Die Entfernung der Spurenelemente von Kupferoxid Nanopartikeln aus Uranium
1Division of Physical Therapy, Department of Orthopedics & Rehabilitation, University of New Mexico, 2Department of Ecosystem Science and Management, University of Wyoming, 3School of Pharmacy, University of Wyoming, 4Department of Environmental and Radiological Health Sciences, Colorado State University, 5Center for Environmental Medicine, Colorado State University, 6College of Pharmacy, California Northstate University

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Schilz, J. R., Reddy, K. J., Nair, S., Johnson, T. E., Tjalkens, R. B., Krueger, K. P., et al. Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability. J. Vis. Exp. (100), e52715, doi:10.3791/52715 (2015).

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Abstract

In situ-Gewinnung (ISR) ist die vorherrschende Methode der Urangewinnung in den Vereinigten Staaten. Während der ISR wird Uran aus einem Erz Körper ausgelaugt und durch Ionenaustausch extrahiert. Die sich ergebende Produktionsblutwasser (PBW) enthält Schadstoffe wie Arsen und andere Schwermetalle. Proben von PBW von einem aktiven ISR-Urananlage wurden mit Kupfer-II-Nanopartikel (CuO-NPs) behandelt. CuO-NP Behandlung PBW reduziert vorrangiger Schadstoffe einschließlich Arsen, Selen, Uran und Vanadium. Unbehandelt und CuO-NP behandelt PBW wurde als die flüssige Komponente der Zellwachstumsmedien und Änderungen der Lebensfähigkeit verwendet wurden mit dem MTT (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) bestimmt Assay in humanen embryonalen Nieren (HEK 293) und die menschliche Leberzellkarzinom (Hep G2-Zellen). CuO-NP-Behandlung wurde mit verbesserten HEK und HEP Lebensfähigkeit der Zellen verbunden. Beschränkungen dieses Verfahrens umfassen die Verdünnung des PBW durch Wachstumsmedienkomponenten und während osmolnalität Verstellung sowie notwendige pH-Einstellung. Dieses Verfahren wird im weiteren Kontext durch Verdünnungseffekte und Veränderungen im pH-Wert der PBW die jedoch üblicherweise leicht sauer ist begrenzt; Diese Methode könnte einen breiteren Einsatz der Beurteilung CuO-NP Behandlung in neutraler Gewässer.

Introduction

Etwa 20% des US-Stromversorgung durch Kernenergie und zum Teil auf der Grundlage nationaler Anreize zur Energieunabhängigkeit zu erhöhen, US nukleare Kapazität wird voraussichtlich weiter steigen 1. Weltweites Wachstum der Kernenergie auch wird sich voraussichtlich fortsetzen, wobei ein Großteil des Wachstums außerhalb der USA 2 auftritt. Ab 2013 wurde 83% der US Uran importiert, aber 952.544 Tonnen Reserven in den USA 3,4 vorhanden sind. Im Jahr 2013 gab es 7 neue Anlage-Anwendungen und 14 Neustart / Erweiterung von Anwendungen zwischen Wyoming, New Mexico, und Nebraska 5. In den USA Uran vorwiegend durch in situ-Gewinnung (ISR) verarbeitet 6 extrahiert. ISR bewirkt, dass weniger Land Unterbrechung und verhindert die Schaffung Halden, die Umweltschadstoffe 7 freigeben können. ISR verwendet wasserbasierte Oxidations Lösungen für Uran von der U-Erzkörper, wonach das Uran aus dem Sickerwasser durch extrahiert auslaugenein Ionenaustauschverfahren 8. Um eine negative Wasserbilanz in der Erzkörper zu halten, wird ein Teil des Sickerwassers, bluten genannt Produktionswasser (PBW) ist abfallend. Ein Teil der PBW wird mit Umkehrosmose (RO) und dekontaminiert in den Abbauprozess wieder eingeführt, aber PBW könnte auch von Vorteil industriellen oder landwirtschaftlichen Nutzen haben, wenn toxische Schadstoffe auf ein annehmbares Niveau von staatlichen Aufsichtsbehörden für die Oberflächen ermittelt und reduziert werden Grundwasser 9. Gegenwärtig sind die meisten ISR-Uran Einrichtungen nutzen RO, um Verunreinigungen aus PBW entfernen. Allerdings ist RO Bearbeitungsenergieintensiv und erzeugt giftige Abfälle Sole, die geregelte Entsorgung erfordert.

Viele Wasserdekontaminationsverfahren existieren, einschließlich Adsorbentien, Membranen und Ionenaustausch. Von diesen ist die Adsorption der am häufigsten verwendet wird, und die jüngsten Entwicklungen in der Synthese von Nanopartikeln ist die Leistungsfähigkeit des Adsorptionsmittels basierten Wasser Dekontaminierungsverfahren 10 verbessert. Cupric oxide-Nanopartikel (CuO-NPs) hatte zuvor nicht umfassend auf Uran ISR PBW studiert, aber in den letzten Studien der Entfernung von Verunreinigungen aus dem Grundwasser, CuO-Nanopartikel wurden gefunden, um einzigartige Eigenschaften, einschließlich nicht vor oder nach der Wasserbehandlungsschritte erfordern (haben B. Einstellen des pH oder Redox-Potential) und eine gute Leistung in unterschiedlichen Wasserzusammensetzungen (beispielsweise in verschiedenen pH-Werten, Salzkonzentrationen oder konkurrierende Ionen) 11. Zusätzlich sind CuO-NPs leicht durch Auslaugen mit Natriumhydroxid (NaOH), wonach der regenerierte CuO-NPs können wiederverwendet werden regeneriert. Details der CuO-NP Spurenmetallfilterfunktionen von natürlichen Gewässern haben bisher veröffentlichten 11-14 worden.

Obwohl nützlich für die Wasserbehandlung können Metalloxidnanopartikel toxisch für lebende Organismen, aber das Ausmaß der Toxizität hängt teilweise von Nanopartikel Merkmale und Bestandteile 10,15,16. Daher ist es wichtig zu untersuchen simultaneous Entfernung von Verunreinigungen und Nanopartikel-Toxizitäten vor Feldeinsatz. Die aktuelle Studie ermittelt die Fähigkeit des CuO-Nanopartikel zu Prioritäts PBW Verunreinigungen (einschließlich Arsen, Selen, Vanadium und Uran) zu entfernen, und bewertet die Wirkung von CuO-NP-Behandlung auf PBW Zytotoxizität.

PBW wurde aus einer aktiven ISR Urananlage gesammelt und verwendet, um die Wirksamkeit von CuO-NP Behandlung Priorität Verunreinigungsentfernung zu bestimmen. PBW Zytotoxizität vor und nach der CuO-NP Behandlung auch beurteilt. PBW ist eine komplexe geologische (Industrie / Umwelt) des Gemischs und sowohl das National Institute of Environmental Health and Science (NIEHS) und der Agentur für Toxic Substances & Disease Registry (ASTDR) werden den Schwerpunkt auf die Untersuchung der Toxizität von umweltrelevanten Gemischen, einschließlich Mischungen wie sie in der Natur oder industriellen Umgebungen, sowie die Förderung in vitro-Tests bestehen, um Chemikalien für weitere in-vivo-Tests zu priorisieren17-19. Studien zur chronischen, niedrig dosierte Mischung Engagements sind eine Herausforderung, weil chronische Exposition gegenüber einer niedrigen Dosis Mischung nicht produzieren offensichtlichen Auswirkungen, zumindest nicht in der kurzen Zeit der meisten Laborstudien. Ähnlich den meisten in-vitro-Untersuchungen von chemischen Mischungen aussetzen Zellen einer definierten Labor hergestellten Mischung aus 2 oder mehreren Metallen 20,21. Diese Studien liefern Basisinformationen, aber vereinfachte Mischung nicht den komplexen antagonistischen und synergistischen Interaktionen, die in einer nativen, Umweltprobe, in der das gesamte Spektrum der Mischungskomponenten vorliegen, die auftreten können zu replizieren.

Die Ziele dieser Studie waren alternative Schmutzentfernungsverfahren für PBW zu untersuchen und die Wirkung (CuO-NP) Behandlung auf PBW Cytotoxizität an kultivierten menschlichen Zellen zu bewerten. Die Ergebnisse könnten die Uranindustrie durch die Entwicklung effizienter und umweltfreundliche Methoden zur Entfernung von Verunreinigungen zu profitieren. Diese Studie liefertder erste Beweis, dass die Reduktion der vorrangigen Schadstoffe in PBW von CuO-Nanopartikel reduziert Zytotoxizität in Säugetierzellen 22.

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Protocol

Alle Proben wurden bei der Uranflüssigkeitsverarbeitung Bau einer Uran ISR-Anlage in Wyoming gesammelt.

1. Herstellung Bleed Water (PBW)

  1. Sammeln zwei Arten von Wasserproben aus einem ISR-Urananlage: PBW und Umkehrosmose (RO) Wasser. Sammeln PBW von einem Überwachungshahn nach dem Ionenaustauschverfahren, aber vor der Umkehrosmose Dekontamination. Sammeln RO Proben nach der PBW durch Umkehr-Osmose-Behandlung dekontaminiert.
    HINWEIS: Auslaugmittel in Rohrleitungen von mehreren gut Felder zur Uranflüssigkeitsverarbeitungsgebäude, wo es in einer Säule gesammelt und für die Ionenaustausch hergestellt transportiert. Etwa 1-3% der Auslaugmittel nach dem Ionenaustausch aus dem Kreislauf entfernt und bezeichnet Produktionsblutwasser (PBW). PBW ist in den Mining-Prozesse wiederverwendet oder dekontaminiert / mit RO Filtration entmineralisiert.
  2. Sammeln Wasserproben in Polyethylen hoher Dichte (HDPE) Flaschen mit Nullkopfraum nachzu Standardarbeitsanweisungen für die Probenentnahme und Analyse des Wyoming Department of Environmental Quality (WYDEQ) 23.
  3. Messen Sie Temperatur und pH-Vor-Ort-und Transport Proben auf Eis, um sie kühl zu halten.
  4. Speicher PBW bei 4 ° C. Halten Sie das PBW Lösung kühl bis nach der konzentrierten essentiellem Eagle-Minimalmedium (EMEM-10x) wird während der Medienvorbereitung hinzugefügt, wie in dem folgenden Protokoll angewiesen.
    HINWEIS: PBW eine oxidierte Lösung, die ausfällt, wenn man sie einfrieren oder auf Raumtemperatur erwärmt. Nach Verdünnen der PBW Lösung ausreichend verdünnt, daß es nicht ausfallen, wenn es auf 37 ° C vor der Anwendung auf Zellen und während der Inkubation.

2. Herstellung von CuO-Nanopartikel (CuO-NPs)

  1. Kombinieren eines reinen Ethanollösung, die 250 ml von 0,2 M CuCl 2 • 2H 2 O, 250 ml 0,4 M Natriumhydroxid (NaOH) und 5 g Polyethylenglykol (PEG) in einem Rundkolben mit sechs mm Borosilikatglas Bälle.
  2. Legen Sie die Lösung in einer modifizierten Mikrowelle und lassen Sie es unter Rückfluss bei Umgebungsluftdruck für 10 Minuten bei 20% Leistung (Abstand von 6 sec auf 24 sec aus) zu reagieren.
  3. Die Lösung wird auf Raumtemperatur (20 ° C), dann in 50 ml konische Röhrchen dekantiert, wobei die Glaskugeln.
  4. Zentrifuge die Lösung in 50 ml konische Röhrchen bei 1.000 xg für 30 Minuten, dekantiert und wäscht danach den CuO-Nanopartikel, die mit einer Sequenz von 300 ml heißem Wasser (60-65 ° C), 100 ml Ethanol und 100 ml Aceton.
  5. Man trocknet die CuO-NPs auf Raumtemperatur (20 ° C) in den 50 ml konische Röhrchen.
  6. Kratzen Sie die CuO-Nanopartikel aus ihren Röhren in einem Mörser. Decken Sie die CuO-Nanopartikel mit Alufolie und erhitzen das CuO-NPs bis 110 ° C in einem Ofen, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen. Kombinieren CuO-Nanopartikel in einer Charge und wiegen die CuO-Nanopartikel.
    HINWEIS: Die Vorbereitung der CuO-Nanopartikel und CuO-NP Behandlung von PBW wurden in Wasser durchgeführt Qualkeit Laboratory of Ecosystem Science and Management, University of Wyoming. CuO-NP-Synthese folgte dem Verfahren von Martinson und Reddy (2009) 11.

3. Behandlung von PBW mit CuO-NPs

  1. Dann werden 50 mg (1 mg / ml) von CuO-NP zu einer 50 ml konischen Röhrchen, gefolgt von 50 ml PBW. Verschließen Sie den Schlauch und reagierte für 30 Minuten auf einer Tischorbitalschüttler bei 250 Upm.
  2. Zentrifugenprobenröhrchen bei 250 · g für 30 Minuten und dann auswählen, den Überstand unter Verwendung eines 0,45 & mgr; m-Spritzenfilter. Verändern die Zentrifugendrehzahl und die Zeit auf dem Nanopartikel abhängen, um sicherzustellen, das CuO-NPs werden kompakt in dem Zentrifugenröhrchen.

4. Elementaranalyse

  1. Vorbereitung unbehandelt (Kontrolle) und CuO-NP behandelt PBW Proben für die Elementaranalyse wie folgt.
  2. Anzusäuern Aliquots (40 ml) von CuO-NP-behandelten und unbehandelten PBW mit Spurenmetall Salpetersäure auf einen pH von 2,0. Analysieren angesäuerten Aliquots PBW für Kationen durch induktiv coupled Plasma-Massenspektroskopie (ICP-MS), wie in Reddy und Roth (2012) 13 beschrieben.
  3. Vorbereitung angesäuerten Aliquots (20 ml) von CuO-NP-behandelten und unbehandelten PBW und Analyse der nicht angesäuerten Aliquots Anionen durch Ionenchromatographie (IC), wie in Reddy und Roth (2012) 13 beschrieben.
    HINWEIS: Aliquots wurden vom Wyoming Department of Agriculture Analytical Services, Laramie WY 82070. Eine Beschreibung des IC und ICPMS Verfahren kann in Reddy und Roth, (2012) 13 gefunden werden analysiert.

5. Herstellung von Zellkulturmedien Mit PBW

  1. Verwenden Sie zwei Steuer (EMEM-1x und RO + Medien) und acht PBW Testmedienlösungen (vier Konzentrationen jedes der unbehandelten PBW und CuO-NP-behandelten Medien) in den Machbarkeitsstudien. Übersichten über die Lösungen sind wie folgt:
    1. Für EMEM-1x Steuerung erwerben essentiellem Eagle-Minimalmedium (EMEM-1x) mit L-Glutamin und Natriumbicarbonat bereits hinzugefügt. Hinzuzufügen fötalem Rinderserum (FBS) Und Antibiotika, den Anweisungen des Herstellers.
      HINWEIS: EMEM-1x wird verdünnt, um die geeignete Konzentration für das Zellwachstum und die L-Glutamin und Natriumbicarbonat bezogen. EMEM-1x erfordert die Zugabe von fötalem Rinderserum (FBS) und einem Antibiotikum Mischung von Penicillin und Streptomycin (50 IU / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin). EMEM-1x als Steuermittel verwendet, da es vom Hersteller empfohlenen Wachstumsmedien für beide Zelltypen in dieser Studie verwendet. Konzentrierte EMEM-10x ist mit RO-Wasser aus der Anlage oder unbehandelt oder CuO-NP-behandelten PBW verdünnt, um die Testlösungen herzustellen. Konzentrierte EMEM-10x zum Zeitpunkt des Kaufs nicht L-Glutamin oder Natriumbicarbonat so dass diese zusätzlich zu dem fötales Rinderserum (FBS) und einem Antibiotikum Mischung aus Penicillin und Streptomycin zugesetzt enthalten.
    2. Für die RO Kontrolllösung verwenden RO Wasser aus der ISR-Anlage gesammelt. Verwenden Sie das gleiche Protokoll wie die PBW Testmedien ersetzen, nur 100% RO water von der ISR-Anlage anstelle von PBW. Um den unbehandelten und CuO-NP-behandelten Lösung Gebrauch RO oder ultrareines Wasser aus dem Labor zu verdünnen.
    3. Verdünnter unbehandeltem PBW in vier Testkonzentrationen vor der Vermischung mit den Zellkulturmedienkomponenten. Bereiten Sie die vier verschiedenen Konzentrationen von unbehandelten PBW Lösungen durch Mischen von unbehandelten PBW mit RO (aus dem Labor) in den folgenden Kombinationen: 100% (reine PBW + nein RO Wasser), 75% (187,5 ml PBW + 62,5 ml RO-Wasser), 50% (125 ml PBW + 125 ml RO-Wasser) oder 25% (62,5 ml PBW + 187,5 ml RO-Wasser).
    4. Verdünnter CuO-NP behandelt PBW in vier Testkonzentrationen vor der Vermischung mit den Zellkulturmedienkomponenten. Bereiten Sie die vier verschiedenen Konzentrationen von CuO-NP behandelt PBW Lösungen durch Mischen PBW (vorbehandelt mit 1 mg / ml CuO-NP für 30 min) mit RO (aus dem Labor) in folgenden Kombinationen: 100% (reine CuO- NP-behandelten PBW + nein RO Wasser), 75% (187,5 ml CuO-NP-behandelten PBW + 62,5 ml RO-Wasser), 50% (125ml CuO-NP-behandelten PBW + 125 ml RO-Wasser) oder 25% (62,5 ml CuO-NP-behandelten PBW + 187,5 ml RO-Wasser).
  2. Vorbereitung 250 ml RO + Medien unbehandeltem PBW + Medien und CuO-NP behandelt PBW + Medienkonzentration durch Zugabe von 25 ml konzentrierter EMEM-10x bis 190 ml des 100% RO und 100%, 75%, 50% oder 25% der vorgefertigten unbehandeltem oder CuO-NP behandelt PBW-Konzentrationen in Schritt 6.1.3 und 6.1.4 erstellt.
  3. Der pH-Wert jeder Lösung auf 7,4 mit NaOH oder HCl.
  4. Ergänzen Konzentration von unbehandelten und CuO-NP-behandelten PBW sowie RO + Medien mit den folgenden Standardkomponenten: 25 ml (10%) fötales Rinderserum (FBS), 2,5 ml L-Glutamin, 0,55 g NaHCO 3 und 1,25 ml Pen / Strep (50 IU / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin).
  5. Stellen Sie die Osmolalität jede Konzentration der unbehandelten PBW + Medien, CuO-NP-behandelten PBW + Medien und RO + Medien auf 290-310 mOsm / kg durch Zugabe von RO Wasser und Maß mit einem Osmometer.
  6. Filtern sie jede Lösung mitein 0,22 um Vakuumfiltereinheit, und bei 4 ° C.
    HINWEIS: Aufgrund der leichten Schwankungen in der Menge an RO-Wasser verwendet, um die Osmolalität einzustellen, variieren endgültigen Medienkonzentrationen innerhalb von 5% liegen, mit unbehandeltem PBW + Medienkonzentrationen bei 56%, 44%, 29% und 16,5% und CuO-NP- behandelt PBW + Medienkonzentration auf 53%, 45%, 30% und 17%.

6. Zelllebensfähigkeit

HINWEIS: Da die Nieren und Leber sind die Zielorgane der Toxizität von Schwermetallen, beschäftigen kultivierten menschlichen embryonalen Nieren (HEK293) Zellen (HEK) und die menschliche Leberzellkarzinom (HepG2) Zellen (HEP) Prüfverfahren 24-26.

  1. Bereiten Sie eine Kultur der HEK und HEP-Zellen 2-3 Tage vor dem Beschichten der Platten mit 96 Vertiefungen in dem Experiment den Anweisungen des Herstellers verwendet wird.
  2. Messen der Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung der 3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Assay.
    HINWEIS: Der MTT-Assay-Protokoll wurde von Mee modifizierterloo et al. (2011) 27.
    1. Erhalten MTT in Pulverform. Hinzufügen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um eine Stammkonzentration von 50 mg / ml. Man schüttelt die Lösung für 2 Stunden und dann mit einer 0,45 um Spritzenfilter und Aliquots in 1,5 ml Gefrier sichere Rohre filtern. Schützen Rohre von Licht und bei 4 ° C.
  3. Entfernen HEK und HEP-Zellen aus ihren Kulturschalen mit Trypsin, Zentrifuge bei 1.000 xg für 5 min und dekantiert die Trypsin. 5 ml PBS und mischen Zellen, um eine Einzelzelllösung zu erhalten. Dann gelten 20 ul der einzelnen Zelllösung zu einem Hämocytometer, um eine Zellzahl pro Milliliter der Lösung zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 1.000 xg für 5 min und dekantieren die PBS verwendet, um die Zellen zu spülen. Fügen Sie die entsprechende Menge an EMEM-1x um die Konzentration der Zellen auf 500 Zellen einstellen / 100 ul (100 ul / Vertiefung).
  4. Füllen Sie die Perimeter Vertiefungen der Platte mit 200 ul PBS, um für die Verdampfung zu steuern.
  5. Seed-Zelles bei einer Dichte von 500 Zellen / Well die Zugabe von 100 & mgr; l zu jeder Vertiefung, mit Ausnahme der Umfangsvertiefungen (die nicht mit Zellen plattiert sind).
    HINWEIS: Beimpfungsdichte für HEK und HEP-Zellen basiert auf experimentellen Wachstumskurven, die die Spitze des Wachstums auf etwa 4-5 Tage auftreten erlauben. Bereiten Wachstumskurven für alle Zelllinien zu Aussaatdichte zu schätzen.
  6. Zellen einer Inkubationszeit von 24 h bei 37 ° C so dass sie (Form durch straffe Verwachsungen an der Platte), bevor Basis MTT Lesungen Zelldichte zu erholen.
  7. Zuführen Basis MTT Ablesungen Zelldichte durch Entfernen der Aussaat Medien aus der ersten Kolonne (ohne den Umfang), und die Zugabe von 100 ul MTT (5 mg / ml in Medium) zu den Vertiefungen für 1 Stunde.
  8. Nach einer Stunde, entfernen Sie das MTT und fügen Sie 100 ul Dimethylsulfoxid (DMSO), um die MTT-Formazan von lebensfähigen Zellen (20 min) hergestellt aufzulösen.
  9. Optische Dichte (OD) der ersten Kolonne bei einer Absorptionswellenlänge von 570 nm, um eine Basis zu erhalten,Linie Lese.
    1. Verwenden Basismesswerte, um sicherzustellen, alle Platten wurden korrekt und ausgesät, dass Zellen stetig wachsende zwischen den Platten. Entfernen Sie das DMSO aus der Säule ist vor Inkubation der nächsten 24 Stunden geprüft.
      HINWEIS: Wenn DMSO ist in der Platte über Nacht stehen gelassen zieht Feuchtigkeit von der benachbarten Spalte, was zu einer Verringerung des Medienvolumens.
  10. Wärmen Sie die Testlösungen (dh die EMEM-1x, RO, unbehandelte PBW und CuO-NP-behandelten PBW-Media-Lösungen) auf 37 ° C im Wasserbad.
  11. Entfernen der Aussaat Medien aus dem Rest der Platte (ohne den Umfang oder die erste Spalte, die für die Basislese verwendet wurde) und mit 100 & mgr; l EMEM-1x, RO + Medien, unbehandeltem PBW + Medienkonzentrationen oder CuO-NP ersetzt behandelten PBW + Medienkonzentration (eine Lösung pro Platte). Zellen in ihrem Testkonzentrationen oder Kontrolllösungen Inkubation für insgesamt sieben Tage (Tage 2-8).
    HINWEIS: Es gibt 10 Platten insgesamt: 1 EMEM-1x, 1 RO + Medien, 1 jedes unbehandelten PBW + Medienkonzentration (56%, 44%, 29% und 16,5%) und eine Platte jedes CuO-NP-behandelten PBW + Medienkonzentration (53%, 45% , 30% und 17%) pro Experiment pro Zelllinie.
  12. Jeder Tag nach Baseline-MTT Lesen, entfernen Sie die Kontroll- und Testlösungen (in der Note unter 6.11 aufgeführten) von der nächsten Spalte der jeweiligen Platte (zB Tag 2 Test- und Kontrollmedien von Zeile 3 entfernt, Brunnen BG, Tag 3: Zeile 4. Brunnen BG etc.) und wiederholen die MTT-Protokoll wie in den Schritten 6,7-6,9 oben beschrieben.
  13. Wiederholen Sie die Protokoll täglich für sieben Tage. Der Mittelwert der OD Ergebnisse für jede Zeile (6 wells) und gegen die Zeit berichtet, dass eine Sieben-Tage-Wachstumskurve zu erzeugen.
  14. Um die Wirkung von Kupfer Chelat auf die Lebensfähigkeit der Zellen in beurteilen CuO-NP behandelt PBW + Medien nach dem gleichen Verfahren wie oben, mit der Ausnahme, werden 100 & mgr; M D-Penicillamin zu steuern und Testlösungen vor der Zugabe der Lösungen zu ihren jeweiligen Platten. Führen Sie die Daten anallyse mit wissenschaftlichen Grafik-Software.

7. Geochemische Modellierung

  1. Download Visual MINTEQ Version 3.0 / 3.1 eine Freeware von der folgenden Website http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/ .
    Hinweis: Visual MINTEQ ist ein Freeware chemischen Gleichgewichtsmodell für die Berechnung von Metall Speziation, Löslichkeitsgleichgewichte, Sorption usw. für natürliche Wässer. Darüber hinaus ist es verwendet wird, um die Speziation, Ionenaktivitäten, Ionenkomplexe und Sättigung Indizes, die zu der Konzentration der Elemente vor und nach der Behandlung (Massenspektroskopie ergibt) verglichen wird, um die möglichen Mechanismen der Elemententfernung 28 zu untersuchen zusagen.
  2. Das Programm zu öffnen und geben die Massenspektroskopiedaten aus Schritt 4, einschließlich pH, ​​Alkalinität und die Konzentrationen von verschiedenen Elementen in das Programm.
    HINWEIS: Da das Grundwasser während der in situ oxidiert uranium Extraktionsverfahren verwenden oxidierten Spezies von Arsen, Vanadium und Uran für die Eingabe.

8. Hemmkonzentration 50 (IC 50)

  1. Berechnen Sie die IC 50 für die unbehandelten und CuO-NP-behandelten PBW + Medienkonzentration durch Mittelung des ersten Lebensfähigkeit (OD-Mittelwerte) am Tag 5 der drei Läufe.
  2. Subtract Tag fünf Lebensfähigkeit Mittelwerte der unbehandelten und CuO-NP-behandelten PBW + Medienkonzentrationen von Tag fünf Lebensfähigkeit Durchschnittswerte von EMEM-1x Rentabilität Unterschiede zu berechnen. Dann teilen Sie die Lebensfähigkeit Unterschiede durch die durchschnittliche Rentabilität an Tag 5 in EMEM, und mit 100 multipliziert, um die prozentuale Hemmung zu erhalten.
  3. Subtrahieren Sie die prozentuale Hemmung von 100 (EMEM-1x Lebensfähigkeit), um die prozentuale Lebensfähigkeit für jede unbehandelte und CuO-NP-behandelten PBW + Medienkonzentration zu erhalten.
  4. Eingang in die wissenschaftliche Grafik-Software, indem Sie EMEM-1x in einer Konzentration von einem Prozent und einer Tragfähigkeit von 100; verwandeln alle Konzentrationen in logSkala (X = Log (X)) und durchzuführen, nichtlineare Regression mit kleinsten Quadrate-Analyse.

9. Datenanalyse

  1. Konzentrationen der Elemente in unbehandelten und CuO-NP-behandelten PBW Vergleichen Sie mit einem zweiseitig, paarweise, Student T-Test.
  2. Berechnen Sie die Flächen unter der Kurve (AUC) mit Hilfe der Wachstumskurve Daten über sieben Tage gesammelt und analysiert die Varianz mit wiederholten Messungen Varianzanalyse (ANOVA), durch Tukey post hoc Vergleich zwischen allen Gruppen gefolgt (n = 3).
  3. Berechnen Sie die IC 50 unter Verwendung von Daten von Tag fünf der Wachstumskurve sowohl für unbehandelte und CuO-NP-behandelten PBW + Media-Lösungen (oben beschrieben). P-Werte <0,05 als signifikant angesehen werden.
    HINWEIS: Für die Zwecke der statistischen Analyse wurde Massenspektroskopie Werte der Hälfte der Nachweisgrenze, um Ionen-Konzentrationen Ebenen unterhalb dieser Grenze 29 zugeordnet.

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Representative Results

PBW Komponentenkonzentrationen und pH-Wert in unbehandelten und CuO-NP behandelt PBW sind in Tabelle 1 angegeben. Martinson und Reddy (2009), berichtet, dass der Ladungsnullpunkt der CuO-NP wird bei 9,4 ± 0,4 geschätzt. Da der pH-Wert der PBW war 7,2-7,4, unter diesen Bedingungen Wasser spendet Protonen auf CuO-NPs, wodurch die Oberfläche der Nanopartikel, um positiv geladene dauern, um die Adsorption von negativ geladenen Spezies. CuO-NP Behandlung entfernt Verunreinigungen aus Priorität PBW einschließlich Arsen, Selen, Uran und Vanadium (Tabelle 1). Die durchschnittliche Arsenkonzentration wurde um 87% [0,0175 bis 0,002 mg / L (zweiseitigen gepaarten t-Test, p <0,0001)] reduziert. CuO-NP-Behandlung deutlich reduziert Selen (30%), Uran (78%), Vanadium (92%) und Phosphat (85%) (p <0,05).

Artbildung Modellierungsergebnisse, die in Tabelle 2 angegeben, unterstützen die analytischen Ergebnisse: 99% der zutal gelöstem Arsen in PBW liegt als HAsO 4 2- und H 2 AsO 4 - und 94% der Gesamtmenge der gelösten Selen in PBW als SeO 4 2- vorliegt. Diese Spezies negativ geladen sind, damit in der Lage, zur Adsorption an CuO-Nanopartikel. Speziation Modellierung vorhergesagt, dass 99% der Vanadiumspezies in PBW negativ geladen sind, auch die Förderung der Adsorption an CuO-Nanopartikel. Jedoch vorhergesagt Speziation Modellierung nur 35,5% des Urans Spezies negativ geladen sind, die die Adsorption an CuO-NPs begrenzen würde. Analyse der Sättigungsindizes voraus, dass keine Art von Arsen, Selen, Uran oder Vanadium enthaltenden Mineralien waren nahe der Sättigung (dh mineralische Niederschlag) Ebenen und unterstützen die Adsorption an CuO-Nanopartikel, im Vergleich zu Niederschlag.

Zur Beurteilung, ob erwarteten Konzentrationen der prioritären Schadstoffe sind in den Medien aus unbehandelten und CuO-NP-behandelten PBW, Proben von unverdünnten Kontrollmedium (EMEM-1x), 56% ausunbehandelt PBW + Medien und der 53% CuO-NP-behandelten PBW + Medien wurden durch ICP-MS analysiert. Unverdünnten Kontrollmedium (EMEM-1x) ist ein kommerzielles Produkt mit L-Glutamin und Natriumbicarbonat zugeführt (vor Zugabe). Kupfer und Selen-Konzentrationen in Kontroll EMEM-1x wurden leicht erhöht, wie erwartet, da sie die für das Zellwachstum sind, aber Arsen, Uran und Vanadium vernachlässigbar waren, in Tabelle 3 angegeben. Vorläufige Studien zeigten, daß, Arsen, Selen und Vanadium-Konzentrationen wurden durch reduzierte CuO-NP Behandlung und, dass der Rückgang wurde in den Konzentrationen in der CuO-NP-behandelten PBW + Medien vertreten. Die gemessene Konzentration von Uran in der CuO-NP-behandelten PBW + Medien wurde verringert im Vergleich zu unbehandelten PBW, und dieser Rückgang war stärker ausgeprägt als die von Visual MINTec v.3 Modellierung vorhergesagt. Kupferspiegel stieg in CuO-NP-Medien behandelt, wie erwartet.

Um die Fähigkeit der CuO-NP-Behandlung, um die Zytotoxizität von PBW auf Säugetier verbessern bestimmenZellen, die Lebensfähigkeit wurde in Zellen, um Lösungen von PBW + Medien ausgesetzt vor und nach der CuO-NP Behandlung beurteilt. Beide HEK (1A) und HEP (1B) Zellen wurden verschiedenen Konzentrationen von unbehandelten oder behandelten PBW + Medien für bis zu sieben Tagen ausgesetzt. In Zellen in unbehandelten PBW + Medien gezüchtet wurde Lebensfähigkeit in einer konzentrationsabhängigen Art und Weise beeinträchtigt, wogegen CuO-NP Behandlung verbessert die zelluläre Lebensfähigkeit in beiden Zelllinien. Die integrierte AUC in 1C gezeigt, dass Zellen in HEK gewachsen CuO-NP behandelt PBW + media waren lebensfähig im Vergleich zu unbehandelten PBW + Medien bei den drei höchsten Konzentrationen (29%, 44% bzw. 56%). HEP-Zellen zeigten etwas anderen Lebensfähigkeit: nur die beiden höchsten Konzentrationen von unbehandelten PBW + Medien (44% und 56%) zeigten eingeschränkter Überlebensfähigkeit im Vergleich zu CuO-NP-behandelten PBW + Medien (1D). Die geringere Konzentrationen von PBW waren weniger toxisch für HEP-Zellen und die Lebensfähigkeit der Zellen weniger von der Behandlung betroffen. DieLebensfähigkeit beider HEK und HEP-Zellen in 16,5% unbehandeltem PBW + Medien gezüchtet war nicht signifikant verschieden von den Zellen in 53% CuO-NP behandelt PBW + Medien (p <0.05) gezüchtet. So erschien CuO-NP Behandlung, um die Zytotoxizität von PBW verbessern, mit Lebensfähigkeit der Nähe von Kontrollebenen. Wie oben diskutiert, wird CuO-NP Behandlung PBW mit einer Zunahme der Kupferkonzentration verbunden. Der Anstieg wurde erwartet, basierend auf früheren Ergebnissen von Reddy und Roth (2012), in dem sie CuO-NPs für Arsen aus dem Grundwasser zu entfernen. Der Anstieg der Kupfer ist abhängig von der spezifischen Wasserchemie des PBW aber weiterhin unter EPA MCL von 1,3 mg / l. Jedoch war es wichtig, um auszuschließen, dass die Zunahme der Konzentrationen an Kupfer trug zu verbesserten Lebensfähigkeit (dh zusätzlich zu oder anstelle von, der Abnahme der Priorität Verunreinigungen). Dementsprechend wurde die Kupferchelatbildners D-Penicillamin, um EMEM-1x Steuer, RO + media control, unbehandelt und CuO-NP-behandelten PBW + Medienlösungen und th hinzugefügten MTT Lebensfähigkeit Wachstumskurve erzeugt wurden, wie oben beschrieben. Kupfer Chelat keine signifikanten Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit von entweder HEK oder HEP-Zellen in RO + media control, unbehandelt und CuO-NP-behandelten PBW + Medien inkubiert (Ergebnisse nicht gezeigt).

Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC 50) wurde von Tag fünf Wachstum von HEK und HEP-Zellen in unbehandelten PBW + Medien (Tabelle 4A) und CuO-NP behandelt PBW + Medien (Tabelle 4B) gezüchtet berechnet. Für HEK-Zellen in unbehandelten PBW + Medien gezüchtet, die IC-50-Wert betrug 1,264 (log% PBW). Somit würde der unbehandelten PBW + Medien müssen auf 18,38% verdünnt werden, um eine 50% ige Abnahme der Lebensfähigkeit zu erhalten. Für HEK-Zellen in CuO-NP-behandelten PBW + Medien gezüchtet, die IC50-Wert war 2,744 (log% PBW). Dieses Ergebnis legt nahe, dass theoretisch die Zytotoxizität der Lösung wurde in dem Maße, behandelt PBW + Medien müsste von 500% konzentriert (log% PBW = 2,744), um eine ähnliche 50% de erzeugen reduzierteAnstieg der Überlebensfähigkeit. Für HEP-Zellen in unbehandelten PBW + Medien gezüchtet, die IC 50 war 1,243 (log% PBW). Dies würde eine Verdünnung der PBW + Medien auf 17,5% erforderlich, um eine 50% ige Abnahme der Lebensfähigkeit zu produzieren. Dagegen ist für HEP Zellen in CuO-NP behandelt PBW + Medien gezüchtet, die IC 50 betrug 5.327 (log% PBW). Dieser Wert wahrscheinlich war so groß, weil die Lebensfähigkeit der Zellen in CuO-NP behandelt PBW + media war nicht signifikant verschieden von den Zellen in EMEM-1x (Kontrolle) gezüchtet. Hellfeldabbildung, in Abbildung 2 am fünften Tag dargestellt, der sowohl HEK und HEP Zellwachstum. Zellzahl und Befestigung in den CuO-NP behandelt PBW + Medien (2E, F) verbessert wurden im Vergleich zu unbehandelten PBW + Medien (2C, D).

Abbildung 1
Abbildung 1: Wachstumskurven. Wachstumskurven wurden verwendet, um die Überlebensfähigkeit und g zu bewertenrowth der Kulturen während der Behandlung. Wachstumskurven für HEK (A) und HEP (B-Zellen) in vier Verdünnungen PBW + Medien im Vergleich zu 53% CuO-NP behandelt PBW + Medien (obere Felder) gezüchtet. EMEM-1x Steuer (EMEM) , RO , 53% CuO-NP-behandelt , 16,5% unbehandelte PBW , 29% unbehandelte PBW , 44% unbehandelte PBW , 56% unbehandelte PBW . Fläche unter der Kurve (AUC) Analyse von HEK (C) und HEP (D) 7 Tage Wachstumskurve Daten (untere Felder). * P <0,05 im Vergleich zur Kontrolle EMEM, #p <0,05 im Vergleich zu RO Kontrolle, §p <0,05 im Vergleich zu 53% CuO NP-behandelten PBW-Medien. (Im Vergleich mit einem Zwei-tailed ANOVA mitTukey post hoc-Analyse, n = 3)

Figur 2
Abb. 2: EMEM-1x Steuer (EMEM) (A, B: Zellmorphologie vor und nach der CuO-NP Behandlung Hellfeldmikroskopie (20x) von HEK (linke Spalte) und HEP (rechte Spalte) Zellen an Tag 5, in gewachsen ), wurde 56% unbehandelte PBW + Medien (C, D) und 53% CuO-NP-behandelten PBW + Medien (E, F) verwendet werden, um die Zellmorphologie zu untersuchen. HEK und HEP-Zellen in EMEM-1x Steuer (EMEM) angebaut (A, B) zeigen, gesund, nahezu konfluenten Wachstum. HEK und HEP-Zellen in unbehandelten PBW + Medien aufgewachsen sind Zahlen reduziert und scheinen losgelöst (C, D). HEK und HEP-Zellen in CuO-NP-behandelten PBW + Medien gezüchtet zeigen bessere Befestigung und gesund, mehr konfluenten Zellen (E F).

Element (mg / l) Durchschnittlich, St. Dev. & Bedeutung
Vor der Behandlung Nach der Behandlung
Arsen 0,018 ± 0,001 0,002 ± 0,0 ***
Selen 1,8 ± 0,07 1,3 ± 0,05 **
Kupfer 0,0015 ± 0,001 0,93 ± 0,43 *
Kalzium 102 ± 82 106 ± 15
Strontium 3,3 ± 1,1 1,5 ± 0,4 *
Magnesium 44 ± 2,1 47 ± 1,7
Natrium 610 ±; 0.0 627 ± 27
Uran 0.98 ± 0.03 0,21 ± 0,03 ***
Barium 0.037 ± 0.02 0.019 ± 0.01
Kalium 12 ± 0,0 12 ± 0,8
Silizium 12 ± 0,7 12 ± 0,5
Vanadium 1,3 ± 0,07 0,1 ± 0,02 ***
Phosphat 0,35 ± 0,07 0,05 ± 0,0 ***
Sulfat 805 ± 21 807 ± 15
Leitfähigkeit 3125 ± 143 3190 ± 62
pH 7,31 ± 0,09 7,36 ± 0,05

Tabelle 1:. Analyse von Kationen und Anionen vor und nach der CuO-NP Behandlung Durchschnittliche Elementkonzentrationen vor und nach der Behandlung mit CuO-NP. Signifikanz zwischen der Konzentration von CuO-NP-behandelten und unbehandelten PBW als * = p <0,05 bezeichnet, ** = p <0,01 und *** = p <0,001. Eine leere Zelle zeigt keinen signifikanten Unterschied. Chloridkonzentrationen lagen zwischen 46,5 ± 0,707 und 55,25 ± 8,180. Aluminium, Bor und Molybdän-Konzentrationen niedrig waren, und zeigten keine signifikante Änderung aufgrund CuO-NP-Behandlung. Mangankonzentrationen waren nicht konsistent.

Components % Der Gesamtkonzentration Spezies
Arsen 58,7 HAsO 4 2-
41.2 H 2 AsO 4 -
Uran 64,1 Ca 2 UO 2 (CO 3) 3 (aq)
32,2 CaUO 2 (CO 3) 3 2-
0,03 UO 2 (CO 3) 2 2-
3.5 UO 2 (CO 3) 3 4-
0,09 Ca 2 UO 2 (CO 3) 3 (aq)
0,02 CaUO 2 (CO 3) 3 2-
Selen 94,3 SeO 4 2-
5.6 Caseo 4 (aq)
Vanadium 2.1 HVO 4 2-
95,7 H 2 VO 4-
2.1 H 2 V 2 O 7 2-
0,01 HV 2 O 7 3-
0,01 V 4 O 12 4-

Tabelle 2: Art der Modellierung mit Visual MINTEQ ver. 3.0 Software. Visuelle MINTEQ ver. 3.0 Software (KTH Royal Institute of Technology, Valhallavägen, Schweden) wurde verwendet, um Metall Speziation der in Tabelle 1 aufgeführten PBW Komponenten zu berechnen. (Aq) = wässrige, im Gegensatz zu der festen Form der betreffenden Art.

EMEM Kontrolle Unbehandelt
PBW PBW + Medien
Arsen 0,003 ± 0,0 0,017 ± 0,0 0,010 ± 0,001
Kupfer 0,01 ± 0,0 0,0015 ± 0,001 0,018 ± 0,0
Selinium 0,013 ± 0,002 1,75 ± 0,07 1,15 ± 0,06
Uran 0,00015 ± 0,0 0.975 ± 0.03 0,71 ± 0,01
Vanadium 0,0015 ± 0,0 1,25 ± 0,07 0,785 ± 0,007
CuO NP-behandelt
PBW PBW + Medien
Arsen 0,0022 ± 0,001 0,0015 ± 0,0
Kupfer 0,926 ± 0,4 0,81 ± 0,0
Selinium 1,25 ± 0,05 0,855 ± 0.0.02
Uran 0.208 ± 0.03 0,45 ± 0,01
Vanadium 0.102 ± 0.02 0,0795 ± 0,01

Tabelle 3:. Die Konzentrationen der Verunreinigungen in Medien Konzentrationen von prioritären Verunreinigungen (mg / L) in EMEM-1x Steuerung (EMEM), unbehandelt PBW, CuO-NP behandelt PBW unbehandeltem PBW + Medien und CuO-NP behandelt PBW + media nach Zugabe von Medienkomponenten (n = 3) wurden bewertet, um Änderungen in der Schadstoffkonzentration aufgrund der Behandlung zu gewährleisten, wurden in unbehandelten PBW + Medien und dargestellt CuO-NP behandelt PBW + Medien angewendet CELls.

Eine unbehandelte PBW + Medien
Konzentrationen von Unbehandelte PBW (log X) % Lebensfähigkeit (HEK-Zellen) % Lebensfähigkeit (HEP-Zellen)
EMEM 100 100
16,5% (1.217) 51,4 50,8
29% (1.462) 39 33,3
44% (1.643) 19,3 14,7
56% (1.748) 14,5 9.4
IC 50 Log [PBW] 1,264 1,243
B CuO-NP-behandelten PBW + Medien
Konzentrationen von CuO-NP-behandelten PBW (log X) % Lebensfähigkeit (HEK-Zellen) % Lebensfähigkeit (HEP-Zellen)
EMEM 100 100
17% (1.230) 86,7 119,8
30% (1,477) 75,8 86,7
45% (1,653) 81 92,4
53% (1.724) 70.3 97,5
IC 50 Log [PBW] 2,744 5,327

Tabelle 4: Berechnung des IC 50. Die IC 50 stellt die Konzentration des unbehandelten PBW + Medien oder CuO-NP behandelt PBW + Medien, die für eine 50% ige Hemmung der Lebensfähigkeit erforderlich ist.   Die prozentuale Lebensfähigkeit am Tag 5 für HEK und HEP Zellen Verdünnungen von unbehandeltem PBW + Medien (A) oder CuO-NP behandelt PBW + Medien (B) belichtet wurden verwendet, um die halbmaximale inhibitorische Konzentration (IC 50) zu errechnen.

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Discussion

Frühere Studien berichteten, dass CuO-Nanopartikel entfernt Arsen aus Grundwasser 11,13,30,31. Diese Studie unterstützt diese früheren Ergebnisse und berichtet, dass CuO-Nanopartikel zu entfernen zusätzliche Verunreinigungen von PBW auch. Diese Studie bestätigt auch früheren Berichten, dass CuO-NPs sind wirksam bei der Entfernung von Arsen, trotz der Anwesenheit von anderen Verunreinigungen und mögliche Konkurrenzionen 11. Speziation Modellierung vorhergesagt, dass 97% der Vanadiumspezies in PBW negativ geladen sind, so dass für die Adsorption an CuO-NPs und Batch-Behandlung entfernt 92% Vanadium.

Dies ist die erste Untersuchung, die Auswirkungen der Entfernung bestimmter Verunreinigungen aus PBW mit CuO-NP zu untersuchen, und dann beurteilt die Änderungen der Cytotoxizität mit der Entfernung verbunden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Untersuchung der Veränderungen der Zytotoxizität komplexer Mischungen unter Verwendung eines in vitro-Ansatz kann möglich sein, aber diese Verfahren sind nicht ohne Grenzen. PBW konnte nicht f verwendet werdenVoll Kraft auf die Zellen, denn, um zu überleben, kultivierten Zellen erfordern eine definierte Wachstumsmedien und bestimmte Osmolalität. PBW + Medien können ebenfalls nicht auf die Zellen ohne pH-Einstellung verwendet werden. Der pH der PBW war 7,31 vor und nach der Behandlung 7,36 jedoch, die Zugabe von Wachstumsmedium-Komponenten reduziert den pH-Wert auf etwa 6,8, abhängig von der Verdünnung. PH-Einstellung ist ein normaler Schritt bei der Herstellung von Zellkulturmedien jedoch, Einstellen des pH der PBW + Medien können die molekularen Wechselwirkungen der Elementspezies mit Medienkomponenten verändert haben. Unbehandelte und CuO-NP-PBW behandelt wurden mit konzentrierter EMEM-10X Wachstumsmedien in verschiedenen Verhältnissen kombiniert, um die Testlösungen (PBW + Medien) zu erhalten. ICP-MS-Analyse wurde an Testmedien durchgeführt, um zu überprüfen, dass die Konzentrationen von Metallen durch CuO-NP-Behandlung (Arsen, Kupfer, Selen, Uran, Vanadium) wesentlich beeinträchtigt waren erwarteten Konzentrationen nach Verdünnung von Medienkomponenten und Osmolalität Verstellung. Der RückgangArsen, Selen und Vanadium nach CuO-NP-Behandlung in den Konzentrationsunterschiede zwischen unbehandeltem PBW + Medien und der CuO-NP behandelt PBW + Medien reflektiert wird. Urankonzentrationen sind höher in der CuO-NP-behandelten PBW + Medien als vorhergesagt. ICP-MS-Daten (Tabelle 1) zeigt, dass mehr Uran aus PBW während CuO-NP-Behandlung entfernt als durch Modellieren vorhergesagt wird. Speziation Modellierung (Tabelle 2) vorhergesagt, dass bei pH 7,3, 35,5% der Uranspezies sind negativ geladen. Das Modell sagt voraus, dass die Haupturanspezies, Kalzium Uranylcarbonat (Ca 2 UO 2 (CO 3) 3) ist neutral.

Die beobachtete 78% Entfernung des Urans war wahrscheinlich auf eine Kombination von Adsorption und Fällung von Uran (als Calcium Uranylcarbonat Mineral). Basierend auf der geochemischen Modellierung ist der Anteil von Uran durch Adsorption entfernt weniger als berechnet so dass für eine höhere Konzentration in der CuO-NPbehandelten PBW + Medien. Der Mechanismus der Uranentfernung von CuO-NP-Behandlung ist unklar und bedarf weiterer Untersuchungen. Eine Erhöhung der Konzentration von Kalzium, Kalium und Magnesium zu erwarten, wenn PBW wurde EMEM-10x jedoch hinzugefügt; CuO-NP-Behandlung keine signifikante Veränderung dieser Elemente zu erzeugen, so wurde kein Unterschied in unbehandelten vs. CuO-NP-behandelten PBW + Medien gesehen. Die Technik der Kombination der Ist-Umwelt mit Media-Komponenten war in die Veränderungen der Elementkonzentrationen aufgrund der Behandlung zu sehen, die erfolgreich; Jedoch ist die Natur der oxidierten PBW beschränkt, wie die PBW + Medien vorgenommen werden könnten. In einem Versuch, die maximale Konzentration der Elemente in Testmedien zu erhöhen, wurde pulverförmigen Zellkulturmedien, die ursprünglich mit unbehandelten und CuO-NP-behandelten PBW gemischt, um PBW + Medien zu machen. Die pulverförmigen Medien oft zu einer Ausfällung von Calciumsalzen führte und es erhöhte die Osmolalität der PBW + Medien, die eine größere Verdünnung mit RO-Wasser erforderlich, wodurch Konzentrationen in der Nähe von Menschen mit flüssigen Medien 10x erhalten. Diese Fragen sind wahrscheinlich PBW spezifische aufgrund seiner oxidativen Zustand und kann nicht ein Problem mit anderen weniger empfindlichen Mischungen sein.

Der MTT-Assay wurde gewählt, um Cytotoxizität zu bewerten, da es ein anerkannter Standard Assay mit hohem Durchsatz, die die allgemeine Gesundheit der Zellen beurteilt durch Messung der mitochondrialen Aktivität. Dieses Verfahren hat Vorteile und Nachteile. Die 96-Well-Format ist für das Erhalten mehrerer Datenpunkte jedoch; die Mehrheit der Zellen an Tag 5 waren ungesund aussehende, rund und nicht mehr an der Platte befestigt. Die Fotos in 2 genommen wurden, bevor die Medien wurde mit einem Vakuum entfernt; Absaugen der Medien, und dann die MTT-Lösung kann ungebunden Zellen entfernt oder abgelöst schlecht haftenden Zellen, einen Beitrag zur Gesamtebene des MTT-Signal nach dem zweiten Tag mit unbehandelten PBW gesehen. Die Annahme ist, dass schwimmende Zellen tot oder sterbend und our die anhaftenden Zellen werden mit dieser Methode untersucht. Es ist auch wichtig, die Grenzen des MTT-Tests in Bezug auf Studien unter Verwendung von Nanopartikeln zu betrachten.

Frühere Studien haben berichtet, daß, wenn sie direkt mit kultivierten Zellen angewendet werden Nanopartikel inhärente Toxizität haben, über ihre Basis chemischen Eigenschaften in Abhängigkeit von ihrer einzigartigen physikalischen Eigenschaften wie Form und Größe 32,33. In dieser aktuellen Studie, haben wir nicht die CuO-Nanopartikel direkt auf die Zellen anzuwenden. Stattdessen wurden die Zellen in PBW das zuvor mit CuO-NPs behandelt worden war, zentrifugiert, um den Großteil der CuO-NPs zu entfernen, und dann zweimal filtriert zur Entfernung mehr CuO-Nanopartikel vor dem PBW wurde verwendet, um PBW + Medien herzustellen belichtet. Die MS Ergebnisse zeigten einen Anstieg der Kupfer nach der Behandlung. Dies könnte die von den Nanopartikeln während der Behandlung oder CuO-Nanopartikel, die durch die Zentrifugation / Filtrationsschritte durchlaufen haben kann, gelöst in dem behandelten PBW u bleiben Kupferionen seinsed, um die PBW + Medien zu machen. CuO-Nanopartikel in einem Größenbereich von 12 bis 18 nm, gemessen mit einer BET-Oberfläche von 85 ± 1 m 2 / g 11 sind aber bekannt, zu aggregieren und auf der Basis des minimalen Anstieg der Kupferkonzentration in dem behandelten PBW meisten Kupfer unabhängig der Quelle nach der Zentrifugation und Filtration entfernt. Visuelle Bestätigung der verbesserten Zellgesundheit und Fluss unterstützen die MTT Assay-Ergebnisse der verbesserten Rentabilität aufgrund CuO-NP Behandlung des PBW (Abbildung 2). Zukünftige Studien mit anderen Methoden auswerten kann (oder zu charakterisieren) ähnlich verwirrende Effekte von CuO-Nanopartikel verursacht wird.

Menschliche embryonale Nieren (HEK 293) und menschliche Leberzellkarzinom (HEP G2) Zellen wurden für Toxizitätstests ausgewählt. Dies sind ein Standard-Zelllinien, die klinisch relevant auf Schwermetallorgantoxizität 24,25,34-40 sind. Ein geringer Aussaatdichte wurde für die MTT-Assays verwendet. Die Zellen wurden bei 500 Zellen / gut, sich erholenfür 24 h und dann auf den Testmedien ausgesetzt. Die niedrige Einsaatdichte war notwendig, um eine Wachstumskurve mit einer log-Phase um Tag 5 zu erreichen, bevor er über konfluenten stationären am Tag 6 oder 7 Chakraborty et al. (2010) berichteten, dass bei einer Untersuchung von Cadmium Toxizität bei kultivierten Nieren proximalen Tubuluszellen (PTC), Konfluenz und Proliferation Status (wuchernden vs. Ruhe) beeinflusst die Reaktion auf die Cadmiumexposition: subkonfluente wuchernden Zellen zeigten mehr Zytotoxizität als konfluente (Ruhestrom) Zellen. HEP und HEK-Zellen zu PBW auf einen höheren Konzentrationen (größer Konfluenz) ähnlich wie bei anderen Assay verwendet ausgesetzt (Ergebnisse nicht gezeigt) hat die robuste Veränderungen in der Morphologie mit dem MTT-Test gesehen, nicht zu zeigen. Weitere Untersuchungen über die Änderungen in der Cytotoxizität unter Verwendung von nicht-adhärenten Zelllinien oder Protokolle, die Ernte und sammelt alle Zellen (zB Durchflusszytometrie) benötigt.

Eine weitere Einschränkung der MTT-Methode in Studien using Nanopartikel ist, dass einige Arten von Nanopartikeln kann mit zelluläre Ernährung stören. Zellkulturmedien enthalten in der Regel zugegeben Proteinquellen, wie zum Beispiel fötales Rinderserum (FBS), das Zellwachstum zu ergänzen. Studien haben gezeigt, dass die Metalloxid-Nanopartikel können wichtige Wachstumskomponenten in FBS führen, aufgrund der erhöhten Absorptionskapazität von Nanopartikeln. Metalloxidnanopartikel wurde gezeigt, dass den FBS durch eine Wechselwirkung mit Calcium 41 verbinden. Je nach pH-Wert der Lösung kann Metallnanoteilchen eine positive oder negative Ladung tragen. Zytotoxizität Studien haben gezeigt, dass Metallnanopartikel zu Zellkulturmedien aufgenommen adsorbieren Kationen, darunter Ca 2+ und entfernen FBS / Serum-Albumin durch Bindung des NP-Ca 2+ -Komplex zu dem Calcium-Bindungsstellen auf Proteinen in FBS. Dies verringert die Konzentration von Ca 2+ und FBS aus den Medien, im wesentlichen verhungern die Zellen und die Erhöhung der Zytotoxizität der na zurückzuführenpartikel 41. Weiterhin Vorbelichtung Nanopartikel FBS / Ca 2+ beschichtet die Nanopartikel, eine Verringerung von deren zytotoxische Wirkung. Allerdings haben wir nicht direkt ausgesetzt werden die Medien auf CuO-Nanopartikel. Auch keine signifikante Abnahme der Ca 2+ Konzentrationen wurden in PBW nach Behandlung mit CuO-NPs gesehen, was keine signifikante Absorption von Ca 2+ auf die CuO-NPs Priming sie mit dem FBS binden. Jedoch ist die Konzentration von Calcium in der PBW hoch genug, dass ein Nanopartikel-induzierte Abnahme nicht offensichtlich gewesen. Es ist noch unwahrscheinlich, dass der CuO-NPs in dieser Studie verwendet werden Absorption großer Mengen an Calcium bei der Verarbeitung, weil es keine Verringerung der Arsen Absorptionsfähigkeiten des CuO-NPs in PBW, die hohe Mengen an Calcium im Vergleich zu früheren Studien mit enthält Grundwasser mit einem niedrigeren Calciumkonzentrationen 13.

Die Daten zeigen, dass CuO-NPs entfernen Arsen, Selen und Vanadium uranium, und dies wird mit einer verbesserten HEK und HEP Zellviabilität im MTT-Test verbunden. Der Mechanismus (en), durch welche die Lebensfähigkeit verbessert muss noch bestimmt werden, aber könnten aufgrund der Entfernung des Prioritäts Verunreinigungen durch CuO-NP, neben anderen Mechanismen. Die aktuelle Studie zeigt auch, dass Standard-Zellkulturverfahren kann verwendet werden, um die Wirksamkeit eines Nanopartikels ISR Wasserbehandlungsverfahren zu bewerten, so dass potenziell eine Reihe von mechanistischen Studien werden abgeschlossen werden, bevor er in den teureren und zeitaufwendig in vivo Tierstudien . Zusätzlich kann CuO-NPs erweisen sich vielseitig für Abbauverfahren und für die Behandlung von Metallmischungen als konventionelle Adsorbentien wie Oxide von Aluminium, Eisen, Titan und Mangan, da CuO-NPs keine pH-Einstellung oder Oxidation von Wasser erfordern, zur Entfernung von Arsen und CuO-NPs Entfernen Sie beide Arsenit und Arsenat in der Gegenwart des konkurrierenden Anionen Phosphat, Silikat und Sulfat. Auch kann CuO-NPs regeneriert und wieder werden-Used, Reduktionsmittel, Kosten und die Menge der verbrauchten Behandlungsabfallnebenprodukte in der Notwendigkeit zur Verfügung 12.

Potentielle Einschränkungen des MTT-Protokoll sind die geringe Zelldichte zum Zeitpunkt der Exposition, Ablösung von Zellen und Signalverlust, Zell Hunger und mögliche Exposition der Zellen an CuO-NP verändernden MTT Reaktivität. Zelldichte und Ablösung Probleme könnten durch Verwendung eines alternativen Test, wie Flusszytometrie, die für höhere Einsaatdichten ermöglicht sowie die Sammlung von allen Zellen (dh sowohl schwebend und befestigt) adressiert werden. Zelle Hunger Fragen konnten durch Messung Wachstumsfaktor-Konzentrationen in den Medien regelmäßig während der Behandlung beurteilt werden. Zukünftige Arbeiten werden auf der Anwendung des geltenden Protokolls zum anderen Zytotoxizitätsassays, die, wenn möglich, CuO-NP Belichtung verändert Assay Aktivität befassen wird, Messungen der Zell Hunger während der Behandlung und auch die Prüfung der Fähigkeit der CuO-Nanopartikel auf Kontamination zu entfernen konzentrierennts und beeinflussen die Zytotoxizität von anderen Typen von komplexen Gemischen, beispielsweise Abfälle aus der Superfund und Entsorgungs Teichen. Solche Studien würden auch Fragen, ob die Methoden waren robust in verschiedenen Einstellungen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CuCl2 Sigma 203149
Borosilicate glass balls VWR 26396-639 6 mm
Nitric Acid Fisher A509-P500 Trace metal grade
0.45 μm syringe filter Fisher SLHA 033S S
10x EMEM Fisher BW12-684F
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
L-glutamine Fisher BP379-100
NaHCO3 Sigma S5761
Penicillin/Streptomycin ATCC 30-2300
0.22 μm vacuum filter unit Fisher 09-740-28C
HEK293 ATCC CRL-1573
HEPG2 ATCC HB-8065
Trypsin Sigma SV3003101
MTT Sigma M2128
D-penicillamine Fisher ICN15180680
96-well plates Fisher 07-200-92
DMSO Fisher D12814
Spectra Max 190 Molecular Devices
Visual MINTEQ version 3.0 KTH Royal Institute of Technology
ICP-MS Agilent Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013.
IC DIONEX DX 500 Dionex Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013.
VWR Incubator VWR

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References

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