마우스 녹내장에 공 촛점 안저 이미징 및 세포 형태 계측 : 신경 퇴행 중 망막 미세 아교 활성화의 생체 역학

1Department of Neurobiology & Anatomy, University of Utah, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah
Published 5/11/2015
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Medicine

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Summary

미세 아교 세포의 활성화 및 microgliosis 만성 신경 퇴행의 핵심 반응이다. 여기, 우리는 생체 내, 공 초점 검안경으로 망막 CX3CR1-GFP + 미세 아교 세포의 장기 시각화를위한 방법을 제시하고, 임계 값 및 형태 계측 학적 대한 식별과 활성화를 정량화 분석한다. 우리는 연령과 관련된 녹내장의 초기 단계 소교 변경 사항을 모니터링 할 수 있습니다.

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Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (99), e52731, doi:10.3791/52731 (2015).

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Abstract

CNS 상주 신경 면역 세포 인 미세 아교 세포는 별개의 기능 및 유전자 발현 프로파일과 액티브 상태로 전환하는, CNS 손상에 응답하여 자신의 형태와 크기를 변환. 건강, 상해 및 질병에 미세 아교 활성화의 역할은 불완전 인해 미세 환경의 변화에​​ 따라 자신의 역동적이고 복잡한 규정을 이해 남아 있습니다. 이에 따라, 비 침습적으로 모니터에 중요하며, 본래 유기체 경시 소교 활성의 변화를 분석한다. 생체 내에서 활성화를 소교 연구 CNS 환경을 바꾸지 않고 동작 추적 소교 기술적 한계에 의해 지연되어왔다. 이는 장기간 변화 추적해야 만성 신경 퇴화, 특히 도전 중에있다. 망막, 비 침습적 라이브 영상 의무가 중추 기관, 시각화 및 만성 질환 중 미세 아교 세포 활성화의 역학을 특성화 할 수있는 강력한 시스템을 제공합니다.

생체 내 이미징, 세포 해상도와 미세 아교 세포를 시각화, 공 촛점 검안경 (cSLO) 및 CX3CR1 GFP / + 기자 마우스를 사용하는 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 대 세포 하위 집합의 세포 활성화와 밀도의 월별 변화 (망막 당 200-300 세포)를 정량화하는 방법을 설명합니다. 우리는 생체 화상의 자동 임계 값 기반 형태 계측 분석을 적용하여 망막 미세 아교 활성화의 실시간 추적을 위해 유용한 메트릭으로서 somal 영역의 사용을 확인한다. 우리는이 라이브 화상 취득을 사용 만성 녹내장의 마우스 모델에서 망막 신경 퇴행의 초기 단계에서 미세 아교 활성화 및 microgliosis의 동적 변화를 모니터링하기위한 전략을 분석한다. 이 방법은 망막과 시신경에 영향을 미치는 만성 중추 신경계 질환에서 신경 세포와 축삭 감소에 미세 아교 세포의 기여를 조사하는 데 유용합니다.

Introduction

미세 아교 세포는 독점적으로 초기 배아 발달 이후 성인기에 걸쳐 중추 신경계 (CNS)에있는 신경 면역 세포이다. 수용체의 복잡한 레퍼토리를 장착, 미세 아교 활동 및 지역 이질성이 인접 신경 아교 세포, 혈액 - 뇌 장벽 및 신경 염증성 세포 1,2 침투 자신의 양방향 상호 작용에 의해 조절된다. 그들이 항상성의 3,4의 섭동에 대한 자신의 영토를 샘플로 기저 소교 기능, 생리 유지 보수 및 수리에 기여한다. CNS의 부상 또는 질병 중, 미세 아교 세포는 반응 표현형에 자신의 전환을 트리거 신경 신호의 첫 번째 조치는 "미세 아교 세포 2,5-7 활성화 되나. 미세 아교 세포의 활성화는 세포 소마와 프로세스 크기 조정 및 6-9 리모델링에 연결되는 유전자 및 단백질 발현의 복잡한 사이클을 포함한다. 미세 아교 세포의 활성화뿐만 아니라, 셀 재분배클러스터링은, 셀의 수 (라 microgliosis)에서 로컬 전반적인 증가를 수반 할 수있다. 이것은 또는 혈액 유래 단핵구 3,4,7,10-14 모집없이 세포 증식과 자기 갱신에서 발생할 수 있습니다. 연령 의존적 만성 CNS 질병의 광범위한 범위에서 microgliosis 및 미세 아교 세포 활성화 평행 질병 진행을 유지 15-19. 어떻게 미세 아교 세포 충격 신경 퇴행하는 것은 그들이 질병의 발병과 진행에 다양한 기여를 할 수 있습니다 모두 신경과 해로운 역할을 주로하기 때문에, 확실하지 않다. 만성 중추 신경계 질환을 이해하기위한 라이브 영상 연구는 동물 모델과 인간의 손상된 중추 신경계의 소교 동작을 모니터링하고, 미세 아교 변경이 초기 질병 단계 15-17,19,20에서 검출 시작이라는 것을 증명하고있다. 따라서, 검출 및 생체 내에서 활성화를 소교 모니터링하는 방법을 개발하는 것이 중요하다.

