في فيفو ديناميات الشبكية دبقية التنشيط خلال تنكس عصبي: متحد البؤر Ophthalmoscopic التصوير والقياس الشكلي خلية في الماوس الزرق

1Department of Neurobiology & Anatomy, University of Utah, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah
Published 5/11/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وكثرة الدبيقيات استجابات الرئيسية لالتنكس العصبي المزمن. هنا، فإننا نقدم طرق لفي الجسم الحي، والتصور على المدى الطويل CX3CR1-GFP + الخلايا الدبقية الشبكية بواسطة تنظير العين متحد البؤر، وعتبة والمورفولوجية تحليل لتحديد وقياس تفعيلها. نحن نراقب التغيرات دبقية خلال المراحل المبكرة من الزرق المرتبطة بالتقدم في السن.

Cite this Article

Copy Citation

Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (99), e52731, doi:10.3791/52731 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الخلايا الدبقية الصغيرة، وهي الخلايا neuroimmune CNS المقيمة، وتحويل التشكل وحجمها استجابة لأضرار CNS، والتحول إلى حالة تنشيط وظائف متميزة وملامح التعبير الجيني. أدوار تفعيل دبقية في مجالات الصحة والاصابة والمرض لا تزال غير مفهومة تماما بسبب التنظيم الديناميكي والمعقد في استجابة للتغيرات في المكروية بهم. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان أن مراقبة غير جراحية وتحليل التغيرات في تفعيل دبقية مع مرور الوقت في الكائن الحي سليمة. في الجسم الحي تأخرت الدراسات تفعيل دبقية التي كتبها القيود التقنية لتتبع سلوك دبقية دون تغيير البيئة CNS. وقد كان هذا تحديا من نوع خاص خلال التنكس العصبي المزمن، حيث يجب أن تعقب التغييرات على المدى الطويل. شبكية العين، وهو جهاز العصبي المركزي قابلة للتصوير العيش غير الغازية، ويوفر نظام قوي لتصور وتميز ديناميات تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة خلال الاضطرابات المزمنة.

الحمار = "jove_content"> يعرض هذا البروتوكول الطرق على المدى الطويل، والتصوير في الجسم الحي من الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين، وذلك باستخدام تنظير العين متحد البؤر (cSLO) وCX3CR1 GFP الفئران / + المراسل، لتصور الخلايا الدبقية الصغيرة لقرار الخلوية. أيضا، نحن تصف أساليب لقياس التغيرات الشهرية في تنشيط الخلايا وكثافة في مجموعات فرعية الخلايا الكبيرة (200-300 الخلايا في شبكية العين). نحن نؤكد استخدام منطقة somal كمقياس مفيدة لتتبع مباشر لتفعيل دبقية في شبكية العين من خلال تطبيق آلية تحليل المورفومترية القائم على عتبة في الجسم الحي الصور. نحن نستخدم هذه الحصول على الصور الحية ويحلل استراتيجيات لرصد التغيرات الديناميكية في تفعيل دبقية وكثرة الدبيقيات خلال المراحل المبكرة من التنكس العصبي في شبكية العين في نموذج الفأر من الزرق المزمن. وينبغي أن يكون هذا النهج مفيدا لمعرفة مدى مساهمة الخلايا الدبقية الصغيرة إلى انخفاض العصبية ومحور عصبي في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي المزمنة التي تؤثر على شبكية العين والعصب البصري.

Introduction

الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا neuroimmune الموجودة حصرا في الجهاز العصبي المركزي (CNS) منذ التطور الجنيني المبكرة وطوال فترة البلوغ. مجهزة ذخيرة معقدة من المستقبلات، وينظم النشاط دبقية وعدم التجانس الإقليمي من خلال تفاعلها ثنائي الاتجاه مع الخلايا العصبية المجاورة، الدبقية، حاجز الدم في الدماغ والخلايا التسلل neuroinflammatory 1،2. تساهم ظائف دبقية القاعدية لصيانة وإصلاح الفسيولوجية، كما عينة أراضيها لاضطرابات في التوازن 3،4. أثناء إصابة الجهاز العصبي المركزي أو المرض، والخلايا الدبقية الصغيرة هي أول المستجيبين للإشارات العصبية التي تؤدي ثم انتقالها إلى النمط الظاهري على رد الفعل، يسمى "تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة 2،5-7. تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة ينطوي على دورة معقدة من الجينات والبروتينات التعبير، التي تقترن إلى سوما الخلية وعملية تغيير الحجم ويعيد 6-9. تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة، فضلا عن إعادة توزيع الخلايا والمجموعات، يمكن رافق الزيادة الإجمالية المحلية في عدد الخلايا (كثرة الدبيقيات تسميته). هذا يمكن أن تنجم عن تكاثر الخلايا وتجديد الذات، مع أو بدون توظيف حيدات الدم المستمدة 3،4،7،10-14. في مجموعة واسعة من وأمراض الجهاز العصبي المركزي المزمنة التي تعتمد على العمر وأصيب كثرة الدبيقيات وتفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة مرض مواز التقدم 15-19. كيف أثر الدبقية الصغيرة التنكس العصبي لا تزال غير واضحة، وذلك أساسا لأنها تلعب الدورين اعصاب والضارة التي قد يكون لها مساهمات متنوعة لظهور المرض وتطور. وقد رصدت الدراسات التصويرية الحية تهدف إلى فهم مرض مزمن CNS السلوك دبقية في الجهاز العصبي المركزي المتضرر من النماذج الحيوانية والبشر، وأثبتت أن التعديلات دبقية هي بداية اكتشافها في مراحل المرض المبكرة 15-17،19،20. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان لوضع نهج لكشف ورصد تفعيل دبقية في الجسم الحي.

DETE غير الغازيةتأسست ction التغيرات الإقليمية في تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ باعتبارها مهمة في مؤشر الجسم الحي من تطور المرض الاعصاب، وذلك باستخدام التصوير الجزيئي أو تلألؤ بيولوجي وانبعاث البوزيترون التصوير المقطعي أو التصوير بالرنين المغناطيسي 18،21،22. هذه الطرق التصوير الجزيئي والنووي الكمية للغاية وغير الغازية كشف دباق لقرار الإقليمي. بدلا من ذلك، واثنين من الفوتون التصوير متحد البؤر في CX3CR1 GFP / + الفئران قد سمح مراقبة الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ لقرار الخلوية 3،4،9،20،23-28. ومع ذلك، فإن هذا النهج يحد على المدى الطويل والمراقبة المتكررة من التعديلات دبقية المزمنة، وبالنظر إلى المخاطر المحتملة للإزعاج سلوكهم حتى مينيملي الإجراءات تصوير الدماغ 29. بدلا من ذلك، الشبكية تقدم الظروف المثلى لمباشرة في الجسم الحي التصور ورصد المتكررة من الخلايا الدبقية الصغيرة في حياتهم سليمة المتخصصة CNS طوال الشيخوخة، بعد الإصابة الحادة، ويحتمل أن تكون خلال الأمراض العصبية المزمنة. وهكذا، فقد أثبتت الدراسات الحديثة جدوى عالية الدقة التصوير من الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين معربا عن GFP من خلال تكييف تنظير العين مسح متحد البؤر الليزر (cSLO) إلى الصورة الحية CX3CR1 GFP / + الفئران. وقد استخدم هذا لتتبع التغيرات الأسبوعية في GFP + الخلايا الأرقام في الفئران الفردي لمدة تصل إلى 10 أسابيع بعد الإصابة التي يسببها ارتفاع ضغط الدم الحاد أو العين 30-36.

