בVivo הדינמיקה של רשתית microglial הפעלה במהלך מוחיה: Confocal Ophthalmoscopic הדמיה וMorphometry הסלולרי בעכבר גלאוקומה

1Department of Neurobiology & Anatomy, University of Utah, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah
Published 5/11/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

הפעלת המיקרוגלים וmicrogliosis הן תגובות מפתח לניוון של מערכת עצבים כרוניות. כאן, אנו מציגים שיטות לin vivo, הדמיה לטווח הארוך של תאים ברשתית microglial CX3CR1-GFP + על ידי ophthalmoscopy confocal, ולסף וmorphometric מנתח לזהות ולכמת ההפעלה שלהם. אנו עוקבים אחר שינויי microglial בגלאוקומה הקשורות לגיל שלבים מוקדמים.

Cite this Article

Copy Citation

Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (99), e52731, doi:10.3791/52731 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מיקרוגלים, שהם תאים במערכת העצבים המרכזית neuroimmune-תושב, להפוך המורפולוגיה והגודל שלהם בתגובה לנזק במערכת העצבים המרכזית, מעבר למצב מופעל עם פונקציות שונות ופרופילי ביטוי גנים. התפקידים של הפעלת microglial בבריאות, פציעה ומחלה נשארים הבינו באופן חלקי בשל הרגולציה הדינמית והמורכבת שלהם בתגובה לשינויים במייקרו-הסביבה שלהם. לכן, זה הוא קריטי לצג הלא פולשני ולנתח שינויים בהפעלת microglial לאורך זמן באורגניזם שלם. במחקרי vivo של הפעלת microglial עוכבו על ידי מגבלות טכניות להתנהגות microglial מעקב מבלי לשנות את הסביבה במערכת העצבים המרכזית. זה היה מאתגר במיוחד בניוון מוחיה כרוני, שבו שינויים לטווח ארוך חייבים להיות במעקב. הרשתית, איבר של מערכת העצבים המרכזית ניתנים להדמית חיה לא פולשנית, מציעה מערכת חזקה לדמיין ולאפיין את הדינמיקה של הפעלת מיקרוגליה בהפרעות כרוניות.

התחת = "jove_content"> פרוטוקול זה מתאר שיטות לטווח ארוך הדמיה, in vivo של מיקרוגליה רשתית, באמצעות ophthalmoscopy confocal (cSLO) ועכברים / + כתב CX3CR1 GFP, לדמיין microglia עם רזולוציה סלולרית. כמו כן, אנו מתארים שיטות לכמת את השינויים חודשיים בהפעלת תא וצפיפות בתת תא גדול (200-300 תאים לכל רשתית). אנו מאשרים את השימוש בשטח somal כמדד שימושי למעקב חי של הפעלת microglial ברשתית על ידי יישום ניתוח morphometric מבוסס סף אוטומטי של תמונות בvivo. אנו משתמשים ברכישת תמונה בשידור חי אלה ומנתח את אסטרטגיות לעקוב אחר השינויים הדינמיים בהפעלה וmicrogliosis microglial במהלך שלבים המוקדמים של ניוון של מערכת עצבי רשתית במודל עכבר של גלאוקומה כרונית. גישה זו צריכה להיות שימושית כדי לחקור את תרומתם של מיקרוגליה לירידה עצבית והפרעות במערכת העצבים המרכזית בaxonal כרוניות המשפיעות על הרשתית ועצב ראייה.

Introduction

Microglia הם תאי neuroimmune שבאופן בלעדי מתגוררים במערכת העצבים המרכזית (CNS) מאז התפתחות עוברית המוקדמת וברחבי בגרות. מצויד ברפרטואר מורכב של קולטנים, פעילות microglial וההטרוגניות אזורית מוסדרות על ידי יחסי הגומלין שלהם עם תאי עצב דו-כיווניים שכנים, גליה, מחסום דם-מוח וחדירת תאי neuroinflammatory 1,2. פונקציות microglial בסיסיות תורמות לתחזוקה ותיקון פיסיולוגיים, כפי שהם לטעום את הטריטוריה שלהם להפרעות ב3,4 הומאוסטזיס. במהלך פציעה במערכת העצבים המרכזית או מחלה, מיקרוגלים הם המגיבים הראשונים לאותות עצביים שלאחר מכן יפעילו את המעבר שלהם לפנוטיפ תגובה, המכונה "מופעל מיקרוגלים 2,5-7. הפעלת Microglia כרוכה מחזור מורכב של גנים והחלבונים ביטוי, שהם מצמידים לסומה תא ושינוי גודל תהליך שיפוץ 6-9. הפעלת מיקרוגלים, כמו גם חלוקה מחדש תא ואשכולות, יכולים להיות מלווה העלייה הכוללת המקומית במספר התאים (microgliosis מכונה). זה יכול להיגרם כתוצאה מהתפשטות תאים והתחדשות עצמית, עם או בלי גיוס של מונוציטים דם נגזרות 3,4,7,10-14. במגוון רחב של מחלות של מערכת העצבים המרכזית כרוניות תלוי גיל, ספג microgliosis ומחלה מקבילה הפעלת מיקרוגלי התקדמות 15-19. איך מיקרוגלי ניוון מוחיים השפעה עדיין לא ברור, בעיקר בגלל שהם משחקים שני תפקידי neuroprotective ומזיקים שעשויות להיות תרומה מגוונת להופעת מחלה והתקדמות. מחקרי הדמיה חיה להבנת מחלה של מערכת העצבים המרכזית כרונית במעקב התנהגות microglial במערכת העצבים המרכזית הפגומה של מודלים של בעלי חיים ובני אדם, והראו כי שינויי microglial מתחילים להבחין בשלבים המוקדמים של מחלה 15-17,19,20. לפיכך, חשוב לפתח גישות כדי לזהות ולעקוב אחר הפעלת microglial in vivo.

Dete לא פולשניסיפורת של שינויים אזוריים בהפעלת מיקרוגלי המוח הוקמה כחשוב במחוון vivo של התקדמות מחלה ניוונית של מערכת עצבים, באמצעות הדמיה מולקולרית או טומוגרפיה פליטת אור ופליטת פוזיטרונים או הדמיה בתהודה מגנטית 18,21,22. שיטות הדמיה מולקולרית וגרעינית כמותי מאוד ולא פולשני אלה לזהות דבקים עם רזולוציה אזורית. לחלופין, ההדמיה confocal שני פוטונים בCX3CR1 GFP / + עכברים אפשרה התצפית של מיקרוגליה מוח עם רזולוציה סלולרית 3,4,9,20,23-28. עם זאת, גישה זו מגבילה לטווח ארוך ותצפית חוזרת ונשנית של שינויי microglial כרוניים, בהתחשב בסיכון הפוטנציאלי של הפרעת ההתנהגות שלהם על ידי נהלי הדמיה מוחית אפילו פולשנית 29. לחלופין, הרשתית מציעה תנאים אופטימליים לישירים, בהדמית vivo וניטור חוזר ונשנה של מיקרוגליה בנישה של מערכת העצבים המרכזית בשלמותם לאורך הזדקנות, בעקבות פציעה אקוטית, ופוטנציאל במחלות ניווניות כרוניות. כך, מחקרים שנעשו לאחרונה הוכיחו את הכדאיות של הדמיה ברזולוציה הגבוהה של מיקרוגליה רשתית להביע GFP ידי התאמת ophthalmoscopy סריקת confocal הלייזר (cSLO) לתמונה החי CX3CR1 GFP / + עכברים. זה נעשה שימוש כדי לעקוב אחר שינויים שבועיים במספרי GFP + תא בעכברים בודדים לתקופה של עד 10 שבועות בעקבות פציעה נגרמה בחריפות או לחץ תוך עיני מוגבר 30-36.

הרחבנו גישה זו כדי לבצע הדמיה לטווח ארוך על פני כמה חודשים, וכמותית לעקוב אחר שינויים בהפעלת מיקרוגליה מבוססים על גודל סומה באמצעות ניתוח morphometric. גודל Somal הוגדר כמדד שימושי של הפעלת מיקרוגליה במחקרי הדמיה חיים באמצעות מיקרוסקופ confocal שני פוטונים בפרוסות בקליפת המוח לבצע בהדמיה vivo של CX3CR1-GFP + מיקרוגלים 9. מחקרים אלה ואחרים הפגינו גם המתאם בין גודל somal והרמות של ביטוי חלבון Iba1, ש"שich גם עולה עם הפעלה 9,37. לפיכך, מיקרוגלים מופעלים יכולים להיות מזוהים בעכברים חיים, והמספרים והפצתם במעקב לאורך זמן בבריאות מערכת העצבים המרכזית ומחלות.

פרוטוקול זה מתאר שיטות לרכישת cSLO חי תמונה וניתוח לעקוב אחר מספרים סלולריים microglial, הפצה והפעלה מורפולוגיים בניוון רשתית תא גנגליון (RGC) (איור 1). כך, מחקר זה משתמש ב: 1) מודל עכבר של גלאוקומה בירושה (DBA / י 2) שעוברת עצב ראייה תלוי גיל וניוון של מערכת עצבים ורשתית תערוכות שונות מדהים בהתקדמות מחלה בין 5 ל 10 חודשים של גיל 38,39, 2) חודשי cSLO in vivo הדמיה להדמיה לטווח ארוך של ה- GFP + תאים ברשתית ועצב הראייה unmyelinated של ה- GFP / + DBA / י 2 עכברים הטרוזיגוטיים Cx3cr1 בגילי 3-5 חודשים, 3) ניתוח הדמיה לחיות בפילוח וthresholding לבודד תאי סומא ומידהאזור IR. אסטרטגיות אלו מיושמות על מנת להעריך את קינטיקה של מדינות הפעלת microglial רשתית בגלאוקומה כרונית בשלבים מוקדמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

In vivo הדמיה מתבצעת במתקני הפתוגן ללא שימוש בפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטת יוטה.
הערה: פרוטוקול הדמיה זו משמש לעכברי כתב בי מיקרוגלי רשתית ומונוציטים / מקרופאגים שחדר לבטא חלבון ירוק-ניאון (GFP) תחת שליטתו של מוקד קולט fractalkine (CX3CR1).

1. in vivo ההדמיה של רשתית GFP + Microglia ידי Confocal סריקת הלייזר Ophthalmoscopy (cSLO)

  1. הפעל את מערכת החימום מבוקר מים, שנקבעה לייצוב טמפרטורת עכבר בין 35-37 המעלות צלזיוס במהלך הליך, ולחבר את שתי כריות חימום.
    1. להפעיל את מערכת האופתלמוסקופ לייזר סריקת confocal (cSLO) (איור 2 א). פתח את תכנית cSLO, הזן את המידע שיזהה את העכבר הבודד ולהגדיר עקמומיות קרנית של 2 מ"מ (תפריט נתונים מטופל).
  2. היכונו להר"יגינג. מאובטח להתאים עדשה נקייה 55º רחב בתחום מטרה בשקעה. הכן את פלטפורמת ההדמיה האופתלמוסקופ ידי הבטחת כרית חימום מכוסה בנייר נקי. השתמש קליפים לשטח הכרית ונייר ולשמור אותם מחסימת התנועה של העדשה האובייקטיבית.
  3. להרדים את העכבר על ידי הזרקת intraperitoneal של 1.3% 2,2,2-tribromoethanol ושל 0.8% אלכוהול טרט-אמיל (250 מ"ג / קילוגרם משקל גוף; 0.5 מיליליטר / 25 גרם משקל גוף) באמצעות מצויד 1 מיליליטר חד פעמי מחט 30½ G מזרק. חזור עכבר לכלוב שלה, שמרה על כרית חימום.
    הערה: המשלוח של חומר ההרדמה בזריקה לעומת שאיפה מאפשרת מיקום קל של העכבר להדמיה וגישה בלא הפרעה לעיניים, ללא קונוסים האף וצינורות.
  4. ברגע שהחיה מפסיקה לנוע ואינה מגיב לקמצוץ זנב, לגרום להרחבת אישון עם Tropicamide וphenylephrine (0.5% כל אחד), על ידי הצבת בעלי החיים נוטה ומכסים את שני העיניים עם הטיפות ל7 דקות.
  5. לאחר 5 דקות, עמ 'התחרה העכבר נוטה במרכז פלטפורמת האופתלמוסקופ, ועדשות מגע בכושר על שני העיניים, הפעלת לחץ מינימאלי.
    הערה: עדשות מגע הם קטנות ושברירית אבל יכולות להיות מטופל בזהירות עם אצבעות, אם כי ניתן להשתמש במלקחיים במקום 40. השימוש בעדשות מגע הוא אופציונלית, אך מומלץ כפי שממזער יובש בעיניים ושומר שקיפות קרנית במהלך הדמיה.
  6. לאחר 7 דקות, כוון את העכבר עם עין ימין מול העדשה האובייקטיבית ומקביל למסלול לעדשה האובייקטיבית, שמירה על בעלי החיים נטולי רסן ליד קצה הרציף (איור 2). לאסוף תמונות של הרוויה וכיוון דומים, לשמור כל הזמן את המרחק מהעין לעדשה אובייקטיבית, כמו גם היישור של העין לנתיב האור בכל מפגשי הדמיה. קליפ שפם ארוך מפריע להתבוננות בעין.
    הערה: לדקות 8-10 הבאות, העכבר לא יזוז או מצמוץ, ויהיה נשימה עם מהלך עדיןמפעלים, אשר מתעד את cSLO עין מעקב ART המצב (בזמן אמת אוטומטי), שמתאים את עמדת ראש הסריקה מבוססת על ציוני דרך קרקעית עם ניגודיות גבוהה. האחרון שזמן, עכברים מתחילים מתנשפים ומהבהבים, מה שהופך את ההדמיה מעשית.
  7. אם ההדמיה מתבצעת ללא שימוש בעדשות מגע, להחיל PBS הטיפות לשתי העיניים כל דקות 2-3 כדי למנוע מהם הייבוש.
  8. אסוף תמונת קרקעית של כלי הדם ברשתית ודיסק אופטי, המתמקד ברשתית הפנימית.
    1. בחר את מצב אינפרא אדום (IR) ולהתאים את הגדרות לעירור 820 ננומטר, 100% כוח לייזר, רגישות 40-60% (איור 2 ג).
    2. עובד במצב במהירות גבוהה (12.6 מסגרת / sec), לאתר את העין באמצעות ג'ויסטיק לנהוג האופתלמוסקופ. בהגדלה נמוכה, לבדוק את הקרנית ועדשה לפציעה או אטימות, ולהוציא מעיני המחקר עם מומים או פגיעה שישפיעו הדמיה הרשתית (איור 3 א).
    3. אתר את אזור הדיסק האופטי (פני השטח שלראש עצב הראייה, ONH) על ידי הבאת המטרה קרובה יותר לעין, אז למרכז את התמונה עליה ולנעול עמדה זו על ידי הברגת ג'ויסטיק. יישור זה של העין להאופתלמוסקופ הוא מפתח להשגה גם להתמקד ופליטה על פני התמונה.
    4. דמיינו את המטוסים הפנימיים של הרשתית, כמו גם ONH, באמצעות כלי דם הגדולים הממוקמים על פני השטח vitreal של הרשתית כמטוס התייחסות מוקדי (59 ו -60 D), או עמוק יותר (55 ד ') בעיניים מראים אופטי נחפר דיסקים. המוקד האופטימלי צריך לפתור תאי דם בתוך כלי דם גדולים, עם לומם וקירות בבירור שונה.
    5. לייעל הרוויה תמונה על ידי התאמת החיוג בלוח הבקרה של מסך מגע, עד הילה לבנה של תאורה אחידה משתרעת ברוב של שדה 55º קרקעית סביב הדיסק האופטי (באמצעות חשיפת יתר קלה). בשלב הבא, להפחית את הרוויה כדי לייעל ניגוד עד תאי דם נעו לאורך כלי הגדולים יכולים להיות ברור נפתר. אם אפל מוקדאזורים להתמיד, לא בשל פגיעה ברשתית, ליישר מחדש את העין למצלמה עד תמונה אחידה בהירה מתקבלת. התאמה זו היא יסוד כדי ללכוד סטים לשחזור של תמונות במצב ואיכות.
    6. אסוף תמונת IR ברזולוציה גבוהה של הרשתית המרכזית (1.4-1.7 מ"מ קוטר, בהתאם לגיל), עם ממוצע של 30 מסגרות בזמן אמת (4.7 מסגרות / שנייה; מנורמל), כדי לשפר את יחס אות לרעש (איור 2 ).
  9. מייד, לרכוש תמונת הקרינה של ה- GFP + מיקרוגלים ו / או מונוציטים חדירה מקומיים למטוסים הפנימיים של הרשתית וONH.
    הערה: אופטימיזציה של תמונת קרקעית IR של הרשתית קובעת את הרזולוציה של תמונת הקרינה של תאי GFP +, כמו גם את היקף הרשתית פנימית הקיף. הכישלון להתמקד המטוסים הפנימיים של הרשתית, אשר יכול להיות מזוהות על ידי רזולוציה נמוכה של כלי הדם, יגרום לנוף המעומעם GFP + תאים (איור 3). כישלון להתאים IR סאטומנה בצורה נכונה ואחיד משפיעה על תמונת הקרינה (FA), מציגה וריאציות artifactual בGFP + עוצמת תא וגודל (איור 3 ג).
    1. Swich לקרינת מצב הדמיה (FA) בפנל מסך המגע, באמצעות עירור כחול, 488 ננומטר לייזר (מערכת סינון מחסום 460-490 ננומטר), והגדרות רכישה (100% רגישות כוח הלייזר ו100-125%), אשר נשמרים קבוע לכל העכברים (איור 2E).
    2. לאסוף XY-נקודה אחת, תמונת הקרינה bidimensional של הרשתית, וללכוד תמונת קרקעית מייד בעמדה זהה (100x ממוצע סריקה; 55º זווית סריקה עבור שני התמונות; איור 2F).
    3. ללכוד תמונה מרובות על ידי הבחירה "מורכב" בלוח הבקרה (איור 2G) ונע ימינה האופתלמוסקופ ועזב, צילום פנורמי הרשתית על פני ציר האף-זמני (איור 2H).
      הערה: לאחר סריקת תמונת XY-נקודה אחת (100x שליכול בממוצע), התוכנה באופן אוטומטי ממוצעי סריקות חדשות מאותו והאזורים החדשים (מוגבלים עם עיגול ירוק במהלך סריקה אופטימלית, או בצבע אדום כאשר הסריקה היא ישימה), ותפרים כל XY-העמדות בזמן אמת. התמונה המורכבת וכתוצאה משתרעת 1.5-1.7 מ"מ על ציר x 3-4 מ"מ האופקי בציר האנכי (55º x 120-124º זווית סריקה).
  10. הדמיה מלאה של כל עכבר תוך 15 דקות לאחר גרימת הרדמה, לפני מהבהב והפעלה מחדש של תנועה.
  11. הסר עדשות מגע, עיני מימה עם PBS ולהחזיר את החיה לכלוב שלה חימם, בדיקת התנהגות עד להחלמה מלאה של תנועתיות.
  12. למחקרים ארוכי טווח באמצעות מפגשי cSLO הדמיה לסירוגין באותו העכבר בודד, לחזור על הדמיה לא פחות מזה מזה 3 ימים, כדי למנוע את הרעילות המצטברת של הרדמה, כמו גם לגירוי של קרנית.

2. עיבוד תמונה חי וניתוח

  1. יישור תמונה רציף:
    1. יישרתמונות הקרקעית לסדרת זמן של אותו עין באמצעות כלי הדם ודיסק אופטי כציוני דרך. פתח את כל התמונות במצגת תכנית מצגת שקופיות מסחריות, על ידי גרירה כל תמונה מעל קודמו עד הדיסקים האופטיים שלהם ליישר על מטוס xy- (התמונה העליונה מופיעה שקופה למחצה בזמן שגרר), ואז לסובב את התמונה העליונה עד כלי דם גדולים חפיפה עם כלי הדם על התמונה למטה (התמקדות בכולים הרחוק ביותר מהדיסק האופטי). רשום את זווית הסיבוב עבור כל תמונה ולשמור את סדרת זמן זה לשימוש עתידי, שמירה על המסלול של זהות עכבר ועין.
    2. יישר את הסדרה המקבילה של תמונות הקרינה XY-נקודה אחת על ידי יישום הזווית נרשמה לתקן את סיבוב XY בכל נקודת זמן, באמצעות תכנית עורך גרפית סריקה. בנוסף, להתאים את הרזולוציה ל -300 dpi (ללא rescaling) ורקע (במצב RGB, רמות בחרו ולטעום לומן של כלי דם שחורים). לשמור תמונות אלהכקבצי TIF, והוסיף "מיושר" לשמות שלהם.
  2. פילוח תא microglial:
    1. לזהות GFP + תאים ברשתית המרכזית, פתוח בFluoRender קובץ TIF "מיושר" המתאים לנקודת זמן / הגיל המוקדם ביותר. זום התמונה כדי להתאים את המסך, ואז להגדיר את התצוגה לדקלם (מרוכבים, מאונך, אינטרפולציה) והמאפיינים שלו (0.58 גמא, 255 לנקודת רוויה, בהירות 255, 195 אלפא ו1.00 הצללה), בחירת שני ערוצי RG כגלויים (להסתיר B ערוץ על-ידי אותו במסגרת סביבת העבודה לחיצה כפולה; איור 4 א).
    2. כדי לבחור תאים בודדים, סף הערוץ האדום (חייב להיות מסומן במסגרת סביבת העבודה), על ידי הגדלת הסף הנמוך עד שרוב התאים הם רעולי פנים (לבן) עם תהליכי מינימום חפיפה ותא (ציאן), תוך שמירה על הסף הגבוה קבוע (255). ערך הסף הנמוך נע בין 100 ו -170, תלוי בעוצמת הקרינה (איור 4 </ Strong>).
    3. להציל את ההשקפה זו עם הערוץ האדום הגלוי בלבד (הפקודה לכידת) כקובץ TIF חדש, והוסיף "cellsegm" לשם המקורי שלה (איור 4C). שימוש בתוכנת עורך גרפי סריקה כללית, להפוך בגווני אפור שלה ולהתאים את הרזולוציה ל -300 dpi כאמור לעיל, ולשמור שוב כמו RGB (איור 4D).
      הערה: מחק את התיקיות (פרויקטים) שנוצרו באופן אוטומטי על ידי FluoRender, ולשמור את סף הבקשה לעיון בעתיד.
  3. פילוח microglial סומה וmorphometry:
    1. לזהות GFP + somata תא לכימות אזור, להשתמש בתוכנת ניתוח תמונה עם מדידות אוטומטיות עוצמה ויכולות סף, כמו גם ספירת אובייקט מבוסס סף ומדידה. פתח את קובץ "cellsegm" TIF, ובחר את שיטת rescaling (שגם) ואת הערוץ האדום (לחץ על לשונית אדומה בRGB). לשפר את ההדמיה על ידי ביטול בחירה "ערוץ נוף בצבע" (לחץ לחיצה ימנית על RG האדוםB כרטיסייה), ובחירה באפשרות "להשלים צבעים" (תמונה / התאם תמונה) כדי להפוך את גווני אפור ולראות את התאים אפורים ב/ שחור על רקע לבן (איור 4E).
    2. לכייל את התמונה ל1.4-1.7 מ"מ בהתאם לגיל, על ידי ציור קו אופקי על פני כל התמונה (הכיול, כיול מהיר).
    3. somata תא בודד מגזר על ידי יישום thresholding עוצמה (איור 4). לשם כך, עבודה בערוץ RGB האדום ולפתוח את פונקצית עצמת סף (אובייקט רוזן; בחירת הפקודה "עדכון ספירה") כדי לעקוב אחר הפרמטרים bidimensional לכל איזור thresholded של העניין (ROI) המייצג somata הבודד.
    4. הגדר את סף העצמה בהיסטוגרמה העצמה, על ידי בחירת 50-60% הנמוכים ביותר של הרמות 255, ושיפור ערך הסף הסופי על ידי חזותי הערכת החפיפה בין מסכת צבע סף (הכחול) ועוטף סומה התא (האפור) ב תאים בודדים (Figure 4E).
    5. להעריך את הדיוק של מסכות סומה התא לייצג את ממדי somal על ידי מדידת השטח לפני ואחרי הפילוח ב 10 תאים וקיבלתי מגוון סף הנבחר, אם המדידות שונות פחות מ -10% (להשתמש בינארי סרגל הכלים ומדידות מבוארים).
    6. ידני לזהות ROIs somal הכוללות מספר תאים ולהפריד רכיבים אלה (לחסל או ROIs הנפרד באמצעות הפקדים בינארי סרגל הכלים, או קטלוגי האובייקט) תוך החלפה / כיבוי בינארי לדמיין ישירות התאים (איור 4F).
    7. לסווג תאי microglial כROIs עם אזורי somal גדולים יותר וקטנים יותר מאשר 50-60 מיקרומטר 2 להפלות somata התא מתאים למיקרוגלים מופעלים ומנוטרל מיקרוגלי בהתאמה, על ידי שימוש בשטח הגבלה.
      הערה: כל תת-קבוצה somal התא מזוהה עם שכבת ינארי pseudocolored שונה, וניתן לאפיין נוסף לפרמטרים מורפולוגיים אחרים (perimeter, מעגלי, וכו '), כמו גם לכמת בתוך מגזרים בדידים רשתית (איור 4G). שמור את התמונה כקובץ ניתחה ND2.
    8. ודא את התהליך ומורכבות הסתעפות בתאי microglial מופעלים בודדים, על ידי שכיסה את מסכת somal ותמונת -point XY הבודד (לעומת עלייה של 50%; איור 4H). באופן ידני לספור את התהליכים ישירות משתרעים סומה התא או למדוד את הקוטר של המצולע המקיף את הסוכה (להשתמש בינארי סרגל הכלים ומדידות מבוארים).
      הערה: תאים הופעל חסרי תהליכים או לשאת כמה (<4) וקצר (<קוטר somal 2x) אלה, בניגוד לתהליכים בתא-מופעל עישון, המהווים סוכה מסועפת ונרחבת (> 3-10x קוטר somal) המקיפים אותם יחסית סומה הקטנה.
    9. ידני לזהות תאים עם somata קטן יותר <20 מיקרומטר 2 ו / או GFP ביטוי מתחת לסף הגילוי, אשר מבלי שיבחינו לכן על ידי בthresholding דריכות. השתמש בפקודת טקסונומיה בהערות לספור אלמנטים מזוהים באופן ידני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

האחרון במחקרי vivo שלנו השתמשו בשיטות רכישת תמונה וניתוח חיות אלה כדי לחזות ולעקוב אחר קינטיקה ודפוסי ONH ושינויי microglial רשתית בגלאוקומה כרונית ומערכת היחסים שלהם בשלבים מוקדמים למאוחר ניוון מוחיים 59. כאן אנו מדגימים פרוטוקול רכישת תמונת cSLO לדמיין תאי microglial על פני שטח גדול של הרשתית המרכזית בDBA / י 2 רשתיות הטרוזיגוטיים צעירות בודדות Cx3CR1-GFP (איור 5). בהתבסס על החלטת תא הגבוהה, אנחנו מיישמים thresholding תמונת החיה וmorphometric ניתוחים המאפשרים פילוח האוטומטי של ה- GFP תאים בודדים + וsomata (איור 6).

כדי לפקח על הפיתוח של microgliosis המקומי ו / או הפעלת מיקרוגלים בגילים שקדמו לגילוי ניוון מוחיים במודל זה של גלאוקומה כרונית, מדדנו וריאציות חודשיות בסך הכל צפיפות תאי מיקרוגליה בCx הטרוזיגוטיים הצעיר הבודדDBA / י 2 רשתיות 3CR1-GFP (n = 10) בין 3-5 חודשים של גיל (איור 7 א). עולה בקנה אחד עם ההתקדמות המשתנה של ניוון של מערכת עצבים בעיני פרט 41-44, הניתוח שלנו מגלה רמות משתנה של הפעלת רשתית מיקרוגלים וmicrogliosis על עיניים בכל גיל (איור 7), ומזהה שינויים דינמיים בצפיפות בסך הכל ומיקרוגלים מופעלים בתוך רשתית בודדת (איור 7 ג). ניכר, מספרים של מיקרוגליה הופעלו אינם מנותקים משינויים בו-זמניים בסך GFP + צפיפות תאים. ממצאים אלה מאשרים in vivo ניתוח לשעבר vivo הקודם של שינויי microglial בDBA / י 2 עכברים 45. כך זיהוי חי cSLO ומדידה של הפעלת microglial רשתית עשוי לשמש כמדדים להתקדמות מחלה המוקדמת בעיני אדם, ועשויים פוטנציאלי להיות קשור לייזום אירועים של הפתוגנזה גלאוקומה.

איור 1:. רכישת תמונה בשידור חי, עיבוד וניתוח זרימת העבודה cSLO שימש למאות תמונה של ה- GFP + תאי מונוציטים היקפיים microglial / מקומיות ל~ 1.7 מ"מ 2 של הרשתית הפנימית העכבר המרכזי. תמונות הקרינה (FA) נרכשו חודשיות עבור אותו עכברים, ומיושרים באמצעות תמונות קרקעית (IR) אינפרא אדום של כלי הדם ברשתית ומשטח vitreal כהתייחסות. פילוח של ה- GFP + תאים וsomata נבע מיישום שני שלבים נפרדים של העצמה-thresholding תמונות רשתית FA. ניתוח morphometric של somata התא מייצג ינארי אפשר מדידה של אזורי somal הבודדים. תאי ה- GFP + עם אזור somal מעל 50 מיקרומטר 2 סווגו כמופעל. צפיפות של ה- GFP כולל והופעלו + תאים נמדדה לתמונות FA רשתית בודדות, ובדיקה של הרחבה סוכה ומורכבות הסתעפות בוצעו על ידי תצפית ישירה של תמונות FA. איור 2
איור 2: בקרות בשידור חי רכישת תמונה בSpectralis cSLO () תצוגת לוח מסך מגע ידני בייזום.. חלון הדמיה תוכנת cSLO (B), המציג את הראש של עכבר חי. הגדרות (C) נבחרו להדמיה אינפרא אדומה (מוארות בכחול). תמונה (ד) הפונדוס של הרשתית במהלך רכישה בזמן אמת (פנל משמאל) ו- (פנל מימין) ממוצע. פקודת הנורמליזציה מצויינים עם העיגול שחור. עורקים וורידים קורנים מהראש עצב הראייה גלויים (בין סוגריים), כמו גם חבילות axonal האופטיים (חיצים) בין כלי הדם. הגדרות (E) שנבחרו להדמיה הקרינה בתוך נקודה אחת XY. (F) הקרינה נקודה האחת (FA, 488 ננומטר) הדמיה במהלך רכישה (מיצוע). Tהוא תמונה קטנה יותר (משמאל) מראה סריקה בודדת, התמונה הגדולה יותר (מימין) מציגה את ההתקדמות של מיצוע עוצמה. הגדרות (G) שנבחרו לרכישת מרובות (מרוכבים), תמונת הקרינה. רכישת ההדמיה הקרינה (H) Multipoint, המראה את הסריקה בהתקדמות, שהתוכנה מזהה עם עיגול ירוק (או אדומה, כאשר הרכישה היא לא אפשרית). ברים סולם מייצגים ~ 5 מ"מ (ב) או 250 מיקרומטר (DH) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו..

איור 3
איור 3: פגמי מפתח עיני ושגיאות הדמיה שיכולה למנוע הדמיה cSLO הנכונה של תאי microglial (- C) שגיאת רכישת תמונת נזק Ocular או פגמים, כמו גם. ים יכול למנוע הדמיה אמינה של ה- GFP + תאים מקומיים למטוסים הפנימיים של הרשתית. () חלק פגמי עין ברוטו הם זיהוי בקלות בתמונות קרקעית, כולל קרנית או אטימות עדשה, או פציעה והעמקה של אזור הדיסק האופטי, אשר כולם למנוע הדמיה ברורה של ה- GFP + תאים. (ב) התמקדות או מעל (קירות של כלי הפכו נבדל לומן) או מתחת למשטח הפנימי של הרשתית (כלי בקושי נראים לעין) מפחית את יכולת הגילוי של פליטת הקרינה GFP מהתאים הממוקמים בתא סיבי עצב וגנגליון שכבות. רמות (C) רווי בצורה לא נכונה או בצורה לא אחידה שנקבעו יכולה לגרום לתמונות בהירות אבל oversaturated (עם תאים חסרי רזולוציה) או תמונות עם אזורים מעורפלים. בר סולם מייצג 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

= "Jove_content" FO: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 4
איור 4: כימות מבוסס thresholding ינארי של ספירת תאי microglial ואזור somal (- D) שלבים של פילוח תא בFluoRender () חלון ניווט עם נוף שניתנו של תמונת הקרינה נקודה אחת נציג של מיקרוגליה בתוך הרשתית המרכזית.. (פנל עליון); מתאים נכסי טיוח (פנל תחתון). (ב) אותה התמונה בשגרת פילוח תא, נתפס כRGB, עם מקביל הגדרות סף (לוחות נמוכים יותר). תאי thresholded מיוצגים על ידי פיקסלים לבנים ומעולפים לתהליכים שלהם בציאן. תמונה (C) של מסכות תא מתקבלות לאחר פילוח תא. מסכה קודמת עם ערכי גווני אפור הפוכים לעיבוד תמונה נוסף (D). (E - H) צעדים של thresholding somal וכימות. (E) שימוש בסף עוצמה לsomata מיקרוגלים מגזריים בהתבסס על פילוח התא הקודם שלהם. היסטוגרמה עוצמת RGB (משמאל) מאפשרת thresholding ידי בחירה ישירה של מגוון נמוך יותר 50-60% של עוצמות (0 עד 127-153). פילוח זה יוצר מסכה לכימות שמבודדת somata פרט microglial (כחולה). תמונות מוגדלת באמצעות הפונקציה שגם (הסגלגלה בצד ימין). (F) מדידות מבוססות סף אוטומטית של החזר על השקעה / somata הבודד (פנל עליון) וצלליות ROI (קטלוג אובייקט, פנל תחתון) משמשות לתיקון ROIs החופף באמצעות כלים בינארי (פנל מימין) להפרדה או שחיקה במדריך. סיווג (G) של אזורי somal הבודדים לפי אזור הגבלה (פנל שמאלי העליון). somata המפולח מסווגים כROIs קטן יותר וגדול יותר מאשר 50-60 מיקרומטר 2, והשכבות בינארי לכל סוג של somata מוקצות פיקסלים בצבע שונים (ירוקמגנט ND, בהתאמה). (H) כיסוי של somata המפולח (הירוקה) בתמונה המקורית (עם ניגודיות מוגברת) המשמש לתצפית ישירה של מורכבות תהליך בתאים מופעלים בודדים (פנל משמאל). מוגדל אור סוכות תא. ברים סולם מייצגים 250 מיקרומטר (AH) או 50 מיקרומטר (H, הבלעה). לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: הדמיה ברזולוציה גבוהה של CX3CR1- GFP + מיקרוגלים / מונוציטים מקומיים לרשתית העכבר הפנימית על ידי ההדמיה לייזר סריקת confocal לחיות (א) תמונת cSLO נקודת xy- יחידה מראה GFP + תאים בתוך המרכז. רשתית בעכבר DBA / י 2 הישנים 2 חודשים (משמאל). תצוגה מוגדלת (מימין) מראה את אזור ONH (המעגל), כלי דם (קווים) מרופד במיקרוגלי perivascular / מקרופאגים, ומיקרוגלי parenchymal ריצוף הרשתית המרכזית. תמונה (B) Multipoint, נאספה מייד לאחר הנקודה אחת כדי להמחיש מיקרוגלים על פני שטח רחב יותר ברשתית (⅓ של הרשתית). (C, D) תמונות זהות, מוצגות בגוונים אפורים הפוכים לתצפית אופטימלית של מורפולוגיה תא ומורכבות (מנוכה מינימאלי לניגוד ורזולוציה). גודל וצורת Somal ניתן לפתור ברוב התאים (משמאל). הארכת ארבור והסתעפות תא יכולים להיפתר בתאים עם somata הגדול (מימין, ו -3 תאים בודדים). תמונת קרקעית אינפרא אדום של דיסק כלי דם ואופטי המשמש ליישור -plane XY של תמונות רציפות (E). ברים סולם מייצגים 250 מיקרומטר (A, B ו- E), ו -25 מיקרומטר (C, ימין קיצוני).es / ftp_upload / 52,731 52731fig5highres.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6:. GFP פילוח התא וsomata microglial () + תאים שניתנו על ידי פילוח ב2D באמצעות FluoRender. somata תא המתאים (ב '), זוהה על ידי thresholding באמצעות תוכנת ניתוח תמונת confocal. מסכת ינארי של תא somata ניתנים לניתוח כמותי (C). סיווג (D) של תאי סומא מפולח לפי התחומים להפלות מופעל תאי microglial (> 50-60 מיקרומטר 2, מג'נטה), ותאים שאינם פעילים (<50 מיקרומטר 2, ירוק). תאים עמומים וקטנים (<10-20 מיקרומטר 2, כוכבית צהובה) מזוהים באופן ידני בתמונה המקורית עם גווני אפור הפוכים ( אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7:. מעקב אורך של צפיפות microglial תא והפעלה בDBA / י 2 רשתיות צעירות () גר קרקעית cSLO ותמונות FA של אותה עין, שנרכשה מ3-5 חודשים של גיל. תמונות FA רציפות שמשו לכמת שינויים לאורך זמן במספרים מוחלט של CX3CR1-GFP + תאים מקומיים ב~ 1.7 מ"מ 2 של רשתית המרכזית. ספירה כלולה parenchymal ומיקרוגלי perivascular, אבל תאים נכללו התקבצו בONH (מיקום מצויינים עם העיגול לבן). ניתוח timecourse של צפיפות תאי מיקרוגליה רשתית והפעלה בגילים שקדמו (ב)ניוון של מערכת עצבים בDBA / י 2 גלאוקומה כרונית (n = 10 רשתיות לגיל). מספרים בסך הכל תאי GFP + ושל תאים מופעלים microglial (somal אזור> 50 מיקרומטר 2) למ"מ 2 של רשתית מרכזית. כל נקודת נתונים מייצגת רשתית בודדת, ואומרת לכל גיל מיוצגים עם קו אופקי. (ג) מעקב חודשי של מספרים בסך הכל תאי GFP + ותאי microglial מופעלים ברשתית אחת. ישנם שינויים מקבילים אך שונים כמותית בסך הכל והופעל צפיפות תאים, עם וריאציה דינמית יותר בצפיפות של תאים מופעלים מורפולוגית. בר סולם מייצג 250 מיקרומטר (). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניטור חי של מספר תא microglial והפעלה מורפולוגיים במחלה ניוונית של מערכת עצבים מחייב השימוש בשיטות הדמיה לא פולשנית המאפשרות הדמיה מפורטת של תכונות תא. לאחר הדמיה, תאי microglial חייבים להיות מבודדים (מפולח) לניתוח morphometric על ידי שימוש בצעדי סף מרובים כדי להעריך גודל somal ו / או מורכבות תהליך כקריאות להפעלת מיקרוגלים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות לרכישת חיה תמונה באמצעות cSLO, וניתוח כמותי של הפעלת microglial מבוססים על תאים רציפים ופילוח סומה. אנו ליישם את האסטרטגיות האלה כדי להעריך את קינטיקה של הפעלת מיקרוגלי רשתית וmicrogliosis מעל 2 חודשים בהקשר של מחלה ניוונית של מערכת עצבים כרונית של הרשתית.

עכברי כתב ומיקרוגליה / סוגי מונוציטים היקפיים תא

השימוש בעכברים המבטאים GFP תחת שליטתו של קולט fractalkine (CX3CR1)מוקד 46 מאפשר זיהוי אמין של מיקרוגלי תושב, והביטוי של GFP חזק מאפשר מדהים בהדמית vivo 30-32,34,36. כאן, אנו משתמשים substrain של DBA / י 2 עכברים, שהופק על ידי backcrossing עכברי C57BL / 6.129P- Cx3cr1 tm1Litt / י 46 לDBA / הרקע הגנטי י 2 59. מונוציטים היקפיים ומקרופאגים, אשר יכולה לפלוש למערכת העצבים המרכזית במחלה או פציעה, גם להביע 15,46,47 תג ה- GFP.

מחקרי הדמיה חיה של מיקרוגליה ברשתית ניווניות

המעקב שלנו in vivo של CX3CR1-GFP תאי רשתית / + באמצעות cSLO בונה על מחקרים קודמים שפיקוח שינויים בGFP הרשתית + מספרים סלולריים בעקבות פציעה אקוטית של עד 10 שבועות 30-32,34,48. כאן, אנו לדמיין CX3CR1-GFP / + מיקרוגלים / מונוציטים היקפיים עם רזולוציה סלולרית, על ידי ההדמיה cSLO החודשית של הרשתית במהלך ההתקדמות המוקדמת של גלאוקומה כרונית.dditionally, אנו משתמשים בניתוח המבוסס על סף אוטומטי תמונת חיה כדי לזהות ולכמת שינוי גודל תא ושיפוץ עם רזולוציה מרחב ובזמן מספיק כדי לעקוב אחר שינויים בסעיפי מיקרוגלים מופעלים וכוללים בתוך עיני פרט ועל פני אנשים.

מגבלות טכניות של ההדמיה cSLO של ה- GFP + מיקרוגלים ברשתית

מצאנו איכות הדמיה להיות עקבית ושחזור, כפי שמודגם על ידי השוואה של אחד מול תמונות רב-XY נקודה שהושגו בפגישה אחת (איור 5). עם זאת, רכישת ההדמיה GFP + תא עקבית ושחזור, בפגישה אחת ובמשך זמן, היא ביקורתי תלויה בבחירה של פרמטרים יציבים להדמיה cSLO קרקעית והקרינה. מערך של העין ואופטית הדיסק למטרת cSLO קובע אחידות של רמות הרוויה וההתמקדות במטוס confocal עניין 49. ו / או specificati לא אחיד לא מדויקיםעל רמות הרוויה יכולה ליצור וריאציות artifactual בגילוי ה- GFP, רקע autofluorescence, ותא ורזולוציה סוכה. להתמקד בצורה נכונה על מיקרוגלים מקומיים לסיבי העצב ושכבות תאי גנגליון, זה קריטי כדי ליישר ולהתמקד בכלי דם ברשתית ועל חבילות axonal על פני השטח vitreal ידי ההדמיה קרקעית IR. זה מספק מטוס התייחסות לאתר את ה- GFP + תאים על ידי FA. המיקוד המחודש נדרש דרוש למעבר מIR לFA יכול להיות מונחה על ידי הרכישה של תמונות FA מרובות בעומקים שונים מעט (55-60 ד ') בכל פגישה ניסיונית. זה גם יכול לעזור לפצות על הבדלים אנטומיים בשל גיל, הרחבת אישון ופתולוגיה (חפירת דיסק אופטית). מאז רזולוציית תמונה ופירוט תא תלויה במפרט האופטימלי של רמות הרוויה לאורך הקרקעית, והיישור זהיר של העין ביחס למצלמה 49, רצפי תמונה שנרכשו לאורך זמן באותה עין חייב להראות תמונות IR קרקעית עם גמוקד onsistent ולהשוות, תאורה, רזולוציה ותוחלת שדה רשתית. ספירה ידנית של כולל מספרי GFP + תא בתמונות שנרכשו בפגישה אחת (1.5-1.7 מ"מ 2 של רשתית, n = 13 רשתית, 3-5 חודשים בגיל) אישרה כימות של cellularity (וריאציה 3-4% עקביות ושחזור; נתונים לא מוצג). זה הכרחי עבור תמונות, כך שתאפשרנה לGFP + פילוח תא באמצעות ניתוח סף המבוסס על מגוון עוצמה דומה, והשוואה של שינויים לאורך זמן.

סף וmorphometric ניתוחים של מיקרוגליה רשתית בתמונות cSLO חיות

רק לאחרונה, ההדמיה vivo של מיקרוגליה מוח עם רזולוציה גבוהה סלולרית על ידי מיקרוסקופ confocal שני פוטונים אפשרה ניתוח כמותי של פרמטרים סומה ותהליך microglial, והאפליה של מיקרוגליה הופעלו מורפולוגית 9,50. כפי שניתן לראות על ידי מחברים אלה, גודל somal הוא המורפולוגיות הבולטות ביותרפרמטר לזיהוי לאורך זמן על ידי ההדמיה confocal שני פוטונים חי של מיקרוגליה מוח, באמצעות thresholding מבוססת עוצמת איטרטיבי כדי להפחית 9 וריאציות אות לרעש. יתר על כן, שינויי גודל somal לתאם עם גברת ביטוי של ביטוי Iba1 בתאים מופעלים 9. כאן, אנו משתמשים בתמונות חיות cSLO ולהחיל פילוח רציף דומה של תאי microglial וsomata, ואחריו ניתוח morphometric לכמת מספרים בסך הכל והופעלו תאי CX3CR1-GFP + המקומיים לרשתית.

אנו משתמשים בתוכנה מיוחד confocal טיוח (FluoRender) לGFP + תאי מגזר ברשתית המרכזית. תמונות אלה, הם thresholded נוסף באמצעות חבילת ניתוח תמונת confocal זמינה מסחרי, כדי לאפשר הפילוח האוטומטי וכימות מבוסס סף של אזור somal סופו של דבר. תמונת החיה שלנו מנתחים אישרה את השימוש בגודל סומה כמדד מורפולוגיים של הפעלת microglial בתמונה חי ניתוח 9. Somalספירה מבוססת סף אפשרה אפיון דפוסים והעלייה בmicrogliosis רשתית, כפי שהודגם בעבר על ידי vivo לשעבר ניתוח תמונה 50. אנו מוצאים כי cSLO מזהה GFP + מיקרוגלים עם הרזולוציה ופירוט הטובים ביותר ברשתית העכבר המרכזית (<2 מ"מ 2), שבו ניתן הדמיה תאים באותו המטוס confocal. לקראת הפריפריה הרשתית, אות הקרינה תערוכות שונות ועיוותים המונעות עיבוד הדמיה זהה וניתוח סף כלתאי GFP + זוהו ברשתית המרכזית שטוחה. לבסוף, הפרוטוקול שלנו מראה שניתוח תמונת cSLO vivo של מיקרוגליה רשתית מציע תפוקה גבוהה יחסית. מספר microglial parenchymal שיכול להיות חזותי מבודד ולכמת ברשתית המרכזית נע בין 200-300 ~ תאים כולל, ו~ 10-180 תאים מופעלים. לפיכך, מיקרוגלי רשתית העכבר מציע אוכלוסייה אופטימלית ללמוד in vivo השינוי ותפקידיהם דuring פתוגנזה של ניוון של מערכת עצבים.

בקשה למחלות כרוניות של מערכת העצבים המרכזית אחרות

שיטות ניתוח תמונת in vivo המתוארות כאן צריכה להיות ישימות להערכת שינויי microglial אקוטיים או כרוניים במחלות אחרות עכבר רשתית ודגמי פציעה. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך את השינויים ברשתית המיקרוגלים / מונוציטים ההיקפיים וכתוצאה מפתולוגיות CNS כרוניות, כגון אלצהיימר, פרקינסון וטרשת נפוצה, בהתחשב בכך שהרשתית ועצב ראייה ממוקדות לניוון מוחיה במחלות אלה 51-56. בקנה אחד עם זו, השימוש בזיהוי חי של רשתית ופתולוגיה ONH לניהול מחלת אלצהיימר מוקדם הוא תחת 54,57,58 מחקר אינטנסיבי.

לסיכום, הממצאים שלנו מצביעים על כך ש, מעקב אורך חיים וכימות של שינויים במספרי מיקרוגלי רשתית והפעלה מורפולוגיים, עשוי לשמש כne אמיןuroimaging סמנים ביולוגיים לגילוי תחילת מחלה והתקדמות מוקדמת. in vivo מתודולוגיה ההדמיה והניתוח אלה חלות על גלאוקומה הקשורות לגיל, ובאופן פוטנציאלי למחלות ניווניות נוספות המשפיעות על הרשתית ועצב ראייה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME 000671 and 00582 Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift.
30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe BD, East Rutherford, NJ 305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T48402, 152463 and P4417 Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week.
Heat therapy T/Pump Gaymar Industries, Orchard Park, NY TP-650
Cotton-tipped applicators Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 23-400-100
Tropicamide 1% Bausch & Lomb, Rochester, NY NDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick center Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK G003709 Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA Version 1.7.1.0
PowerPoint Microsoft, Redmond, WA Version 14.4.3
Adobe Photoshop Adobe, San Jose, CA Version CS3
FluoRender Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah Version 2.13 Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements C Nikon, Melville, NY Version 4.30.01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7, (65), 1-18 (2013).
  2. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91, (2), 461-553 (2011).
  3. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, (6), 752-758 (2005).
  4. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  6. Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33, (3), 256-266 (2001).
  7. Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, (6), 563-581 (1999).
  8. Jonas, R. A., et al. The spider effect: morphological and orienting classification of microglia in response to stimuli in vivo. PloS One. 7, (2), e30763 (2012).
  9. Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PloS One. 7, (2), 1-9 (2012).
  10. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10, (12), 1538-1543 (2007).
  11. Elmore, M. R., et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 82, (2), 380-397 (2014).
  12. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, (1), 151-170 (1990).
  13. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  14. Solomon, J. N., et al. Origin and distribution of bone marrow-derived cells in the central nervous system in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 53, 744-753 (2006).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat. Neurosc. 14, (9), 1142-1149 (2011).
  16. Sapp, E., et al. Early and progressive accumulation of reactive microglia in the Huntington disease brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60, (2), 161-172 (2001).
  17. Maeda, J., et al. In vivo positron emission tomographic imaging of glial responses to amyloid-beta and tau pathologies in mouse models of Alzheimer's disease and related disorders. J. Neurosc. 31, (12), 4720-4730 (2011).
  18. Jacobs, A. H., Tavitian, B. Noninvasive molecular imaging of neuroinflammation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, (7), 1393-1415 (2012).
  19. Ouchi, Y., et al. Microglial activation and dopamine terminal loss in early Parkinson's disease. Ann. Neurol. 57, (2), 168-175 (2005).
  20. Fuhrmann, M., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13, (4), 411-413 (2010).
  21. Trapani, A., Palazzo, C., de Candia, M., Lasorsa, F. M., Trapani, G. Targeting of the translocator protein 18 kDa (TSPO): a valuable approach for nuclear and optical imaging of activated microglia. Bioconjug. Chem. 24, (9), 1415-1428 (2013).
  22. Venneti, S., Lopresti, B. J., Wiley, C. A. Molecular imaging of microglia/macrophages in the brain. Glia. 61, (1), 10-23 (2013).
  23. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat. Comm. 3, (1227), 1-15 (2012).
  24. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6, (3), e17910 (2011).
  25. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp. Neurol. 254, (214), 109-120 (2014).
  26. Nayak, D., Zinselmeyer, B. H., Corps, K. N., McGavern, D. B. In vivo dynamics of innate immune sentinels in the CNS. Intravital. 1, (2), 95-106 (2012).
  27. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, (11), 1-16 (2010).
  28. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. J. Neurosci. 29, (13), 3974-3980 (2009).
  29. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J. Vis. Exp. 19, (43), (2010).
  30. Alt, C., Runnels, J. M., L, T. G. S., P, L. C. In vivo tracking of hematopoietic cells in the retina of chimeric mice with a scanning laser ophthalmoscope. Intravital. 1, (2), 132-140 (2012).
  31. Eter, N., et al. In vivo visualization of dendritic cells, macrophages, and microglial cells responding to laser-induced damage in the fundus of the eye. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49, (8), 3649-3658 (2008).
  32. Liu, S., et al. Tracking retinal microgliosis in models of retinal ganglion cell damage. Investigative ophthalmology & visual science. 53, 6254-6262 (2012).
  33. Maeda, A., et al. Two-photon microscopy reveals early rod photoreceptor cell damage in light-exposed mutant mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111, (14), E1428-E1437 (2014).
  34. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46, (8-9), 1336-1345 (2006).
  35. Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Res. 45, (28), 3512-3519 (2005).
  36. Alt, C., Runnels, J. M., Mortensen, L. J., Zaher, W., Lin, C. P. In vivo imaging of microglia turnover in the mouse retina after ionizing radiation and dexamethasone treatment. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 55, (8), 5314-5319 (2014).
  37. Bosco, A., et al. Reduced retina microglial activation and improved optic nerve integrity with minocycline treatment in the DBA/2J mouse model of glaucoma. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49, (4), 1437-1446 (2008).
  38. Anderson, M. G., et al. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, (1), 81-85 (2002).
  39. Chang, B., et al. Interacting loci cause severe iris atrophy and glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 21, (4), 405-409 (1999).
  40. Smith, R. S., Korb, D., John, S. W. A goniolens for clinical monitoring of the mouse iridocorneal angle and optic nerve. Mol. Vis. 8, 26-31 (2002).
  41. Buckingham, B. P., et al. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal loss in a mouse model of glaucoma. J. Neurosci. 28, (11), 2735-2744 (2008).
  42. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. J. Cell Biol. 179, (7), 1523-1537 (2007).
  43. Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J. Cell Biol. 171, (2), 313-325 (2005).
  44. Soto, I., et al. Retinal ganglion cells downregulate gene expression and lose their axons within the optic nerve head in a mouse glaucoma model. J. Neurosci. 28, (2), 548-561 (2008).
  45. Bosco, A., Steele, M. R., Vetter, M. L. Early microglia activation in a mouse model of chronic glaucoma. J. Comp. Neurol. 519, (4), 599-620 (2011).
  46. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, (11), 4106-4114 (2000).
  47. Broux, B., et al. CX(3)CR1 drives cytotoxic CD4(+)CD28(-) T cells into the brain of multiple sclerosis patients. J. Autoimmun. 38, (1), 10-19 (2012).
  48. Paques, M., et al. In vivo observation of the locomotion of microglial cells in the retina. Glia. 58, (14), 1663-1668 (2010).
  49. Charbel Issa, P., et al. Optimization of in vivo confocal autofluorescence imaging of the ocular fundus in mice and its application to models of human retinal degeneration. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 53, (2), 1066-1075 (2012).
  50. Beynon, S. B., Walker, F. R. Microglial activation in the injured and healthy brain: what are we really talking about? Practical and theoretical issues associated with the measurement of changes in microglial morphology. Neuroscience. 225, (2012), 162-171 (2012).
  51. Chan, J. W. Recent advances in optic neuritis related to multiple sclerosis. Acta Ophthalmol. 90, (3), 203-209 (2012).
  52. Frost, S., Martins, R. N., Kanagasingam, Y. Ocular biomarkers for early detection of Alzheimer's disease. J. Alzheimer's Dis. 22, (1), 1-16 (2010).
  53. Guo, L., Duggan, J., Cordeiro, M. F. Alzheimer's disease and retinal neurodegeneration. Curr. Alzheimer Res. 7, (1), 3-14 (2010).
  54. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 83, (9), 917-922 (2012).
  55. Kersten, H. M., Roxburgh, R. H., Danesh-Meyer, H. V. Ophthalmic manifestations of inherited neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurol. 10, (6), 349-362 (2014).
  56. Kesler, A., Vakhapova, V., Korczyn, A. D., Naftaliev, E., Neudorfer, M. Retinal thickness in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. Clin. Neurol. Neurosurg. 113, (7), 523-526 (2011).
  57. Petzold, A., et al. Optical coherence tomography in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 9, (9), 921-932 (2010).
  58. Satue, M., et al. Retinal thinning and correlation with functional disability in patients with Parkinson's disease. Br. J. Ophthalmol. 98, (3), 350-355 (2014).
  59. Bosco, A., Romero, C. O., Breen, K. T., Chagovetz, A. A., Steele, M. R., Ambati, B. K., Vetter, M. L. Neurodegeneration severity can be predicted from early microglia alterations monitored in vivo in a mouse model of chronic glaucoma. Dis Model Mech. (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats