הסרת יסודות קורט ידי Cupric תחמוצת חלקיקים מאורניום
1Division of Physical Therapy, Department of Orthopedics & Rehabilitation, University of New Mexico, 2Department of Ecosystem Science and Management, University of Wyoming, 3School of Pharmacy, University of Wyoming, 4Department of Environmental and Radiological Health Sciences, Colorado State University, 5Center for Environmental Medicine, Colorado State University, 6College of Pharmacy, California Northstate University

Published 6/21/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Schilz, J. R., Reddy, K. J., Nair, S., Johnson, T. E., Tjalkens, R. B., Krueger, K. P., et al. Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability. J. Vis. Exp. (100), e52715, doi:10.3791/52715 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

באתר ההתאוששות (ISR) הוא השיטה העיקרית להפקת אורניום בארצות הברית. במהלך ISR, אורניום דלף מגוף עפרות וחולץ באמצעות חילוף יונים. המים לדמם ייצור כתוצאה (PBW) מכילים מזהמים כגון ארסן ומתכות כבדות אחרות. דוגמאות של PBW ממתקן אורניום ISR פעיל טופלו בחלקיקי תחמוצת Cupric (CuO-NPS). טיפול CuO-NP של מזהמי עדיפות PBW מופחתים, כוללים ארסן, סלניום, אורניום, ונדיום. assay שלא טופל וCuO-NP טופל PBW שימש כמרכיב הנוזלי של תקשורת צמיחת תאים ושינויים בכדאיות נקבעו על ידי MTT (3 (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) ברומיד -2,5-diphenyltetrazolium) בכליות עובריות אנושיות (HEK 293) וקרצינומה של אדם hepatocellular (G2 הפ) תאים. טיפול CuO-NP היה קשור עם HEK השתפר וכדאיויות תא HEP. מגבלות של שיטה זו כוללות דילול של PBW ידי רכיבי תקשורת צמיחה ובמהלך osmolהתאמת ality כמו גם התאמת pH הכרחית. שיטה זו היא מוגבלת בהקשר הרחב יותר שלה בשל השפעות דילול ושינויים ב- pH של PBW שהוא באופן מסורתי חומצי מעט עם זאת; יש בשיטה זו יכולה שימוש רחב יותר הערכת טיפול CuO-NP במים ניטראליים יותר.

Introduction

כ -20% מאספקת החשמל בארה"ב מסופקים על ידי אנרגיה גרעינית ו, המבוססת בחלקו על תמריצים לאומיים להגדיל את עצמאות אנרגיה, ארה"ב יכולת גרעינית צפויה להגדיל 1. צמיחה בעולם באנרגיה גרעינית גם צפויה להימשך, עם הרבה של הצמיחה המתרחשת מחוץ לארה"ב 2. נכון לשנת 2013, 83% מהאורניום בארה"ב היה מיובא, אבל 952544 טונות של עתודות קיימות בארה"ב 3,4. בשנת 2013 היו 7 יישומי מתקן חדשים ויישומי 14 הפעלה מחדש / הרחבה בין יומינג, ניו מקסיקו, נברסקה ו5. בארה"ב, אורניום מופק באמצעות רובה בהתאוששות באתרו (ISR) מעבד 6. ISR גורם להפרעת ארץ פחות ונמנע מיצירת ערימות עוקב שיכול לשחרר מזהמים סביבתיים 7. ISR משתמש פתרונות חמצון על בסיס מים ליץ אורניום מהגוף עפרות המחתרת, לאחר שהאורניום מופק באמצעות leachateתהליך חילוף יונים 8. כדי לשמור על מאזן מים שלילי בגוף עפרות, חלק מleachate, ייצור נקרא לדמם מים (PBW), הוא דימם מ. חלק מPBW הוא לחטא באמצעות אוסמוזה ההפוכה (RO) ומחדש הוכנס לתהליך הכרייה, אלא גם יש לי PBW יכול שימושים תעשייתיים או חקלאיים מועילים, אם ניתן להפחית מזהמים רעילים לרמות מקובלות נקבעו על ידי רשויות פיקוח מדינה למשטח ו תהום 9. נכון לעכשיו, רוב מתקני אורניום ISR להשתמש RO להסרת מזהמים מPBW. עם זאת, עיבוד RO הוא עתיר אנרגיה ומייצר מלח פסולת רעיל, אשר דורש סילוק מוסדר.

שיטות טיהור מים רבות קיימות, כוללים חומרי ספיחה, קרומים, וחילוף יונים. מבין אלה, ספיחה היא נפוץ ביותר, וההתפתחויות האחרונות בסינתזת ננו-חלקיקים שיפרה את היכולות של טיהור מים מבוסס בעלי כושר ספיגה מעבד 10. oxi Cupricחלקיקי דה (CuO-NPS) בעבר לא נחקרו בהרחבה על אורניום ISR PBW, אבל במחקרים שנעשה לאחרונה להסרת מזהמים ממי תהום, CuO-צירופים ונמצאו יש תכונות ייחודיות, הכולל לא דורש צעדי טיפול לפני או אחרי-מים ( למשל, התאמת pH או פוטנציאל חיזור) ומתפקד היטב ביצירות מים שונות (לדוגמא, בPHS שונה, ריכוזי מלח, או יונים מתחרים) 11. בנוסף, CuO-הצירופים ומתחדשים בקלות על ידי שטיפה עם נתרן הידרוקסידי (NaOH), לאחר שניתן לעשות שימוש חוזר CuO-הצירופים ומחדש. פרטים של יכולות סינון עקבות מתכת CuO-NP ממים הטבעיים כבר פורסמו בעבר 11-14.

למרות שימושי לטיפול במים, חלקיקי תחמוצת מתכת יכולים להיות רעילים ליצורים חיים, אבל במידה של הרעילות תלויה, בין שאר, על מאפייני ננו-חלקיקים ומרכיבים 10,15,16. לכן, חשוב ללמוד simultרעילויות aneous מזהמים ההסרה וננו-חלקיקים לפני יישומים בתחום. המחקר הנוכחי נקבע היכולת של CuO-צירופים ולהסרת מזהמי PBW עדיפות (כולל ארסן, סלניום, ונדיום ואורניום), והעריך את ההשפעה של טיפול CuO-NP ברעיל PBW.

PBW נאסף ממתקן אורניום ISR פעיל ומנוצל כדי לקבוע את היעילות של טיפול CuO-NP בהסרת מזהמים עדיפות. רעיל PBW לפני ואחרי טיפול CuO-NP גם הוערך. PBW היא גיאולוגי מורכב תערובת (תעשייתית / סביבתית) ושניהם מהמכון הלאומי לבריאות הסביבה והמדע (NIEHS) והסוכנות לחומרים רעילים ורישום מחלות (ASTDR) תוך שימת דגש על לימוד הרעילות של תערובות רלוונטיות לסביבה, כוללים תערובות כפי שהם קיימים בהגדרות טבע או תעשייתי, כמו גם קידום בבדיקת מבחנה לתעדף כימיקלים לin vivo בדיקות נוספות17-19. מחקרים של חשיפות תערובת כרוניות, במינון נמוך מאתגרים כי חשיפה כרונית לתערובת במינון נמוכה לא לייצר אפקטים ברורים, לפחות לא במסגרת הזמן הקצרה של מרבית מחקרי המעבדה. כמו כן, רוב המחקרים במבחנה של תערובות כימיות לחשוף תאים לתערובת תוצרת מעבדה מוגדרת של 2 או יותר מתכות 20,21. מחקרים אלו מספקים מידע בסיסי, אבל תערובות פשוטות לא לשכפל את האינטראקציות עוינות וסינרגטי המורכבים שעלולות להתרחש במדגם מקורי, איכות סביבה, שבו המגוון הרחב של רכיבי תערובת נמצא.

מטרותיו של מחקר זה היו לבחון תהליכי הסרת מזהמים חלופיים לPBW ולהעריך את ההשפעה של טיפול (CuO-NP) ברעיל PBW שימוש בתאי אדם בתרבית. התוצאות יכולות להפיק תועלת תעשיית האורניום באמצעות פיתוח שיטות יעילים יותר או ידידותיות לסביבה לסילוק מזהם. מחקר זה מספקהעדות הראשונה כי הפחתת מזהמי עדיפות בPBW ידי CuO-צירופים ומפחיתה רעילה בתאי יונקים 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הדגימות נאספו בבניין עיבוד נוזל אורניום של מתקן ISR האורניום בוויומינג.

1. הפקת Bleed מים (PBW)

  1. לאסוף שני סוגים של דגימות מים ממתקן אורניום ISR: PBW ואוסמוזה הפוך מים (RO). לאסוף PBW מברז ניטור לאחר תהליך חילוף היונים אבל לפני טיהור אוסמוזה הפוכה. לאסוף דגימות RO לאחר PBW הוא לחטא על ידי טיפול אוסמוזה הפוך.
    הערה: Lixiviant מועבר בצינורות משדות גם מרובים לבניין עיבוד אורניום הנוזלי, שבו הוא נאסף בטור ומוכן לחילוף יונים. כ-1-3% מlixiviant לאחר חילוף יונים הוא להסיר את המעגל ומים לדמם ייצור מכונים (PBW). PBW הוא שימוש חוזר בתהליכי הכרייה או לחטא / demineralized עם סינון RO.
  2. לאסוף דגימות מים בפוליאתילן בצפיפות גבוהה (HDPE) בקבוקים עם פי חלל ראש אפסלנהלי הפעלה סטנדרטיים לאיסוף דגימה וניתוח של המחלקה לאיכות הסביבה ויומינג (WYDEQ) 23.
  3. מדידת טמפרטורה וחומציות באתר ודגימות תחבורה על קרח כדי לשמור אותם מגניבים.
  4. PBW החנות ב 4 מעלות צלזיוס. שמור את פתרון PBW מגניב עד אחרי התקשורת חיונית (EMEM-10x) המינימאלי של הנשר המרוכז מתווסף במהלך הכנת תקשורת כפי שהורה בפרוטוקול הבא.
    הערה: PBW הוא פתרון חמצון שלזרז אם אפשרו להקפיא או חימם לטמפרטורת חדר. לאחר דילול פתרון PBW מספיק לדלל שלא לזרז כאשר מחומם עד 37 מעלות צלזיוס לפני בקשה לתאים ובמהלך הדגירה.

2. הכנת CuO החלקיקים (CuO-NPS)

  1. לשלב פתרון האתנולית טהור המכיל 250 מיליליטר של 0.2 מ 'CuCl 2 • 2H 2 O, 250 מיליליטר של 0.4 מ' נתרן הידרוקסידי (NaOH), ו -5 פוליאתילן גליקול G (PEG) בבקבוק עגול התחתון עם כדורי זכוכית בורוסיליקט שש מ"מ.
  2. מניחים את הפתרון במיקרוגל שונה ולאפשר לו להגיב תחת ריפלוקס בלחץ אוויר הסביבה במשך 10 דקות ב 20% כוח (מרווחים של 6 שניות על, 24 שניות כבויות).
  3. לקרר את הפתרון לטמפרטורת חדר (20 מעלות צלזיוס), ולאחר מכן יצק לתוך 50 מיליליטר צינורות חרוטי, שעזב את כדורי הזכוכית.
  4. צנטריפוגה הפתרון בצינורות 50 מיליליטר חרוטי XG ב 1000 למשך 30 דקות, יצק, ולאחר מכן לשטוף את CuO-הצירופים ועם רצף של מים 300 מיליליטר חמים (60-65 מעלות צלזיוס), 100 מיליליטר אתנול, ו-100 מיליליטר אצטון.
  5. ייבש את CuO-הצירופים ולטמפרטורת חדר (20 מעלות צלזיוס) בצינורות 50 מיליליטר חרוטי.
  6. לגרד את CuO-הצירופים ומתוך הצינורות שלהם לתוך מרגמה. מכסה את CuO-הצירופים ועם נייר אלומיניום ולחמם את CuO-הצירופים ועד 110 מעלות צלזיוס בתנור כדי להסיר את הנוזל הנותר. לשלב CuO-צירופים ולתצוו אחד ולשקול את CuO-הצירופים.
    הערה: הכנת CuO-הצירופים וטיפול CuO-NP של PBW נערכה בQual המיםity מעבדה של מערכת אקולוגית מדע וניהול, אוניברסיטת ויומינג. CuO-NP סינתזה ואחרי ההליך של מרטינסון וReddy (2009) 11.

3. טיפול בPBW עם CuO-צירופים ו

  1. הוסף 50 מ"ג (1 מ"ג / מיליליטר) של CuO-NP לצינור חרוטי 50 מ"ל ואחריו 50 מיליליטר של PBW. לאטום את הצינור והגיב למשך 30 דקות על שייקר מסלולית עליונה ספסל ב 250 סל"ד.
  2. צינורות מדגם צנטריפוגה ב 250 XG למשך 30 דקות ולאחר מכן לסנן את supernatant באמצעות מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר. לשנות את מהירות צנטריפוגות וזמן יכול לסמוך על ננו-חלקיקים על מנת להבטיח את CuO-הצירופים והפכו קומפקטיים בצינור צנטריפוגות.

4. ניתוח היסודות

  1. הכן מטופל (שליטה) ודגימות PBW טופלה CuO-NP לניתוח יסודות כדלקמן.
  2. להפוך לחומצת aliquots (40 מיליליטר) של PBW-טופל NP CuO ואינו המטופלים עם חומצה חנקתית כיתה עקבות מתכת לpH של 2.0. לנתח aliquots PBW acidified לקטיונים ידי coupl אינדוקטיביאד פלזמה ההמונית ספקטרוסקופיה (ICP-MS) כפי שמתואר בReddy ורות (2012) 13.
  3. הכן aliquots unacidified (20 מיליליטר) של PBW-טופל NP CuO ואינו מטופלים ולנתח את aliquots unacidified לאניוני ידי כרומטוגרפיה יון (IC), כמתואר בReddy ורות (2012) 13.
    הערה: Aliquots נותח על ידי מחלקת יומינג של שירותים אנליטיים חקלאות, ניתן למצוא הארמי WY 82070. תיאור של הליך IC וICPMS בReddy ורות, (2012) 13.

5. הכנת תרבית תאי מדיה באמצעות PBW

  1. השתמש בשתי שליטה (תקשורת EMEM-1x וRO +) ושמונה פתרונות תקשורת מבחן PBW (ארבעה ריכוזים של כל מטופל ותקשורת PBW טופלה CuO-NP) במחקרי ההיתכנות. סקירות של הפתרונות הן כדלקמן:
    1. לשליטת EMEM-1x, לרכוש מדיה חיונית המינימלית של הנשר (EMEM-1x) עם L- גלוטמין וסודה לשתייה כבר הוסיפו. להוסיף סרום שור עוברי (FBS) ואנטיביוטיקה לפי הוראות יצרן.
      הערה: EMEM-1x נרכש מדולל לריכוז המתאים לצמיחת תאים ומכילים L- גלוטמין וסודה לשתייה. EMEM-1x דורש תוספת של סרום שור עוברי (FBS) ושילוב אנטיביוטיקה פניצילין וסטרפטומיצין (50 / פניצילין מיליליטר IU ו -50 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר). EMEM-1x משמש כתקשורת שליטה כי זה תקשורת הצמיחה המומלצת של היצרן עבור שני סוגי התאים המשמשים במחקר זה. המרוכז EMEM-10x הוא מדולל במי RO מהמתקן או PBW שלא טופל או שטופל CuO-NP לייצר פתרונות הבדיקה. המרוכז EMEM-10x כאשר רכש אינו מכיל L- גלוטמין או סודיום ביקרבונט ולכן אלה מתווספים בנוסף לסרום השור העוברי (FBS) ושילוב אנטיביוטיקה פניצילין וסטרפטומיצין.
    2. לפתרון שליטת RO להשתמש במי RO נאספו ממתקן ISR. השתמש באותו הפרוטוקול כאמצעי תקשורת בדיקת PBW רק להחליף 100% ואט ROאה ממתקן ISR במקום של PBW. לדלל את המים שלא טופלו ושימוש פתרון שטופל CuO-NP RO או ultrapure מהמעבדה.
    3. לדלל PBW מטופל לארבעה ריכוזי בדיקה לפני הערבוב עם רכיבי תקשורת תרבות תא. הכן את ארבעת ריכוזים שונים של פתרונות PBW שלא טופלו על ידי ערבוב PBW מטופל עם RO (מהמעבדה) בשילובים הבאים: 100% (PBW הטהור + אין מים RO), 75% (187.5 מיליליטר של PBW + 62.5 מיליליטר מים RO), 50% (125 מיליליטר של PBW + 125 מיליליטר מים RO) או 25% (62.5 מיליליטר של PBW + 187.5 מיליליטר המים RO).
    4. טופל CuO-NP לדלל PBW לארבעה ריכוזי בדיקה לפני הערבוב עם רכיבי תקשורת תרבות תא. (CuO- הטהור 100%: הכן את ארבעת ריכוזים שונים של פתרונות PBW טופל CuO-NP ידי ערבוב PBW (שטופל מראש עם 1 מ"ג / מיליליטר CuO-NP למשך 30 דקות) עם RO (מהמעבדה) בשילובים הבאים PBW טופל NP + אין מים RO), 75% (187.5 מיליליטר של PBW + 62.5 מיליליטר מים RO טופל CuO-NP), 50% (125טופל CuO-NP מיליליטר של PBW + 125 מיליליטר מים RO) או 25% (62.5 מיליליטר של PBW טופל CuO-NP + 187.5 מיליליטר המים RO).
  2. הכן 250 מיליליטר של RO + תקשורת, שלא טופל PBW + תקשורת וריכוז PBW + תקשורת שטופל CuO-NP-ידי הוספת 25 מיליליטר של EMEM-10x המרוכז 190 מיליליטר של 100% RO ושל 100%, 75%, 50% או 25% מריכוזי PBW premade שלא טופלו או שטופלו CuO-NP יצרו בשלב 6.1.3 ו6.1.4.
  3. התאם את ה- pH של כל פתרון ל7.4 עם NaOH או HCl.
  4. להשלים כל ריכוז של PBW מטופל ומטופל-CuO-NP כמו גם RO + תקשורת עם הרכיבים סטנדרטיים הבאים: 25ml (10%) בסרום שור עוברי (FBS), L- גלוטמין 2.5 מיליליטר, 0.55 גר 'NaHCO 3 ו1.25 מיליליטר עט / סטרפטוקוקוס (50 IU פניצילין / מיליליטר ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין).
  5. התאם את osmolality של כל ריכוז של PBW + תקשורת שלא טופל, טופל CuO-NP PBW תקשורת + וRO + תקשורת 290-310 mOsm / קילוגרם על ידי הוספת המים RO ומידה באמצעות osmometer.
  6. סנן כל פתרון באמצעותיחידת 0.22 מיקרומטר ואקום מסנן, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: בשל שינויים קלים בכמות המים RO משמשת לכוונון osmolality, להשתנות ריכוזים סופיים תקשורת בטווח של 5%, עם PBW מטופל + ריכוזי תקשורת על 56%, 44%, 29% ו- 16.5% וCuO-NP- טופל ריכוזי PBW + תקשורת על 53%, 45%, 30% ושל 17%.

הכדאיות 6. סלולארי

הערה: בהתחשב בכך שכליות ובכבד הם איברי היעד של רעילות מתכת כבדה, להעסיק תאים בתרבית הכליה עוברית אנושית (HEK293) (HEK) ותאי קרצינומה hepatocellular האנושי (HepG2) (HEP) שיטות בדיקת 24-26.

  1. הכן תרבות של תאי HEK וHEP 2-3 ימים לפני ציפוי 96-גם הצלחות המשמשות בניסוי לפי הוראות יצרן.
  2. למדוד כדאיות תא באמצעות [-2-5 dimethylthiazol-י.ל. 4,] -2, ברומיד 5-diphenyltetrazolium assay 3 (MTT).
    הערה: פרוטוקול assay MTT היה שונה ממייrloo et al. (2011) 27.
    1. להשיג MTT בצורת אבקה. להוסיף מלח פוספט (PBS) כדי לפצות על ריכוז המניה של 50 מ"ג / מיליליטר. להתסיס את הפתרון לשעה 2 ולאחר מכן לסנן עם מסנן 0.45 מיקרומטר מזרק וaliquot לתוך צינורות בטוחים 1.5 מיליליטר מקפיא. להגן על צינורות מן האור וחנות על 4 מעלות צלזיוס.
  3. הסרת תאי HEK וHEP ממנות התרבות שלהם באמצעות טריפסין, צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות ולמזוג טריפסין. הוסף 5 מיליליטר של PBS ולערבב תאים כדי להשיג פתרון תא בודד. לאחר מכן, החל 20 μl של פתרון התא הבודד לhemocytometer להשיג ספירת תאים למיליליטר של פתרון. צנטריפוגה התאים שוב XG ב 1000 למשך 5 דקות ולמזוג PBS נהג לשטוף את התאים. להוסיף את הכמות המתאימה של EMEM-1x להתאים את הריכוז של תאים לתא 500/100 μl (100 μl / טוב).
  4. מלא את בארות ההיקף של הצלחת עם 200 μl PBS לשלוט לאידוי.
  5. תא זרעים בצפיפות של 500 תאים / הוספה גם 100 μl היטב כל אחד, פרט לבארות ההיקפיות (שאינם מצופים עם תאים).
    הערה: צפיפות זריעה לתאי HEK וHEP מבוססת על עקומות גדילה ניסיוניות המאפשרות לשיא של צמיחה להתרחש סביב ימים 4-5. הכן עקומות גדילה לכל שורות התאים להעריך צפיפות זריעה.
  6. דגירה תאים עבור 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ומאפשר להם להתאושש (טופס הידבקויות הדוקות לצלחת) לפני ביצוע קריאות MTT הבסיס של צפיפות תאים.
  7. לבצע קריאות MTT בסיס של צפיפות תאים על ידי הסרת תקשורת הזריעה מהעמודה הראשונה (לא כולל ההיקפי) והוספה של MTT 100 μl (5 מ"ג / מיליליטר בתקשורת) לבארות עבור שעה 1.
  8. לאחר שעה, להסיר את MTT ולהוסיף של sulfoxide דימתיל (DMSO) 100 μl לפזר MTT-formazan מיוצר על ידי תאי קיימא (20 דקות).
  9. קראו את הצפיפות האופטית (OD) של העמודה הראשונה באורך גל של 570 ננומטר קליטה להשיג בסיסקו קריאה.
    1. השתמש קריאות בסיס כדי להבטיח את כל הצלחות היו זרע בצורה נכונה ושתאים גדלים באופן עקבי בין צלחות. הסר את DMSO מהעמודה נבדק לפני דוגרים במשך שעות 24 הבאות.
      הערה: אם DMSO נשאר בצלחת לילה זה מושך לחות מהעמודה הסמוכה, וגרם לירידה בהיקף התקשורת.
  10. לחמם את פתרונות הבדיקה (כלומר, EMEM-1x, RO, PBW שלא טופל ופתרונות תקשורת PBW טופל CuO-NP) עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  11. הסר את המדיה זריעה משאר הצלחת (לא כולל ההיקפי או העמודה הראשונה ששמשה לקריאה הבסיסית) והוחלף בשל EMEM-1x, ריכוזים + תקשורת, PBW + תקשורת שלא טופל RO או CuO-NP 100 μl PBW -treated + ריכוזי תקשורת (פתרון אחד לכל צלחת). דגירה תאים בריכוזי המבחן או פתרונות שליטתם עבור הסכום כולל של שבעה ימים (ימי 2-8).
    הערה: יש 10 צלחות כוללת: 1 EMEM-1x, 1 RO + תקשורת, 1 של כל ריכוז PBW + תקשורת שלא טופל (56%, 44%, 29% ו- 16.5%) וצלחת אחת של כל ריכוז PBW + תקשורת שטופל CuO-NP (53%, 45% , 30% ושל 17%) לניסוי בכל שורת תא.
  12. בכל יום הבא קריאת MTT בסיס, להסיר את פתרונות שליטה ובדיקה (מופיעים בפתק מתחת 6.11) מהטור הבא של הצלחת שלהם (למשל יום 2 תקשורת מבחן והשליטה יוסרו מן השורה 3, בארות BG; יום 3: שורה 4, בארות BG וכו ') וחזור על פרוטוקול MTT כפי שמתואר בשלבים 6.7-6.9 לעיל.
  13. חזור על הפרוטוקול כל יום במשך שבעה ימים. ממוצע תוצאות OD עבור כל שורה (6 בארות) ודיווחתי נגד זמן כדי ליצור עקומת צמיחה של שבעה ימים.
  14. כדי להעריך את ההשפעה של קלאציה נחושת על כדאיות תא בCuO-NP-טופל PBW + תקשורת לפי אותו הנוהל כאמור לעיל, למעט להוסיף של D-penicillamine 100 מיקרומטר לשלוט ופתרונות בדיקה לפני הוספת הפתרונות לצלחות שלהם. בצע אנאלי נתוניםיסיס באמצעות תוכנת גרפים מדעית.