فإننا قمنا بمد هذا النهج لأداء التصوير على المدى الطويل على مدى عدة أشهر، والكمية تعقب التغييرات في تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة استنادا إلى حجم سوما باستخدام تحليل المورفومترية. وقد عرفت حجم Somal كمقياس المفيد تفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة في دراسات التصوير الحية باستخدام اثنين من الفوتون المجهري متحد البؤر في شرائح القشرية لأداء في مجال التصوير المجراة من CX3CR1-GFP + الخلايا الدبقية الصغيرة 9. كما أظهرت هذه الدراسات وغيرها العلاقة بين حجم somal ومستويات البروتين Iba1 التعبير، ذوي الخوذات البيضاءالتراث الثقافي غير المادي يزيد أيضا مع تفعيل 9،37. وبالتالي، يمكن تحديد تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران الحية، ورصد أعدادها وتوزيعها على مر الزمن خلال CNS الصحة والمرض.

يصف هذا البروتوكول طرق cSLO الحصول على الصور الحية وتحليل لرصد أعداد الخلايا الدبقية، توزيع وتفعيل الصرفي أثناء الشبكية خلايا العقدة (RGC) انحطاط (الشكل 1). وبالتالي، تستخدم هذه الدراسة: 1) نموذج الفأر من الزرق ورثت (DBA / 2J) أن يخضع تعتمد على سن العصب البصري والشبكية والتنكس العصبي يظهر التباين الملحوظ في تطور المرض ما بين 5 و 10 شهرا من العمر 38،39، 2) شهريا cSLO في الجسم الحي التصوير لرؤية طويلة الأجل لGFP + الخلايا في شبكية العين والعصب البصري امياليني من متخالف Cx3cr1 GFP / + DBA / 2J الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 3-5 أشهر، 3) تحليل التصوير الحي من قبل تجزئة والعتبة لعزل somata الخلية والتدبير المنطقة الأشعة تحت الحمراء. يتم تطبيق هذه الاستراتيجيات لتقييم حركية الشبكية دول تفعيل دبقية خلال المراحل المبكرة من الزرق المزمن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

في الجسم الحي أن يتم التصوير في مرافق خالية من مسببات الأمراض باستخدام بروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة ولاية يوتا.
ملاحظة: يتم استخدام هذا البروتوكول التصوير بالنسبة للفئران مراسل فيه الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين والتسلل حيدات / الضامة تعبر عن الأخضر الفلورسنت البروتين (GFP) تحت سيطرة موضع fractalkine مستقبلات (CX3CR1).

1. في فيفو تصوير الشبكية GFP + الخلايا الدبقية الصغيرة التي متحد البؤر المسح بالليزر تنظير العين (cSLO)