비 침습적 DETE뇌 미세 아교 세포의 활성화에 지역 변경 ction의는 분자 영상 또는 생물 발광 및 양전자 방출 단층 촬영이나 자기 공명 영상 18,21,22를 사용하여, 신경 퇴행성 질병 진행의 생체 지표에 중요한로 설립되었다. 이러한 고도로 정량적 및 비 침습적 분자 핵 촬상 방법은 지역 신경교 증 해상도를 검출한다. 또한, CX3CR1 GFP / + 마우스의 두 광자 공 초점 영상은 세포 해상도 3,4,9,20,23-28와 뇌 미세 아교 세포의 관찰을 허용했다. 그러나이 방법은 심지어 최소 침습 뇌 영상 절차 (29)에 의해 행동을 방해의 잠재적 위험 주어진 장기 만성 소교 변화의 반복 관찰을 제한한다. 또한, 망막 급성 손상 후 생체 내 시각화 직접위한 최적의 조건, 노화에 걸쳐 자신의 본래 중추 신경계의 틈새에서 미세 아교 세포의 반복 모니터링을 제공하며,잠재적으로 만성 신경 퇴행성 질환 중. 따라서, 최근 연구에 촛점 이미지 스캐닝 레이저 검안경 (cSLO) 라이브 CX3CR1 GFP / + 마우스를 적응시킴으로써 GFP를 발현하는 망막 미세 아교 세포의 고해상도 영상의 가능성을 증명했다. 이것은 급성 유도 상해 또는 안구 고혈압 30-36 다음 최대 10 주 동안 개인 마우스의 GFP + 세포 수의 주간 변화를 추적하는 데 사용되었습니다.

우리는 몇 개월 이상 장기 촬상을 수행 한 정량적 형태 계측 분석을 사용하여 소마 크기에 기초하여 미세 아교 세포의 활성의 변화를 추적하기 위해이 방법을 확장 하였다. Somal 크기 CX3CR1-GFP + 9 미세 아교 세포의 생체 내 이미징 수행 피질 슬라이스 개의 광자 공 초점 현미경을 사용하여 실시간 이미징 실험의 미세 아교 세포 활성화의 유용한 메트릭으로 정의 하였다. 이들 및 다른 연구에서도 WH, somal 사이즈 Iba1 단백질 발현 수준 간의 상관 관계를 증명무형 문화 유산도 활성화 9,37 증가한다. 따라서, 활성화 된 미세 아교 세포는 살아있는 마우스에서 확인 될 수 있으며, 그 수 및 분포는 CNS 상태 및 질환의 시간 경과를 모니터링.

이 프로토콜은 cSLO 라이브 이미지 수집 및 분석을위한 방법은 미세 아교 세포 수, 망막 신경절 세포 (RGC) 변성 (그림 1) 동안의 분포와 형태 학적 활성을 모니터링에 대해 설명합니다. 따라서, 본 연구에서는 사용 : 1) 연령에 따라 시신경 및 망막 신경 퇴행 및 겪는 상속 녹내장 (DBA / 2J)의 마우스 모델의 나이 (38, 39)의 5 10개월 사이에서 질병의 진행에 놀라운 변화를 보여주고, 2) 월 장기 망막에 GFP + 세포의 시각화 3-5 개월 세포 인 somata 및 측정을 분리하는 분할 및 임계 3) 라이브 영상 분석 세 이형 Cx3cr1 GFP / + DBA / 2J 마우스의 무수 시신경에 대한 cSLO 생체 내 이미징적외선 영역입니다. 이러한 전략은 만성 녹내장의 초기 단계에서 망막 미세 아교 활성화 상태의 동역학을 평가하기 위해 적용된다.

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Protocol

생체 내 이미징은 유타 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 무균 시설에서 수행된다.
참고 :이 영상 프로토콜은 망막 미세 아교 세포 및 침투 단핵구 / 대 식세포가 fractalkine 수용체 궤적 (CX3CR1)의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 기자 마우스에 사용됩니다.

공 초점 주사 레이저 검안경으로 망막 GFP + 미세 아교 세포의 생체 내 이미징 1. (cSLO)

  1. 절차를 수행하는 동안 35 ~ 37 ºC 사이의 마우스 온도를 안정화 세트 물 제어 난방 시스템 켜기, 2 개의 가열 패드를 연결합니다.
    1. 공 초점 주사 레이저 검안경 (cSLO) 시스템 (그림 2A)를 시작합니다. 각각의 마우스를 확인하고 2mm (환자 데이터 메뉴)의 각막 곡률을 설정합니다 정보를 입력, cSLO 프로그램을 엽니 다.
  2. IMA 준비카. 안전하게 소켓에 깨끗한 55º 넓은 필드 대물 렌즈에 맞게. 깨끗한 종이로 덮여 가열 패드를 확보하여 검안경 이미징 플랫폼을 준비합니다. 패드와 용지를 납작하게하고, 대물 렌즈의 이동을 차단하는 그것들을 유지하는 클립을 사용.
  3. 1.3 % 2,2,2- tribromoethanol 0.8 % 급 - 아밀 알콜의 복강 내 주사하여 마우스를 마취 (250 ㎎ / ㎏ 체중 0.5 ㎖ / 25g 체중) 1ml의 일회용 끼워 30½ G 바늘을 사용하여 주사기. 새장에 마우스를 반환, 가열 패드에 있었다.
    참고 : 흡입에 비해 주사 마취제의 전달 코 콘 튜브의 무료 영상과 눈에 탁 트인 액세스를위한 마우스, 쉽게 배치 할 수 있습니다.
  4. 동물이 이동 중지하고 꼬리 핀치에 응답하지되면 발생하기 쉬운 동물을 배치하고 7 분의 방울과 두 눈을 취재하여, Tropicamide 및 페닐 (0.5 % 각각)와 동공 팽창을 유도한다.
  5. 5 분, P 후최소한의 압력을 적용, 두 눈을 통해 검안경 플랫폼의 중심에 발생하기 쉬운 마우스, 맞는 콘택트 렌즈를 레이스.
    참고 : 집게 대신 40 사용할 수 있지만 콘택트 렌즈는 작고 연약하지만 조심스럽게 손가락으로 처리 할 수 있습니다. 그것은 눈 건조를 최소화하고 영상 중 각막의 투명성을 유지로 콘택트 렌즈의 사용은 선택 사항이지만 권장합니다.
  6. 7 분 후, 플랫폼 (도 2B)의 가장자리 근처 무제한 동물성 유지, 대물 렌즈와 대물 렌즈에 평행 한 궤도 대향 우안으로 마우스의 방향. 비교 채도와 방향의 이미지를 수집하기 위해, 항상 대물 렌즈의 눈으로부터의 거리뿐만 아니라, 세션에 걸쳐 이미징 광 경로에 눈의 정렬을 유지한다. 눈의 관찰을 방해 긴 수염 클립.
    참고 : 다음 8-10 분 동안, 마우스를 이동하거나 점멸, 부드러운 움직임과 의지 호흡하지 않을 것이다콘트라스트가 높은 안저 랜드 마크를 기반으로 스캔 헤드 위치를 조정 cSLO 눈 추적 ART (자동 실시간) 모드에 의해 추적 사항. 그 때 과거, 마우스는 이미지가 허무하게 헥헥 및 점멸하기 시작.
  7. 촬상 콘택트 렌즈를 사용하지 않고 수행되는 경우, PBS가 양쪽 눈으로 건조되는 것을 방지하기 위해 매 2-3 분 방울 적용.
  8. 망막 혈관 및 시신경 유두의 안저 화상을 수집 내측 망막에 초점을 맞추었다.
    1. 적외선 모드 (IR)를 선택하고 820 nm의 여기, 100 % 레이저 파워, 40 % -60 %의 민감도 (그림 2C)로 설정을 조정합니다.
    2. 고속 모드 (12.6 프레임 / 초)에서 작동 검안경을 구동하기 위해 조이스틱을 이용하여 눈의 위치를​​. 저배율에서 부상이나 불투명도의 각막과 렌즈를 검사하고, 망막 (그림 3A)를 이미징 영향을 미칠 것 결함이나 부상으로 연구 눈에서 제외합니다.
    3. 시신경 유두 면적 (의 표면을 찾습니다가까이 눈에 목표를 가져 와서 시신경, 시신경 유두는) 다음의 이미지 중심과 조이스틱을 돌려서이 위치를 잠급니다. 검안경으로 눈이 정렬도 얻을 이미지를 가로 질러 초점을 방출하는 열쇠입니다.
    4. 발굴 된 광섬유를 나타내는 눈 기준 초점면 (59, 60 D) 또는 깊이 (55 D)로서 망막 vitreal 표면 상에 위치 된 주요 혈관을 사용하여, 시신경 유두뿐만 아니라, 망막의 내측 평면을 시각화 디스크. 최적의 초점은 명확하게 구별되는 자신의 루멘과 벽, 주요 혈관 내에서 혈액 세포를 순환 해결해야한다.
    5. 균일 한 밝기의 흰색 할로 (약간의 노출 과다 사용) 시신경 주위 55º 안저 필드의 대부분에 걸쳐까지, 터치 스크린 제어 패널에 다이얼을 조정하여 화상의 채도를 최적화. 다음으로, 주요 혈관을 따라 이동하는 혈액 세포가 분명히 확인할 수있을 때까지 콘트라스트를 최적화하기 위해 채도를 낮추는. 초점 어두운 경우지역되지 인해 망막 손상, 균일하게 밝은 이미지가 얻어 질 때까지 카메라에 눈을 다시 정렬, 지속. 이 조정은 위치와 품질의 이미지의 재현 세트를 캡처하는 데 필수적입니다.
    6. 실시간 30 프레임 (47 프레임 / 초 정규화)를 평균화 (나이에 따라 직경 1.4-1.7 mm)을 중심 망막의 고해상도 IR 이미지 수집 신호 대 잡음비를 개선하기 위해, (도 2D ).
  9. 즉시, GFP + 미세 아교 세포 및 / 또는 시신경 유두 및 망막의 안쪽면에 국소 침윤 단핵구의 형광 화상을 취득.
    주 : 망막의 IR 안저 화상의 최적화 GFP + 세포의 형광 이미지의 해상도뿐만 아니라 내측 스팬 망막의 정도를 결정한다. 혈관의 가난한 해상도를 감지 할 수있는 망막의 안쪽면에 초점을하지 않을 경우, 흐리게 GFP + 세포 뷰 (그림 3B)가 발생합니다. IR 사투를 조정하지 않으면배급은 정확하고 균일하게 GFP + 세포의 강도와 크기 (그림 3C)에서 인공적인 변화를 도입, 형광 이미지 (FA)에 영향을줍니다.
    1. 유지 블루, 488 nm의 레이저 여기 (460-490 nm의 배리어 필터 세트), 및 수집 설정 (100 % 레이저 파워와 100~125% 감도)를 사용하여, 상기 터치 스크린 패널의 촬상 모드 (FA)을 형광하도록 Switch가 아래로 내려가 모든 마우스 (그림 2E)의 정수입니다.
    2. 하나의 XY 점, 망막의 bidimensional 형광 이미지를 수집하고 즉시 동일한 위치에 안저 이미지를 캡처 (100X 스캔 평균, 두 이미지를 55º 스캔 각도도 2 층).
    3. 코 - 시간 축 (그림 2H)에서 망막 패닝, 제어판 (그림 2G)에서 "복합"를 선택하고 검안경을 오른쪽으로 이동 왼쪽으로 다중 이미지를 캡처합니다.
      주 : 단일 XY 포인트 이미지를 스캔 한 후 (100 배의실시간으로 소프트웨어가 자동으로 최적의 스캔, 스캔이 실행할 수없는 경우 빨간색 동안 평균 녹색 원과 접하는 같은 새로운 영역 (새로운 검사) 및 스티치 모든 XY-위치) 평균 수 있습니다. 얻어진 합성 화상이 종축 (X 55º 120-124º 주사 각도)에 수평축 X 3-4mm 1.5-1.7 mm에 걸쳐있다.
  10. 깜박임 운동 다시 시작하기 전에 마취를 유도 한 후 15 분 이내에 각 마우스의 전체 영상.
  11. PBS로 콘택트 렌즈, 수화물 눈을 제거하고 운동의 전체 복구 될 때까지 동작을 확인, 그 예열 케이지에 동물을 반환합니다.
  12. 동일한 개인 마우스에서 간헐적 cSLO 이미징 세션을 사용하여 종 연구의 경우, 마취의 누적 독성뿐만 아니라 각막에 자극을 피하기 위해 더 적은 3 일 간격 이미지를 반복합니다.

2. 라이브 영상 처리 및 분석

  1. 순차 이미지 정렬 :
    1. 정렬랜드 마크로 혈관계 및 광학 디스크를 사용하여 같은 눈의 시계열위한 안저 화상. 상용 슬라이드 쇼 프리젠 테이션 프로그램에서, 자신의 광학 디스크 xy- 평면에 정렬 될 때까지 하나를 전 (상단 이미지를 드래그하면서 반투명 표시), 그때까지 상단 이미지를 회전을 통해 각각의 이미지를 드래그하여 모든 이미지를 열고 그 주요 혈관 (먼 시신경 유두에서 선박에 초점) 아래의 이미지에 혈관과 중복. 각 이미지의 회전 각도를 기록하고 마우스와 눈의 신원을 추적하는 데, 나중에 참조 할 수 있도록이 시계열을 저장합니다.
    2. 각 시점에서 XY 회전을 보정하는 기록 각도인가 래스터 그래픽 에디터 프로그램을 사용하여 단일의 XY 점 형광 화상의 대응하는 일련 맞추고. 또한, 300 (스케일링)없이 dpi의와 배경에 해상도를 조정 (RGB 모드, 레벨 선택과 검은 색으로 혈관의 내강 샘플). 이러한 이미지를 저장TIF 파일로, 자신의 이름으로 "정렬"을 추가.
  2. 소교 세포 분할 :
    1. FluoRender에서 열린 중앙 망막에 이른 시점 / 연령에 해당하는 "정렬"TIF 파일을 GFP + 세포를 식별합니다. 화면에 맞게 이미지를 확대 한 다음 (숨기기 볼과 RG 채널 모두를 선택, 렌더링 뷰 (복합, 직교는, 보간)과 속성 (0.58 감마, 255 포화 점, 255 휘도, 195 알파 1.00 음영)을 정의 두 번 클릭하여 작업 공간 프레임을하여 B 채널도 4A).
    2. 상수 높은 임계 값을 유지하면서 세포의 대부분은, 최소한의 중복 및 세포 프로세스 (시안) (흰색)을 마스크 때까지 낮은 임계 값을 증가시켜, (작업 공간 프레임에 강조해야 함) 개별 셀, 임계 빨강 채널을 선택하려면 (255). 낮은 임계치는 형광 강도 (도 4B <에 따라, (100) 및 (170) 사이에서 변화/ STRONG>).
    3. 원래 이름 (그림 4C)에 "cellsegm"을 추가, 새로운 TIF 파일로 볼 수 빨강 채널 만 (캡처 명령)이보기를 저장합니다. 일반 래스터 그래픽 편집기 소프트웨어를 사용하여, 자사의 그레이 스케일을 반전 상기와 같이 300 DPI에 해상도를 조정하고, RGB (그림 4D)로 다시 저장합니다.
      참고 : 자동 FluoRender에 의해 생성 된 폴더 (프로젝트)를 삭제하고, 나중에 참조 할 수 있도록 적용 임계 값을 저장합니다.
  3. 미세 아교 소마 세분화 및 형태 계측 :
    1. 영역 부량 GFP + 세포 인 somata를 식별하기 위해 자동화 된 세기 측정과 임계 기능뿐만 아니라, 임계 값 기반 객체 카운팅 및 측정과 이미지 분석 소프트웨어를 사용한다. "cellsegm"TIF 파일을 열고 스케일링 방법 (스플라인)과 빨강 채널을 선택 RGB (빨간색 탭을 클릭합니다). "색에보기 채널"을 선택 취소하여 시각화 개선 (빨간색 RG를 마우스 오른쪽 단추로 클릭B 탭) 및 "색상을 보완"을 선택 (이미지 / 그레이 스케일을 반전 흰색 배경 (그림 4E) 위에 검정색 / 회색 세포를 볼 수) 이미지를 조정합니다.
    2. 전체 이미지 (교정, 빠른 교정)을 가로 지르는 수평선을 그려, 나이에 따라 1.4-1.7 mm로 이미지를 보정합니다.
    3. 강도 임계 값 (그림 4B)을 적용하여 세그먼트 개별 세포 인 somata. 이를 위해, 빨간색 RGB 채널 작업과는 임계 강도 기능을 엽니 다 (객체 개수; "카운트 업데이트"명령을 선택) 개별 인 somata을 나타내는이자 (ROI)의 각 임계 된 지역 bidimensional 매개 변수를 추적하기 위해.
    4. 255 레벨 중 낮은 50~60% 선택 시각적 임계 색 마스크 (청색) 및 셀 소마 경계 (회색)에서 서로 중첩을 평가하여 최종 임계치 값을 정제하여, 휘도 히스토그램의 강도 임계치를 정의 각 셀 (Figure 4E).
    5. 측정은 10 % 미만 (이진 툴바 및 주석이 측정 값을 사용하여)을 다른 경우 10 세포에서 분할 전 면적을 측정하여 이후 somal 치수를 나타내며, 상기 선택된 임계 값 범위를 사용할 셀 소마 마스크의 정밀도를 추정한다.
    6. 수동으로 여러 셀을 포함하고 직접 세포 (그림 4 층)를 시각화하는 바이너리를 ON / OFF 전환하면서 이러한 요소 (이진 도구 모음 컨트롤, 또는 개체 카탈로그를 사용하여 제거하거나 별도의 ROI) 분리 somal의 ROI를 식별.
    7. somal 영역이 크고보다 작은 50 ~ 60 μm의 2가 활성화 된 미세 아교 세포에 해당하는 세포 인 somata를 차별 및 면적 제한을 사용하여, 각각 미세 아교 세포를 비활성화 할 수와 로아와 같은 미세 아교 세포를 분류.
      참고 : 각 셀 somal 부분 집합이 다른 모조 착색 이진 층으로 식별하고, 또한 다른 형태 학적 매개 변수에 대한 특징으로 할 수있다 (perime터, 원형 등)뿐만 아니라 이산 망막 섹터 (도 4G) 내에서 정량화. ND2 파일로 분석 된 이미지를 저장합니다.
    8. somal 마스크 및 단일 XY N'- 포인트 이미지를 오버레이하여 개별 활성 소교 세포에서 처리 및 분기 복잡성을 확인 (도 4H 대비 50 % 증가). 수동으로 직접 셀 소마에서 연장 프로세스를 계산 또는 아버 (이진 도구 모음 및 주석이 측정을 사용)를 포괄하는 다각형의 직경을 측정한다.
      주 : 활성 세포 프로세스 부족 또는 몇 베어 (<4) 및 짧은 (<2 배 somal 직경)들, 분지 및 광범위한 아버를 포함 비활성 셀 공정 대조적 (> 3-10x somal 직경) 비교적 그들의 주변 작은 소마.
    9. 따라서 수동에 의해 검출되지되는 검출 한계 아래 인 somata 미만 <20 ㎛의 2 및 / 또는 GFP 발현으로 세포를 식별긴장의 임계. 수동으로 식별 요소를 계산하는 주석의 분류 명령을 사용하십시오.

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Representative Results

우리의 최근 생체 내에서 연구 시각화하고 늦게 신경 퇴행 59 만성 녹내장과의 관계의 초기 단계 반응 속도와 시신경 유두와 망막 미세 아교 변화의 패턴을 추적하는이 라이브 이미지 수집 및 분석 방법을 사용했다. 여기에서 우리는 개인의 젊은 이형 Cx3CR1-GFP의 DBA / 2J 망막의 중심 망막 (그림 5)의 넓은 지역에 걸쳐 미세 아교 세포를 시각화하는 cSLO 영상 획득 프로토콜을 보여줍니다. 높은 셀 해상도를 바탕으로, 우리는 라이브 영상 임계 값을 적용하고 형태 계측 학적 개별 GFP + 세포와 인 somata (그림 6)의 자동 분할을 허용하는 분석한다.

지역 microgliosis 및 / 또는 만성 녹내장이 모델에서 검출 신경 퇴행 이전 시대에서 미세 아교 세포 활성화의 개발을 모니터링하기 위해, 우리는 개인의 젊은 이형 CX에 총 미세 아교 세포의 세포 밀도의 월별 변화를 측정3CR1-GFP의 DBA / 2J 망막 나이 (그림 7A)의 3-5개월 사이 (N = 10). 개인의 눈 41-44에서 신경 퇴행의 변수 진행과 일치, 우리의 분석은 각 나이 (그림 7B)에 눈에서 망막 미세 아교 세포의 활성화 및 microgliosis의 변수 수준을 보여, 총의 밀도에 역동적 인 변화와 개인의 망막 내에서 활성화 된 미세 아교 세포를 감지 (그림 7C). 눈에 띄게 활성화 된 미세 아교 세포의 수는 총 GFP + 세포 밀도의 동시 변화에서 커플 해제된다. 이러한 생체 내 연구 결과는 DBA / 2J 마우스 (45)의 미세 아교 변경 이전의 생체 분석을 확인합니다. 따라서 cSLO 실시간 검출 및 망막 미세 아교 활성화의 측정은 각각의 눈에 초 내의 질환 진행의 지표로서 역할을 할 수 있으며, 잠재적으로 녹내장 발병의 초기 사건에 링크 될 수있다.

그림 1. 라이브 이미지 획득, 처리 및 분석 플로 cSLO 마우스 내부 망막의 중심 ~ 1.7 mm (2)에 국부적 인 GFP + 소교 / 말초 단핵구 세포의 화상 수백 하였다. 형광 이미지 (FA)는 동일한 쥐 월간 취득하고, 기준으로하여 망​​막 혈관 및 vitreal 표면의 적외선 (IR​​) 저부 이미지를 사용하여 정렬 하였다. GFP + 세포와 인 somata의 분할은 FA 망막 이미지에 강도 임계 값의 두 개의 별도의 단계를 적용의 결과. 이진 나타내는 세포 인 somata의 형태 학적 분석은 개별 somal 영역의 측정을 허용했다. 활성화로 50 μm의 2 위 somal 면적 GFP + 세포를 분류 하였다. 총 활성화 GFP + 세포의 밀도는 각각의 망막 FA의 이미지를 측정하고, 아버 확장의 검사 및 분기 복잡성은 FA 이미지를 직접 관찰에 의해 수행 하였다. 그림 2
그림 2 : cSLO Spectralis에서 라이브 영상 획득 컨트롤 () 개시에 수동 터치 스크린 패널 디스플레이.. 살아있는 쥐의 머리를 나타내는 (B) cSLO 소프트웨어 촬상 창. 적외선 영상 선택 (C) 설정은 (파란색으로 점등). 실시간 수집 (왼쪽 패널)와 평균 (오른쪽 패널) 동안 망막의 (D) 안저 이미지입니다. 정규화 명령은 검은 색 원으로 표시. 혈관 사이에 시신경 축삭 번들 (화살표)이기 때문에 동맥과 시신경 유두에서 방사 정맥, (괄호 사이의) 볼 수 있습니다. (E) 설정은 하나의 XY 포인트 내에서 형광 이미징을위한 선택. (F) 단일 포인트 형광 (FA, 488 ㎚) 획득 (평균) 동안 영상을. 티그는 작은 이미지 (왼쪽) 개별 검색을 보여, 큰 이미지 (오른쪽) 강도 평균의 진행 상황을 보여줍니다. (G) 설정 지점 (복합), 형광 이미지의 획득으로 선택. (H) 멀티 형광 이미징 인수, 소프트웨어가 녹색 원으로 식별 진행중인 검사, 표시 (또는 빨간색하면 획득 할 수 없습니다 경우). 스케일 바 ~ 5mm (B) 또는 250 μm의 (DH) 표현 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요. .

그림 3
도 3 : 소교 세포의 정확한 cSLO 촬상을 방지 할 수 키 안구 결함 이미징 오차 (A - C) 안구 손상이나 결함뿐만 아니라, 화상 획득 에러.S는 망막의 안쪽면에 국부적 인 GFP + 세포의 안정적인 영상을 방지 할 수 있습니다. (A) 일부 심한 눈 결함, 각막 또는 렌즈 혼탁, 또는 부상을 포함하고 광학 디스크 영역의 심화 안저 이미지에서 쉽게 검출되어 모두의 GFP + 세포의 명확한 영상을 방지한다. (용기의 벽은 루멘 구별 될) 위 또는 망막 (혈관이 거의 보이지)의 내면 아래 중 초점 (B)는 신경 섬유 및 신경절 세포에 위치하는 셀로부터의 GFP 형광 방사의 검출 가능성을 줄여 층. (C) 채도 수준은 잘못 또는 고르지 가려진 영역 또는 이미지 (해상도가없는 세포) 밝은 그러나 과포화 이미지가 발생할 수 있습니다 설정합니다. 스케일 바는 250 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 4 : 미세 아교 세포 수 및 somal 지역의 이진 임계 값 기반의 정량 (- D) 중심 망막 내 미세 아교 세포의 대표 단일 지점 형광 이미지의 렌더링 볼 FluoRender에서 셀 분할의 단계 (A) 탐색 창.. (상단 패널); 렌더링 속성 (아래 패널)에 대응. 임계 값 설정 (하부 패널)에 대응하여, RGB로 볼 (B)의 셀 분할 루틴 동안 동일한 이미지. 역치 세포는 흰색 픽셀로 표현과 시안에서의 프로세스에 중첩된다. 셀 분할 후의 셀 마스크 (C) 이미지. (D) 추가 이미지 처리를위한 반전 된 그레이 스케일 값을 이전 마스크. (E - H) somal의 임계 값과 정량의 단계. 이전 셀 분할을 기반으로 세그먼트 미세 아교 세포의 인 somata에 강도 임계 값 (E)를 사용합니다. RGB 강도 히스토그램 (왼쪽) 강도의 낮은 50~60% 범위 (127-153 0)을 직접 선택하여 임계 값을 수 있습니다. 이 분할 개별 소교 인 somata (파란색)를 분리 정량 마스크를 만듭니다. 이미지는 (오른쪽 타원형) 스플라인 함수를 사용하여 재 스케일링된다. (F) 각각의 투자 수익 (ROI) / 인 somata (상단 패널) 및 수동 분리 또는 침식에 대한 바이너리 도구 (오른쪽 패널)를 사용하여 중복 로아를 해결하는 데 사용되는 투자 수익 (ROI) 실루엣 (개체 카탈로그, 하단 패널)의 자동 임계 값 기반 측정. 지역 제한 (맨 왼쪽 패널)에 의한 개별 somal 영역 (G) 분류. 세그먼트 인 somata가 로아 작은으로 분류하고보다 큰 50 ~ 60 μm의 2, 인 somata의 각 클래스에 대한 이진 층이 다른 색의 픽셀을 할당됩니다 (녹색의차 마젠타, 각각). 개인 활성화 된 세포에서 프로세스 복잡성의 직접 관찰 (왼쪽 패널)에 사용 (증가 대비) 원본 이미지의 세그먼트 인 somata (녹색)의 (H) 오버레이. 세포 아버의보기를 확대. 스케일 바는 대표 250 μm의 (AH) 또는 50 μm의 (H, 삽입). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : CX3CR1- GFP + 미세 아교 세포의 고해상도 시각화 / 단핵구 라이브 공 초점 주사 레이저 영상으로 내부 마우스 망막에 지역화 () 단일 xy- 점 cSLO 이미지가 중앙에서 GFP + 세포를 게재합니다. 2 개월 된 DBA / 2J 마우스 (왼쪽)에서 망막. 시신경 유두 면적 (원)을 보여주는 확대도 (오른쪽), 혈관 (라인) 혈관 주위 미세 아교 세포 / 대 식세포, 중앙 망막을 바둑판 식으로 배열 실질 미세 아교 세포와 함께 줄 지어. (B) 다 지점 화상은, 넓은 면적의 망막 (망막의 ⅓)에 걸쳐 미세 아교 세포를 시각화하기 위해 단일 점 직후에 모았다. (C, D) 세포 형태와 복잡성 최적 관찰 반전 그레이 스케일로 도시 된 이미지들은 동일한 (최소 콘트라스트, 해상도 조정). Somal의 크기와 모양은 대부분의 세포 (왼쪽)에서 해결 될 수 있습니다. 아버 확장과 세포 분기 대형 인 somata (오른쪽, 3 각각의 세포)와 세포에서 해결할 수 있습니다. (E) 순차 이미지의 XY -plane 배향 사용 혈관계 및 시신경 유두의 적외선 저상. 스케일 바는 250 μm의 (A, B 및 E), 25 μm의 (C, 맨 오른쪽)을 나타냅니다.ES / ftp_upload / 52731 / 52731fig5highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6 :. 미세 아교 세포와 인 somata의 분할 (A) GFP + 세포는 FluoRender를 사용하여 2D로 분할 렌더링. 공 촛점 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 임계 화에 의해 검출 (B)의 해당 셀 인 somata. (다) 정량 분석에 인 somata 의무 세포의 이진 마스크입니다. 지역으로 분단되는 세포 인 somata의 (D) 분류 미세 아교 세포 (> 50 ~ 60 μm의 2, 마젠타), 및 비 활성화 된 세포 (<50 μm의 2, 녹색) 활성화 차별합니다. 희미한 작은 세포 (<10 ~ 20 μm의 2, 노란색 별표) 반전 그레이 스케일로 원본 이미지 (수동으로 식별 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
그림 7 :. 젊은 DBA / 2J 망막의 미세 아교 세포 밀도 및 활성화의 종 추적 (A) 시대의 3~5개월 인수 같은 눈의 cSLO의 안저 및 FA의 이미지를 살고 있습니다. 순차 FA 이미지는 망막의 중심 ~ 1.7 mm (2) 내에 국부적 총 CX3CR1-GFP + 세포의 수의 경시 변화를 정량화하기 위해 사용되었다. 수는 실질과 혈관 주위 미세 아교 세포하지만, 시신경 유두에서 클러스터 제외 세포를 (위치는 흰색 원으로 표시) 포함. (B) 앞의 세에서 망막 미세 아교 세포의 밀도 및 활성화의 Timecourse 분석DBA / 2J 만성 녹내장 (N = 나이 당 10 망막)에 신경 변성. 총 GFP + 세포의 중앙 망막의 mm 2 당 활성화 된 소교 세포 (somal 영역> 50 μm의 2)의 수. 각 데이터 포인트는 하나의 망막을 나타내고, 수평 라인으로 표현되는 각 연령 수단. 총 GFP + 세포와 망막 단일 활성 소교 세포의 수의 (C) 월간 추적. 형태 학적으로 활성화 된 세포의 밀도보다 동적 인 변화에 총 활성화 세포 밀도에 평행하지만 다른 양적 변화가있다. 스케일 바는 250 μm의 (A)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

신경 퇴행성 질환 중 소교 세포의 수와 활성 형태의 실시간 모니터링은 세포 기능의 상세한 시각화를 허용 비 침습성 영상화 방법의 사용을 요구한다. 촬상 후, 소교 세포는 미세 아교 세포의 활성화를위한 판독 somal 같은 크기 및 / 또는 공정의 복잡성을 평가하기 위해 여러 단계의 임계치를 이용하여 형태 학적 분석을 위해 (분단) 고립되어야한다. 이 프로토콜에서는, 우리는 cSLO를 사용하여 라이브 영상 획득, 순차적 세포 및 소마 분할을 기반으로 미세 아교 활성화의 정량 분석​​하는 방법을 설명합니다. 우리는 망막의 만성 신경 퇴행성 질환의 맥락 2 개월 동안 망막 미세 아교 세포의 활성화 및 microgliosis의 역학을 평가하기 위해 이러한 전략을 적용 할 수 있습니다.

리포터 생쥐와 미세 아교 세포 / 말초 단핵 세포 유형

fractalkine 수용체의 조절하에 GFP를 발현 마우스의 사용 (CX3CR1)궤적 (46)는 상주하는 미세 아교 세포의 신뢰성있는 식별을 허용하고 견고한 GFP 발현은 생체 시각화 30-32,34,36 현저한 허용한다. 여기, 우리는 DBA / 2J 유전 적 배경 59에 C57BL / 6.129P- Cx3cr1 tm1Litt / J 마우스 (46)를 교잡에 의해 유도 된 DBA / 2J 마우스의 substrain를 사용합니다. 질병 또는 부상시 CNS에 침입 할 수 말초 단핵 세포 및 대 식세포는 또한 GFP 태그 15,46,47 표현.

신경 퇴행성 망막의 미세 아교 세포의 라이브 영상 연구

cSLO를 사용 CX3CR1-GFP / + 망막 세포의 우리의 생체 내 추적 최대 십주 30-32,34,48에 대한 급성 손상 후 망막 GFP + 세포 수의 변화를 모니터링 이전의 연구에 기반. 여기, 우리는 CX3CR1-GFP / + 미세 아교 세포 / 만성 녹내장의 초기 진행 중에 망막의 월간 cSLO 영상으로 세포 해상도와 주변 단핵 세포를 시각화.dditionally, 우리는 검출 및 셀 크기 조정을 정량화하는 라이브 화상 자동 임계 값 기반 분석을 사용하여 각각의 눈 내의 개인 걸쳐 미세 아교 세포 활성화 및 총 횟수의 변화를 감시하기에 충분한 공간 및 시간 해상도 리모델링.

망막에 GFP + 미세 아교 세포의 cSLO 영상의 기술적 한계

단일 세션에서 얻은 멀티 XY 포인트 이미지 (그림 5) 대 하나의 비교에 의해 예시 된 바와 같이 우리는 영상 품질이 일관되고 재현 될 것을 알았다. 그러나, 일관되고 재생 가능한 GFP + 세포 영상 획득은 단일 세션 및 시간이 지남에 따라 매우 안저 형광 cSLO 촬상 안정된 파라미터들의 선택에 달려있다. cSLO 목적을 눈 광학 디스크의 정렬은 포화 농도의 균일 성 및이자 (49)의 촛점 평면에 초점을 결정한다. 정확 및 / 또는 불균일 specificati포화 수준에 GFP 감지,자가 형광 배경 및 세포 및 정자 해상도 인공적인 변화를 생성 할 수 있습니다. 제대로 신경 섬유와 신경절 세포 층에 지역화 된 미세 아교 세포에 초점을하기 위해서는 정렬과 망막 혈관과 적외선 안저 영상으로 vitreal 표면에서 축삭 번들에 집중하는 것이 중요합니다. 이 FA에 의한 GFP + 세포를 찾습니다 참조 평면을 제공한다. FA에 IR에서 전환에 필요한 필수 재 초점은 각 실험 세션에서 약간 다른 깊이 (55-60 D)에서 여러 FA 이미지의 획득에 의해 유도 될 수있다. 이는 또한 나이, 동공 팽창과 병리 (광학 디스크 발굴)에 대한 해부학 적 차이를 보상 할 수 있습니다. 이미지 해상도 및 셀 세부 안저 걸쳐 채도 레벨의 최적의 사양, 및 카메라 (49)에 대한 눈의 상대 조심 배향에 의존하기 때문에, 이미지 시퀀스는 C와 저부 IR 이미지를 표시해야 같은 눈에 대해 시간 취득onsistent과 비교 초점, 조명, 해상도와 망막 필드 범위. 하나의 세션 (1.5-1.7 mm의 망막의 2, N = 13 망막, 세 3~5개월)에서 획득 된 영상에서 총 GFP + 세포 수의 수동 수는 세포 수 (3-4 %의 변화의 일관되고 재현 정량을 확인, 데이터를하지 그림 참조). 이미지가 임계 비슷한 강도의 범위를 기반으로 분석, 시간이 지남에 따라 변화의 비교를 통해 GFP + 세포 분할을위한 의무로이 필요하다.

임계 값 및 형태 계측 학적 라이브 cSLO 이미지에서 망막 미세 아교 세포 분석

최근에, 두 광자 공 초점 현미경으로 높은 세포 해상도와 뇌 미세 아교 세포의 생체 내 시각화 미세 아교 소마 및 공정 매개 변수의 정량 분석, 형태 학적으로 활성화 된 미세 아교 세포 9,50의 차별을 가능하게했다. 이들 저자들에 의해 도시 된 바와 같이, somal 크기가 가장 현저하다 형태학반복적 임계 강도 계를 사용하여 뇌의 미세 아교 세포의 라이브 개의 광자 공 초점 화상에 의해 시간이 지남에 따라 감지 파라미터는 신호대 잡음 편차를 줄이기 위해 9. 또한, somal 크기 변화는 활성화 된 세포 9 Iba1 표현의 상향 조절과 상관 관계. 여기, 우리는 망막에 지역화 CX3CR1-GFP + 세포를 cSLO 라이브 이미지를 사용하는 총의 수를 정량화하는 형태 계측 학적 분석 한 다음 미세 아교 세포 인 somata의 비교 연속 분할을 적용하고 활성화.

우리는 중앙 망막에 세그먼트 GFP + 세포에 전문 공 초점 렌더링 소프트웨어 (FluoRender)를 사용합니다. 이러한 이미지는, 상기 최종적으로 자동 분할 및 somal 영역의 임계 값 기반 정량화를 허용하도록, 시판되는 공 초점 화상 분석 패키지를 사용하여 임계 된된다. 우리의 라이브 화상이 라이브 화상 해석 9 소교 활성화 형태 메트릭으로서 소마 크기의 사용을 확인 분석한다. Somal이전에 생체 영상 분석 (50)에 의해 입증 된 바와 같이 임계 값 기반 카운트는, 패턴과 망막 microgliosis의 증가의 특성을 허용했다. 우리는 cSLO 세포가 같은 공 초점면에 이미지화 할 수있는 마우스 중앙 망막 (<2mm 2) 내에서 최고의 해상도와 세부 GFP + 미세 아교 세포를 감지 것을 찾을 수 있습니다. 망막 주변부를 향해 형광 신호가 변동과 평탄한 중앙 망막에서 검출 GFP + 세포로서 동일 영상 처리 및 임계 분석을 방지 왜곡을 나타낸다. 마지막으로, 우리의 프로토콜은 망막 미세 아교 세포의 cSLO 생체 영상 분석이 상대적으로 높은 처리량을 제공하고 있음을 보여준다. 시각적으로 분리되고 중심 망막 내에서 정량화 될 수있는 실질 소교의 수는 200-300 ~ 간의 총 세포 및 ~ 10-180 세포 활성화를 변화. 따라서, 마우스 망막 미세 아교 세포는 D 생체 내 자신의 변화와 역할을 연구하기 위해 최적의 인구를 제공합니다신경 변성의 발병을 uring.

다른 중추 신경계 만성 질환에 응용

여기에 설명 된 생체 화상 분석 방법은 다른 마우스 망막 질환 및 손상 모델에서, 급성 또는 만성 소교 변화를 평가에 적용 가능해야한다. 또한,이 프로토콜은 망막과 시신경이 질병 51-56에서 신경 퇴화를 대상으로 주어진 알츠하이머, 파킨슨 병 및 다발성 경화증과 같은 만성 중추 신경계의 병리로 인한 망막 미세 아교 세포 / 말초 단핵 세포의 변화를 평가하는 역할을 할 수있다. 이와 라인에서, 초기 알츠하이머 병 관리를위한 망막 및 시신경 유두 병리의 라이브 검색의 사용은 강렬한 연구 54,57,58 받고있다.

결론적으로, 우리의 연구 결과는 라이브, 종 추적 및 망막 미세 아교 세포의 숫자와 형태 학적 활성의 변화를 정량화, 신뢰할 네브라스카 서비스를 제공 할 수 있음을 시사바이오 마커를 uroimaging하는 것은 질병의 발병 초기 ​​진행을 감지합니다. 이 생체 내 이미징 및 분석 방법론은 망막과 시신경에 영향을 미칠 다른 신경 퇴행성 질환에 잠재적으로 연령과 관련된 녹내장에 적용합니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME 000671 and 00582 Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift.
30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe BD, East Rutherford, NJ 305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T48402, 152463 and P4417 Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week.
Heat therapy T/Pump Gaymar Industries, Orchard Park, NY TP-650
Cotton-tipped applicators Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 23-400-100
Tropicamide 1% Bausch & Lomb, Rochester, NY NDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick center Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK G003709 Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA Version 1.7.1.0
PowerPoint Microsoft, Redmond, WA Version 14.4.3
Adobe Photoshop Adobe, San Jose, CA Version CS3
FluoRender Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah Version 2.13 Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements C Nikon, Melville, NY Version 4.30.01

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