Morris water maze Test: Ottimizzazione per ceppo di topi e Ambiente di prova

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Weitzner, D. S., Engler-Chiurazzi, E. B., Kotilinek, L. A., Ashe, K. H., Reed, M. N. Morris Water Maze Test: Optimization for Mouse Strain and Testing Environment. J. Vis. Exp. (100), e52706, doi:10.3791/52706 (2015).

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Abstract

Introduction

Modelli di topi transgenici sono stati strumentali nel valutare la fisiopatologia della malattia di Alzheimer (AD), così come il potenziale di interventi terapeutici. Compiti cognitivi, come la Morris water maze (MWM), sono comunemente usati con questi modelli per identificare i correlati molecolari di deficit di memoria e per valutare l'efficacia dei farmaci pre-clinici. È essenziale, tuttavia, che la gamma dinamica del compito cognitivo essere sufficientemente ampia per rilevare gli effetti del trattamento sottili. Con i modelli murini di AD, deficit cognitivi sono tipicamente età-dipendente, e topi mostrano cali progressivi in termini di prestazioni (ad esempio, 1). L'uso di un compito cognitivo sensibile può consentire l'individuazione di sottili differenze presto nella vita dell'animale, riducendo in tal modo i costi associati con gli animali di invecchiamento. Ad esempio, riducendo il numero di prove di formazione nei Barnes ippocampali-dipendente labirinto 15-5 aumentato la difficoltà del compito, conseguente detection dei deficit nel modello 3xTg in età prima di quanto precedentemente riportato 2. In precedenza il rilevamento dei deficit non solo offre un notevole risparmio di tempo e di costi, ma aumenta anche la probabilità che i cambiamenti molecolari alla base deficit cognitivi possono essere identificati.

Un fattore che influenza la sensibilità di compiti cognitivi è lo sfondo ceppo genetico del modello di topo. Ad esempio, topi BALB / c mostrano prestazioni superiori in compiti di apprendimento e memoria rispetto ad altri ceppi, quali la C57BL / 6 3. La F1 FVB / N x 129S6 sfondo viene utilizzato per due dei modelli più ampiamente utilizzati di AD, la Tg2576 e RTG (tauP301L) 4510 modelli. Questo ceppo presenta capacità di apprendimento superiore nel MWM rispetto ad altri ceppi, tra cui B6 / mice SJL 4. A causa di questa capacità di apprendimento superiore, l'uso di una singola sonda dopo una formazione può mascherare differenze di gruppo derivanti da un'eccessiva formazione. Inoltre, la sensibility di prove della sonda può essere età-dipendente. Abbiamo precedentemente dimostrato che i processi sonde precedenti, dopo l'allenamento piattaforma nascosta limitato, sono più sensibili alle differenze di giovane Tg2576 rispetto ai giovani transgene-negativi controlli littermate che sono prove di sonda inserita dopo una formazione più ampia 5. Al contrario, le prove della sonda di seguito una formazione sono più sensibili a più anziani (20-25 mesi) i topi Tg2576 rispetto ai fratellini di età superiore ai sei precedenti prove sonda 5. Con inframmezzando prove sonda tutta la formazione, la probabilità che sarà identificato un processo sensibile è aumentata, in particolare se il test viene eseguito longitudinale e la sensibilità di un particolare processo sonda è dipendente dall'età. La figura 1 mostra le prestazioni superiori di F1 FVB / N x topi 129S6 sotto il protocollo ottimizzato per questo ceppo rispetto a topi dello sfondo B6 / SJL addestrato sotto un protocollo con una formazione più ampia.

La MWM ègeneralmente si pensa di fornire misure affidabili e riproducibili attraverso tempo e laboratori 6. Ad esempio, il protocollo principale originariamente utilizzato dal nostro laboratorio 1,7 Minnesota è stato implementato con successo con piccole modifiche alla West Virginia University 8. Allo stesso modo, i livelli equivalenti di impairment sono stati osservati in RTG (tauP301L) 4510 topi rispetto al controllo littermates se alloggiati in condizioni esenti da organismi patogeni o convenzionali 9. Tuttavia, l'ambiente di test può influenzare la sensibilità del compito MWM. Fattori come l'illuminazione della stanza, prese d'aria, gradienti di temperatura, e rumori contribuiscono a stimoli ambientali 4 che alla fine possono influenzare le prestazioni. Quando il nostro laboratorio di Minnesota e vivaio sono stati spostati in un nuovo edificio, fino ad una riduzione del 38% nelle prestazioni wild-type è stata osservata, riducendo sostanzialmente la gamma dinamica del compito e la capacità di individuare i deficit transgene-related. Questo cambiamento di performance si è verificato nonostante progettazione della sala prove per essere di dimensione e configurazione equivalente, e con le stesse indicazioni visive applicate. A "ri-ottimizzazione" del protocollo originale era necessaria per aumentare la gamma dinamica del compito MWM nel nuovo ambiente di test.

Qui il protocollo originale adatti per essere utilizzati con la F1 FVB / N x 129S6 fondo 5 è descritto. Poiché alcuni studi suggeriscono stress è associato con scarso rendimento MWM 10 e pre-trattamento può alleviare il deficit indotta da stress in prestazioni 11, un protocollo di pre-trattamento è stato progettato per acclimatare i topi per l'introduzione e la rimozione della piscina prima della prova MWM . A seguito di pre-trattamento, i topi sottoposti a una formazione piattaforma visibile, in cui una piattaforma rialzata è contrassegnato da una bandiera. Formazione piattaforma Visibile è usato per identificare i topi con problemi di performance legati ad anomalie senso-motorie. Utilizzando criteri di esclusione di cui alla protsezione ocol, topi prestazioni incompetente vengono rimossi dalle successive esami di prove di formazione piattaforma e sonda nascosti. Le svalutazioni negli studi di formazione piattaforma e sonda nascosti vengono interpretati come deficit cognitivi perché le prestazioni sensomotoria è scomposto fuori dei dati. Dopo il completamento della formazione piattaforma visibile, topi cominciano formazione piattaforma nascosta in cui la piattaforma è immerso in acqua e rimane nella stessa posizione rispetto a stimoli esterni. Prove in cui la piattaforma viene rimosso (prove sonda) si alternano per tutta la formazione piattaforma nascosta per valutare l'influenza di formazione supplementare. Poiché prove sonda verificano all'inizio di ogni giorno, prima formazione aggiuntiva piattaforma nascosta, prove sonde misurano la capacità dell'animale di ricordare la posizione della piattaforma seguito di un ritardo di 20 ore, considerata una misura di memoria di riferimento 12. Infine, i modi in cui questo protocollo originale era di ri-ottimizzate quando le variazioni di ambiente di testprestazioni di controllo perturbato sono descritti.

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Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con gli standard di cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) e approvati dal IACUC della West Virginia University.

1. Pre-gestione

  1. Configurazione del Pool
    1. Prop piscina pre-trattamento per cui è sollevato ad un'altezza comoda.
    2. Inserire 2 L di acqua (21 ° C) in piscina pre-movimentazione ad un livello di circa 1 cm.
      Nota: non aggiungere coloranti.
  2. Procedura
    1. Portare i topi dal vivaio alla sala prove.
    2. Verificare l'identificazione del soggetto (numero soggetto, coda tatuaggio, clip orecchio, ecc.).
    3. Mark coda del topo con un pennarello indelebile per distinguere i topi all'interno della gabbia che sono stati sottoposti a test da quelli che restano da esaminare pre-gestione. Segna tutti i topi in una gabbia con lo stesso colore.
    4. Mettere un topo nel bicchiere di trasferimento per approssitamente 5 sec. Poi, versate delicatamente il mouse fuori del bicchiere nella piscina di pre-trattamento.
    5. Usando un timer, permette il mouse per rimanere in piscina per 20 sec.
    6. Dopo 20 secondi, inserire delicatamente lo scoop (non inclinare) davanti al mouse. Brevemente permettono il mouse per esplorare la paletta, e, se necessario, incoraggiare il mouse per salire sul paletta facendo scorrere delicatamente la paletta sotto il mouse mentre lentamente sollevando. Fare attenzione a non spaventare i topi con lo scoop.
    7. Una volta che il mouse è in scoop, trasportarlo indietro alla gabbia dell'azienda.
    8. Ripetere queste procedure per ciascun topo nella gabbia una volta al giorno per 10 giorni. Ad intervalli regolari (ad esempio dopo ogni animale), raccogliere fecale boli e biancheria da letto dalla piscina con una rete.
    9. Risciacquare il becher di trasferimento con acqua a intervalli regolari (ad esempio in seguito al completamento di una gabbia di topi).
    10. Una volta completate queste operazioni, lavare il bicchiere di trasferimento con acqua più volte, discarica fuori l'acqua dala piscina, e sciacquare la piscina di circa due volte con acqua.

2. Visibile Training Platform

  1. Impostare il mouse prestazioni software di monitoraggio ad esempio Viewer (vedi Tabella dei Materiali).
    1. Calibrare il video in modo che corrisponda alle dimensioni del labirinto sotto 'Configurazione' - scheda "Filtri e oggetti".
    2. Impostare filtri in modo che il software in grado di differenziare un mouse dallo sfondo.
      1. Regolare la "sensibilità" al di sotto della zona "filtro di sfondo" in modo che il software di monitoraggio identifica l'animale.
      2. Fare clic sull'opzione "accettare" una volta che il software di monitoraggio identifica l'animale. Scegliere l'opzione "Modifica" per mancanza di corrente elettrica zone al di fuori della zona labirinto.
      3. Selezionare l'appropriato "del filtro animale" e "min. dimensioni degli animali ".
  2. Creare le Schede Run <ol>
  3. Creare un foglio di corsa elenca ogni mouse, ogni sede potenziale, e uno spazio per le note che contengono informazioni sul comportamento aberrante.
  4. Predeterminare posizioni per il test piattaforma visibile che sono gli stessi per ogni gruppo di topi. Così, per la prima prova, pre-determinare che la piattaforma sarà posizionato sul lato opposto a dove il mouse viene posizionato nel labirinto, sul lato destro vicino alla parete. Per il secondo processo, pre-determinare che la piattaforma sarà collocato in una posizione diversa lungo la parete di fondo per ogni mouse e che questo continuerà per ognuno dei 6 prove.
  • Impostazione della Camera
    1. Appendere le tende per la stanza in modo che eventuali indizi spaziali sono oscurate.
  • Configurazione del Tub.
    1. Posizionare la vasca in modo che corrisponda alla configurazione del software di monitoraggio garantendo il labirinto corrisponde con l'impostazione della configurazione sul "Configurazione" - scheda "Zone Definizione". Nota: E 'hPEL per garantire la vasca è in posizione corretta prima del riempimento con acqua come la vasca non è facilmente riposizionamento di una volta riempito.
    2. Riempite la vasca con acqua di rubinetto, e con un termometro, assicurare la temperatura dell'acqua è di circa 21 ° C. Assicurarsi che l'acqua rimane all'interno di un grado di temperatura in tutta questa sperimentazione, come l'acqua fredda può influire sulle prestazioni soprattutto quando si utilizzano topi anziani 8.
      Nota: non aggiungere coloranti.
    3. Utilizzando le posizioni predeterminate, posizionare la piattaforma, che ha una bandiera montata che raggiunge un'altezza di 13 cm ed è 4,5 centimetri x 4,5 cm con un bold "S" carattere forma impresso su di essa, nella prima posizione della vasca in modo che è di circa 1 pollice sopra la superficie dell'acqua.
  • Procedura
    1. Prendete il primo mouse dalla gabbia, verificare l'identificazione del soggetto, contrassegnare la coda con un pennarello permanente del colore giusto, e il luogo nel bicchiere.
    2. Posizionare delicatamente il mouse nella vasca, avviare il timer, e assicurarsi che il software di monitoraggio sta monitorando l'animale. Lasciare che il mouse fino a 2 minuti per individuare la piattaforma. Una volta che il mouse individua la piattaforma, consentire il mouse 20 sec sulla piattaforma.
    3. Se l'animale trova la piattaforma e procede a saltare o cadere, scoop il mouse e posizionare il mouse sulla piattaforma. Se il mouse continua a saltare o cadere dalla piattaforma, tenere il mouse sulla piattaforma, in modo che il topo viene a sapere che rimane sulla piattaforma porta a fuggire dalla vasca.
      Nota: Il mouse deve rimanere sulla piattaforma per un tempo complessivo di 20 sec; in tal modo, se il mouse salta dopo 5 secondi, la quantità di tempo rimanente sulla piattaforma è 15 sec e non ripristina a 20 sec.
    4. Se l'animale non riesce a trovare la piattaforma nel periodo di 2 minuti, raccogliere il mouse e posizionarlo sulla piattaforma per 20 sec.
    5. Dopo 20 secondi sulla piattaforma, togliere il mouse dalla piattaforma, come fatto nella formazione pre-trattamento e posizionare il mouse in the gabbia riscaldata foderato con carta da cucina e riscaldato a ~ 31 ° C da una piastra elettrica e lampada di calore per 30 sec. Effettuare la valutazione periodica della temperatura corporea con un termometro rettale per assicurare che certi ceppi di topi o topi ad una certa età non sono differenzialmente suscettibili di ipotermia indotta da esposizione all'acqua.
    6. Dopo 2 minuti alla gabbia tenuta con la lampada di riscaldamento, trasferire il mouse per la gabbia tenuta solo con una piastra elettrica, ma senza lampada di calore, di recuperare tra la prova. Alla fine, mettere tutti i topi da una singola gabbia a casa nella stessa gabbia azienda durante i test.
    7. Pulire il labirinto di detriti con una rete dopo ogni mouse ha completato un processo, di interrompere stimoli olfattivi.
  • Ripetere questi passaggi per ogni mouse nel gruppo. Dopo ogni topo ha completato la prima prova, spostare la piattaforma per la seconda posizione predeterminata.
    Nota: La piattaforma rimarrà nella stessa posizione per ogni mouse durante un singolo processo e saràspostati in altre posizioni predeterminate per le prove successive. Questo viene fatto per garantire che i topi 1) imparare c'è una piattaforma di sfuggire, 2) nuotare direttamente alla piattaforma visibile, dimostrando così la competenza visivo intatto, e 3) non hanno deficit motori.
  • Eseguire queste procedure per 6 prove per i primi 3 giorni di test. Quindi, effettuare la formazione visibile nei giorni di test 1, 2, e 3, con circa il 10 min tra ogni prova (figura 2).
  • Durante l'allenamento piattaforma visibile, utilizzare il software di monitoraggio degli animali per misurare la latenza per raggiungere la piattaforma, tracciare il cammino ottico dell'animale, e nuotare velocità. Ottenere queste misurazioni dalla scheda "labirinto d'acqua" sotto "Lista sperimentale" ed esportare direttamente in un foglio di calcolo Excel.
    Nota: L'uso di un timer mano può anche essere utile per assicurare l'accuratezza del software di monitoraggio.
  • Formazione 3. Morris water maze piattaforma nascosta

    1. Set la stanza
      1. Appendere le tende nella stanza di oscurare indizi spaziali in laboratorio.
      2. Posizionare spunti strategicamente sulle tende. Assicurarsi che i segnali sono grandi e contengono colori contrastanti (es .: in bianco e nero), per una migliore visibilità. Spunti Hang a distanza e l'altezza in cui sono visibili i topi da all'interno della vasca. Nota: I segnali sono statici e non si muovono durante il corso dei test.
    2. Impostare il software Mouse prestazioni Monitoraggio
      1. Calibrare il video in modo che corrisponda alle dimensioni del labirinto sotto 'Configurazione' - scheda "Filtri e oggetti".
      2. Impostare i filtri in modo che il software può distinguere i topi dallo sfondo.
        1. Utilizzare le stesse procedure come descritto nel test piattaforma visibile (passi 2.1.2.1-2.1.2.3) per impostare i filtri per Morris water maze formazione piattaforma nascosta.
      3. Creare quattro quadranti uguali all'interno del labirinto
        1. Fare clicl'opzione "Ellisse" nella scheda "Zone Definition" prima, e creare un cerchio che corrisponde al labirinto sullo schermo. Nota: In questa scheda, viene visualizzato il labirinto attuale set up, in modo che consente la possibilità di abbinare la configurazione del computer con l'installazione attuale labirinto.
        2. Fare clic sull'opzione "Rettangolo" e creare quattro quadrati uguali. Mettere queste piazze sullo schermo per creare quattro quadranti uguali all'interno del cerchio appena creato.
      4. Creare le piattaforme nel labirinto.
        1. Selezionare l'opzione "Ellisse", e creare un cerchio delle dimensioni della piattaforma che verrà utilizzata. Nota: Posizionando la piattaforma nel labirinto anticipo può essere utile per creare un'ellisse la dimensione esatta della piattaforma.
        2. Inserire la posizione della piattaforma appena creato nel centro del quadrante bersaglio. (Si consiglia di chiamare questo oggetto "target" per distinguere le piattaforme corrette dal resto). Passo critico: Nella casella appena BELow "Grid", selezionare l'opzione "stop" in "trigger" per la piattaforma di destinazione. Ciò farà sì che il programma per arrestare una volta che il mouse raggiunge la piattaforma.
        3. Creare altre tre aree di piattaforma identiche, e metterli nelle posizioni esatte degli altri quadranti. Non selezionare "stop" nell'opzione "trigger".
    3. Creare le Sheets Run
      1. Creare un foglio di corsa elenca ogni mouse, ogni prova, uno spazio per annotare il tempo per raggiungere la piattaforma, e uno spazio per annotare comportamenti problema (Tabella 1).
      2. Pre-determinare il punto di rilascio di ciascun topo in maniera pseudocasuale. Utilizzare la selezione pseudo-casuale tale che la distanza alla piattaforma è uguale ogni giorno, ciascuna delle 4 posizioni viene usato allo stesso modo, e l'angolo dall'inizio alla piattaforma (es., Da sinistra o destra) è ottenuta all'interno e tra giorni.
        Nota: la posizione della piattaforma in fugaScheda per assicurare la posizione della piattaforma non si muove dalla posizione originale. Assicurarsi che la piattaforma si trova al centro di una delle quattro zone creati sul software di monitoraggio.
        Nota: Se il test longitudinale viene condotto a varie età, spostare la piattaforma in una nuova posizione ad ogni età.
    4. Impostazione del Labirinto
      1. Regolare sia il labirinto d'acqua o la fotocamera in modo che ci sia una corrispondenza tra il labirinto e la messa a punto di configurazione sul "Configurazione" - scheda "Zone Definizione".
      2. Etichettare i quattro quadranti invisibili del labirinto (N, S, E, W). Verificare che questi match con la configurazione nel software di monitoraggio per garantire i topi vengono rilasciate dai punti di partenza corretti.
        Critical Passo: Inserire queste etichette al di fuori del labirinto e fuori di vista di un animale nuoto dato che spunti all'interno del labirinto costituiscono un compito dipendente non ippocampale non spaziale.
      3. Riempire il labirinto con rubinetto water (circa 21 ° C) in modo che la piattaforma è di circa 5 mm sotto la superficie dell'acqua.
      4. Posizionare la piattaforma nella posizione predeterminata.
        Nota: la posizione della piattaforma rimarrà lo stesso per tutti i mouse essere testati in tutti giorni e prove.
      5. Utilizzare atossico tempera bianca per rendere l'acqua opaca. Fare questo per garantire che la parte superiore della piattaforma è invisibile degli occhi degli animali durante il nuoto.
    5. Procedura
      1. Prendete il mouse dalla gabbia, contrassegnare la coda con un pennarello permanente del colore giusto, e mettere nel bicchiere.
      2. Delicatamente versare il mouse nel labirinto, in modo che entra di fronte al muro. Nota: Ogni topo verrà posizionato nella stessa posizione di partenza per una prova unica.
      3. Al rilascio iniziale del mouse, avviare il timer e stare in una zona dove il tester non è facilmente visibile dai topi. Assicurarsi che il software di monitoraggio degli animali sia correttamente rintracciando l'animale. Una volta che l'animale raggiunge la piattaforma, consentono di rimanere sulla piattaforma per 15 sec.
        Nota: Questo permette all'animale di orientare alla sua posizione spaziale all'interno della stanza.
      4. Dopo 15 secondi sulla piattaforma, allontanare l'animale dal labirinto e ritorno il mouse per la gabbia riscaldata.
      5. Se il mouse trova la piattaforma e procede a saltare o cadere prima del 15 sec, raccogliere il mouse e rimetterlo sulla piattaforma per il resto dei 15 sec modo il mouse impara ad associare la piattaforma con fuga.
      6. Se il mouse non individua la piattaforma entro 60 secondi, scoop delicatamente il mouse e posizionarlo sulla piattaforma. Permettono di rimanere sulla piattaforma per 15 secondi, quindi rimuovere l'animale con la paletta e riportarlo alla gabbia riscaldata.
      7. Pulire il labirinto di detriti con una rete per interrompere stimoli olfattivi.
      8. Ripetere queste procedure per i rimanenti topi nel gruppo. Così, per giorni di test da 4 a 9, condurre quattro prove del treno piattaforma nascostaing al giorno con circa 20 minuti tra ogni prova.
      9. Cambiare la posizione di partenza pseduorandomly per ogni prova. Così, durante il processo 1, rilasciare tutti i topi dalla stessa posizione di partenza, quindi ripetere la procedura da una posizione di partenza diversa per le prove successive. Ogni giorno, variare i punti di rilascio per assicurare gli animali non sviluppano una, non ippocampale strategia motorio dipendente non spaziale. Ad esempio, se i topi vengono rilasciati da N, S, E, e W punti il ​​primo giorno, non rilasciarli nello stesso ordine il giorno seguente.
      10. Durante l'allenamento piattaforma nascosta, utilizzare il software di monitoraggio degli animali per misurare la latenza per raggiungere la piattaforma, la lunghezza della traiettoria dell'animale, e la percentuale di tempo o di distanza l'animale trascorre in ogni quadrante labirinto. Ottenere queste misurazioni dalla scheda "labirinto d'acqua" sotto "Lista Experiment" e possono essere esportati direttamente a un foglio di calcolo Excel.
        Nota: L'uso di un timer mano garantisce la precisione del rilevamentosoftware.

    4. Prove Probe

    1. Impostare il software Mouse prestazioni Monitoraggio
      1. Utilizzare le stesse procedure nella procedura piattaforma nascosta Morris water maze (passaggi 3.2.1-3.2.4.3) con una sola eccezione. Passo critico: Per gli studi della sonda, assicurarsi l'opzione "stop" per "trigger" è disattivata durante le prove della sonda. Ciò impedirà il programma termini quando un topo attraversa la zona della piattaforma.
    2. Creare le Sheets Run
      1. Creare un foglio di corsa elenca ogni mouse, ogni prova, e uno spazio per annotare un comportamento aberrante. Pre-determinare il punto di rilascio durante le prove sonda in modo tale che si alternano tra i due lati opposti della piattaforma. Così, pre-determinare i punti di emissione tale che i topi non vengono rilasciate dai due lati che sono adiacenti alla piattaforma.
    3. Procedura
      1. Condurre studi sonda simili alla formazione piattaforma nascosta, con la eccezione che nessuna piattaforma è nel labirinto.
      2. Rilascia un topo da un punto di rilascio predeterminato. Durante il processo della sonda, togliere la piattaforma e il mouse ha 60 sec a nuotare nel labirinto.
      3. Durante il test, eseguire 4 prove della sonda. Modificare il punto di rilascio dei topi tra le prove sonda. Quindi, modificare il punto di rilascio del processo sonda di corrente da quella del processo probe precedente.
      4. Durante le prove sonda, utilizzare il software di monitoraggio degli animali per monitorare la lunghezza di percorso dell'animale, la percentuale di tempo l'animale trascorre in ciascun quadrante del labirinto, e il numero di volte che un animale nuota sopra la zona precedentemente platformed. Ottenere queste misurazioni dalla scheda "Analisi dei dati" e la scheda "labirinto d'acqua" sotto "Lista Sperimentale", ed esportare direttamente a un foglio di calcolo Excel.
        Nota: L'uso di un timer mano può anche essere utile per assicurare l'accuratezza del software di monitoraggio.
      5. Condurre una prova della sonda primaformazione piattaforma nascosta nei giorni 6, 7, 8 e 10. (Figura 2). Dopo queste prove sonda, eseguire 4 prove della piattaforma nascosta formazione ogni giorno. Quindi, eseguire una sonda prima, subito seguita dalla formazione piattaforma nascosta per tutti i mouse utilizzando le stesse procedure come descritto nel paragrafo 3. Al contrario, non eseguire ulteriori formazione piattaforma nascosto dopo la prova della sonda il giorno 10.

    5. Analisi

    1. Training Platform Visibile
      1. Effettuare misure ripetute ANOVA separatamente per (a) cammino ottico, (b) la latenza per trovare la piattaforma, e (c) nuotare velocità, con transgene (o un'altra variabile, come il trattamento) come tra i soggetti variabile e durata che blocchi di formazione come la variabile all'interno dello stesso soggetto. Nota: Per i progetti più complessi, una consultazione con un esperto di statistica può essere utile. Vedere 8,13 per informazioni sul gruppo di taglie sufficiente per alimentare correttamente questo compito con i modelli di uso comune del morbo di Alzheimer7; s malattia.
      2. Prestazioni Incompetenza
        1. Identificare topi prestazioni incompetente, tra cui topi che dimostrano incompetenza visiva o motore, o animali che non acquisiscono gli elementi procedurali della prova, e rimuovere questi topi dalle successive analisi statistiche di piattaforma nascosti e prestazioni della sonda.
          1. Calcolare la latenza media e nuotare velocità per l'ultimo giorno di allenamento piattaforma visibile per ogni mouse. Rimuovere topi con mezzi 2 deviazioni standard al di sopra del gruppo significano, in quanto ciò potrebbe essere indicativo di motore o problemi visivi.
          2. Individuare e rimuovere i topi non riuscendo a orientare o seguire la paletta di fuga, o topi che presentano un comportamento aberrante, come il nuoto cavatappi o galleggianti.
    2. Formazione Morris water maze piattaforma nascosta
      1. Condurre misure ripetute ANOVA su (a) cammino ottico, (b) la latenza per trovare la piattaforma nascosta, (c) nuotare velocità, e (d) tempo per cento o centodistanza nel quadrante con transgene come variabile tra i soggetti e le prove come variabile all'interno dello stesso soggetto.
    3. Prove Probe
      1. Velocità di nuotata
        1. Condurre misure ripetute ANOVA sulla velocità di nuoto in tutti gli studi della sonda con transgene come variabile tra i soggetti e le prove come variabile all'interno dello stesso soggetto.
      2. Piattaforma indice incrocio
        1. Utilizzando la configurazione di prova sonda per ogni mouse, indice di attraversamento piattaforma (PCI) viene calcolata utilizzando la seguente formula: PCI = numero di volte il mouse attraversa la posizione di destinazione - attraversamenti medio della posizione equivalente negli altri 3 quadranti.
          Nota: Questo è condotta per determinare se il mouse sta usando una strategia di ricerca spaziale, come indicato da più attraversamenti della posizione piattaforma addestrato, o una strategia non spaziale di thigmotaxic nuoto, come indicato da approssimativamente uguali incroci i quattro sedi.
        2. Comportamento ripetutomisure ANOVA su PCI con transgene come variabile tra i soggetti e le prove come variabile all'interno dello stesso soggetto.
      3. Percentuale di tempo o distanza per cento nel quadrante
        1. Calcola il tempo o la distanza per cento ogni mouse passa nei quattro quadranti del labirinto. Effettuare misure ripetute ANOVA sulla percentuale di tempo, o distanza, con transgene come variabile tra i soggetti e prove come variabile entro i soggetti. Utilizzare il tempo per cento per determinare se si utilizza una strategia di ricerca spaziale; risultati di tempo circa il 25% nel quadrante di destinazione indicano i topi stanno effettuando a livello possibilità e che non utilizzano una strategia di ricerca spaziale.
      4. O / N dimenticare
        1. Confrontare la latenza di attraversamento zona binari sul processo sonda per la latenza per localizzare la piattaforma sulla prova finale del giorno precedente. Nota: Se la latenza della traversata piattaforma sul processo sonda è significativamente più lungo di latenza per trovare la platform durante l'ultima prova di piattaforma nascosto il giorno prima, quindi O / N dimenticanza della posizione piattaforma è in corso.
    4. Analisi Post Hoc
      1. Seguire RMANOVAs significativi con post hoc confronti di transgene in ogni prova.

    6. Esempio di Re-ottimizzazione per un nuovo test ambiente

    1. Pre-trattamento. Condurre pre-trattamento in camera custodia. Posizionare le gabbie senza coperchio su un carrello di trasporto per l'intera sessione.
      Nota: Obiettivi per la modifica della procedura di pre-trattamento è quello di introdurre più gradualmente manipolazioni dei gestori e l'esposizione ai dispositivi di trasporto (bicchiere e paletta) e per aumentare i topi di tempo sono nella gabbia casa senza coperchi microisolator e al di fuori della loro gabbia in un campo aperto e condizioni di luce più luminose.
      1. Giorni 1 e 2
        1. Consentire topi per acclimatarsi alle mani che sono nella gabbia, seguiti da dolce toccante, Seguita da essere sollevato per l'ispezione tatuaggio e marcatura della coda. A partire dal 2 ° giorno di pre-trattamento, posizionare materiale di nidificazione supplementare nella gabbia per fornire ulteriore materiale per la costruzione del nido e riparo, mentre i coperchi sono stati rimossi 9.
      2. Giorni 3 e 4
        1. Porre il bicchiere trasporti, scoop, e la bandiera della piattaforma visibile nella casella di pre-trattamento e permettono topi di esplorare per 2 studi a 2 min per prova.
        2. Non usare acqua in questo protocollo durante la pre-trattamento. Piuttosto, assicurare la scatola contiene abbastanza biancheria pulita per coprire il piano ed è profumato con una piccola quantità di femminile e maschile lettiera sporca se entrambi i generi sono in fase di sperimentazione. Cambiare la biancheria da letto ogni giorno.
      3. 5 ° giorno
        1. Topi posto nella casella di pre-trattamento contenente lettiera poco sporca e la bandiera piattaforma visibile per 3 prove, per 20 secondi ciascuno. Utilizzare becher e la paletta per trasportare i topi e dalla scatola.
      4. Training Platform Visibile
        1. Impostare la temperatura dell'acqua a 27 ° C (solitamente usata per l'ambiente di test Minnesota).
        2. Riportare i topi alla gabbia a casa acquistando la piattaforma cued.
        3. Consentire topi fino a 60 secondi per acquisire la piattaforma visibile.
        4. Condurre sessioni di formazione, comprensivi di 3 prove al giorno per 5 giorni.
      5. Formazione piattaforma nascosta
        1. Modificare segnali visivi. Tranne che per una grande tenda per oscurare il gestore, o eliminare o rendere più strette le altre tende che circondano la piscina in modo da avere una stanza più aperta. Posizionare oggetti aggiuntivi per la stanza (per esempio, scaffalature esposto, tessuto nero poster con un simbolo bianco, un pallone da spiaggia in bianco e nero, di grandi imbuti neri, i notebook, e un animale di pezza nera), con un conseguente cue visivo equilibrato ma più vario set di usato in precedenza.
        2. Iniziare nascosto formazione piattaforma 72 ore dopo il completamento della piattaforma visibile training, con un intervallo di circa 30 minuti tra le prove.
        3. Condurre sessioni di formazione, comprensivi di 2 studi per 8 giorni.
      6. Prove Probe
        1. Eseguire prove sonda 72 ore in seguito a processi di formazione nascoste 8, 12, e 16.Include un intervallo di 3 giorni tra prove 8-9 e 12-13 della formazione.
        2. Impostare il tempo di durata della sonda per 30 sec.

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    Representative Results

    Abbiamo usato il Morris water maze per studiare gli effetti del beta-amiloide (Tg2576 topi) e mutanti P301L tau (RTG (tauP301L) 4510 topi) sulla memoria di riferimento spaziale (ad esempio, 1,5,7,8). Figura 3 è il risultato rappresentativo segnalato nel nostro studio che esamina l'effetto di insorgenza nell'età adulta espressione P301L tau sull'apprendimento e la memoria 8, utilizzando il test Ambiente A. Per valutare le capacità motorie e visive, i topi sono stati confrontati tra blocchi di formazione piattaforma visibile, in cui ogni blocco la formazione consisteva di 3 prove. Cammino ottico in allenamento piattaforma visibile non differiva tra i controlli e topi tauP301L (Figura 3A), suggerendo transgene positivi e negativi topi presentano nuoto comparabili ed entrambi i gruppi in grado di vedere il segnale visivo (bandiera) che segna la piattaforma. Nessun topi sono stati identificati come prestazioni incompetente in base ai criteri di esclusione. Successivamente, le prestazioni in blocco la formazione piattaforma nascosta è stata confrontata, in cui ogniblocco è composto da 1 giorno (4 studi) della formazione. Come i topi appreso la posizione della piattaforma, il cammino ottico e tempo per trovare la piattaforma diminuiti. Tuttavia, percorso ottico era significativamente più lunga nei topi tauP301L rispetto ai controlli per ogni blocco di formazione (figura 3B), suggerendo l'apprendimento spaziale è stata compromessa nei topi tauP301L. Quattro prove sonda, in cui la piattaforma è stata rimossa, stati intervallati tutta formazione piattaforma nascosta e ha avuto luogo all'inizio della giornata, prima dell'inizio della formazione piattaforma nascosta. Così, questi studi sonde misurano la memoria di riferimento spaziale. Confrontando tutti questi quattro prove sonda, controlli significativamente migliorata con formazione supplementare (Figura 3C), come indicato dalla aumento del tempo nel quadrante destinazione. Al contrario, i topi tauP301L non migliorano con una formazione supplementare. Pertanto, le maggiori differenze tra i due gruppi a questa età si è verificato nel corso del processo sonda 4. Questi dati indicano che l'espressione P301L tauè associato con sia l'apprendimento spaziale e deficit di memoria di riferimento spaziali. Mentre il compito labirinto d'acqua può essere relativamente stabile per alcune differenze procedurali, la F1 FVB / N x 129S6 sfondo sforzo può essere particolarmente sensibile a certi cambiamenti ambientali. Il primo protocollo descritto è stato anche utilizzato con successo in ambiente B (ad es., 1,7). Tuttavia, wild-type prestazioni della sonda era significativamente inferiore quando il primo protocollo è stato utilizzato in una terza posizione, Ambiente C. Il protocollo ri-ottimizzato significativamente migliorate prestazioni della sonda wild-type (Figura 4).

    Figura 1
    Figura 1:. Ottimizzazione del protocollo per lo sfondo ceppo selvatico 7-8 mesi di età i topi sono stati addestrati con gli stessi stimoli e test dell'ambiente. F1 FVB / N x 129S6 (N = 24) e B6 / SJL (N = 16) topi prima ricevuto 18 e 24 pla visibileprove di formazione TForm rispettivamente consegnate a 6 e 8 studi al giorno rispettivamente. Entrambi i ceppi ricevuto 4 nascosti prove di formazione piattaforma al giorno. Per F1 FVB / N x 129S6 topi, prove della sonda sono stati effettuati 20 ore dopo 8, 12, 16, e 24 prove di formazione. Per B6 / SJL topi, prove della sonda sono stati effettuati 20 ore dopo 12, 24, e 36 prove di formazione.

    Figura 2
    Figura 2:. Timeline topi hanno ricevuto una formazione piattaforma visibile per 3 giorni, 6 prove al giorno, seguita dalla formazione piattaforma nascosta per 6 giorni, 4 prove al giorno. Quattro prove sonda sono stati eseguiti 20 ore dopo 8, 12, 16, e 24 prove formazione nascosti.

    Figura 3
    Figura 3: Risultati Rappresentante per i topi Morris water maze tauP301L trasportano il P umana.301L gene tau sono stati esaminati a circa 6,5 mesi di età dopo tre mesi di espressione P301L tau (n = 41 tauP301L e n = 46 controlli con un numero circa uguale di maschi e femmine in ogni gruppo). (A) Cammino ottico in allenamento piattaforma visibile non differiva tra i controlli e topi tauP301L (p s> 0,05). (B) Durante l'allenamento piattaforma nascosta, topi tauP301L dimostrato pathlengths significativamente più lunghi in tutti i blocchi di formazione (Transgene: F (1, 83) = 41.96, p <0,0001; Transgene × Block: F (5, 415) = 0,6141, p = 0,69 ). (C) I controlli migliorati attraverso le quattro prove della sonda, mentre i topi tauP301L no (Transgene: F (1, 83) = 29.1, p <0,0001; Transgene Trial ×: F (3, 270) = 4.91, p = 0.008). Ogni blocco la formazione composta da 3 prove per la formazione piattaforma visibile o 4 prove per hidden formazione piattaforma. Tukey post-hoc analisi: * p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001. Porzioni di figura 3 ristampato da Hunsberger et al., Dimensione effetto di deficit di memoria nei topi con espressione P301L tau ad insorgenza nell'età adulta, Behav Brain Res, vol. 272, pp. 181-95. Copyright 2014, con il permesso di Elsevier.

    Figura 4
    Figura 4: Sonda I punteggi sono influenzati significativamente da ambiente di testing e il protocollo di formazione di tre gruppi di tau F1 negativo FVB / N x 129S6 topi addestrati utilizzando varie combinazioni di protocollo di allenamento e di ambiente di test generati significativamente diversi punteggi sonda dopo 8, 12, e 16 di formazione. prove (Gruppo: F (2, 42) = 14.89, p <0,0001; Gruppo x Trial: F (4, 84) = 1.10, p = 0,36). Topi formate è utilizzando il protocollo 1 e il same insieme di spunti applicativi visualizzati punteggi significativamente più bassi della sonda in Ambiente C rispetto alla B Ambiente (Ambiente: F (1, 25) = 28.58, p <0,0001; Ambiente x Trial: F (2, 50) = 1.93, p = 0,16) . I topi addestrati in Ambiente C visualizzata punteggi significativamente più alti della sonda quando modificato spunti e del Protocollo di ri-ottimizzato 2 sono stati utilizzati rispetto ai topi addestrato utilizzando gli spunti originali e protocollo 1 (Protocollo: F (1, 30) = 15.32, p <0,001; Protocol x Trial: F (2, 60) = 0,91, p = 0.41) ** p <0,001; *** p <0,0001..

    Giorno 1 Morris Water Maze - Cohort: Data: _________
    Piattaforma in SE quadrante Tester: &# 160; Ora di inizio: ora di fine: Temperatura dell'acqua: 1m tempo di prova max / 15s su piattaforma / * collocati su piattaforma
    Gruppo 1
    Trial 1
    ID Animal Marcatura Cage # Fine
    tempo
    Rilascio
    punto
    Piattaforma
    posizione
    Trova piattaforma? Tempo Note (cioè il comportamento dispari)
    W SE
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    20 minuti ITI
    Trial 2
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    20 minuti ITI
    Trial 3
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    20 minuti ITI
    Trial 4
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    </ Td> S SE
    S SE
    S SE

    Tabella 1:. Piattaforma nascosta Run foglio Un foglio corsa esempio in cui la piattaforma si trova nel sud-est è fornita (SE) quadrante. Lo sperimentatore deve scrivere il numero ID del topo, eventuali segni di riconoscimento sulla coda o le orecchie, e il raggruppamento gabbia. Il punto di rilascio è indicata sul foglio e deve essere pseudo-casuale determinato come descritto al punto 3.3.2. Registra se il mouse trova la piattaforma e il tempo per trovare la piattaforma. Strano comportamento, compresi galleggianti o thigmotaxis, dovrebbe notare.

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    Discussion

    Il compito MWM è ampiamente utilizzato per valutare l'apprendimento spaziale e la memoria. Tuttavia, la robustezza di questo compito può essere influenzata da molti fattori e richiede l'ottimizzazione sia bassa tensione e ambiente di prova. Come mostrato in figura 4, lo stesso protocollo di allenamento e applicata indicazioni visive utilizzate in due diverse camere di prova (dimensione equivalente e layout) ceduto prestazioni della sonda significativamente differenti. Dal momento che molte caratteristiche della sala prove potrebbero contribuire agli stimoli spaziale 4, è stato ipotizzato che le due camere erano significativamente differenti in qualche modo sconosciuta che ha reso la prova più difficile. Nel modificare i segnali extra-labirinto, abbiamo optato per aumentare efficacemente il numero di segnali visivi. Inoltre, minimizzando l'uso di tende, eventuali segnali uditivi o olfattivi che potrebbero esistere possono essere stati alterati. Il livello di luce delle due sale prova fosse equivalente, ma il livello di luce gabbia casa nel nuovo vivaio era più basso, con conseguentein un differenziale di livello di luce più elevato quando si passa da gabbia a casa a sala prove. È stato suggerito che i topi BALB / c sono in grado di svolgere il compito MWM fornire i livelli di luce sono sufficientemente bassa 14. Tuttavia, i tentativi di migliorare le prestazioni abbassando i livelli di luce in camera di prova non hanno avuto successo (dati non pubblicati). Fino ad oggi, non si sa quale fattore (s) ha contribuito al calo delle prestazioni nel nuovo ambiente di test, ma il pre-trattamento modificato, spunti, e protocollo di allenamento hanno portato ad un aumento significativo nei punteggi della sonda.

    Se possibile, si consiglia di testare un gruppo di wild-type o topi di controllo dello stesso ceppo di fondo e l'età come l'esperimento previsto per valutare tasso di apprendimento e di posizionamento ottimale della sonda per il particolare ambiente di test. Idealmente, la prima sonda viene posta quando circa la metà dei topi stanno mostrando una probabile ricerca positiva bias (% -Il tempo target≥35) e l'ultima sonda quandola maggior parte dei topi di controllo mostrano una ricerca di polarizzazione positiva e hanno raggiunto plateau prestazioni. Questa strategia è stata utilizzata per determinare il posizionamento della sonda per gli esecutori superiori (F1 FVB / N x 129S6) e uno sfondo che ha imparato più lentamente (misto C57BL / 6 x FVB / N x 129S6), dove circa la metà dei topi avevano bersaglio occupazioni quadranti di ≥35 dopo 8 prove o 18 prove rispettivamente con un gruppo in media, circa il 35% con tempo per la prima sonda. Sonde successive dovrebbero essere superiore al primo, se impostato in questo modo, idealmente con almeno una differenza di 15 punti rispetto al basale del 25% -time. Se si confrontano i punteggi delle sonde, che sono moderatamente bassa (~ 35%) -Time, in modo che questo rappresenti un pregiudizio significativo per il target e, quindi, una differenza valida, confrontando l'obiettivo di non bersaglio quadranti 4,5. Inoltre, la media minima gruppo non dovrebbe essere sostanzialmente inferiore al 25% -time nel quadrante di destinazione, che sarebbe considerato basale o prestazioni possibilità. Confrontando target occupazione non bersaglio può aiutare ad identificare se ci sono pregiudizi da pranzo, ad esempio, i topi che spendono più tempo nel quadrante opposto a uno dei quadranti adiacenti sarebbe un modello di ricerca inaspettato.

    Alcune raccomandazioni mentre la conduzione di test includono la limitazione del numero di persone che prova ogni coorte di animali a 1 individuale per ridurre la variabilità di trattamento ed il collaudo di stili tra sperimentatori, e la realizzazione di test a circa alla stessa ora ogni giorno. Inoltre, è stato suggerito che i topi ricezione 2 studi al giorno imparare quasi più rapidamente quelli che ricevono 4 prove al giorno 15. È essenziale che gli animali da diversi ceppi / sfondi / gruppi di trattamento essere rappresentati in ciascun gruppo test se più di una coorte deve essere eseguito durante un giorno. Infine, è necessario prestare attenzione al fine di garantire i topi non diventano ipotermico, come ipotermia può influenzare le prestazioni ed è il sesso e la tensione di fondo dipendenti 16. Anche se the inter-trial intervallo usato qui (20 min) dovrebbe essere sufficiente a prevenire l'ipotermia, altri metodi includono la regolazione della temperatura dell'acqua, ponendo i topi in una gabbia riscaldato tra la prova, o una combinazione dei due, se necessario. Tuttavia, va notato che la temperatura dell'acqua può influenzare le prestazioni in entrambe le direzioni. Ad esempio, i ratti proestrous prestazioni migliori in condizioni di caldo (33 ° C), mentre i ratti estro prestazioni migliori in condizioni di freddo (19 ° C) 17. Quindi, bisogna fare attenzione a controllare per temperature dell'acqua attraverso esperimenti. Nel caso in ipotermia essere una preoccupazione per un animale particolare, lo sperimentatore poteva mano asciutta che animale con un tovagliolo di carta nel caso in cui non riescono a governare dopo nuotata o dare alcuna indicazione di comportamenti ipotermia. La valutazione periodica della temperatura corporea in grado di garantire le condizioni sono sufficienti a prevenire l'ipotermia.

    Un'altra considerazione procedurale riguarda visibile piattaforma training. Topi più giovani o un altro ceppo possono avere bisogno di un minor numero di studi di formazione piattaforma visibili. Un orientamento suggerito è quello di formare fino a quando il gruppo di controllo ha raggiunto piano delle prestazioni durante gli ultimi 3-6 prove di formazione consecutivi, fornendo il gruppo sperimentale mostra prestazioni equivalenti. Se il disegno sperimentale comprende giovani e vecchi topi, impostare la durata della formazione piattaforma visibile per il gruppo, che richiede il maggior numero di prove di formazione per raggiungere piano delle prestazioni 5. Inoltre, la piattaforma visibile può essere efficace verso acclimatazione topi per la procedura di gestione e di prova e può eliminare la necessità di pre-uso, se i topi non sono molto piccolo quando prima testato o manipolazione umana non sia eccessivamente aversive al ceppo in prova.

    Benefici di massima del Morris water maze includono sua insensibilità relativa a fattori motivazionali rispetto ai compiti base alimentare, la sua validità come misura di larve ippocampo-dipendentenavigazione ial e memoria di riferimento, e la sua efficacia 15 cross-specie. Un potenziale limitazione della tecnica è che, perché questo protocollo è su misura per uno specifico ceppo sfondo, può non essere efficace con altri animali o altri sfondo ceppi di topi. Inoltre, come parte del protocollo, si cerca di creare e posizionare strategicamente spunti identificabili in tutta la stanza mazing. Tuttavia, non è chiaro quale altezza esatta è ottimale quando si posiziona spunti per la stanza. Così, segnali che sono grandi e sono distinguibili l'uno dall'altro sono necessari per la formazione efficace.

    In sintesi, ottimizzando l'attività MWM per l'uso con un particolare ceppo di sfondo e testare ambiente può aumentare significativamente la gamma dinamica del compito, con conseguente notevole risparmio di tempo e costi.

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    Disclosures

    Gli autori non hanno nulla da rivelare.

    Acknowledgments

    Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of scienze mediche generali (Reed / Engler-Chiurazzi - U54GM104942), l'Istituto nazionale per i disordini neurologici e Stroke (Ashe - R01NS33249, R01NS63249 e R01NS79374), Cobre (Engler-Chiurazzi - P20GM109098), il Associazione Alzheimer (Reed - NIRG-12-242187), un WVU Faculty Research Senato Grant (Reed), una borsa di WVU PSCOR (Reed), e fondi interni del WVU College of Ufficio Medicina Dean (Engler-Chiurazzi). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NIH o Associazione Alzheimer.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Viewer Tracking software Biobserve This particular software is not a requirement - there are other tracking systems available
    Pre-handling pool Dimensions approximately 1 foot wide x 2 feet long x 1.5 feet deep
    Plastic beaker 1 L
    Scoop
    Small net
    Stopwatch
    Non-toxic white tempera paint Any color paint can be used; however, most tracking software programs require that the paint contrast with the color of the animal.
    Visible platform Color should contrast that of maze
    Curtain rod
    Curtains
    Circular tub Usually white in color; approximately 4 feet in diameter
    Hidden platform Painted same color as the water

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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