  1. تشغيل نظام التدفئة التي تسيطر عليها الماء، سيؤدي إلى استقرار درجة حرارة الماوس بين 35-37 درجة مئوية خلال الإجراء، وربط اثنين من منصات التدفئة.
    1. بدء متحد البؤر منظار العين المسح بالليزر (cSLO) النظام (الشكل 2A). فتح البرنامج cSLO، أدخل المعلومات التي من شأنها تحديد الماوس الفردية ووضع انحناء القرنية من 2 ملم (القائمة بيانات المريض).
  2. الاستعداد لمعهد العالم العربيجينج. تناسب بشكل آمن على 55º واسعة المجال نظيفة عدسة الهدف على المقبس. إعداد منصة التصوير منظار العين من خلال تأمين وسادة التدفئة مغطاة ورقة نظيفة. استخدام لقطات للشد وسادة ورقة ومنعهم من عرقلة حركة العدسة الشيئية.
  3. تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من 1.3٪ 2،2،2-ثلاثي بروم إيثانول و 0.8٪ ثالثي الأميل الكحول (250 ملغم / كغم من وزن الجسم؛ 0.5 مل / 25 غرام من وزن الجسم) باستخدام إبرة 30½ G المجهزة ل1 مل يمكن التخلص منها حقنة. عودة الماوس لقفصه، وأبقى على وسادة التدفئة.
    ملاحظة: تسليم المخدر عن طريق الحقن مقابل استنشاق يسمح المواقع أسهل من الماوس للتصوير والوصول دون عائق للعيون، وخالية من المخاريط الأنف والأنابيب.
  4. بمجرد أن يتوقف الحيوان المتحركة وغير مستجيب لقرصة الذيل، لحث اتساع حدقة العين مع تروبيكاميد وفينيليفرين (0.5٪ لكل منهما)، عن طريق وضع الحيوان عرضة وتغطي كلتا العينين مع قطرات لمدة 7 دقائق.
  5. بعد 5 دقائق، صالدانتيل الماوس عرضة على مركز للمنصة منظار العين، وعدسات لاصقة تناسب أكثر من كلتا العينين، وتطبيق الحد الأدنى من الضغط.
    ملاحظة: العدسات اللاصقة هي صغيرة وهشة ولكن يمكن التعامل معها بعناية مع الأصابع، على الرغم من ملقط يمكن استخدامها بدلا من 40. استخدام العدسات اللاصقة هو اختياري، ولكن على النحو الموصى به ان يقلل من جفاف العين، ويحافظ على شفافية القرنية أثناء التصوير.
  6. بعد 7 دقائق، توجيه الماوس مع العين اليمنى التي تواجه عدسة موضوعية وبالتوازي المدار إلى العدسة الشيئية، والحفاظ على الحيوانات غير المقيد بالقرب من حافة المنصة (الشكل 2B). لجمع الصور من التشبع للمقارنة والتوجه، والحفاظ باستمرار المسافة من العين إلى العدسة الشيئية، وكذلك المواءمة بين العين إلى مسار الضوء طوال جلسات التصوير. مقطع شعيرات طويلة التدخل في مراقبة العين.
    ملاحظة: للحصول على 8-10 دقيقة المقبل، والماوس لا يتحرك أو طرفة، وسوف التنفس مع الحركة لطيفالإدلاء بالبيانات التي تتبعها cSLO العين تتبع ART (التلقائي في الوقت الحقيقي) واسطة، الذي يعدل الموقف مسح الرأس على أساس معالم قاع مع التباين العالي. الماضي ذلك الوقت، الفئران تبدأ يلهث وامض، مما يجعل من التصوير غير عملي.
  7. إذا تم إجراء التصوير بدون استخدام العدسات اللاصقة، وتطبيق برنامج تلفزيوني قطرات لكلتا العينين كل 2-3 دقيقة لمنعهم من الجفاف.
  8. جمع الصورة قاع الأوعية الدموية في شبكية العين والقرص البصري، وتركز على شبكية العين الداخلية.
    1. تحديد وضع الأشعة تحت الحمراء (IR) وضبط الإعدادات إلى 820 نانومتر الإثارة، 100٪ طاقة الليزر، 40-60٪ الحساسية (الشكل 2C).
    2. العمل في وضع عالية السرعة (12.6 إطار / ثانية)، حدد موقع العين باستخدام عصا التحكم لدفع منظار العين. في التكبير المنخفض، وفحص القرنية والعدسة لإصابة أو التعتيم، واستبعاد من وجهة نظر الدراسة يعانون من عيوب أو الإصابة التي من شأنها أن تؤثر على تصوير شبكية العين (الشكل 3A).
    3. حدد منطقة القرص البصري (سطحرأس العصب البصري، ONH) بإحراز الهدف أقرب إلى العين، ثم تركز الصورة على أنها وقفل هذا الموقف من قبل الشد على عصا التحكم. هذا التوافق من العين إلى منظار العين هي مفتاح الحصول حتى التركيز والانبعاثات عبر الصورة.
    4. تصور الطائرات الداخلية للشبكية، وكذلك ONH، وذلك باستخدام الأوعية الدموية الرئيسية تقع على سطح vitreal من شبكية العين حيث طائرة مرجعية محورية (59 و 60 D)، أو أعمق (55 D) في عيون تظهر البصرية المحفورة أقراص. يجب التركيز الأمثل لحل خلايا الدم داخل الأوعية الدموية الرئيسية، والتجويف والجدران مميزة بشكل واضح.
    5. تحسين صورة الإشباع عن طريق ضبط الطلب على لوحة التحكم التي تعمل باللمس، حتى هالة بيضاء من الإضاءة موحدة تمتد في أكثر من مجال 55º قاع حول القرص البصري (باستخدام التعرض المفرط طفيف). المقبل، وانخفاض تشبع لتحسين النقيض من ذلك حتى خلايا الدم تتحرك على طول الأوعية الكبرى يمكن حلها بشكل واضح. إذا الظلام البؤريولا تزال المناطق، وليس بسبب تلف في شبكية العين، إعادة تنظيم العين إلى الكاميرا حتى يتم الحصول على صورة بهيجة. هذا التعديل هو أمر أساسي للقبض على مجموعات قابلة للتكرار الصور في موقف والجودة.
    6. جمع صورة الأشعة تحت الحمراء عالية الدقة من الشبكية المركزية (1،4-1،7 مم في القطر، اعتمادا على العمر)، حيث بلغ متوسطها 30 لقطة في الوقت الحقيقي (4.7 لقطة / ثانية؛ تطبيع)، لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء (الشكل 2D ).
  9. على الفور، والحصول على صورة مضان من GFP + الخلايا الدبقية الصغيرة و / أو التسلل حيدات مترجمة إلى الطائرات الداخلية للشبكية وONH.
    ملاحظة: الأمثل للصورة قاع IR الشبكية يحدد دقة الصورة مضان من الخلايا GFP +، فضلا عن مدى شبكية العين الداخلية امتدت. الفشل في التركيز الطائرات الداخلية للشبكية، والتي يمكن الكشف عنها بواسطة قرار ضعف الأوعية الدموية، ويؤدي في GFP + خلية وجهات النظر باهتة (الشكل 3B). الفشل في ضبط IR نجمة واحدةالتموينية بشكل صحيح ومنتظم يؤثر على صورة مضان (FA)، وإدخال تغيرات مصطنعة في GFP + كثافة الخلايا وحجم (الشكل 3C).
    1. Swich إلى مضان وضع التصوير (FA) في لوحة الشاشة التي تعمل باللمس، وذلك باستخدام اللون الأزرق، 488 نانومتر الإثارة ليزر (460-490 نانومتر مرشح حاجز مجموعة)، وضبط حيازة (100٪ طاقة الليزر و100-125٪ حساسية)، والتي حافظت ثابت لجميع الفئران (الشكل 2E).
    2. جمع س ص نقطة واحدة، صورة مضان bidimensional من شبكية العين، والتقاط صورة قاع فورا في موقف مماثل (100X المتوسط ​​المسح؛ 55º زاوية المسح الضوئي لكلا الصور، الشكل 2F).
    3. التقاط صورة متعددة عن طريق اختيار "المركب" في لوحة التحكم (الشكل 2G) وتحريك الحق منظار العين واليسار، بالغسل الشبكية عبر المحور الزمني الأنف (الشكل 2H).
      ملاحظة: بعد مسح صورة س ص نقطة واحدة (100X الصورةيمكن المتوسط)، والبرنامج تلقائيا بمسح متوسطات جديدة من نفس المناطق والجديدة (مقيدة مع دائرة خضراء أثناء الفحص الأمثل، أو أحمر عند الفحص غير عملي)، وغرز جميع المناصب XY-في الوقت الحقيقي. الصورة المركبة الناتجة تمتد 1،5-1،7 مم على المحور السيني الأفقي 3-4 ملم في المحور الرأسي (55º س 120-124º زاوية المسح الضوئي).
  10. التصوير الكامل من كل فأر خلال 15 دقيقة بعد تحريض التخدير، وقبل وامض وإعادة تشغيل الحركة.
  11. إزالة العدسات اللاصقة والعيون هيدرات مع برنامج تلفزيوني والعودة الحيوان إلى قفصه حرارة، والتحقق من السلوك حتى الشفاء التام من الحركة.
  12. للدراسات طولية باستخدام جلسات cSLO التصوير متقطعة في نفس الماوس الفردية، كرر التصوير لا تقل عن 3 أيام على حدة لتجنب السمية التراكمية للتخدير، وكذلك تهيج القرنية.

2. لايف معالجة الصور وتحليل

  1. متتابعة صورة المحاذاة:
    1. محاذاةالصور قاع لسلسلة زمنية من نفس العين باستخدام الأوعية الدموية والقرص البصري كما المعالم. فتح جميع الصور في برنامج عرض الشرائح العرض التجاري، عن طريق سحب كل صورة على مدى السابقة واحد حتى محاذاة الأقراص البصرية الخاصة بهم على متن الطائرة xy- (تظهر الصورة العليا شبه شفافة في حين أن تنجر)، ثم تناوب على صورة أعلى حتى ل الأوعية الدموية الرئيسية تتداخل مع الأوعية الدموية في الصورة أدناه (التركيز على سفن أبعد من القرص البصري). تسجيل زاوية دوران لكل صورة وحفظ هذه السلسلة من الوقت للرجوع إليها في المستقبل، تتبع الماوس والعين الهوية.
    2. محاذاة سلسلة المقابلة من واحد الصور مضان XY نقطة من خلال تطبيق زاوية المسجلة لتصحيح دوران س ص في كل نقطة زمنية، وذلك باستخدام خطوط المسح برنامج محرر الرسوم البيانية. بالإضافة إلى ذلك، ضبط دقة 300 نقطة في البوصة (بدون إعادة قياس) والخلفية (في وضع RGB، حدد المستويات وأخذ عينات من التجويف في أحد الاوعية الدموية كما أسود). حفظ هذه الصوركملفات TIF، مضيفا "الانحياز" لأسمائهم.
  2. دبقية تجزئة الخلية:
    1. لتحديد GFP + الخلايا في شبكية العين المركزية، وفتح في FluoRender على "الانحياز" ملف TIF المقابلة لأقرب نقطة زمنية / العمر. تكبير الصورة لتناسب الشاشة، ثم تحديد وجهة التقديم (مركب، متعامد، محرف) وخصائصه (0.58 جاما، 255 نقطة التشبع، 255 الإنارة، 195 ألفا و 1.00 التظليل)، واختيار كل من قنوات RG كما مرئية (إخفاء قناة B بها في إطار مساحة النقر المزدوج، الشكل 4A).
    2. لتحديد الخلايا الفردية، عتبة القناة الحمراء (يجب أن يتم تسليط الضوء على الإطار مساحة عمل)، من خلال زيادة عتبة منخفضة حتى يتم حجب معظم الخلايا (أبيض) مع الحد الأدنى من عمليات التداخل والخلية (السماوي)، مع الحفاظ على عتبة عالية ثابت (255). قيمة عتبة منخفضة تتراوح ما بين 100 و 170، اعتمادا على كثافة مضان (الشكل 4B </ قوي>).
    3. حفظ هذا الرأي مع القناة الحمراء مرئية فقط (القيادة التقاط) كملف TIF الجديد، مضيفا "cellsegm" إلى اسمه الأصلي (الشكل 4C). باستخدام خطوط المسح عام محرر الرسوم البيانية البرمجيات، عكس اللون الرمادي، وضبط دقة 300 نقطة في البوصة على النحو الوارد أعلاه، وحفظ مرة أخرى كما RGB (الشكل 4D).
      ملاحظة: حذف المجلدات (المشاريع) التي تم إنشاؤها تلقائيا من قبل FluoRender، وحفظ عتبة تطبيقها لتكون مرجعا في المستقبل.
  3. دبقية تجزئة سوما وقياس الأشكال:
    1. لتحديد GFP + somata خلية لتقدير مساحة، استخدم صورة برامج التحليل مع القياسات الآلي كثافة وقدرات عتبة، وكذلك القائم على عتبة العد الكائن والقياس. فتح "cellsegm" ملف TIF، وحدد طريقة إعادة قياس (سين) والقناة الحمراء (انقر علامة التبويب الأحمر في RGB). تحسين التصور من خلال إلغاء "قناة الرأي في لون" (بزر الماوس الأيمن فوق RG الأحمرعلامة التبويب B)، واختيار "تكمل الألوان" (صورة / ضبط صورة) لعكس اللون الرمادي ورؤية الخلايا في رمادي / أسود على خلفية بيضاء (الشكل 4E).
    2. معايرة الصورة ل1،4-1،7 مم تبعا للعمر، عن طريق رسم خط أفقي عبر كامل الصورة (المعايرة، معايرة السريع).
    3. الجزء somata خلية فردية من خلال تطبيق العتبة كثافة (الشكل 4B). لهذا، والعمل على قناة RGB الأحمر وفتح وظيفة عتبة كثافة (وجوه عدد، واختيار "تحديث العد" الأوامر) من أجل تتبع المعلمات bidimensional لكل منطقة thresholded الفائدة (ROI) تمثل somata الفردية.
    4. تحديد عتبة كثافة في الرسم البياني كثافة، من خلال تحديد أدنى 50-60٪ من مستويات 255، وصقل قيمة العتبة النهائية من خلال تقييم بصريا التداخل بين قناع اللون العتبة (الأزرق) ومحيط سوما الخلية (الرمادي) في الخلايا الفردية (Figure 4E).
    5. تقدير دقة الأقنعة سوما الخلية لتمثيل أبعاد somal عن طريق قياس المنطقة قبل وبعد تجزئة في 10 الخلايا، واستعرض مجموعة عتبة محددة إذا كانت القياسات تختلف أقل من 10٪ (استخدم شريط ثنائي والمقاييس المفصل).
    6. تحديد رويس somal التي تشمل عدة خلايا وفصل هذه العناصر (أو القضاء رويس منفصلة باستخدام عناصر التحكم ثنائي شريط الأدوات، أو الكتالوج كائن)، في حين تبديل على / قبالة ثنائي لتصور بشكل مباشر على الخلايا (الشكل 4F) يدويا.
    7. تصنيف الخلايا الدبقية كما رويس مع المناطق somal أكبر وأصغر من 50-60 ميكرون 2 للتمييز somata الخلية المقابلة لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الدبقية الصغيرة بتعطيل على التوالي، وذلك باستخدام المساحة تقييد.
      ملاحظة: يتم تعريف كل somal خلية فرعية مع مختلف طبقة ثنائية pseudocolored، ويمكن وصفها كذلك لمعلمات الشكلية الأخرى (perimeثالثا، دائرية، وما إلى ذلك)، وكذلك كميا داخل القطاعات الشبكية المنفصلة (الشكل 4G). حفظ الصورة تحليلها كملف ND2.
    8. تحقق من العملية والمتفرعة التعقيد في خلايا دبيقي تنشيط الفردية، التي تتراكب مع قناع somal وس ص واحد صورة -point (زيادة المقابل 50٪، الشكل 4H). العد يدويا العمليات تمتد مباشرة من سوما الخلية أو قياس قطر المضلع يشمل الشجرة (استخدم شريط ثنائي والمقاييس المفصل).
      ملاحظة: المنشط الخلايا تفتقر العمليات أو تتحمل قليلة (<4) وباختصار (<2X somal قطر) منها، وعلى النقيض من العمليات غير المفعلة الخلية، والتي تتكون من الشجرة المتشعبة والواسعة (> 3-10x somal قطر) المحيطة بها نسبيا سوما صغير.
    9. تحديد الخلايا يدويا مع somata أصغر من <20 ميكرون 2 و / أو GFP التعبير دون حد الكشف، والتي بالتالي لم يتم كشفها من قبل فيتوتر العتبة. استخدام الأمر للتصنيف في شروح لحساب العناصر المحددة يدويا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدمت لدينا مؤخرا في الدراسات المجراة هذه الحصول على الصور وتحليل أساليب العيش لتصور وتتبع حركية وأنماط ONH والتغيرات دبقية صغيرة في شبكية العين خلال المراحل المبكرة من الزرق المزمن وعلاقتها أواخر التنكس العصبي 59. نحن هنا توضيح cSLO بروتوكول الحصول على الصور لتصور الخلايا الدبقية عبر منطقة واسعة من الشبكية المركزية في الفردية الشباب متخالف Cx3CR1-GFP DBA / 2J شبكية العين (الشكل 5). استنادا إلى قرار خلية عالية، ونحن نطبق صورة حية العتبة والتحليلات المورفولوجية التي تسمح للتجزئة التلقائي الفردية GFP + الخلايا وsomata (الشكل 6).

لمراقبة تطور كثرة الدبيقيات المحلية و / أو تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في العصور السابقة التنكس العصبي كشف في هذا النموذج من الزرق المزمن، قمنا بقياس تغيرات شهرية من مجموع كثافة الخلايا الدبقية الصغيرة في فردي الشباب متخالف معادل3CR1-GFP DBA / 2J شبكية العين (ن = 10) بين 3-5 أشهر من العمر (الشكل 7A). وتمشيا مع تطور متغير من التنكس العصبي في الفردية عيون 41-44، تحليلنا يكشف عن مستويات مختلفة من تفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين وكثرة الدبيقيات عبر عيون في كل عصر (الشكل 7B)، وبالكشف عن التغيرات الديناميكية في كثافة من الكل وتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين الفردية (الشكل 7C). بشكل ملحوظ، وفكت أعداد الخلايا الدبقية الصغيرة تفعيلها من التغييرات المتزامنة في GFP الكلي + كثافة الخلية. هذه النتائج في الجسم الحي تؤكد فيفو السابقين التحليل السابق من التغييرات دبقية في DBA / 2J الفئران 45. وبالتالي cSLO كشف الحية وقياس تفعيل دبقية الشبكية قد يكون بمثابة مؤشرات تطور المرض في وقت مبكر ضمن الفردية العيون، ويحتمل أن تكون مرتبطة بدء أحداث الزرق المرضية.

وقد استخدم الحصول على الصور الحية ومعالجة وتحليل سير العمل cSLO لمئات صورة GFP + الخلايا الوحيدات الطرفية دبيقي / مترجمة إلى وسط ~ 1.7 مم 2 من شبكية العين الداخلية الماوس: الرقم 1. تم الحصول على الصور مضان (FA) شهريا لنفس الفئران، ومحاذاة الصور باستخدام الأشعة تحت الحمراء (IR) قاع الأوعية الدموية في شبكية العين وسطح vitreal كمرجع. أدت تجزئة GFP + الخلايا وsomata من تطبيق خطوتين منفصلة من الكثافة العتبة لكرة القدم صور شبكية العين. يسمح تحليل المورفومترية للثنائي يمثل somata خلية قياس المناطق somal الفردية. صنفت GFP + الخلايا مع منطقة somal فوق 50 ميكرون 2 كما تفعيلها. وقد تم قياس كثافة من إجمالي والمفعلين GFP + الخلايا الفردية للصور FA شبكية العين، وفحص تمديد الشجرة وأجريت المتفرعة التعقيد من خلال الملاحظة المباشرة من الصور FA. الرقم 2
الشكل 2: لايف ضوابط الحصول على الصور في cSLO Spectralis (A) دليل الشاشات التي تعمل باللمس لوحة العرض على بدء. (B) نافذة التصوير البرامج cSLO، يظهر رأسا على فأرة الحاسوب حية. (C) الإعدادات المحددة للتصوير بالأشعة تحت الحمراء (مضاءة باللون الأزرق). (D) صورة قاع العين في شبكية العين خلال الاستحواذ الحقيقي الوقت (اللوحة اليسرى) ومتوسط ​​(اللوحة اليمنى). وأشارت القيادة التطبيع مع دائرة سوداء. الشرايين والأوردة يشع من رأس العصب البصري مرئية (بين قوسين)، وكذلك حزم محور عصبي البصرية (السهام) بين الأوعية الدموية. إعدادات (E) مختارة للتصوير مضان داخل نقطة س ص واحدة. (F) نقطة واحدة مضان (FA، 488 نانومتر) التصوير خلال اقتناء (المتوسط). تيإنه صورة أصغر (يسار) يدل على المسح الفردية، وصورة بشكل اكبر (يمين) ويبين التقدم المحرز في كثافة المتوسط. (G) الإعدادات المحددة للالاستحواذ على عدة نقاط (المركبة)، صورة مضان. (H) متعددة اكتساب التصوير مضان، وتبين من المسح الضوئي في التقدم، الذي يحدد البرنامج مع دائرة خضراء (أو أحمر عند الاستحواذ غير ممكن). الحانات النطاق تمثل ~ 5 مم (B) أو 250 ميكرون (DH) يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. .

الشكل (3)
الرقم 3: عيوب العين الرئيسية والأخطاء التصوير التي يمكن أن تمنع التصوير cSLO الصحيح من الخلايا الدبقية (A - C) الضرر العيني أو العيوب، وكذلك خطأ الحصول على الصور. الصورة يمكن أن تمنع التصوير موثوق بها من GFP + الخلايا مترجمة إلى طائرات أعمق من شبكية العين. (A) بعض العيوب العين الجسيمة هي التي يمكن اكتشافها بسهولة في الصور قاع، بما في ذلك القرنية أو العدسة التعتيم، أو الإصابة وتعميق مساحة القرص البصري، وكلها منع التصوير واضح من GFP + الخلايا. (B) التركيز إما فوق (جدران الأوعية تصبح تمييزه عن التجويف) أو تحت السطح الداخلي للشبكية العين (السفن هي بالكاد مرئية) يقلل من إمكانية الكشف عن GFP مضان الانبعاثات من الخلايا الموجودة في الخلية الألياف العصبية والعقدة طبقات. المستويات (C) التشبع بشكل غير صحيح أو بشكل غير متساو مجموعة يمكن أن يؤدي في صور مشرق ولكن مشبعة (مع الخلايا التي تفتقر إلى الدقة) أو صور مع المناطق حجب. يمثل شريط مقياس 250 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

= "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الرقم 4
الرقم 4: ثنائي الكمي القائم على العتبة من عدد الخلايا الدبقية ومنطقة somal (A - D) خطوات تجزئة الخلية في FluoRender (A) للملاحة نافذة مطلة المقدمة من على بعد نقطة واحدة صورة مضان تمثيلية من الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين المركزية. (اللوحة العلوية)؛ المقابلة الخصائص تقديم (اللوحة السفلى). (B) نفس الصورة أثناء روتين تجزئة الخلية، ينظر إليها على أنها RGB، مع ضبط عتبة (لوحات أقل) المقابلة. يتم تمثيل الخلايا Thresholded من قبل بكسل البيضاء ومضافين لعملياتها في السماوي. (C) صورة من أقنعة الخلية التي تم الحصول عليها بعد تجزئة الخلية. (D) قناع السابق مع قيم اللون الرمادي مقلوب لمزيد من المعالجة الصورة. (E - H) خطوات من العتبة somal وتقدير. (E) استخدام عتبة كثافة لشريحة الخلايا الدبقية الصغيرة somata على أساس تقسيم الخلية السابقة الخاصة بهم. الرسم البياني كثافة RGB (يسار) يسمح العتبة التي كتبها الاختيار المباشر من أقل نطاق 50-60٪ من شدة (من 0 إلى 127-153). هذا التقسيم يخلق قناع للقياس الكمي الذي يعزل somata دبقية الفردية (الأزرق). يتم ترتيبها الصور باستخدام وظيفة المفتاح (البيضاوي على اليمين). (F) القياسات المأخوذة من عتبة التلقائية للدول، فرادى ROI / somata (اللوحة العلوية) والصور الظلية العائد على الاستثمار (كتالوج كائن، اللوحة السفلية) المستخدمة لتصحيح رويس متداخلة باستخدام أدوات الثنائية (اللوحة اليمنى) للفصل اليدوي أو التآكل. (G) تصنيف المناطق somal الفردية حسب المنطقة تقييد (اللوحة اليسرى أعلى). تصنف somata مجزأة كما رويس أصغر وأكبر من 50-60 ميكرون ويتم تعيين طبقات ثنائية لكل فئة من فئات مختلفة somata بكسل اللون (الأخضر لالثاني أرجواني، على التوالي). (H) تراكب من somata مجزأة (الأخضر) على الصورة الأصلية (مع زيادة المقابل) تستخدم للمراقبة المباشرة من تعقيد العملية في الخلايا تفعيلها الفردية (اللوحة اليسرى). عرض العرش خلية المكبرة. تمثل القضبان نطاق 250 ميكرون (AH) أو 50 ميكرون (H، أقحم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5: عالية الدقة تصور CX3CR1- GFP + الخلايا الدبقية الصغيرة / المترجمة حيدات لشبكية العين الماوس الداخلية التي كتبها متحد البؤر الحية التصوير الضوئي ليزر (A) نقطة واحدة xy- cSLO صورة تظهر GFP + الخلايا داخل المركزية. شبكية العين في 2 الشهر DBA القديم / 2J الماوس (يسار). عرض تضخيم (يمين) تظهر المنطقة ONH (دائرة)، والأوعية الدموية (خطوط) واصطف مع الخلايا الدبقية الصغيرة المحيطة بالأوعية / الضامة، ومتني الخلايا الدبقية الصغيرة تبليط الشبكية المركزية. (B) متعددة الصور، التي تم جمعها مباشرة بعد نقطة واحدة لتصور الخلايا الدبقية الصغيرة في جميع أنحاء منطقة الشبكية أوسع (⅓ في شبكية العين). (C، D) صور متطابقة، كما هو موضح مع اللون الرمادي مقلوب للمراقبة المثلى للمورفولوجيا الخلايا والتعقيد (تعديل الحد الأدنى للوعلى النقيض من قرار). حجم Somal وشكل يمكن حلها في معظم الخلايا (يسار). تمديد الشجرة والمتفرعة خلية يمكن حلها في الخلايا مع somata كبير (الحق، و3 الخلايا الفردية). (E) صورة قاع الأشعة تحت الحمراء من الأوعية الدموية والبصرية القرص المستخدمة لس ص محاذاة -plane من صور متسلسلة. تمثل القضبان نطاق 250 ميكرون (A، B و E)، و 25 ميكرون (C، أقصى اليمين).وفاق / ftp_upload / 52731 / 52731fig5highres.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6: تقسيم الخلايا الدبقية وsomata (A) GFP + الخلايا التي تقضي بها تجزئة في 2D باستخدام FluoRender. (B) somata الخلية المقابلة، الكشف عنها من قبل العتبة باستخدام صورة متحد البؤر برامج التحليل. (C) قناع ثنائي خلية somata قابلة للتحليل الكمي. (D) تصنيف somata خلية مجزأة حسب المنطقة ليميز تنشيط خلايا دبقية (> 50-60 ميكرون قرمزي)، والخلايا غير مفعلة (<50 ميكرون الأخضر). ويتم تحديد الخلايا قاتمة والصغيرة (<10-20 ميكرون النجمة الصفراء) يدويا في الصورة الأصلية مع اللون الرمادي مقلوب ( الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7: تتبع طولية من كثافة الخلايا الدبقية والتنشيط في الشباب DBA / 2J شبكية العين (A) يعيش cSLO قاع والصور FA من نفس العين، تم الحصول عليها من 3-5 أشهر من العمر. استخدمت الصور FA متتابعة لقياس التغيرات على مر الزمن في مجموع أعداد CX3CR1-GFP + الخلايا المترجمة في وسط ~ 1.7 مم 2 من شبكية العين. وتضمنت التهم متني والخلايا الدبقية الصغيرة المحيطة بالأوعية، ولكن الخلايا استبعاد تتجمع في ONH (أشار موقف مع دائرة بيضاء). (B) تحليل Timecourse من كثافة الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين وتفعيل في العصور السابقةالتنكس العصبي في DBA / 2J الزرق المزمن = 10 شبكية العين في العمر). أرقام من مجموع الخلايا GFP + والخلايا الدبقية المنشط (منطقة somal> 50 ميكرون 2) لكل ملم 2 الشبكية المركزية. كل نقطة تمثل البيانات الشبكية واحدة، وتعني ليتم تمثيل مع خط أفقي كل عصر. (C) تتبع الشهري لأعداد مجموع الخلايا GFP + والخلايا دبيقي تفعيلها في شبكية العين واحدة. هناك تغييرات موازية ولكنها مختلفة من الناحية الكمية في إجمالي والمفعلين كثافة الخلايا، مع تباين أكثر ديناميكية في كثافة الخلايا تفعيلها شكليا. يمثل شريط مقياس 250 ميكرون (A). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

رصد حي لعدد الخلايا دبقية وتفعيل الصرفي أثناء مرض الاعصاب يتطلب استخدام أساليب التصوير غير الغازية التي تسمح التصور التفصيلي من الميزات الخلية. بعد التصوير، والخلايا الدبقية يجب أن تكون معزولة (مجزأة) للتحليل المظهرية عن طريق استخدام الخطوات عتبة متعددة لتقييم حجم somal و / أو تعقيد العملية قراءات لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. في هذا البروتوكول، وصفنا طرق الحصول على الصور الحية باستخدام cSLO، والتحليل الكمي من تفعيل دبقية بناء على خلية متتابعة وسوما تجزئة. نحن نطبق هذه الاستراتيجيات لتقييم حركية تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين وكثرة الدبيقيات أكثر من 2 أشهر في سياق مرض الاعصاب المزمن في شبكية العين.

الفئران مراسل والخلايا الدبقية الصغيرة / حيدات الطرفية أنواع الخلايا

استخدام الفئران التي تعبر عن GFP تحت سيطرة مستقبلات fractalkine (CX3CR1)مكان 46 يسمح بتحديد موثوق من الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة، ويسمح قوية التعبير GFP ملحوظا في الجسم الحي التصور 30-32،34،36. هنا، ونحن نستخدم substrain من DBA / 2J الفئران، التي يجنيها backcrossing C57BL / 6.129P- Cx3cr1 tm1Litt / J الفئران 46 في DBA / 2J خلفية وراثية 59. وحيدات الضامة الطرفية، والتي يمكن أن تغزو الجهاز العصبي المركزي أثناء المرض أو الإصابة، كما تعبر عن العلامة GFP 15،46،47.

دراسات التصوير الحية من الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين الاعصاب

لدينا تتبع في الجسم الحي من CX3CR1-GFP / + خلايا الشبكية باستخدام cSLO يبني على الدراسات السابقة التي ترصد التغيرات في GFP الشبكية + أعداد الخلايا بعد الاصابة الحادة لمدة تصل إلى 10 أسابيع 30-32،34،48. هنا، نحن تصور CX3CR1-GFP / + الخلايا الدبقية الصغيرة / حيدات الطرفية لقرار الخلوية، من خلال التصوير cSLO الشهري للشبكية العين خلال التقدم في وقت مبكر من الزرق المزمن. Additionally، ونحن نستخدم صورة حية الآلي التحليل القائم على عتبة لكشف وتحديد تغيير حجم الخلية وإعادة عرض مع ما يكفي من القرار المكانية والزمانية لرصد التغيرات في تنشيط وإجمالي تعداد الخلايا الدبقية الصغيرة داخل الفردية العينين وبين الأفراد.

القيود التقنية من cSLO التصوير من GFP + الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين

وجدنا جودة التصوير لتكون متسقة وقابلة للتكرار، كما يتضح من المقارنة بين واحد مقابل صور نقطة س ص المتعددة التي تم الحصول عليها في جلسة واحدة (الشكل 5). ومع ذلك، واقتناء GFP + خلية التصوير متسقة وقابلة للتكرار، في جلسة واحدة وعلى مر الزمن، وتعتمد بشكل كبير على مجموعة من المعلمات مستقرة للتصوير قاع العين ومضان cSLO. المواءمة بين العين والبصرية القرص إلى الهدف cSLO تحدد التوحيد من مستويات التشبع والتركيز على الطائرة مبائر من الفائدة 49. / أو specificati غير دقيقة وغير موحدةعلى مستويات التشبع يمكن أن تولد تغيرات مصطنعة في الكشف عن GFP، الخلفية تألق ذاتي، والخلايا وقرار الشجرة. للتركيز بشكل صحيح على الخلايا الدبقية الصغيرة مترجمة إلى الألياف العصبية وطبقات الخلايا العقدية، فمن الأهمية بمكان لمواءمة والتركيز على الأوعية الدموية في شبكية العين وعلى حزم محور عصبي على سطح vitreal بواسطة الأشعة تحت الحمراء التصوير قاع. وهذا يوفر طائرة مرجعية لتحديد GFP + الخلايا عن طريق الاتحاد الانجليزي. إعادة تركيز المطلوبة اللازمة للتحول من الأشعة تحت الحمراء لكرة القدم يمكن أن تسترشد اقتناء صور متعددة FA على أعماق مختلفة قليلا (55-60 D) في كل دورة تجريبية. هذا يمكن أن يساعد أيضا تعويض عن الاختلافات التشريحية نظرا لكبر سنه، اتساع حدقة العين وعلم الأمراض (البصري الحفر القرص). منذ دقة وضوح الصورة والتفاصيل الخلية يعتمد على المواصفات المثلى من مستويات التشبع في جميع أنحاء قاع، والمواءمة متأنية للعين بالنسبة للكاميرا 49، تسلسل الصور المكتسبة على مر الزمن لنفس العين أن تظهر الصور قاع IR مع جالتركيز onsistent وقابلة للمقارنة، والإضاءة، القرار، ومدى حقل في شبكية العين. وأكدت التهم اليدوية GFP + خلية مجموع الأرقام في الصور المكتسبة في جلسة واحدة (1،5-1،7 مم 2 من شبكية العين، ن = 13 شبكية العين، الذين تتراوح أعمارهم بين 3-5 أشهر) الكمي متسقة وقابلة للتكرار من الخلوية (الاختلاف 3-4٪، البيانات لا معروضة). وهذا أمر ضروري للصور لتكون قابلة للGFP + تجزئة الخلية عن طريق تحليل عتبة استنادا إلى مجموعة كثافة مماثلة، ومقارنة التغيرات على مر الزمن.

العتبة والمورفولوجية وتحلل الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين في الصور cSLO الحية

مؤخرا فقط، وقد مكن في الجسم الحي التصور من الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ لقرار الخلوية عالية من قبل اثنين من الفوتون المجهري متحد البؤر التحليل الكمي للدبقية سوما والعملية المعلمات، والتمييز من تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة شكليا 9،50. كما يتضح من هؤلاء الكتاب، وحجم somal هو الصرفية الأكثر بروزاالمعلمة للكشف على مر الزمن التي كتبها live اثنين من الفوتون التصوير متحد البؤر من الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ، وذلك باستخدام تكرارية العتبة القائم على كثافة للحد من الإشارة إلى الضوضاء الاختلافات 9. وعلاوة على ذلك، يتغير حجم somal ترتبط مع upregulation من Iba1 التعبير في خلايا تنشيط 9. هنا، فإننا نستخدم cSLO الصور الحية وتطبيق تجزئة متسلسلة مماثلة للخلايا الدبقية وsomata، تليها التحليل المظهرية لتحديد أعداد مجموعه والمفعلين CX3CR1-GFP + الخلايا مترجمة إلى شبكية العين.

نستخدم متحد البؤر المتخصصة تقديم برنامج (FluoRender) لشريحة GFP + الخلايا في شبكية العين المركزية. هذه الصور، وthresholded كذلك باستخدام حزمة تحليل الصور مبائر المتاحة تجاريا، للسماح في نهاية المطاف تجزئة التلقائي والكمي القائم على أعتاب منطقة somal. لدينا صورة حية تحليلات تؤكد استخدام حجم سوما كمقياس الصرفي تفعيل دبقية في تحليل الصور الحية 9. Somalالتهم المستندة إلى عتبة سمحت توصيف أنماط والزيادات في كثرة الدبيقيات شبكية العين، كما هو موضح سابقا من قبل المجراة سابقا تحليل الصور 50. نجد أن cSLO بالكشف عن GFP + الخلايا الدبقية الصغيرة مع أفضل قرار والتفاصيل داخل الماوس الشبكية المركزية (<2 مم 2)، حيث الخلايا يمكن تصويرها في نفس الطائرة مبائر. نحو محيط الشبكية، تظهر إشارة مضان التباين والتشوهات التي تحول دون معالجة التصوير متطابقة وتحليل العتبة بالنسبة للGFP + الخلايا المكتشفة في الشبكية المركزية تملق. أخيرا، يظهر بروتوكول لدينا أن cSLO في الجسم الحي تحليل الصور من الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين يقدم إنتاجية عالية نسبيا. عدد متني دبيقي والتي قد تكون معزولة بصريا وكميا في الشبكية المركزية تنوعت بين ~ 200-300 مجموع الخلايا، و~ 10-180 خلايا تفعيلها. وبالتالي، فإن الماوس الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين يقدم لسكان الأمثل للدراسة في الجسم الحي على التحول والأدوار دأورينغ التسبب في التنكس العصبي.

تطبيق لأمراض مزمنة أخرى CNS

يجب في الجسم الحي أساليب تحليل الصور الموصوفة هنا تكون قابلة للتطبيق لتقييم التغيرات دبقية حادة أو مزمنة في غيرها من أمراض شبكية العين الماوس ونماذج الاصابة. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول قد تخدم لتقييم التغيرات الخلايا الدبقية الصغيرة / الوحيدات الطرفية الشبكية الناتجة عن أمراض الجهاز العصبي المركزي المزمنة، مثل مرض الزهايمر والشلل الرعاش والتصلب المتعدد، وبالنظر إلى أن شبكية العين والعصب البصري وتستهدف لالتنكس العصبي في هذه الأمراض 51-56. في هذا الإطار، واستخدام الكشف المباشر لشبكية العين وONH علم الأمراض لإدارة مرض الزهايمر في وقت مبكر هو تحت الدراسة المكثفة 54،57،58.

في الختام، تشير النتائج التي توصلنا إليها أن يعيش، وتتبع الطولي وتقدير التغيرات في أعداد الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين وتفعيل الصرفي، قد تخدم شمال شرق يعول عليهuroimaging المؤشرات الحيوية للكشف عن بداية ظهور أعراض المرض والتقدم في وقت مبكر. هذه المنهجية في الجسم الحي التصوير والتحليل تنطبق على الزرق المرتبطة بالعمر، ويحتمل أن تكون للأمراض العصبية الأخرى التي تؤثر على شبكية العين والعصب البصري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME 000671 and 00582 Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift.
30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe BD, East Rutherford, NJ 305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T48402, 152463 and P4417 Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week.
Heat therapy T/Pump Gaymar Industries, Orchard Park, NY TP-650
Cotton-tipped applicators Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 23-400-100
Tropicamide 1% Bausch & Lomb, Rochester, NY NDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick center Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK G003709 Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA Version 1.7.1.0
PowerPoint Microsoft, Redmond, WA Version 14.4.3
Adobe Photoshop Adobe, San Jose, CA Version CS3
FluoRender Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah Version 2.13 Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements C Nikon, Melville, NY Version 4.30.01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7, (65), 1-18 (2013).
  2. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91, (2), 461-553 (2011).
  3. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, (6), 752-758 (2005).
  4. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  6. Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33, (3), 256-266 (2001).
  7. Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, (6), 563-581 (1999).
  8. Jonas, R. A., et al. The spider effect: morphological and orienting classification of microglia in response to stimuli in vivo. PloS One. 7, (2), e30763 (2012).
  9. Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PloS One. 7, (2), 1-9 (2012).
  10. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10, (12), 1538-1543 (2007).
  11. Elmore, M. R., et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 82, (2), 380-397 (2014).
  12. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, (1), 151-170 (1990).
  13. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  14. Solomon, J. N., et al. Origin and distribution of bone marrow-derived cells in the central nervous system in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 53, 744-753 (2006).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat. Neurosc. 14, (9), 1142-1149 (2011).
  16. Sapp, E., et al. Early and progressive accumulation of reactive microglia in the Huntington disease brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60, (2), 161-172 (2001).
  17. Maeda, J., et al. In vivo positron emission tomographic imaging of glial responses to amyloid-beta and tau pathologies in mouse models of Alzheimer's disease and related disorders. J. Neurosc. 31, (12), 4720-4730 (2011).
  18. Jacobs, A. H., Tavitian, B. Noninvasive molecular imaging of neuroinflammation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, (7), 1393-1415 (2012).
  19. Ouchi, Y., et al. Microglial activation and dopamine terminal loss in early Parkinson's disease. Ann. Neurol. 57, (2), 168-175 (2005).
  20. Fuhrmann, M., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13, (4), 411-413 (2010).
  21. Trapani, A., Palazzo, C., de Candia, M., Lasorsa, F. M., Trapani, G. Targeting of the translocator protein 18 kDa (TSPO): a valuable approach for nuclear and optical imaging of activated microglia. Bioconjug. Chem. 24, (9), 1415-1428 (2013).
  22. Venneti, S., Lopresti, B. J., Wiley, C. A. Molecular imaging of microglia/macrophages in the brain. Glia. 61, (1), 10-23 (2013).
  23. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat. Comm. 3, (1227), 1-15 (2012).
  24. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6, (3), e17910 (2011).
  25. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp. Neurol. 254, (214), 109-120 (2014).
  26. Nayak, D., Zinselmeyer, B. H., Corps, K. N., McGavern, D. B. In vivo dynamics of innate immune sentinels in the CNS. Intravital. 1, (2), 95-106 (2012).
  27. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, (11), 1-16 (2010).
  28. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. J. Neurosci. 29, (13), 3974-3980 (2009).
  29. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J. Vis. Exp. 19, (43), (2010).
  30. Alt, C., Runnels, J. M., L, T. G. S., P, L. C. In vivo tracking of hematopoietic cells in the retina of chimeric mice with a scanning laser ophthalmoscope. Intravital. 1, (2), 132-140 (2012).
  31. Eter, N., et al. In vivo visualization of dendritic cells, macrophages, and microglial cells responding to laser-induced damage in the fundus of the eye. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49, (8), 3649-3658 (2008).
  32. Liu, S., et al. Tracking retinal microgliosis in models of retinal ganglion cell damage. Investigative ophthalmology & visual science. 53, 6254-6262 (2012).
  33. Maeda, A., et al. Two-photon microscopy reveals early rod photoreceptor cell damage in light-exposed mutant mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111, (14), E1428-E1437 (2014).
  34. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46, (8-9), 1336-1345 (2006).
  35. Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Res. 45, (28), 3512-3519 (2005).
  36. Alt, C., Runnels, J. M., Mortensen, L. J., Zaher, W., Lin, C. P. In vivo imaging of microglia turnover in the mouse retina after ionizing radiation and dexamethasone treatment. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 55, (8), 5314-5319 (2014).
  37. Bosco, A., et al. Reduced retina microglial activation and improved optic nerve integrity with minocycline treatment in the DBA/2J mouse model of glaucoma. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49, (4), 1437-1446 (2008).
  38. Anderson, M. G., et al. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, (1), 81-85 (2002).
  39. Chang, B., et al. Interacting loci cause severe iris atrophy and glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 21, (4), 405-409 (1999).
  40. Smith, R. S., Korb, D., John, S. W. A goniolens for clinical monitoring of the mouse iridocorneal angle and optic nerve. Mol. Vis. 8, 26-31 (2002).
  41. Buckingham, B. P., et al. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal loss in a mouse model of glaucoma. J. Neurosci. 28, (11), 2735-2744 (2008).
  42. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. J. Cell Biol. 179, (7), 1523-1537 (2007).
  43. Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J. Cell Biol. 171, (2), 313-325 (2005).
  44. Soto, I., et al. Retinal ganglion cells downregulate gene expression and lose their axons within the optic nerve head in a mouse glaucoma model. J. Neurosci. 28, (2), 548-561 (2008).
  45. Bosco, A., Steele, M. R., Vetter, M. L. Early microglia activation in a mouse model of chronic glaucoma. J. Comp. Neurol. 519, (4), 599-620 (2011).
  46. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, (11), 4106-4114 (2000).
  47. Broux, B., et al. CX(3)CR1 drives cytotoxic CD4(+)CD28(-) T cells into the brain of multiple sclerosis patients. J. Autoimmun. 38, (1), 10-19 (2012).
  48. Paques, M., et al. In vivo observation of the locomotion of microglial cells in the retina. Glia. 58, (14), 1663-1668 (2010).
  49. Charbel Issa, P., et al. Optimization of in vivo confocal autofluorescence imaging of the ocular fundus in mice and its application to models of human retinal degeneration. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 53, (2), 1066-1075 (2012).
  50. Beynon, S. B., Walker, F. R. Microglial activation in the injured and healthy brain: what are we really talking about? Practical and theoretical issues associated with the measurement of changes in microglial morphology. Neuroscience. 225, (2012), 162-171 (2012).
  51. Chan, J. W. Recent advances in optic neuritis related to multiple sclerosis. Acta Ophthalmol. 90, (3), 203-209 (2012).
  52. Frost, S., Martins, R. N., Kanagasingam, Y. Ocular biomarkers for early detection of Alzheimer's disease. J. Alzheimer's Dis. 22, (1), 1-16 (2010).
  53. Guo, L., Duggan, J., Cordeiro, M. F. Alzheimer's disease and retinal neurodegeneration. Curr. Alzheimer Res. 7, (1), 3-14 (2010).
  54. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 83, (9), 917-922 (2012).
  55. Kersten, H. M., Roxburgh, R. H., Danesh-Meyer, H. V. Ophthalmic manifestations of inherited neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurol. 10, (6), 349-362 (2014).
  56. Kesler, A., Vakhapova, V., Korczyn, A. D., Naftaliev, E., Neudorfer, M. Retinal thickness in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. Clin. Neurol. Neurosurg. 113, (7), 523-526 (2011).
  57. Petzold, A., et al. Optical coherence tomography in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 9, (9), 921-932 (2010).
  58. Satue, M., et al. Retinal thinning and correlation with functional disability in patients with Parkinson's disease. Br. J. Ophthalmol. 98, (3), 350-355 (2014).
  59. Bosco, A., Romero, C. O., Breen, K. T., Chagovetz, A. A., Steele, M. R., Ambati, B. K., Vetter, M. L. Neurodegeneration severity can be predicted from early microglia alterations monitored in vivo in a mouse model of chronic glaucoma. Dis Model Mech. (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats