Utilización del ensayo Soft Agar formación de colonias para identificar inhibidores de tumorigenicidad en células de cáncer de mama

Medicine

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Horibata, S., Vo, T. V., Subramanian, V., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (99), e52727, doi:10.3791/52727 (2015).

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Abstract

Protocol

1. Preparación de 3% 2-hidroxietil agarosa

  1. En un frasco de vidrio de 100 ml limpio y seco, añadir 0,9 g de 2-hidroxietilo agarosa (Agarosa VII) seguido de 30 ml de agua destilada.
  2. Microondas la mezcla durante 15 segundos y suavemente remolino. Repita este paso al menos tres veces más hasta que el polvo de agarosa se disuelve totalmente.
  3. Autoclave la botella que contiene solución durante 15 min.
  4. Deje que la solución de agarosa se enfríe a temperatura ambiente antes de su uso posterior. Guarde la solución a temperatura ambiente.

2. Preparación de la capa inferior: 0,6% en gel de agarosa

  1. Pre-caliente varias 5 ml y 10 ml pipetas en una incubadora a 37 ° para evitar que la agarosa se solidifique en la pipeta durante la manipulación.
  2. Parcialmente aflojar la tapa de la botella y microondas la solución de agarosa pre-hechos 3% 2-hidroxietil durante 15 s. Luego, agitar suavemente la solución y microondas durante otros 15 seg. PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al girar el agarosolución en sí porque la solución se eleva cuando se expone al aire y puede extenderse.
  3. Si hay gel sólido residual en la botella, microondas durante unos segundos más.
  4. Mantenga el frasco que contiene la solución de agarosa en un baño de agua a 45 ° C durante los próximos pasos para prevenir la solución de agarosa se solidifique antes de tiempo.
  5. Medios MCF10DCIS caliente en un 37 ° C baño de agua. Nota: los medios de comunicación MCF10DCIS consta de DMEM / F12, 5% de suero de caballo, 5% de penicilina estreptomicina.
  6. Transferencia de 3 ml de la solución de agarosa al 3% utilizando las pipetas pre-calentado en un tubo cónico de 50 ml estéril.
  7. Añada inmediatamente 12 ml de medio MCF10DCIS cálidos e invierta suavemente el tubo cónico para mezclar la agarosa con los medios de comunicación. Trate de no formar las burbujas, ya que interfiere con la colonia contar después.
  8. Añadir con cuidado 2 ml de esta mezcla en cada pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos sin formar burbujas de aire.
  9. Incubar el 6 pocillos horizonta placa de cultivoLLY sobre una superficie plana a 4 ° C durante 1 hora para permitir que la mezcla se solidifique.
  10. Después de que se solidifique la mezcla, colocar la placa en una incubadora a 37ºC durante 30 min. La capa inferior está ahora listo para su uso.

3. Preparación de la capa que contiene Cell-: 0,3% en gel de agarosa

  1. Células trypsinize MCF10DCIS y diluir a una concentración de células de 4 x 10 4 / ml.
  2. Tome 2 ml de la agarosa 3% utilizando pipetas pre-calentado y transferir a un tubo cónico de 50 ml estéril.
  3. Inmediatamente añadir 8 ml de medio MCF10DCIS al tubo cónico e invertir suavemente para mezclar la agarosa con los medios. Evite la formación de burbujas.
  4. Tome 2 ml de las células MCF10DCIS (4 x 10 4 / ml) y tratar con BB-CLA (0 mM (DMSO) o 1 mM).
  5. En una dilución 1: 1, mezclar las células con la agarosa 0,6%.
  6. Tomar 1 ml de la mezcla de células de agarosa y agregar suavemente sobre la capa inferior de la 6-p pocillo de cultivotardías (2 x 10 4 células / ml).
  7. Coloque la placa de cultivo de 6 pocillos en posición horizontal sobre una superficie plana a 4 ° C durante al menos 15 min para permitir que la capa superior se solidifique.
  8. Después de que se solidifique la mezcla, colocar la placa en una incubadora a 37 ° durante una semana antes de añadir la capa de alimentación.

4. Preparación de la capa de alimentación: 0,3% en gel de agarosa

  1. Microondas el 2-hidroxietil solución de agarosa pre-hechos del 3% durante 15 s. agitar suavemente la solución y microondas durante otros 15 seg.
  2. Equilibrar la botella de solución de agarosa en un baño de agua a 45 ° C.
  3. Calentar los medios MCF10DCIS en un baño de agua a 37 ° C.
  4. Mezclar 1 ml de solución de agarosa al 3% con 9 ml de medio MCF10DCIS caliente en un tubo cónico de 50 ml e invertir suavemente para mezclar la agarosa con los medios de comunicación. Evitar la formación de burbujas de aire.
  5. Tratar la mezcla con BB-CLA (0 mM (DMSO) o 1 mM).
  6. Añadir suavemente 1 ml de esta mezcla (sin paraming burbujas) en cada pocillo de la placa de cultivo de 6 pocillos que contiene la parte inferior y capas blandas.
  7. Coloque la placa de cultivo de 6 pocillos en posición horizontal sobre una superficie plana a 4 ° C durante al menos 15 min para permitir que la mezcla se solidifique.
  8. Después de la capa de alimentación solidifica, coloque la placa en una incubadora a 37 °.
  9. Repita este procedimiento de alimentación semanal mediante la superposición de 1 ml de solución de agarosa / medio / tratamiento de 0,3% en la capa de alimentación existente para reponer las células con nuevos medios de comunicación hasta que se observa la formación de colonias. Nota: Agar en las capas blandas y el alimentador es muy suave y, por lo tanto, los nutrientes añadidos de la capa de alimentación se difundirán fácilmente en la capa que contiene la célula a llegar a las células.

5. Recolección de Datos

  1. Después de 2,5 semanas de crecimiento celular en el agar suave, contar el número de colonias en cada pocillo utilizando un microscopio de luz. Para facilitar la cuantificación, imprima una rejilla sobre una transparencia y adjuntar la red a laPlaca de 6 pocillos para ayudar a localizar donde las células son durante el conteo. Desde tamaño de la colonia (cuantificada por el diámetro de cada colonia) variará, predefinir un tamaño de la colonia de referencia para determinar qué colonias se marcarán. Por ejemplo, incluir tamaños de colonia de 70 micras o más grande en el análisis de datos.
  2. Almacenar las muestras a 4 ° C para evitar una mayor formación de colonias y para el recuento futuro. Selle la placa de cultivo de 6 pocillos con Parafilm para evitar que los geles se sequen.

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Representative Results

El ensayo de formación de colonias en agar blando se puede utilizar para una amplia gama de aplicaciones que documentan la tumorigenicidad de las células cancerosas. Una ventaja principal de esta técnica es que la matriz semi-sólido favorece selectivamente el crecimiento de células que pueden proliferar en una manera independiente de anclaje. Este rasgo se exhibe principalmente por las células cancerosas, pero no por las células normales. Utilizamos principalmente esta técnica para probar la eficacia de inhibición del crecimiento tumoral por las drogas y para probar el efecto de la sobreexpresión o el agotamiento de nuestros genes de interés, incluyendo genes PADI, en la tumorigenicidad de células de cáncer de mama. Aquí, se evaluó el efecto de la BB-CLA en la inhibición tumorigénico de PADI2 sobreexpresan células MCF10DCIS (Figura 1 y 2).

Los resultados demuestran que BB-CLA inhibe significativamente la formación de colonias de células derivadas de MCF10DCIS. Figura 3 muestra que, en presencia de un inhibidor de PADI t, aquí fue una reducción tanto en la formación de colonias y el tamaño de colonia en comparación con el control de DMSO. [Nota:. BB-CLA se disolvió en DMSO y por lo tanto, DMSO se usó como control] El tamaño de las colonias para BB-CLA células tratadas MCF10DCIS eran predominantemente dentro del intervalo de 20 a 100 micras mientras que el tamaño de las colonias para el DMSO de control exhibió un mayor rango de 70 a 150 micras después de 2,5 semanas de crecimiento.

Las colonias más grandes que 70 micras se contaron y se analizaron (Figura 4). Hubo un promedio de 3.536 colonias en el control de DMSO mientras que sólo 1.967 colonias se observaron en el grupo tratado BB-CLA después de 2,5 semanas de cultivo de agar blando. Esto representa una disminución del 44% en la formación de colonias promedio en presencia de 1 mM BB-CLA, lo que indica una inhibición significativa tumorigénico de células de cáncer de mama (células MCF10DCIS) por el inhibidor de PADI.

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Figura 1. Estructura química de BB-CLA.

Figura 2
Figura 2. Esquema general del Protocolo para el ensayo de formación de colonias en agar blando. Cada pocillo de las placas de cultivo de 6 pocillos se revistió primero con gel de agarosa al 0,6% (capa inferior). Después una mezcla en gel de agarosa 0,3% que contenía las células MCF10DCIS y, o bien el inhibidor de BB-CLA (1 M) o DMSO (control) se estratificó en la parte superior del gel 0,6%. Una vez por semana, se añadió la mezcla de gel de agarosa al 0,3% (que contiene BB-CLA) en la parte superior de la capa suave. Después de 2 a 4 semanas, se observó la formación de colonias y contó para el análisis de datos. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

"Figura Figura 3. Imágenes de formación de colonias en las células tratadas MCF10DCIS-BB-CLA. MCF10DCIS células se hicieron crecer en agar blando en presencia (1 M BB-CLA) o ausencia de BB-CLA (0 M DMSO). Después de 2,5 semanas, las colonias fueron imágenes utilizando un microscopio invertido para imágenes de baja magnificación y un microscopio de luz para imágenes de alta magnificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Cuantificación de MCF10DCIS número de colonias después de las células BB-CLA tratamiento. MCF10DCIS se cultivaron en agar blando a diferentes concentraciones de BB-CLA (0 mM (DMSO), o 1 M BB-CLA). Después de 2,5 semanas, las colonias individuales más grande THSe contaron un 70 micras. Los experimentos se repitieron 4 veces (n = 4). La significación estadística de la diferencia total de recuento de células entre las muestras de control y tratamiento se determinó mediante la prueba t de dos muestras de Student (* p <0,005).

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Discussion

La tasa de formación de colonias en agar blando varía dependiendo del tipo de célula 9. Por lo tanto, el número de células para iniciar con debe ser optimizado y ajustado en consecuencia. Una gama de partida sugerido es de entre 5 x 10 02 al 01 x 10 4 células por pocillo utilizando una placa de 6 pocillos. Además, tamaño de las colonias varía en función de la tasa de crecimiento de cada célula. Por lo tanto, se necesita un predefinido un punto de corte para el tamaño de colonia para anotar colonias individuales para análisis cuantitativos aguas abajo. Aquí, las colonias más grandes que 70 micras se cuantificaron para evitar la inclusión de las células no proliferativas derivados de la placa inicial.

Para un crecimiento óptimo, al hacer los geles de agarosa en 3D, es aconsejable utilizar el mismo medio de cultivo celular utilizado normalmente para cultivos de células 2D. Esto se debe a que el cambio de medio a menudo altera la tasa de crecimiento de las células, necesitando así pases adicionales para permitir que las células se adaptan al nuevo medio. Por ejemplo, Las células MCF10DCIS se pueden cultivar de manera óptima en RPMI-1640, DMEM, o medios de comunicación DMEM / F12. Sin embargo, cuando MCF10DCIS medios de cultivo se cambia de RPMI-1640 a DMEM / F12, hay una notable reducción en la tasa de proliferación celular. Además, se debe tener cuidado de mantener las concentraciones séricas a un nivel constante, ya que, sin suero, la formación de colonias se inhibirá 10. Además, después de la agarosa es calentados, permitir que la botella se equilibre en un baño de agua 45 ° C antes de mezclar con medios que contienen células para evitar el sobrecalentamiento de las células. Dado que la agarosa solidifica rápidamente a temperatura ambiente, recomendamos que todas las pipetas y placas de cultivo de 6 pocillos se precalientan en una incubadora a 37 ° antes de añadir solución de agarosa para evitar la solidificación prematura durante la manipulación.

Mientras que la técnica de formación de colonias en agar blando es una valiosa herramienta para la medición de la tumorigenicidad en una gama de líneas celulares de cáncer, algunas líneas no crecen en agar blando. Anotsu potencial inconveniente del método es que las células viables no pueden ser recuperados una vez que se sembraron en el agar blando. Además, si un compuesto tiene un período más corto biodisponibilidad, necesitará la etapa de alimentación a realizar con más frecuencia (es decir, cada dos días) y necesitará las muestras que se recogen en menos de siete días. También tendrá que ser reducido al tiempo que permite a las diferencias potenciales entre las muestras que deben observarse El umbral para el tamaño de la colonia. En estos casos, tendrían que ser incorporadas para optimizar los parámetros experimentales para reducir al mínimo los resultados falsos positivos y falsos negativos controles. Además, esta técnica puede ser lento y difícil cuando se prueba un gran número de muestras. Sin embargo, los avances tecnológicos han ayudado a superar algunas de estas limitaciones. El ensayo de agar suave convencional (como se documenta en este manuscrito) normalmente utiliza placas de cultivo de 6 pocillos o placas de cultivo de 6 mm. Con los lectores de placas automatizado, sin embargo, multiplmuestras e pueden ser procesados ​​en placas de 384 pocillos 11. Por ejemplo, los investigadores pre-cargado células tumorales con tintes como alamarBlue y colorantes de tetrazolio y colonias se cuantificarán mediante lector de placas, obviando así la necesidad de contar manualmente el número de colonias 11. Esta capacidad de alto rendimiento es, por lo tanto, susceptibles para pantallas medicamento contra el cáncer a gran escala.

En resumen, el ensayo de agar blando es una técnica de pre-clínica valiosa que puede usarse para evaluar la tumorigenicidad de una amplia gama de células de cáncer (mama, próstata, ovario, y otros) con respecto a su sensibilidad a los medicamentos, hormonas, calor, hipoxia, y una multitud de otras condiciones de tratamiento. El ensayo continúa proporcionando una herramienta sencilla e informativo para los investigadores del cáncer que desean entender mejor los mecanismos de la progresión del cáncer y probar el potencial anti-tumor de nuevas terapias contra el cáncer.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Axiopot Carl Zeiss Microscopy 1021859251
Inverted Microscope Olympus CKX41
DMEM/F-12 Lonza BioWhittaker 12-719F
HyClone Donor Equine Serum Fisher Scientific SH30074.03
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature Sigma-Aldrich 39346-81-1

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References

  1. Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
  2. Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71, (6), 361-367 (2004).
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