7. דוגמנות גיאוכימיות

  1. הורד גרסת MINTEQ חזותית 3.0 / 3.1 חופשית מאתר האינטרנט הבא http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/.
    הערה: MINTEQ החזותית הוא מודל שיווי משקל כימי חופשית לחישוב התפצלות מתכת, שיווי משקל מסיסות, וכו 'ספיחה למים טבעיים. בנוסף הוא משמש כדי לחזות התמיינות יון, פעילויות יון, קומפלקסי יון ומדדי רוויה אשר בהשוואה לריכוז של אלמנטים לפני ואחרי טיפול (תוצאות ספקטרוסקופיה מסה) לבחון מנגנונים אפשריים של הסרת אלמנט 28.
  2. פתח את התכנית וקלט נתונים ספקטרוסקופיה ההמוניות מהשלב 4, כולל pH, בסיסי והריכוזים של יסודות שונים, לתכנית.
    הערה: בהתחשב בכך שהתהום הוא מתחמצן בurani האתראממ תהליך החילוץ, להשתמש מיני חמצון של ארסן, ונדיום, ואורניום עבור קלט.

8. מעכב ריכוז 50 (IC 50)

  1. לחשב את IC 50 לריכוזי PBW + תקשורת שלא טופלו ומטופלים-CuO-NP ידי ממוצעי הכדאיות (ממוצעי OD) ביום 5 של שלוש ריצות נפרדות הראשון.
  2. יום חמישה ממוצעי כדאיות הפחת של ריכוזי PBW + תקשורת שלא טופלו ומטופלים-CuO-NP מיום חמישה ממוצעי כדאיות של EMEM-1x לחשב הבדלי כדאיות. ואז לחלק את הבדלי כדאיות ידי הכדאיות הממוצעת ביום 5 בEMEM, ולהכפיל ב -100 כדי לקבל עיכוב אחוזים.
  3. להפחית את עיכוב אחוזים מ 100 (כדאיות EMEM-1x) כדי לקבל את כדאיות אחוזים עבור כל ריכוז PBW + תקשורת שלא טופל ומטופלים-CuO-NP.
  4. קלט לגרפי תוכנה מדעית על ידי הגדרת EMEM-1x בריכוז של אחד וכדאיות אחוזים של 100; להפוך כל הריכוזים לתוך יומןבקנה מידה (X = יומן (X)) ולבצע רגרסיה ליניארית עם ניתוח בכושר רבוע לפחות.

ניתוח 9. נתונים

  1. השוואת ריכוזים של יסודות בPBW שלא טופל ומטופלים-NP CuO עם שני זנב, לזווג, סטודנטים T-מבחן.
  2. לחשב את השטחים מתחת לעקומה (AUC) על ידי שימוש בנתונים שנאספו במשך עקומת הצמיחה שבעה ימים ולנתח את השונות בניתוח מדידות חוזרות של שונות (ANOVA), ואחריו השוואת פוסט הוק של Tukey בין כל הקבוצות (n = 3).
  3. לחשב את IC 50 על ידי שימוש בנתונים מיום חמש של עקומת הצמיחה לשני PBW מטופל ומטופל-CuO-NP + פתרונות תקשורת (שתוארו לעיל). ערכי P של <0.05 נחשבים משמעותיים.
    הערה: לצורך הניתוח הסטטיסטי, ערכי ספקטרוסקופיה המוניים של מחצית גבול הגילוי הוטל על רמות ריכוזי יונים מתחת לגבול ש-29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ריכוזי PBW רכיב ו- pH בPBW מטופל ומטופל-CuO-NP מדווחים בטבלה 1. מרטינסון וReddy (2009), דיווחו כי נקודת אפס אחראי CuO-NP מוערכת ב 9.4 ± 0.4. בהתחשב בכך שה- pH של PBW היה 7.2-7.4, בתנאים אלה, מים תורם פרוטונים לCuO-NPS, גורמים למשטח ננו-חלקיקי שמטען חשמלי חיובי המאפשר לספיחה של מינים טעונים שלילי. מזהמי טיפול CuO-NP הוסרו מסדר עדיפויות PBW, כוללים ארסן, סלניום, אורניום ונדיום (טבלת 1). ריכוז הארסן הממוצע הופחת על ידי 87% [0.0175-.002 מ"ג / ליטר (שני זנב מבחן t מזווג, p <0.0001)]. טיפול CuO-NP גם סלניום צמצם באופן משמעותי (30%), אורניום (78%), ונדיום (92%), ופוספט (85%) (p <0.05).

תוצאות מודלים התפצלות, שדווחו בטבלה 2, תומך בתוצאות האנליטיות: 99% לארסן מומס טל בPBW קיים כ4 HAsO 2 ו- H 2 4 אסו - 94% ושל סלניום המומס הכולל בPBW קיים כ4 SEO 2. מינים אלה באופן שלילי נזקפים, מסוגל adsorbing לCuO-צירופים ומכאן. דוגמנות התפצלות חזתה כי 99% ממינים ונדיום בPBW מטען שלילי, גם קידום ספיחה לCuO-צירופים. עם זאת, מודלים התפצלות חזו רק 35.5% מהאורניום מינים טעונים שליליים, אשר יגביל את הספיחה לCuO-צירופים. ניתוח של מדדי הרוויה חזה כי אין מינים של arsenic-, selenium-, אורניום או מינרלים המכיל נדיום היו קרובים לרוויה (כלומר, משקעים מינרלים) משקעים רמות, ספיחת תמיכה לCuO-NPS, לעומת.

כדי להעריך אם ריכוזים צפויים של מזהמי עדיפות הם בתקשורת עשתה מPBW מטופל ומטופל-CuO-NP, דוגמאות של תקשורת שליטה חי (EMEM-1x), 56%PBW תקשורת שלא טופלה + ושל 53% PBW טופל CuO-NP + תקשורת נותחו על ידי ICP-MS. תקשורת שליטה חי (EMEM-1x) היא מוצר מסחרי המסופק עם L- גלוטמין וסודה לשתייה (הוסיף מראש). ריכוזי נחושת וסלניום בשליטת EMEM-1x מעט היו גבוהים כצפוי, כי הם חיוניים לצמיחת תאים, אבל ארסן, אורניום ונדיום היו זניחים, שדווח בטבלה 3. מחקרים ראשוניים הראו כי, ארסן, ריכוזי סלניום ונדיום הופחתו טיפול CuO-NP וכי הירידה הייתה מיוצגת בריכוזים בPBW + תקשורת שטופלה CuO-NP. הריכוז הנמדד של אורניום בPBW + התקשורת שטופלה CuO-NP היה ירד לעומת PBW שלא טופל, וירידה זו הייתה בולטת יותר מהצפוי על ידי דוגמנות v.3 MINTEC חזותית. רמות הנחושת עלו בתקשורת שטופלה CuO-NP כצפוי.

כדי לקבוע את היכולת של טיפול CuO-NP לשיפור רעיל של PBW על יונקיםתאים, כדאיות הוערכו בתאים שנחשפו לפתרונות של PBW + תקשורת לפני ואחרי טיפול CuO-NP. שני תאי HEK (איור 1 א) וHEP (איור 1) נחשפו לריכוזים שונים של PBW + תקשורת שלא טופל או מטופלים עד שבעה ימים. בתאים שגודלו בPBW + תקשורת שלא טופל, כדאיות נפגעה באופן תלוי ריכוז, ואילו טיפול CuO-NP שיפור כדאיות סלולרית בשתי שורות התאים. AUC המשולב באיור 1C מראה שטופלו CuO-NP תאי HEK גדלו בPBW + התקשורת היתה קיימא יותר בהשוואה לPBW מטופל + תקשורת בשלושת הריכוזים הגבוהים ביותר (29%, 44% ו -56%). תאי HEP הראו כדאיות מעט שונה: רק שני הריכוזים הגבוהים ביותר של PBW מטופל + תקשורת (44% ו -56%) הראו יכולת קיום לקוי בהשוואה לPBW טופל CuO-NP + תקשורת (1D איור). הריכוזים לדלל יותר של PBW היו פחות רעילים לתאי HEP, וכדאיויות תא מושפעות פחות טיפול.הכדאיות של שני תאי HEK וHEP גדלו ב- 16.5% PBW + תקשורת שלא טופל לא הייתה שונה באופן משמעותי מהתאים שגודלו בPBW טופל CuO-NP 53% + תקשורת (p <0.05). לפיכך, טיפול CuO-NP הופיע לשיפור הרעיל של PBW, עם כדאיות ליד רמות השליטה. כאמור לעיל, טיפול CuO-NP של PBW קשור עם עלייה בריכוזי נחושת. היה צפוי הגידול, המבוסס על תוצאות קודמות של רדי ורות (2012), שבו הם משמשים CuO-צירופים וכדי להסיר ארסן מתהום. העלייה בנחושת תלויה בכימיה המים הספציפית של PBW, אבל נשארה מתחת EPA MCL של 1.3 מ"ג / L. עם זאת, זה היה חשוב כדי לשלול כי העלייה בריכוזי נחושת תרמה לכדאיות משופרת (כלומר, בנוסף ל, או במקום, הירידה במזהמים עדיפות). בהתאם לכך, D-penicillamine chelator הנחושת התווסף לשליטת EMEM-1x, שליטת RO + תקשורת, פתרונות PBW + תקשורת שלא טופלו ומטופלים-CuO-NP, והעקומת צמיחת כדאיות en MTT נוצרה, כפי שתוארה לעיל. קלאציה נחושת לא עשה משמעותי להשפיע כדאיות של שני תאי HEK או HEP מודגרות בשליטה + תקשורת RO, PBW + תקשורת שלא טופל ומטופלים-CuO-NP (תוצאות לא מוצגות).

הריכוז המעכב המקסימאלי המחצית (IC 50) חושב מיום חמש צמיחה של HEK ותאי HEP גדלו בPBW מטופל + תקשורת (4A טבלה) וPBW טופל CuO-NP + תקשורת (טבלת 4 ב). לתאי HEK גדלו בPBW + תקשורת שלא טופל, ערך IC 50 היה 1.264 (יומן% PBW). לפיכך, + תקשורת PBW מטופל הייתה צריכה להיות מדוללת ל18.38% כדי להגיע לירידה של 50% ביכולת קיום. לתאי HEK גדלו בPBW + תקשורת שטופל CuO-NP, ערך IC 50 היה 2.744 (יומן% PBW). תוצאה זו מצביעה על כך שתיאורטית הרעילה של הפתרון הופחת שלטופלה PBW + תקשורת הייתה צריכה להיות מרוכזת ב -500% (יומן% PBW = 2.744) לייצר דה 50% דומים במידהקמט בכדאיות. לתאי HEP גדלו בPBW + תקשורת שלא טופל, 50 IC היה 1.243 (יומן PBW%). זה היה דורש דילול של PBW + תקשורת 17.5% לייצר ירידה של 50% ביכולת קיום. לעומת זאת, לתאי HEP גדלו בPBW + תקשורת שטופל CuO-NP, 50 IC היה 5.327 (יומן PBW%). ערך זה עשוי היה כל כך גדול, כי את הכדאיות של התאים בPBW + תקשורת שטופל CuO-NP לא הייתה שונה באופן משמעותי מהתאים שגודלו בEMEM-1x (שליטה). הדמיה בהירה שדה, באיור 2, של שתי הצמיחה הסלולרית HEK וHEP ביום חמש. מספר תאים ומצורפים בPBW + התקשורת שטופלה CuO-NP (איור 2E, F) שופרו בהשוואה לPBW מטופל + תקשורת (איור 2 ג, ד).

איור 1
עקומות גדילה: 1 איור. עקומות גדילה שמשו להערכת הכדאיות וגרמתיrowth של התרבויות במהלך טיפול. עקומות גדילה לHEK () וHEP תאים (ב ') גדלו בארבעה דילולים של PBW + תקשורת לעומת 53% PBW + תקשורת (לוחות העליונים) שטופל CuO-NP. שליטת EMEM-1x (EMEM) , RO , שטופלו CuO-NP 53% , 16.5% PBW שלא טופל , 29% PBW שלא טופל , 44% PBW שלא טופל , 56% PBW שלא טופל . שטח מתחת לעקומת הניתוח (AUC) של HEK (C) וHEP (ד ') נתונים עקומת הצמיחה של 7 יום (לוחות נמוכים יותר). * P <0.05 לעומת שליטת EMEM, #p <0.05 לעומת שליטת RO, §p <0.05 בהשוואה ל -53% PBW-תקשורת שטופל NP CuO. (בהשוואה באמצעות ANOVA שני זנב עםהניתוח של Tukey פוסט הוק, n = 3.)

איור 2
איור 2:. מורפולוגיה תא לפני ואחרי טיפול CuO-NP מיקרוסקופ שדה מואר (20X) של HEK (עמודה שמאלית) וHEP (עמודה ימנית) תאים ביום 5, גדל ב: שליטת EMEM-1x (EMEM) (A, B ), 56% PBW + תקשורת (C, D) ו -53% PBW טופל CuO-NP + תקשורת (E, F) שלא טופל שימשה לבחון מורפולוגיה תא. תאי HEK וHEP גדלו בשליטת EMEM-1x (EMEM) (A, B) להציג צמיחה בריאה, כמעט ומחוברות. תאי HEK וHEP גדלו בPBW + תקשורת שלא טופל צמצמו מספרים ונראים מנותקים (C, D). תאי HEK וHEP גדלו בPBW + תקשורת שטופל CuO-NP להראות מצורף טוב יותר ותאים בריאים, ומחוברות יותר (E F).

אלמנט (מ"ג / ליטר) ממוצע, סנט Dev. ומשמעות
לפני הטיפול לאחר טיפול
ארסן 0.018 ± 0.001 0.002 ± 0.0 ***
סלניום 1.8 ± 0.07 1.3 ± 0.05 **
נחושת .0015 ± 0.001 0.93 ± 0.43 *
סידן 102 ± 82 106 ± 15
סטרונציום 3.3 ± 1.1 1.5 ± 0.4 *
מגנזיום 44 ± 2.1 47 ± 1.7
נתרן 610 ±; 0.0 627 ± 27
אורניום 0.98 ± 0.03 0.21 ± 0.03 ***
בַּריוֹן 0.037 ± 0.02 0.019 ± 0.01
אשלגן 12 ± 0.0 12 ± 0.8
הסיליקון 12 ± 0.7 12 ± 0.5
ונדיום 1.3 ± 0.07 0.1 ± 0.02 ***
פוספט 0.35 ± 0.07 0.05 ± 0.0 ***
סולפט 805 ± 21 807 ± 15
מוליכות 3125 ± 143 3190 ± 62
pH 7.31 ± 0.09 7.36 ± 0.05

ריכוזי אלמנט ניתוח של קטיונים ואניונים לפני ואחרי טיפול CuO-NP הממוצעת לפני ואחרי טיפול עם CuO-NP: טבלה 1.. משמעות בין הריכוז של PBW-טופל NP CuO ואינו המטופלים יועדו כ* = p <0.05, ** = p <0.01 ו*** = p <0.001. תא ריק מציין שאין הבדל משמעותי. ריכוזי כלוריד נעו בין 46.5 ± .707 ו55.25 ± 8.180. ריכוזי אלומיניום, בורון, ומוליבדן היו נמוכים ולא הראו שינוי משמעותי עקב טיפול CuO-NP. ריכוזים מנגן לא היו עקביים.

רכיבים % מריכוז מוחלט מינים
ארסן 58.7 4 HAsO 2
41.2 H 2 4 אסו -
אורניום 64.1 Ca 2 אואו 2 (CO 3) 3 (aq)
32.2 CaUO 2 (CO 3) 3 2
0.03 אואו 2 (CO 3) 2 2
3.5 אואו 2 (CO 3) 3 4
0.09 Ca 2 אואו 2 (CO 3) 3 (aq)
0.02 CaUO 2 (CO 3) 3 2
סלניום 94.3 SEO 4 2
5.6 CaSeO 4 (aq)
ונדיום 2.1 4 HVO 2
95.7 H 2 VO 4
2.1 H 2 V 2 O 7 2
0.01 HV 2 O 7 3
0.01 V 4 O 12 4

טבלה 2: מינים מודלים באמצעות Ver MINTEQ החזותי. 3.0 תוכנה. Ver MINTEQ החזותי. 3.0 תוכנה (KTH מכון המלכותי לטכנולוגיה, Valhallavägen, שוודיה) הייתה (aq) = מימית המשמש לחישוב התפצלות מתכת של רכיבי PBW המפורטים בטבלה 1. בניגוד לצורה המוצקה של מינים ש.

EMEM בקרה שלא טופל
PBW PBW + תקשורת
ארסן 0.003 ± 0.0 0.017 ± 0.0 0.010 ± 0.001
נחושת 0.01 ± 0.0 .0015 ± 0.001 0.018 ± 0.0
Selinium 0.013 ± 0.002 1.75 ± 0.07 1.15 ± 0.06
אורניום .00015 ± 0.0 0.975 ± 0.03 0.71 ± 0.01
ונדיום .0015 ± 0.0 1.25 ± 0.07 .785 ± 0.007
טופל NP CuO
PBW PBW + תקשורת
ארסן .0022 ± 0.001 .0015 ± 0.0
נחושת .926 ± 0.4 0.81 ± 0.0
Selinium 1.25 ± 0.05 .855 ± 0.0.02
אורניום .208 ± 0.03 0.45 ± 0.01
ונדיום .102 ± 0.02 .0795 ± 0.01

טבלה 3:. ריכוזים של מזהמים בריכוזי תקשורת של מזהמי עדיפות (מ"ג / ליטר) בשליטת EMEM-1x (EMEM), PBW שלא טופל, PBW טופל CuO-NP, PBW מטופל + תקשורת וPBW + תקשורת שטופל CuO-NP לאחר הוספת רכיבי מדיה (n = 3) הוערכו על מנת להבטיח שינויים בריכוז מזהם עקב טיפול היו מיוצגים בPBW תקשורת שלא טופלה + וCuO-NP-טופל PBW + תקשורת להחיל CELLS.

PBW + מדיה שלא טופלה
ריכוזים של PBW מטופל (יומן X) הכדאיות% (תאי HEK) הכדאיות% (תאי HEP)
EMEM 100 100
16.5% (1.217) 51.4 50.8
29% (1.462) 39 33.3
44% (1.643) 19.3 14.7
56% (1.748) 14.5 9.4
IC 50 התחבר [PBW] 1.264 1.243
טופל CuO-NP B PBW + מדיה
ריכוזים של PBW (X יומן) שטופל CuO-NP הכדאיות% (תאי HEK) הכדאיות% (תאי HEP)
EMEM 100 100
17% (1.230) 86.7 119.8
30% (1.477) 75.8 86.7
45% (1.653) 81 92.4
53% (1.724) 70.3 97.5
IC 50 התחבר [PBW] 2.744 5.327

לוח 4: חישוב של IC 50. 50 IC מייצג את הריכוז של PBW מטופל + תקשורת או PBW טופל CuO-NP + תקשורת שנדרש לעיכוב של 50% מיכולת הקיום.   כדאיות אחוזים ביום 5 לתאי HEK וHEP נחשפו לדילולים של PBW + מדיה שלא טופלה () או PBW + מדיה טופלה CuO-NP (ב ') ששמשה בחישוב הריכוז חצי המקסימאלי המעכב (IC 50).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקרים קודמים דיווחו כי CuO-צירופים והוסרו ארסן מ11,13,30,31 מי תהום. מחקר זה תומך בממצאים הקודמים אלה וגם מדווח כי CuO-צירופים והסרת מזהמים נוספים מPBW. מחקר זה גם מאשר דיווחים קודמים שCuO-צירופים ויעילים בהסרת ארסן, למרות נוכחותם של מזהמים אחרים ויונים מתחרים פוטנציאליים 11. דוגמנות התפצלות חזתה כי 97% ממינים ונדיום בPBW הם טעונים שליליים, ומאפשר לספיחה לCuO-צירופים, והטיפול אצווה להסיר 92% של ונדיום.

זהו המחקר הראשון כדי לחקור את ההשפעות של הסרת מזהמים ספציפיים מPBW באמצעות CuO-NP, ולאחר מכן להעריך את השינויים ברעילים הקשורים להסרת. התוצאות מראות שחוקר את השינויים ברעילים של תערובות מורכבות באמצעות גישה במבחנה יכולה להיות אפשרי, אבל שיטות אלה אינן ללא גבולות. PBW לא יכול לשמש Fכוח ull בתאים, כי כדי לשרוד, תאים בתרבית דורשים תקשורת צמיחה מוגדרת וספציפי osmolality. תקשורת PBW + יכולה גם לא להיות בשימוש בתאים ללא התאמת pH. PH של PBW היה 7.31 לפני ואחרי טיפול 7.36 עם זאת; התוספת של רכיבי תקשורת צמיחה מופחתת pH של כ 6.8, בהתאם לדילול. התאמת Ph היא צעד רגיל בהכנה של תקשורת בתרבות תא עם זאת; התאמת ה- pH של PBW + התקשורת אולי שינתה את האינטראקציות מולקולריות של מיני אלמנט עם רכיבי תקשורת. PBW שלא טופל ומטופלים-CuO-NP היה בשילוב עם תקשורת צמיחת EMEM-10X מרוכז בפרופורציות שונות כדי להשיג את פתרונות הבדיקה (PBW + תקשורת). ניתוח ICP-MS בוצע על תקשורת מבחן כדי לוודא שהריכוזים של מתכות המושפעות באופן משמעותי על ידי CuO-NP-טיפול (ארסן, נחושת, סלניום, אורניום, ונדיום) היו בריכוזים צפויים לאחר דילול על ידי רכיבי תקשורת והתאמת osmolality. הירידהבארסן, סלניום, ונדיום לאחר CuO-NP-הטיפול בא לידי ביטוי בהבדלים בין ריכוז PBW מטופל + תקשורת וPBW טופל CuO-NP + תקשורת. ריכוזי אורניום גבוהים יותר בPBW + תקשורת שטופל CuO-NP מהצפוי. נתונים ICP-MS (טבלה 1) מצביעים על כך שיותר אורניום הוסר מPBW במהלך טיפול CuO-NP מהצפוי על ידי דוגמנות. דוגמנות התפצלות (טבלה 2) חזתה כי ב- pH 7.3, רק 35.5% ממיני האורניום הם טעונים שליליים. המודל צופה כי מיני אורניום גדולים, פחמת סידן uranyl (Ca 2 אואו 2 (CO 3) 3), הוא ניטראלי.

הסרת 78% שנצפו של אורניום הייתה סבירה בשל שילוב של ספיחת אורניום ומשקעים (כמו מינרלים פחמה uranyl סידן). בהתבסס על המודלים גיאוכימיים, אחוז של אורניום הוסר על ידי ספיחה הוא פחות מ מחושב מאפשר לריכוז גבוה יותר בCuO-NPPBW -treated + תקשורת. המנגנון של הסרת אורניום על ידי CuO-NP-טיפול לא ברור ודורש חקירה נוספת. עלייה בריכוז של סידן, אשלגן ומגנזיום הייתה צפויה כאשר PBW התווסף לEMEM-10x עם זאת; CuO-NP-טיפול לא הניב שינוי משמעותי בגורמים אלה ולכן אין הבדל נראה במטופל לעומת PBW + תקשורת שטופל CuO-NP. הטכניקה של שילוב סביבתי בפועל עם רכיבי תקשורת הייתה מוצלחת בייצוג השינויים ראו בריכוזי אלמנט בשל טיפול; עם זאת טבע חמצון של PBW מוגבל איך יכול להתבצע PBW + התקשורת. בניסיון להגדיל את הריכוז המרבי של האלמנטים בתקשורת מבחן, תקשורת ותרבות תא אבקה הייתה מעורב במקור עם PBW מטופל ומטופל-CuO-NP לעשות PBW + תקשורת. תקשורת האבקה לעתים קרובות הביאה משקעים מלחי סידן וזה הגדיל את osmolality של PBW + התקשורת שנדרש דילול גדול יותר עם מים RO, הפקת concentrations הקרוב לאלו שהושגו עם 10x תקשורת נוזלית. נושאים אלה הם סיכוי טובים ביותר PBW ספציפיים בשל מצב חמצוני שלה ולא יכולים להיות בעיה עם תערובות פחות רגישות אחרות.

Assay MTT נבחר להעריך רעיל כי זה assay תפוקה גבוהה סטנדרטי הכיר בכך שמעריך את הבריאות הכללית של תאים על ידי מדידת פעילות המיטוכונדריה. לשיטה זו יתרונות וחסרונות. פורמט 96-גם הוא שימושי לקבלת נקודות נתונים מרובות עם זאת; רוב התאים ביום 5 היו לא בריאים למראה, מעוגל וכבר לא מחובר לצלחת. התמונות באיור 2 נלקחו לפני התקשורת הוסרה באמצעות ואקום; שאיבה מהתקשורת, ולאחר מכן להוסיף את פתרון MTT עשוי הסירו תאים פנויים או מנותק תאים גרועים חסיד, תורם לרמה הכוללת של אות MTT לאחר יום שני ראתה עם PBW שלא טופל. ההנחה היא שתאים צפים מתים או הגוססים וonly התאים המצורפים נבחנים בשיטה זו. כמו כן, חשוב לשקול את המגבלות של assay MTT ביחס למחקרים באמצעות חלקיקים.

מחקרים קודמים דיווח כי, כאשר ישירות להחיל תאים בתרבית, ייתכן שיש לי חלקיקים רעילים הגלום, מעבר לתכונות הכימיות בסיס שלהם, בהתאם למאפיינים הפיזיים הייחודיים שלהם, כגון גודל וצורת 32,33. במחקר הנוכחי, שלא להחיל את CuO-הצירופים וישירות על גבי התאים. במקום זאת, תאים נחשפו לPBW שטופל בעבר עם CuO-NPS, centrifuged להסיר את רוב CuO-הצירופים ולאחר מכן מסוננת פעמיים כדי להסיר יותר CuO-צירופים ולפני PBW שימש להכנת PBW + תקשורת. תוצאות MS הראו עלייה בנחושת לאחר טיפול. זה יכול להיות יוני נחושת שפורקו מהחלקיקים במהלך טיפול או CuO-צירופים ושייתכן שעברו את שלבי צנטריפוגה / הסינון להישאר בPBW טופל used לעשות PBW + תקשורת. CuO-צירופים ונעים בגודל 12-18 ננומטר עם שטח פן BET נמדד של 85 ± 1 מ 2 / g 11 אבל ידועים לצבור ומבוססים על הגידול המזערי בריכוזי נחושת בPBW טופל, רוב נחושת קשר של המקור מוסר לאחר צנטריפוגה וסינון. אישור חזותי של בריאות תא משופרת ומפגש לתמוך בתוצאות assay MTT של כדאיות השתפרה עקב טיפול CuO-NP של PBW (איור 2). מחקרים עתידיים בשיטות אחרות יכול להעריך (או לאפיין) תופעות של בלבול דומה הנגרמות על ידי CuO-צירופים.

תאי כליה העוברית אנושית (HEK 293) והאדם Hepatocellular Carcinoma (G2 HEP) נבחרו לבדיקת רעילות. אלה שורות תאים סטנדרטיים הקליניות רלוונטיים לרעילות איבר כבדה מתכת 24,25,34-40. צפיפות זריעה נמוכה שימשה למבחני MTT. תאי זרע בתאים 500 / טוב, אפשרו להתאוששבמשך 24 שעות, ולאחר מכן נחשף לתקשורת המבחן. צפיפות הזריעה הנמוכה הייתה הכרחית כדי להשיג עקומת צמיחה בשלב יומן סביב יום 5, לפני שהפך-מחוברות שוב ונייח ביום 6 או 7. Chakraborty et al. (2010) דיווח כי במחקר של רעילות קדמיום בכליות בתרבית תאים הפרוקסימלי אבובית (PTC), confluency ומצב התפשטות (מתרבים לעומת שקט) השפיעו על התגובה לחשיפת קדמיום: תאים תת-מחוברות מתרבות הראו יותר רעילים מאשר מחוברות תאים (שקטים). תאי HEK HEP ונחשפו לPBW בריכוזים גבוהים יותר (confluency יותר) דומים לאלה המשמשים assay אחר (תוצאות לא מוצגות) לא הראו שינויים חזקים במורפולוגיה ראתה עם assay MTT. יש צורך בחקירה נוספת לשינויים ברעילים באמצעות שורות תאים שאינם חסיד או פרוטוקולים שלקצור ולאסוף את כל התאים (לדוגמא cytometry זרימה).

מגבלה נוספת של שיטת MTT במחקרינוing חלקיקים הוא שסוגים מסוימים של חלקיקים עלולים להפריע לתזונה סלולרית. תרבות תקשורת הסלולרי בדרך כלל מכילה מקורות הוסיפו חלבון, כגון סרום שור עוברי (FBS), כדי להשלים את צמיחת תאים. מחקרים הראו כי ננו-חלקיקי תחמוצת מתכת יכולים לרוקן רכיבי צמיחה חשובים בFBS, בשל יכולת הקליטה המוגברת של חלקיקים. חלקיקי תחמוצת מתכת הוכחו מקושרים לFBS דרך אינטראקציה עם סידן 41. בהתאם לרמת החומציות של הפתרון, חלקיקי מתכת יכולים לשאת מטען חיובי או שלילי. מחקרים רעילים הראו כי חלקיקי המתכת הוסיפו לתרבית תאי תקשורת לספוג קטיונים, כולל Ca 2 +, ולאחר מכן להסיר FBS / אלבומין בסרום באמצעות מחייב של מתחם NP-Ca 2 + לסידן מחייב אתרים בחלבונים בFBS. זה מקטין את הריכוז של Ca 2 + וFBS מהתקשורת, באופן המרעיב את התאים והגדלת הרעילים מיוחס לnanoparticles 41. יתר על כן, לפני חשיפה של חלקיקים לFBS / Ca 2 + מצופה חלקיקים, הפחתת ההשפעה הרעילה לתאים שלהם. עם זאת, אנחנו לא ישירות לחשוף את התקשורת לCuO-צירופים. כמו כן, אין ירידה משמעותית בCa 2 + ריכוזים נראו בPBW לאחר הטיפול בCuO-NPS, המציין אין קליטה משמעותית של Ca 2 + על CuO-הצירופים ותחול אותם להיקשר עם FBS. עם זאת, ריכוז הסידן בPBW גבוה מספיק שירידה נגרם ננו-חלקיקים אולי לא הייתה ברורה. זה עדיין לא סביר שCuO-הצירופים והשתמשו במחקר זה סופגים כמויות גדולות של סידן במהלך עיבוד, כי לא היה ירידה ביכולות קליטה של ​​ארסן CuO-הצירופים בPBW, המכיל רמות גבוהות של סידן בהשוואה למחקרים קודמים עם מי תהום עם סידן נמוך ריכוזי 13.

הנתונים מראים כי CuO-צירופים ולהסיר ארסן, ונדיום סלניום וUranium, וזה קשור לכדאיויות תא HEK וHEP משופרות בassay MTT. המנגנון (ים) שבו הכדאיות הוא השתפר טרם נקבע, אבל יכול להיות בגלל הסרת מזהמי עדיפות ידי CuO-NP, בין מנגנונים אחרים. המחקר הנוכחי מוכיח כי גם בשיטות סטנדרטי תרבות תא יכולים לשמש כדי להעריך את היעילות של שיטת טיפול במי ISR ננו-חלקיקים, פוטנציאל המאפשר מגוון רחב של מחקרים מכניסטית להסתיים, לפני שעברו במחקרים בבעלי החיים vivo יותר יקרים וגוזל זמן . בנוסף, CuO-צירופים ועשויים להיות תכליתי יותר לתהליכי כרייה ולטיפול בתערובות מתכת מ adsorbents הקונבנציונלי כמו תחמוצות של אלומיניום, ברזל, טיטניום, ומנגן, מאז CuO-צירופים ואינם דורשים התאמת pH או חמצון של מים להסרת ארסן, וCuO-צירופים ולהסיר את שני arsenite וarsenate בנוכחות פוספט אניוני המתחרה, סיליקט וסולפט. כמו כן, יכול להיות מחדש ומחדש CuO-צירופים ו-משומשות, הפחתת עלויות מגיב ואת כמות תוצרי לוואי פסולת הטיפול בילו בצורך של רשות 12.

מגבלות אפשריות של פרוטוקול MTT כוללות צפיפות הנמוכה תא בזמן חשיפה, ניתוק של תאים והפסד של אות, רעב תא וחשיפה ישירה אפשרית של התאים לתגובתיות MTT שינוי CuO-NP. צפיפות תאים ובעיות ניתוק יכולים להיות ממוענות באמצעות מבחן חלופי כגון cytometry זרימה, המאפשרת לצפיפות זריעה גבוהה יותר, כמו גם האוסף של כל התאים (כלומר, שניהם צף ומצורף). שאלות רעב תא יכולות להיות מוערכות על ידי מדידת ריכוזי גורם גדילה בתקשורת מעת לעת במהלך טיפול. עבודה עתידית תתמקד ביישום הפרוטוקול הנוכחי למבחנים שונים רעילים שיעסקו אם פעילות assay אפשרית CuO-NP חשיפה שינתה, מדידות של רעב תא במהלך טיפול וגם בודקים את היכולת של CuO-צירופים ולהסיר contaminaNTS ולהשפיע הרעיל של סוגים אחרים של תערובות מורכבות, כגון פסולת מאתרים מזוהמים ובברכות לסילוק פסולת. מחקרים כאלה גם התייחסו לשאלה האם השיטות היו חזקות במסגרות שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CuCl2 Sigma 203149
Borosilicate glass balls VWR 26396-639 6 mm
Nitric Acid Fisher A509-P500 Trace metal grade
0.45 μm syringe filter Fisher SLHA 033S S
10x EMEM Fisher BW12-684F
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
L-glutamine Fisher BP379-100
NaHCO3 Sigma S5761
Penicillin/Streptomycin ATCC 30-2300
0.22 μm vacuum filter unit Fisher 09-740-28C
HEK293 ATCC CRL-1573
HEPG2 ATCC HB-8065
Trypsin Sigma SV3003101
MTT Sigma M2128
D-penicillamine Fisher ICN15180680
96-well plates Fisher 07-200-92
DMSO Fisher D12814
Spectra Max 190 Molecular Devices
Visual MINTEQ version 3.0 KTH Royal Institute of Technology
ICP-MS Agilent Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013.
IC DIONEX DX 500 Dionex Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013.
VWR Incubator VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. What is the status of the U.S. nuclear industry? Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.gov/energy_in_brief/article/nuclear_industry.cfm (2014).
  2. International Energy Outlook. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.gov/forecasts/archive/ieo11/pdf/0484%282011%29.pdf (2011).
  3. Uranium Marketing Annual Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.gov/uranium/marketing/ (2014).
  4. Domestic Uranium Production Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.gov/uranium/production/annual/ (2014).
  5. Uranium Recovery. Washington (DC): U.S. United States Nuclear Regulatory Commission (US). Available from: http://www.nrc.gov/materials/uranium-recovery/license-apps/ur-projects-list-public.pdf (2014).
  6. U.S. Uranium Reserves Estimates. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.doe.gov/cneaf/nuclear/page/reserves/ures.html (2010).
  7. The Future of Uranium Production in Wyoming: A Public Forum on In-Situ Recovery. Washington (DC): Meridian Institute. Available from: http://www.uwyo.edu/ser/_files/docs/conferences/2010/uraniumforum/ser_uranium_forum_final_report.pdf (2010).
  8. Generic Environmental Impact Statement for In-Situ Leach Uranium Milling Facilities Washington (DC): U.S. Nuclear Regulatory commission (US). Available from: http://www.nrc.gov/reading-rm/doc-collections/nuregs/staff/sr1910/v1/ (2012).
  9. Wyoming surface water quality standards. Cheyenne (WY): State of Wyoming Department of Environmental Quality (US). Available from: http://soswy.state.wy.us/Rules/RULES/6547.pdf (2011).
  10. Qu, X., Alvarez, P., Li, Q. Applications of nanotechnology in water and wastewater treatment. Water Research. 47, (12), 3931-3946 (2013).
  11. Martinson, C., Reddy, K. Adsorption of arsenic(III) and arsenic(V) by cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, (2), 401-411 (2009).
  12. Reddy, K., McDonald, K., King, H. A novel arsenic removal process for water using cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 397, 96-102 (2013).
  13. Reddy, K., Roth, T. Arsenic Removal from Natural Groundwater Using Cupric Oxide. Ground Water. 51, (1), 83-91 (2012).
  14. Zhang, G., Ren, Z., Zhang, X., Chen, J. Nanostructured iron(III)-copper(II) binary oxide: a novel adsorbent for enhanced arsenic removal from aqueous solutions. Water Research. 47, (12), 4022-4031 (2013).
  15. Ali, I. New generation adsorbents for water treatment. Chemical Reviews. 112, (10), 5073-5091 (2012).
  16. Zhang, Q. CuO nanostructures: Synthesis, characterization, growth mechanisms, fundamental properties, and applications. Progress in Materials Science. 60, 208-337 (2014).
  17. Schmidt, C. TOX 21: new dimensions of toxicity testing. Environmental health perspectives. 117, (8), 348-353 (2009).
  18. Firestone, M., Kavlock, R., Zenick, H., Kramer, M. The U.S. Environmental Protection Agency Strategic Plan for Evaluating the Toxicity of Chemicals. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13, (2-4), 139-162 (2010).
  19. Guidance Manual for the Assessment of Joint Toxic Action of Chemical Mixtures [Internet]. Atlanta (GA); Agency for Toxic Substance and Disease Registry (US). Available from: http://www.atsdr.cdc.gov/interactionprofiles/IP-ga/ipga.pdf (2014).
  20. Bae, D., Gennings, C., Carter, W., Yang, R., Campain, J. Toxicological interactions among arsenic, cadmium, chromium, and lead in human keratinocytes. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 63, (1), 132-142 (2001).
  21. Whittaker, M. Exposure to Pb, Cd, and As mixtures potentiates the production of oxidative stress precursors: 30-day, 90-day, and 180-day drinking water studies in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 254, (2), 154-166 (2011).
  22. Schilz, J. Investigating the ability of cupric oxide nanoparticles to adsorb metal contaminants from uranium in-situ recovery (ISR) production bleed water and assessing the associated changes in cytotoxicity. University of Wyoming. Laramie, WY. Available from: ProQuest UMI, Ann Arbor, MI (2014).
  23. Manual of Standard Operating Procedures for Sample Collection and Analysis. Cheyenne (WY): Wyoming Department of Environmental Quality (US). Available from: http://deq.state.wy.us/wqd/watershed/downloads/qa/4-1089.pdf (2011).
  24. Florea, A., Splettstoesser, F., Büsselberg, D. Arsenic trioxide (As2O3) induced calcium signals and cytotoxicity in two human cell lines SY-5Y neuroblastoma and 293 embryonic kidney (HEK). Toxicology and Applied Pharmacology. 220, (3), 292-301 (2007).
  25. Mao, W. Cadmium induces apoptosis in human embryonic kidney (HEK) 293 cells by caspase-dependent and -independent pathways acting on mitochondria. Toxicology in Vitro. 21, (3), 343-354 (2007).
  26. Tchounwou, P., Yedjou, C., Patlolla, A., Sutton, D. Heavy Metal Toxicity and the Environment. Molecular, Clinical and Environmental Toxicology. 101, 133-164 (2012).
  27. Meerloo, J., Kaspers, G., Cloos, J. Cell Sensitivity Assays: The MTT Assay. Cancer Cell Culture. 731, 237-245 (2011).
  28. Gustafsson, J. Visual MINTEQ. Royal Institute of Technology. Stockholm, Sweden. (2010).
  29. Hallab, N., Caicedo, M., McAllister, K., Skipor, A., Amstutz, H., Jacobs, J. Asymptomatic prospective and retrospective cohorts with metal-on-metal hip arthroplasty indicate acquired lymphocyte reactivity varies with metal ion levels on a group basis. Journal of Orthopaedic Research. 31, (2), 173-182 (2013).
  30. Goswami, A., Raul, P., Purkait, M. Arsenic adsorption using copper (II) oxide nanoparticles. Chemical Engineering Research and Design. 90, (9), 1387-1396 (2011).
  31. Pillewan, P., Mukherjee, S., Roychowdhury, T., Das, S., Bansiwal, A., Rayalu, S. Removal of As(III) and As(V) from water by copper oxide incorporated mesoporous alumina. Journal of Hazardous Materials. 186, (1), 367-375 (2011).
  32. Kroll, A. Cytotoxicity screening of 23 engineered nanomaterials using a test matrix of ten cell lines and three different assays. Particle and fibre toxicology. 8, (9), 1-19 (2011).
  33. Fahmy, B., Cormier, S. Copper oxide nanoparticles induce oxidative stress and cytotoxicity in airway epithelial cells. Toxicology in vitro: an international journal published in association with BIBRA. 23, (7), 1365-1371 (2009).
  34. Radike, M. Distribution and accumulation of a mixture of arsenic, cadmium, chromium, nickel and vanadium in mouse small intestin, kidney, pancreas, and femur following oral administration in water or feed. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 65, (23), 2029-2052 (2002).
  35. Barbier, O., Jacquillet, G., Tauc, M., Cougnon, M., Poujeol, P. Effect of heavy metals on, and handling by, the kidney. Nephron. Physiology. 99, (4), 105-110 (2005).
  36. Zheng, X., Watts, G., Vaught, S., Gandolfi, A. Low-level arsenite induced gene expression in HEK293 cells. Toxicology. 187, (1), 39-48 (2003).
  37. Li, Z., Piao, F., Liu, S., Wang, Y., Qu, S. Subchronic exposure to arsenic trioxide-induced oxidative DNA damage in kidney tissue of mice. Experimental and Toxicologic Pathology. 62, (5), 543-547 (2010).
  38. Farombi, E., Akintunde, J., Nzute, N., Adedara, I., Arojojoye, O. Municipal landfill leachate induces hepatotoxicity and oxidative stress in rats. Toxicology and Industrial Health. 28, (6), 532-541 (2011).
  39. Das, N. Arsenic exposure through drinking water increases the risk of liver and cardiovascular diseases in the population of West Bengal. India. BMC public health. 12, (1), 639-648 (2012).
  40. Valko, M., Morris, H., Cronin, M. Metals, toxicity and oxidative stress. Current Medicinal Chemistry. 12, (10), 1161-1208 (2005).
  41. Horie, M. Protein Adsorption of Ultrafine Metal Oxide and Its Influence on Cytotoxicity toward Cultured Cells. Chemical Research in Toxicology. 22, (3), 543-553 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats