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated rat anti human Podoplanin, clone NC-80. BioLegend 337006 Used at 1:200 dilution
PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400112 Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400126 Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400120 Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 BioLegend 400525 Used at 1:200 dilution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204, (10), 2349-2362 (2007).
  2. Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation. Am J Pathol. 180, (6), 2561-2575 (2012).
  3. Zawieja, D. C. Contractile physiology of lymphatics. Lymphat Res Biol. 7, (2), 87-96 (2009).
  4. Witte, M. H., et al. Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology. Cancer Metastasis Rev. 25, (2), 159-184 (2006).
  5. Andrade, M., Jacomo, A. Anatomy of the human lymphatic system. Cancer Treat Res. 135, 55-77 (2007).
  6. Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78. 2, Elsevier Saunders. Robbins. (2009).
  7. Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps. Carcinogenesis. 27, (9), 1729-1738 (2006).
  8. Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas and. University Press. Oxford. 1059-1076 (2013).
  9. Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas. 14, University Press. Oxford. 562-594 (2013).
  10. Bellini, C., Hennekam, R. C. Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).
  11. Schook, C. C., et al. Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients. Plast Reconstr Surg. 127, (6), 2419-2431 (2011).
  12. Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M. Genetics of lymphatic anomalies. J Clin Invest. 124, (3), 898-904 (2014).
  13. for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification. Available from: http://www.issva.org/classification.com. (2014).
  14. Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. J Pediatr. 164, (2), 383-388 (2014).
  15. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model. Angiogenesis. 17, (1), 1-15 (2014).
  16. Smith, R. J. Lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 2, (1), 25-31 (2004).
  17. Chen, E. Y., et al. Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 7, (2), 75-80 (2009).
  18. Norgall, S., et al. Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas. BMC cancer. 7, (2), 75-80 (2007).
  19. Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J. Vascular malformations. Part I. J Am Acad Dermatol. 56, (3), 353-370 (2007).
  20. Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. Melbourne, Australia. (2014).
  21. Baluk, P., McDonald, D. M. Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis. Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).
  22. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14, (1), 87-103 (2008).
  23. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels. Histol Histopathol. 26, (6), 781-796 (2011).
  24. Hagerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. EMBO J. 32, (5), 629-644 (2013).
  25. Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).
  26. Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154, (2), 385-394 (1999).
  27. Kaipainen, A., et al. Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (8), 3566-3570 (1995).
  28. Schacht, V., et al. T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema. EMBO J. 22, (14), 3546-3556 (2003).
  29. Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. J Exp Med. 194, (6), 797-808 (2001).
  30. Florez-Vargas, A., et al. Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations. Lymphology. 41, (3), 103-110 (2008).
  31. Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes Dev. 19, (3), 397-410 (2005).
  32. Connell, F. C., et al. Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas. Hum Genet. 124, (6), 625-631 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics