En Vivo Dinámica de Retina Microglial Activación Durante Neurodegeneración: Confocal oftalmoscópico Imaging y Morfometría celular en el ratón Glaucoma

1Department of Neurobiology & Anatomy, University of Utah, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah
Published 5/11/2015
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Medicine

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Summary

La activación de la microglia y microgliosis son respuestas clave a la neurodegeneración crónica. A continuación, presentamos los métodos para in vivo, visualización a largo plazo de la retina células microgliales CX3CR1-GFP + por oftalmoscopía confocal y de umbral y los análisis morfométricos para identificar y cuantificar su activación. Hacemos un seguimiento de los cambios microgliales durante las primeras etapas del glaucoma relacionada con la edad.

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Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (99), e52731, doi:10.3791/52731 (2015).

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Abstract

La microglía, que son células neuroimmune CNS residentes, transforman su morfología y tamaño en respuesta al daño del SNC, el cambio a un estado activado con funciones distintas y perfiles de expresión génica. Los papeles de la activación microglial en la salud, lesiones y enfermedades Todavía no se entiende debido a su regulación dinámica y compleja en respuesta a los cambios en su microambiente. Por lo tanto, es crítico para el monitor de forma no invasiva y analizar cambios en la activación microglial en el tiempo en el organismo intacto. Estudios in vivo de la activación microglial se han retrasado por las limitaciones técnicas para el seguimiento de la conducta microglial sin alterar el entorno del SNC. Esto ha sido particularmente difícil durante la neurodegeneración crónica, donde los cambios a largo plazo deben ser rastreados. La retina, un órgano CNS susceptibles de imágenes en vivo no invasiva, ofrece un potente sistema para visualizar y caracterizar la dinámica de la activación de la microglia durante trastornos crónicos.

en vivo de la microglía de la retina, usando oftalmoscopia confocal (cSLO) y ratones / + reportero CX3CR1 GFP, para visualizar la microglia con la resolución celular. Además, se describen los métodos para cuantificar los cambios mensuales en la activación celular y la densidad en grandes subconjuntos de células (200-300 células por la retina). Confirmamos el uso de la zona de Somal como una métrica útil para el seguimiento en directo de la activación microglial en la retina mediante la aplicación de análisis morfométricos basados ​​umbral automatizado de imágenes en vivo. Utilizamos estos adquisición de imágenes en directo y análisis de estrategias para monitorear los cambios dinámicos en la activación microglial y microgliosis durante las primeras etapas de la neurodegeneración de la retina en un modelo murino de glaucoma crónico. Este enfoque debe ser útil para investigar las contribuciones de microglia a declive neuronal y axonal en los trastornos crónicos del sistema nervioso central que afectan a la retina y el nervio óptico.

Introduction

La microglía son células neuroimmune que residen exclusivamente en el sistema nervioso central (CNS) desde el desarrollo embrionario temprano y durante la edad adulta. Equipado con un complejo repertorio de receptores, la actividad microglial y la heterogeneidad regional se rigen por su interacción bidireccional con las neuronas vecinas, glia, barrera hematoencefálica y la infiltración de células neuroinflamatorios 1,2. Funciones microgliales basales contribuyen al mantenimiento y reparación fisiológica, ya que prueben su territorio de las perturbaciones en la homeostasis de 3,4. Durante una lesión o enfermedad del SNC, microglia son los primeros en responder a las señales neuronales que luego desencadenan su transición a un fenotipo reactiva, denominado "microglia 2,5-7 activado. La activación de microglía implica un ciclo complejo de genes y la expresión de la proteína, que están acoplados a soma celular y cambiar el tamaño de proceso y la remodelación de 6-9. La activación de la microglia, así como la redistribución celular yclustering, puede ir acompañada del aumento general local en el número de células (denominado microgliosis). Esto puede ser el resultado de la proliferación celular y la auto-renovación, con o sin reclutamiento de monocitos derivados de la sangre 3,4,7,10-14. En una amplia gama de enfermedades del SNC, crónicas dependientes de la edad, sostenida microgliosis y la enfermedad paralela activación microglia progresión 15-19. Cómo microglia neurodegeneración impacto sigue siendo poco clara, principalmente porque desempeñan ambos papeles neuroprotectores y nocivos que pueden tener diversas contribuciones a la aparición de la enfermedad y la progresión. Estudios de imagen en directo dirigidas a la comprensión de la enfermedad crónica del SNC han monitoreado el comportamiento microglial en el SNC dañado de modelos animales y los seres humanos, y ha demostrado que las alteraciones microgliales son principios detectable en las etapas iniciales de la enfermedad 15-17,19,20. Por lo tanto, es fundamental para desarrollar enfoques para detectar y vigilar la activación microglial en vivo.

Dete no invasivacción de los cambios regionales en la activación de la microglia cerebral se estableció como un importante indicador en vivo de la progresión de la enfermedad neurodegenerativa, utilizando la imagen molecular o bioluminiscencia y la tomografía por emisión de positrones o la resonancia magnética 18,21,22. Estos métodos de imagen molecular y nuclear altamente cuantitativos y no invasivos detectan gliosis con la resolución regional. Por otra parte, de dos fotones de imagen confocal en CX3CR1 GFP / + ratones ha permitido la observación de la microglía del cerebro con la resolución celular 3,4,9,20,23-28. Sin embargo, este enfoque limita a largo plazo y la observación repetida de alteraciones crónicas microgliales, dado el riesgo potencial de alterar su comportamiento mediante técnicas de imagen cerebral incluso mínimamente invasivos 29. Alternativamente, la retina ofrece las condiciones óptimas para la visualización directa, en vivo y monitoreo repetido de microglia en su intacta nicho SNC largo envejecimiento, después de una lesión aguda, ypotencialmente durante enfermedades neurodegenerativas crónicas. Así, los estudios recientes han demostrado la viabilidad de imágenes de alta resolución de la microglía de la retina que expresan GFP mediante la adaptación de la oftalmoscopía confocal de barrido láser (cSLO) a la imagen en vivo CX3CR1 GFP / + ratones. Esto ha sido utilizado para rastrear los cambios semanales en GFP + el número de células en ratones individuales de hasta 10 semanas después de la lesión aguda inducida o hipertensión ocular 30-36.

Hemos extendido este enfoque para realizar las imágenes a largo plazo durante varios meses, y cuantitativamente seguimiento de los cambios en la activación de la microglia en función del tamaño soma usando análisis morfométrico. Tamaño Somal se definió como una métrica útil de la activación de la microglia en los estudios de imagen en vivo de dos fotones usando microscopía confocal en rodajas corticales para realizar imágenes in vivo de CX3CR1-GFP + microglia 9. Estos y otros estudios también demostraron la correlación entre el tamaño Somal y los niveles de expresión de la proteína Iba1, whICH también aumenta con la activación de 9,37. Por lo tanto, microglia activada puede ser identificado en ratones vivos, y su número y distribución monitoreado en el tiempo durante la salud y la enfermedad del SNC.

Este protocolo describe métodos para la adquisición de imágenes en vivo cSLO y análisis para controlar el número de células microgliales, la distribución y la activación morfológica durante células ganglionares (RGC) degeneración de la retina (Figura 1). Por lo tanto, este estudio utiliza: 1) un modelo de ratón de glaucoma heredado (DBA / 2J) que sufre nervio óptico dependiente de la edad y la neurodegeneración de la retina y muestra una notable variabilidad en la progresión de la enfermedad entre 5 y 10 meses de edad 38,39, 2) mensual cSLO de formación de imágenes in vivo para la visualización a largo plazo de las células GFP + en la retina y el nervio óptico unmyelinated de heterocigotos CX3CR1 GFP / + ratones DBA / 2J de edad 3-5 meses, 3) análisis de imágenes en vivo por la segmentación y de umbral para aislar somas de células y medida laárea de IR. Estas estrategias se aplican para evaluar la cinética de estados de activación microglial de la retina durante las primeras etapas de glaucoma crónico.

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Protocol

En vivo de imágenes se realiza en instalaciones libres de patógenos utilizando los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Utah.
NOTA: Este protocolo de formación de imágenes se utiliza para reportero ratones en los que la microglía de la retina y la infiltración de monocitos / macrófagos expresan la proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del locus del receptor de fractalquina (CX3CR1).

1. En Vivo Imaging de Retina GFP + Microglia por confocal de barrido láser oftalmoscopia (cSLO)

  1. Encienda el sistema de calefacción con control de agua, ajuste para estabilizar la temperatura del ratón entre 35-37 ºC durante el procedimiento, y conectar dos almohadillas térmicas.
    1. Inicie el sistema confocal oftalmoscopio láser de exploración (cSLO) (Figura 2). Abra el programa cSLO, introduzca la información que identificará el ratón individual y establecer una curvatura corneal de 2 mm (menú de datos del paciente).
  2. Prepárese para imaging. Encajar de forma segura un 55º de campo amplio lente objetivo limpia en su zócalo. Preparar la plataforma de imágenes oftalmoscopio asegurando una almohadilla eléctrica cubierto con papel limpio. Utilice clips para aplanar la almohadilla y el papel y evitar que se bloquea el movimiento de la lente objetivo.
  3. Anestesiar el ratón por inyección intraperitoneal de 1,3% 2,2,2-tribromoetanol y 0,8% de alcohol terc-amílico (250 mg / kg de peso corporal; 0,5 ml / 25 g de peso corporal) usando una aguja de 30½ G montado en un desechable 1 ml jeringa. Ratón y vuelta a su jaula, mantenido sobre una almohadilla térmica.
    NOTA: La entrega de la anestesia mediante inyección contra la inhalación permite fácil posicionamiento del ratón para la imagen y el acceso sin obstáculos a los ojos, sin nariz conos y tubos.
  4. Una vez que el animal deja de moverse y no responde a la pizca de cola, inducir dilatación de la pupila con tropicamida y fenilefrina (0,5% cada uno), colocando el animal en decúbito prono y cubrir ambos ojos con las gotas de 7 min.
  5. Después de 5 min, pata el ratón boca abajo en el centro de la plataforma oftalmoscopio, y lentes de contacto se ajustan sobre ambos ojos, la aplicación de presión mínima.
    NOTA: Las lentes de contacto son pequeñas y frágil, pero pueden ser cuidadosamente manejados con los dedos, aunque fórceps pueden utilizarse en lugar 40. El uso de lentes de contacto es opcional, pero se recomienda ya que minimiza la sequedad ocular y preserva la transparencia corneal durante la exploración.
  6. Después de 7 min, orientar el ratón con el ojo derecho frente a la lente del objetivo y de la órbita paralela a la lente del objetivo, manteniendo el animal suelto cerca del borde de la plataforma (Figura 2B). Para recoger imágenes de saturación y la orientación comparable, constantemente mantener la distancia del ojo a la lente de objetivo, así como la alineación del ojo a la trayectoria de la luz a lo largo de las sesiones de formación de imágenes. Clip largos bigotes que interfieren con la observación del ojo.
    NOTA: Para el próximo 8-10 minutos, el ratón no se mueve ni parpadea, y lo hará respirar con movimiento suavetos, que son seguidos por el cSLO seguimiento de los ojos ART modo (automático en tiempo real), que ajusta la posición del cabezal de escaneo basado en hitos del fondo de ojo con alto contraste. Pasado ese tiempo, los ratones comienzan jadeando y parpadeando, haciendo de imágenes poco práctico.
  7. Si la imagen se realiza sin el uso de lentes de contacto, aplicar PBS cae a ambos ojos cada 2-3 min para evitar que se seque.
  8. Recolecta la imagen del fondo de ojo de la vascularización de la retina y del nervio óptico, se centró en la retina interna.
    1. Seleccione el modo de infrarrojo (IR) y ajustar la configuración a 820 nm de excitación, 100% de potencia del láser, 40-60% de sensibilidad (Figura 2C).
    2. Trabajar en el modo de alta velocidad (12,6 marco / seg), localice el ojo utilizando el joystick para conducir el oftalmoscopio. A menor aumento, inspeccione la córnea y el cristalino para lesiones o la opacidad, y excluir de los ojos de estudio con defectos o daños que afectarán imágenes de la retina (Figura 3A).
    3. Localice el área del disco óptico (la superficie dela cabeza del nervio óptico, ONH) por lo que el objetivo más cerca del ojo, luego centrar la imagen en él y bloquear esta posición atornillando el joystick. Esta alineación del ojo para el oftalmoscopio es clave para obtener incluso el enfoque y la emisión a través de la imagen.
    4. Visualizar los planos internos de la retina, así como la ONH, utilizando los principales vasos sanguíneos situados en la superficie vítrea de la retina como un plano de referencia focal (59 y 60 D), o más profundo (55 D) en los ojos que muestran óptica excavado discos. El enfoque óptimo debería resolver circulante glóbulos dentro de los vasos sanguíneos principales, con su luz y paredes claramente diferenciadas.
    5. Optimizar la saturación de la imagen ajustando el dial en el panel de control de pantalla táctil, hasta que un halo blanco de iluminación uniforme se extiende en la mayor parte del campo de 55º fundus alrededor del disco óptico (con ligera sobreexposición). A continuación, baje la saturación para optimizar el contraste hasta que las células de la sangre en movimiento a lo largo de los principales vasos pueden ser claramente resueltos. Si oscura focaláreas persisten, no debido a daño en la retina, realinear el ojo a la cámara hasta que se obtiene una imagen brillante de manera uniforme. Este ajuste es fundamental para capturar conjuntos reproducibles de imágenes en la posición y la calidad.
    6. Se recoge una imagen IR de alta resolución de la retina central (1.4 a 1.7 mm de diámetro, dependiendo de la edad), con un promedio de 30 cuadros en tiempo real (4,7 fotogramas / seg; normalizado), para mejorar la relación señal-ruido (Figura 2D ).
  9. Inmediatamente, adquirir una imagen de fluorescencia de GFP + microglia y / o monocitos infiltrantes localizadas a los planos internos de la retina y la CNO.
    NOTA: Optimización de la imagen del fondo de ojo IR de la retina determina la resolución de la imagen de fluorescencia de las células GFP +, así como la extensión de la retina interna se extendió. Si no se centrará los planos internos de la retina, que puede ser detectada por la mala resolución de la vasculatura, dará lugar a GFP + células vistas atenuados (Figura 3B). Si no se ajusta satu IRración afecta correcta y uniforme la imagen de fluorescencia (FA), la introducción de variaciones de artefactos en las buenas prácticas agrarias + células intensidad y tamaño (Figura 3C).
    1. Swich a la fluorescencia modo de imagen (FA) en el panel de la pantalla táctil, utilizando azul, de excitación 488 nm láser (460-490 nm conjunto filtro de barrera), y los ajustes de adquisición (100% de la potencia del láser y 100-125% de sensibilidad), que se mantienen constante para todos los ratones (Figura 2E).
    2. Reunir un solo punto xy, imagen de fluorescencia bidimensional de la retina, y la captura de una imagen de fondo de ojo de inmediato en la posición idéntica (100x promedio exploración; 55º ángulo de exploración tanto de imágenes; Figura 2F).
    3. Capturar una imagen de multipunto seleccionando "compuesto" en el panel de control (Figura 2G) y moviendo el derecho oftalmoscopio y la izquierda, la panorámica de la retina a través del eje-nasal temporal (Figura 2H).
      NOTA: Después de escanear una sola imagen xy-punto (100x spuede promediar), el software promedios automáticamente nuevos scans de las mismas y las nuevas áreas (circunscritos con un círculo verde durante la exploración óptima, o rojo cuando el análisis es inviable), y todos los puntos de sutura-xy posiciones en tiempo real. La imagen compuesta resultante se extiende por 1.5 a 1.7 mm en el eje horizontal x 3-4 mm en el eje vertical (55º x 120-124º ángulo de exploración).
  10. Imagen completa de cada ratón dentro de los 15 minutos después de la inducción de la anestesia, antes de parpadear y se reinicia de movimiento.
  11. Quitar las lentes de contacto, ojos de hidratos con PBS y devolver el animal a su jaula calentado, comprobando el comportamiento hasta la recuperación completa de la motilidad.
  12. Para los estudios longitudinales utilizando intermitentes sesiones cSLO-de formación de imágenes en el mismo ratón individual, repetir de formación de imágenes no menos de 3 días de diferencia para evitar la toxicidad acumulativa de la anestesia, así como irritación de la córnea.

2. Vivo Procesamiento y Análisis de Imágenes

  1. Alineación de la imagen secuencial:
    1. Alinearlas imágenes de fondo de ojo para una serie temporal de la misma ojo utilizando la vasculatura y disco óptico como puntos de referencia. Abra todas las imágenes en un programa de presentación de diapositivas comercial, arrastrando cada imagen sobre la anterior hasta que sus discos ópticos se alinean en el plano xy (la imagen superior aparece semitransparente mientras era arrastrado), a continuación, gire la imagen superior hasta su los principales vasos sanguíneos se superponen con la vasculatura en la imagen de abajo (se centran en los vasos más alejado del disco óptico). Registre el ángulo de rotación para cada imagen y guardar esta serie de tiempo para futuras referencias, hacer el seguimiento de la identidad del ratón y de los ojos.
    2. Alinear la serie correspondiente de imágenes de fluorescencia individuales xy de punto mediante la aplicación del ángulo de grabado para corregir la rotación xy en cada punto de tiempo, usando un programa editor gráfico de trama. Además, ajustar la resolución de 300 dpi (sin cambio de escala) y el fondo (en el modo RGB, seleccione Niveles y muestra la luz de un vaso sanguíneo como negro). Guarde estas imágenescomo archivos TIF, añadiendo "alineado" a sus nombres.
  2. Segmentación celular microglial:
    1. Para identificar las células GFP + en la retina central, abierta en FluoRender el archivo TIF "alineado" correspondiente al primer punto de tiempo / edad. Ampliar la imagen para ajustarse a la pantalla, a continuación, definir la vista Render (compuesto, ortogonal, interpolado) y sus propiedades (0,58 gamma, 255 punto de saturación, luminancia 255, 195 alfa y 1,00 sombreado), la selección tanto de los canales RG como visible (ocultar canal B haciendo doble clic en él en el marco de área de trabajo; Figura 4A).
    2. Para seleccionar celdas individuales, umbral del canal rojo (debe ser destacado en el marco de área de trabajo), al aumentar el umbral bajo hasta que la mayoría de las células se enmascaran (blanco) con superposición de células y procesos mínimos (cian), manteniendo constante el umbral alto (255). El bajo valor umbral varía entre 100 y 170, dependiendo de la intensidad de fluorescencia (Figura 4B </ Strong>).
    3. Guardar este punto de vista con el canal rojo visible sólo (comando de captura) como un nuevo archivo TIF, y agregó que "cellsegm" a su nombre original (Figura 4C). Usando una trama genérica software de edición gráfica, invierta su escala de grises y ajustar la resolución de 300 dpi que el anterior, y guardar de nuevo como RGB (Figura 4D).
      NOTA: Elimine las carpetas (proyectos) creados automáticamente por FluoRender, y guardar el umbral aplicado para referencia futura.
  3. Segmentación soma microglial y morfometría:
    1. Para identificar GFP + somas de células para el área de la cuantificación, utilizar software de análisis de imagen con las mediciones automatizadas de intensidad y capacidades de umbral, así como a base de umbral objeto de conteo y medición. Abra el archivo TIF "cellsegm" y seleccionar el método de cambio de escala (spline) y el canal rojo (haga clic en la ficha roja en RGB). Mejorar la visualización desmarcando "canal de vista de color" (clic derecho en el RG rojoPestaña B), y seleccionando "complementar los colores" (Imagen / Ajustar imagen) para invertir la escala de grises y ver las celdas en color gris / negro sobre fondo blanco (Figura 4E).
    2. Calibre la imagen para 1.4 a 1.7 mm dependiendo de la edad, dibujando una línea horizontal a través de toda la imagen (calibración, calibración rápida).
    3. Segmento somata célula individual mediante la aplicación de umbrales de intensidad (Figura 4B). Para ello, el trabajo en el canal RGB rojo y abrir la función de Intensidad Umbral (Object Count; la selección de comandos "update count") con el fin de realizar un seguimiento de los parámetros bidimensionales para cada región umbrales concretos de interés (ROI) que representa somata individual.
    4. Definir el umbral de intensidad en el histograma de intensidad, mediante la selección de la más baja de 50-60% de los niveles 255, y refinando el valor umbral definitiva mediante la evaluación visualmente la superposición entre la máscara de color umbral (azul) y el perímetro soma celular (gris) en células individuales (Figura 4E).
    5. Estimar la exactitud de las máscaras soma celular para representar las dimensiones Somal midiendo el área antes y después de la segmentación en 10 células y aceptar el rango de umbral seleccionado si las mediciones difieren menos del 10% (use la barra de herramientas binario y Medidas anotados).
    6. Identificar manualmente ROI Somal que incluyen varias celdas y separan estos elementos (eliminar o ROI separadas utilizando los controles de la barra de herramientas binario, o el catálogo de objetos), mientras que alternar / desactivar el binario para visualizar directamente las células (Figura 4F).
    7. Clasifique las células microgliales como ROI con áreas Somal más grande y más pequeño que el 50-60 micras 2 discriminar somata celda correspondiente a microglia activada y desactivada microglia, respectivamente, mediante el uso de la zona de restricción.
      NOTA: Cada subconjunto Somal celda se identifica con una capa binario pseudocoloreada diferente, y puede caracterizarse adicionalmente para otros parámetros morfológicos (périméter, la circularidad, etc.), así como cuantificar dentro de los sectores de la retina discretas (Figura 4G). Guarda la imagen analizada como un archivo ND2.
    8. Verifique el proceso y la complejidad de ramificación en las células microgliales activadas individuales, mediante la superposición de la máscara Somal y la imagen -point sola xy (contraste aumentó 50%; Figura 4H). Manualmente contar los procesos que se extienden directamente desde el soma celular o medir el diámetro del polígono que abarca el eje (utilizar la barra de herramientas binario y Medidas anotados).
      NOTA: Activado células carecen de procesos o tienen pocos (<4) y corto (<2x diámetro Somal) queridos, en contraste con los procesos no activadas de células, que comprenden un cenador ramificada y extensa (> 3-10x diámetro Somal) que rodea su relativamente pequeña soma.
    9. Identificar manualmente células con expresión somata menor que <20 micras 2 y / o GFP por debajo del límite de detección, por lo tanto, que no son detectados por enumbralización intensidad. Utilice el comando Taxonomía en Anotaciones a contar elementos identificados manualmente.

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Representative Results

Nuestros reciente in vivo estudios utilizaron estos métodos de adquisición y análisis de imágenes en vivo de visualizar y realizar un seguimiento de la cinética y los patrones de la CNO y cambios microgliales retina durante las primeras etapas del glaucoma crónico y su relación con finales de neurodegeneración 59. Aquí ilustramos un protocolo de adquisición de imágenes cSLO de visualizar las células microgliales en una gran área de la retina central en individuales jóvenes heterocigotos CX3CR1-GFP DBA / 2J retinas (Figura 5). Sobre la base de la resolución de la celda de alta, aplicamos imagen en vivo de umbral y morfométricos análisis que permite la segmentación automática de GFP células individuales + y somata (Figura 6).

Para supervisar el desarrollo de microgliosis local y / o activación de la microglía en edades anteriores neurodegeneración detectable en este modelo de glaucoma crónico, que mide las variaciones mensuales de densidad total de células microglia en persona joven heterocigóticos Cx3CR1-GFP DBA / 2J retinas (n = 10) entre 3-5 meses de edad (Figura 7A). En consonancia con la progresión variables de la neurodegeneración en los ojos cada 41-44, nuestro análisis revela niveles variables de activación de la microglía de la retina y microgliosis través de los ojos de cada edad (Figura 7B), y detecta los cambios dinámicos en la densidad del total y microglia activada dentro retinas individuales (Figura 7C). Notablemente, el número de microglia activada se desacopla de cambios concurrentes en GFP total de + densidad celular. Estos resultados in vivo confirman anterior análisis ex vivo de cambios microgliales en DBA / 2J ratones 45. Así cSLO detección en vivo y la medición de la activación microglial retina pueden servir como indicadores de la progresión de la enfermedad dentro de principios de ojos individuales, y pueden potencialmente ser ligado a sucesos iniciadores de la patogénesis del glaucoma.

"Figura Figura 1:. La adquisición de imágenes en vivo, procesamiento y análisis de flujo de trabajo se utilizó para cSLO imagen cientos de células de monocitos periféricos microgliales / GFP + localizados en el centro de ~ 1.7 mm 2 de la retina interna ratón. Imágenes de fluorescencia (FA) se adquirieron mensual para los mismos ratones, y alineados utilizando infrarrojos imágenes (IR) del fondo de ojo de la vasculatura de la retina y vítreo superficie como referencia. La segmentación de las células GFP + y somata el resultado de la aplicación de dos etapas separadas de intensidad umbral de FA imágenes retinianas. Análisis morfométrico del binario que representa somata celular permite la medición de áreas Somal individuales. Células GFP + con área Somal por encima de 50 m 2 fueron clasificados como activado. La densidad de células totales y activos GFP + se midió para las imágenes de la retina individuales FA, y el examen de extensión Arbor y la complejidad de ramificación se realizó por observación directa de imágenes FA. Figura 2
Figura 2: Controles de adquisición de imágenes en directo en cSLO Spectralis (A) pantalla del panel de pantalla táctil Manual de iniciación.. (B) la ventana de imágenes de software cSLO, que muestra la cabeza de un ratón vivo. (C) Ajustes seleccionados para la imagen de infrarrojos (iluminados en azul). (D) Imagen del fondo de ojo de la retina durante la adquisición en tiempo real (panel izquierdo) y (derecha) de la media. Comando Normalización indicado con el círculo negro. Arterias y venas que irradian de la cabeza del nervio óptico son visible (entre paréntesis), como son los haces de axonales óptica (flechas) en entre los vasos sanguíneos. (E) Ajustes seleccionados para imágenes de fluorescencia en un solo punto xy. (F) de un punto de fluorescencia (FA, 488 nm) durante la adquisición de imágenes (de promedio). Tque imagen más pequeña (izquierda) muestra una exploración individual, la imagen más grande (a la derecha) muestra el progreso de la intensidad promedio. (G) Ajustes seleccionados para la adquisición de una imagen de fluorescencia multipunto (compuesto),. Adquisición de imágenes de fluorescencia (H) Multipunto, que muestra la exploración en curso, que el software identifica con un círculo verde (o rojo cuando la adquisición no es posible). Las barras de escala representan ~ 5 mm (B) o 250 mm (DH) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. .

Figura 3
Figura 3: defectos oculares clave y los errores de formación de imágenes que pueden prevenir la formación de imágenes cSLO correcta de las células microgliales (A - C) daños o defectos oculares, así como error de adquisición de imágenes.s puede prevenir imagen fiable de las buenas prácticas agrarias + células localizadas a los planos más profundos de la retina. (A) Algunos defectos brutos de los ojos son fácilmente detectables en las imágenes de fondo de ojo, incluyendo la córnea o la opacidad de la lente, o lesiones y profundización de la zona del disco óptico, todo lo cual evitar que la imagen clara de las células GFP +. (B) Centrándose ya sea por encima (las paredes de los vasos se vuelven indistinguibles desde el lumen) o por debajo de la superficie interna de la retina (los vasos son apenas visibles) reduce la detectabilidad de emisión de fluorescencia de GFP a partir de células ubicadas en la célula de fibras nerviosas y el ganglio capas. Niveles (C) Saturación de forma incorrecta o desigualmente establecen puede resultar en imágenes brillantes pero sobresaturados (con células que carecen de resolución) o imágenes con áreas oscurecidas. La barra de escala representa 250 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 4: Binary cuantificación basada en umbrales de recuentos de células microgliales y zona Somal (A - D) Pasos de la segmentación celular en FluoRender (A) La ventana de navegación con vista renderizada de una imagen de fluorescencia de un solo punto representativo de la microglia dentro de la retina central.. (panel superior); correspondientes propiedades de renderizado (panel inferior). (B) La misma imagen durante una rutina de la segmentación celular, visto como RGB, con los correspondientes ajustes de umbral (paneles inferiores). Células de umbral están representados por píxeles blancos y superpuestos a sus procesos en cian. (C) Imagen de máscaras de células obtenidas después de la segmentación celular. (D) máscara anterior con valores de escala de grises invertidos para su posterior procesamiento de imágenes. (E - H) Pasos de umbralización Somal y cuantificación. (E) El uso del umbral de intensidad para somata microglia segmento basado en su segmentación celda anterior. El histograma RGB intensidad (izquierda) permite umbralización por selección directa de la gama más baja del 50-60% de la intensidad (de 0 a 127 a 153). Esta segmentación crea una máscara cuantificable que aísla somata microglial individuo (azul). Las imágenes se reajustarán mediante la función spline (óvalo de la derecha). (F) Medidas automáticas basadas en umbrales de ROI / somata persona (panel superior) y las siluetas de ROI (Catálogo de objetos, panel inferior) que se utilizan para corregir ROI superpuestos utilizando herramientas de binarios (panel derecho) para la separación manual o erosión. (G) Clasificación de las áreas Somal individuales por área de restricción (panel superior izquierdo). Somata segmentada están clasificadas como regiones de interés más pequeña y más grande que 50 a 60 micras 2, y las capas binarias para cada clase de somata se asignan diferentes píxeles de color (verde unnd magenta, respectivamente). (H) Superposición de la somata segmentado (verde) de la imagen original (con un aumento de contraste) que se utiliza para la observación directa de la complejidad del proceso en las células activadas individuales (panel izquierdo). Vista de cenadores celulares ampliada. Las barras de escala representan 250 micras (AH) o 50 m (H, recuadro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: De alta resolución de visualización de CX3CR1- GFP + microglia / monocitos localiza en la retina del ratón interno por confocal en vivo de imágenes de láser de barrido (A) Imagen cSLO punto xy individual que muestra células GFP + dentro de la central. retina en un 2 meses de edad del ratón DBA / 2J (izquierda). Vista ampliada (derecha) que muestra el área ONH (círculo), los vasos sanguíneos (líneas) forrado con microglia perivascular / macrófagos y microglia parénquima embaldosar la retina central. Imagen (B) Multipunto, recogidos inmediatamente después de que el único punto de visualizar microglia través de un área más amplia de la retina (⅓ de la retina). (C, D) imágenes idénticas, que se muestra con la escala de grises invertida para la observación óptima de la morfología celular y la complejidad (mínimamente ajustadas para el contraste y la resolución). Tamaño y forma Somal se pueden resolver en la mayoría de las células (izquierda). Extensión Arbor y ramificación de células se pueden resolver en las células con gran somata (derecha, y 3 celdas individuales). (E) Imagen de fondo de ojo infrarrojo del disco vasculatura y óptica utilizada para xy alineación plano xy de imágenes secuenciales. Las barras de escala representan 250 micras (A, B y E), y 25 micras (C, extremo derecho).en / ftp_upload / 52731 / 52731fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6:. La segmentación de las células de la microglia y somata (A) GFP + células prestados por la segmentación en 2D usando FluoRender. (B) somata celda correspondiente, detectado por umbralización utilizando la imagen confocal software de análisis. (C) máscara binaria de somata de células susceptibles de análisis cuantitativo. (D) Clasificación de somata celular segmentada por área de discriminar activa las células microgliales (> 50-60 micras 2, magenta), y células no activadas (<50 m 2, verde). Células Dim y pequeñas (<10 a 20 micras 2, asterisco amarillo) se identifican de forma manual en la imagen original con la escala de grises invertida ( Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7:. Seguimiento longitudinal de la densidad celular y la activación microglial en jóvenes DBA / 2J retinas (A) Live cSLO fondo de ojo y las imágenes FA del mismo ojo, adquirido de 3-5 meses de edad. Imágenes secuenciales FA fueron utilizados para cuantificar los cambios en el tiempo en el número total de CX3CR1-GFP + células localizadas en el centro de ~ 1.7 mm 2 de retina. Condes incluidos parénquima microglia y perivascular, pero las células excluidos agrupados en la CNO (posición indicada con el círculo blanco). (B) Análisis timecourse de retina densidad celular y la activación de la microglia en edades anterioresneurodegeneración en ratones DBA / 2J glaucoma crónico (n = 10 retinas por edad). El número de células totales GFP + y de las células microgliales activadas (área Somal> 50 m 2) por mm 2 de la retina central. Cada punto de datos representa una sola retina, y medios para cada edad se representan con una línea horizontal. (C) el seguimiento mensual del número de células totales GFP + y de las células microgliales activadas en una sola retina. Hay cambios paralelos pero cuantitativamente diferentes en densidad total y de células activadas, con variación más dinámico en la densidad de células morfológicamente activados. La barra de escala representa 250 micras (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Monitoreo en vivo del número de células y la activación microglial morfológica durante una enfermedad neurodegenerativa requiere el uso de métodos de imagen no invasivas que permiten la visualización detallada de las características celulares. Después de las imágenes, las células microgliales deben ser aislados (segmentado) para el análisis morfométrico mediante el uso de múltiples pasos de umbral para evaluar el tamaño Somal y / o complejidad del proceso como lecturas para la activación microglia. En este protocolo, se describen métodos para la adquisición de imágenes en vivo usando cSLO y análisis cuantitativo de la activación microglial basado en células secuencial y la segmentación del soma. Aplicamos estas estrategias para evaluar la cinética de la activación de la microglía de la retina y microgliosis más de 2 meses en el contexto de una enfermedad neurodegenerativa crónica de la retina.

Ratones reportero y microglia / monocitos periféricos tipos de células

El uso de ratones que expresan GFP bajo el control del receptor de fractalquina (CX3CR1)locus 46 permite la identificación fiable de la microglía residente y robusta expresión de GFP permite notable en la visualización vivo 30-32,34,36. Aquí, utilizamos una subcepa de ratones DBA / 2J, derivado por retrocruzamiento C57BL / 6.129P- CX3CR1 tm1Litt / J ratones 46 en el DBA / 2J antecedentes genéticos 59. Monocitos y macrófagos periféricos, que pueden invadir el SNC durante la enfermedad o lesión, también expresan el 15,46,47 etiqueta GFP.

Estudios de imagen en directo de la microglía de la retina neurodegenerativa

Nuestro seguimiento in vivo de células de la retina / + CX3CR1-GFP utilizando cSLO se basa en estudios previos que monitorean los cambios en las buenas prácticas agrarias + el número de células de la retina después de una lesión aguda de hasta 10 semanas 30-32,34,48. Aquí, visualizamos CX3CR1-GFP / + microglia / monocitos periféricos con resolución celular, mediante imágenes cSLO mensual de la retina durante la primera progresión del glaucoma crónico. LAdicionalmente, utilizamos análisis basado umbral automatizado imagen en vivo para detectar y cuantificar el cambio de tamaño celular y la remodelación de suficiente resolución espacial y temporal para monitorear los cambios en el recuento de microglia activadas y totales dentro de los ojos las personas y entre los individuos.

Las limitaciones técnicas de cSLO imágenes de GFP + microglia en la retina

Encontramos la calidad de imagen para ser consistente y reproducible, como lo demuestra una comparación de imágenes única versus punto xy múltiples obtenidos en una sola sesión (Figura 5). Sin embargo, la adquisición de imágenes de células GFP + consistente y reproducible, en una sola sesión y con el tiempo, es depende críticamente de la selección de parámetros estables para formación de imágenes de fondo de ojo y la fluorescencia cSLO. La alineación del disco óptico del ojo y al objetivo cSLO determina la uniformidad de los niveles de saturación y el enfoque en el plano confocal de interés 49. Y / o especific no uniforme inexactaen los niveles de saturación puede generar variaciones de artefactos en la detección de buenas prácticas agrarias, fondo autofluorescencia y celular y resolución cenador. Para enfocar correctamente en microglia localizadas a la fibra nerviosa y capas de células ganglionares, es fundamental para alinear y se centran en los vasos sanguíneos de la retina y en paquetes axonal en la superficie vítrea por imágenes de fondo de ojo IR. Esto proporciona un plano de referencia para localizar la GFP + células por FA. La reorientación requerida necesaria para cambiar de IR a la FA puede ser guiado por la adquisición de múltiples imágenes FA ligeramente diferentes profundidades (55-60 D) en cada sesión experimental. Esto también puede ayudar a compensar las diferencias anatómicas debido a la edad, dilatación de la pupila y la patología (excavación del disco óptico). Desde resolución de la imagen y el detalle celular depende de la especificación óptima de los niveles de saturación en todo el fondo de ojo, y cuidadosa alineación del ojo con relación a la cámara 49, las secuencias de imagen adquirida con el tiempo para el mismo ojo debe mostrar imágenes IR de fondo de ojo con cenfoque onsistent y comparable, la iluminación, la resolución y la duración de campo de la retina. Conteos manuales de GFP + el número de células totales en imágenes adquiridas en una sola sesión (1.5 a 1.7 mm 2 de retina, n = 13 retinas, edad 3-5 meses) confirmaron cuantificación consistente y reproducible de celularidad (variación de 3-4%; datos no se muestra). Esto es necesario para que las imágenes sean susceptibles de GFP + segmentación celular a través de análisis de umbral basado en un rango similar intensidad, y la comparación de los cambios en el tiempo.

Umbral y morfométricos análisis de la microglía de la retina en imágenes en directo cSLO

Sólo recientemente, la visualización in vivo de la microglía del cerebro con alta resolución celular por dos fotones de microscopía confocal ha permitido el análisis cuantitativo de parámetros soma y de procesos microgliales, y la discriminación de la microglia activada morfológicamente 9,50. Como se muestra por estos autores, el tamaño Somal es el morfológico más conspicuoparámetro detectable en el tiempo mediante vivo de dos fotones de formación de imágenes confocal de la microglía del cerebro, usando umbralización basado en intensidad iterativo para reducir las variaciones de señal a ruido 9. Por otra parte, los cambios de tamaño Somal correlacionan con la regulación positiva de la expresión Iba1 en células activadas 9. Aquí, utilizamos cSLO imágenes en directo y aplicamos la segmentación secuencial comparable de células y somata microgliales, seguido por análisis morfométrico de cuantificar el número de células totales y activamos CX3CR1-GFP + localizadas en la retina.

Utilizamos software de renderizado confocal especializada (FluoRender) para GFP células segmento + en la retina central. Estas imágenes, se thresholded aún más el uso de un paquete de análisis de imagen confocal disponible en el mercado, para que en última instancia, la segmentación automática y cuantificación basada límite de superficie Somal. Nuestro análisis de imagen en vivo confirmó el uso de tamaño soma como métrica morfológica de la activación microglial en el análisis de imágenes en vivo 9. Somalrecuentos basados ​​en umbrales permitidos la caracterización de los patrones y los aumentos en microgliosis retina, como se ha demostrado previamente por ex vivo de análisis de imagen 50. Encontramos que cSLO detecta GFP + microglia con mejor resolución y detalle dentro de la retina central del ratón (<2 mm 2), donde las células se pueden obtener imágenes en el mismo plano confocal. Hacia la periferia retina, la señal de fluorescencia muestra la variabilidad y distorsiones que impiden idénticos procesamiento de imágenes y análisis de umbral como para células GFP + detectados en la retina central más plana. Por último, el protocolo indica que cSLO in vivo de análisis de imágenes de la microglía de la retina ofrece un relativamente alto rendimiento. El número de microglial del parénquima que podría ser visualmente aislado y cuantificado dentro de la retina central varió entre ~ 200-300 células totales, y ~ 10-180 células activadas. Así, la microglía de la retina del ratón ofrece una población óptima para estudiar in vivo su transformación y papeles durante la patogénesis de la neurodegeneración.

Aplicación a otras enfermedades crónicas del SNC

Los métodos in vivo de análisis de imágenes que aquí se describen deben ser aplicables para evaluar los cambios microgliales agudas o crónicas en otras enfermedades de la retina de ratón y modelos de lesión. Además, este protocolo puede servir para evaluar los cambios microglia / monocitos periférica de la retina que resultan de patologías crónicas del sistema nervioso central, como el Alzheimer, el Parkinson y la esclerosis múltiple, dado que la retina y el nervio óptico son objeto de la neurodegeneración en estas enfermedades 51-56. En línea con esto, el uso de la detección en vivo de retina y HNO patología para la gestión de la enfermedad de Alzheimer temprana está bajo intensa 54,57,58 estudio.

En conclusión, nuestros hallazgos sugieren que, el seguimiento longitudinal en vivo y cuantificación de los cambios en los números de microglía de la retina y la activación morfológica, pueden servir como ne fiableuroimaging biomarcadores para detectar aparición de la enfermedad y la progresión temprana. Estos metodología de formación de imágenes in vivo y análisis se aplica a glaucoma relacionada con la edad, y potencialmente para otras enfermedades neurodegenerativas que afectan a la retina y el nervio óptico.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME 000671 and 00582 Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift.
30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe BD, East Rutherford, NJ 305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T48402, 152463 and P4417 Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week.
Heat therapy T/Pump Gaymar Industries, Orchard Park, NY TP-650
Cotton-tipped applicators Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 23-400-100
Tropicamide 1% Bausch & Lomb, Rochester, NY NDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick center Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK G003709 Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA Version 1.7.1.0
PowerPoint Microsoft, Redmond, WA Version 14.4.3
Adobe Photoshop Adobe, San Jose, CA Version CS3
FluoRender Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah Version 2.13 Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements C Nikon, Melville, NY Version 4.30.01

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